Nguyễn thị thu huyền tổng hợp, thử tác dụng gây độc tế bào và ức chế histon deacetylase của một số dẫn chất 1h indazol 5 yln hydroxyacrylamid

Trên cơ sở những nghiên cứu về các chất ức chế HDAC và hoạt tính kháng ung thư của các dẫn chất indazol, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược – khoa Công nghệ Hóa Dược - trường Đại học Dư

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU HUYỀN

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THU HUYỀN

1 PGS TS Phan Thị Phương Dung

2 TS Dương Tiến Anh

Nơi thực hiện:

Bộ môn Hóa Dược – Khoa Công nghệ Hóa dược

HÀ NỘI – 2023

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày nội dung khóa luận, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến những người đã luôn hỗ trợ, động viên và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Phan Thị Phương Dung, TS Đỗ Thị Mai Dung, TS Dương Tiến Anh

Thầy cô đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được tham gia nghiên cứu khoa học và thực hiện khóa luận tốt nghiệp của mình Trong suốt quá trình thực nghiệm tại bộ môn, thầy

cô đã luôn động viên và cho tôi những lời khuyên bổ ích, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi từ khi tôi còn bỡ ngỡ cho tới khi tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Dược - khoa Công nghệ Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa – trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thành viên tham gia nghiên cứu khoa học tại bộ môn Hóa Dược – khoa Công nghệ Hóa Dược – trường Đại học Dược Hà Nội,

đặc biệt là chị Nguyễn Thị Thu Hằng, anh Nguyễn Quang Thế Vũ, anh Nguyễn Đức Thịnh, bạn Bùi Phương Mai, bạn Vũ Hà Vy, bạn Nguyễn Ánh Phương, bạn Vũ Anh Minh, em Nguyễn Thị Nga, em Nguyễn Đức Tú, em Trần Thị Thu Huyền, các em

nhóm nghiên cứu Tổng hợp hóa dược Mọi người đã luôn hỗ trợ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bố mẹ, những người thân trong gia đình và bạn bè tôi đã luôn động viên và là chỗ dựa tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội

Hà Nội, ngày 04 tháng 06 năm 2023

Sinh viên

Nguyễn Thị Thu Huyền

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 HISTON DEACETYLASE 2

1.1.1 Khái niệm histon deacetylase 2

1.1.2 Phân loại histon deacetylase 3

1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym histon deacetylase 3

1.1.4 Mối quan hệ của histon deacetylase và ung thư 4

1.2 CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE 5

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC 5

1.2.2 Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC 7

1.2.3 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 9

1.3 PHẢN ỨNG HECK 11

1.3.1 Đặc điểm phản ứng Heck 11

1.3.2 Cơ chế phản ứng Heck 12

1.4 DẪN CHẤT INDAZOL VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA DẪN CHẤT INDAZOL 13

1.4.1 Indazol và một số dẫn chất chứa khung indazol 13

1.4.2 Hoạt tính kháng ung thư của dẫn chất indazol 14

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 17

2.1.1 Hóa chất 17

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Hóa học 18

2.2.2 Thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất tổng hợp được 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3.1 Hóa học 18

2.3.2 Thử hoạt tính sinh học 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23

3.1 HÓA HỌC 23

3.1.1 Tổng hợp hóa học 23

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 29

3.1.3 Khẳng định cấu trúc 30

3.2 HOẠT TÍNH SINH HỌC 35

3.2.1 Đánh giá độc tính trên tế bào ung thư 35

3.2.2 Đánh giá khả năng ức chế HDAC 35

3.3 BÀN LUẬN 36

3.3.1 Tổng hợp hóa học 36

3.3.2 Khẳng định cấu trúc 39

3.3.3 Hoạt tính sinh học 44

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đồng vị carbon-13

(Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

3JCH : Tương tác dị hạt nhân giữa 13C và 1H qua 3 liên kết

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

(Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy)

Bad : Bcl-2-associated agonist of cell death

CDK : Kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinase)

CDKN1A : Cyclin Dependent Kinase Inhibitor 1A

DISC : Phức hợp tín hiệu gây chết (Death-inducing signaling complex)

DMSO-d 6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa

ESI : Ion hóa phun bụi điện tử (Electrospray ionization)

(U.S Food and Drug Administration) FGFR : Thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi

(Fibroblast growth factor receptor) FLICE : Thành phần của phức hợp truyền tín hiệu gây chết tế bào theo

chương trình

HCT116 : Dòng tế bào ung thư đại tràng

HDAC : Histon deacetylase

HDACi : Chất ức chế histon deacetylase (Histon deacetylase inhibitor) HIF-1α : Yếu tố cảm ứng hypoxia (Hypoxia-inducible factor 1α)

HMBC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết

(Heteronuclear Multiple Bond Coherence) HSQC : Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết

(Heteronuclear Single Quantum Coherence)

IC50 : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)

INSS : Hệ thống phân loại u nguyên bào thần kinh

MDA-MD-231 : Dòng tế bào ung thư vú

PC3 : Dòng tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt

SMMC-7721 : Dòng tế bào ung thư gan ở người

(Vascular endothelial growth factor) WHO : Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization)

δ (ppm) : Độ chuyển dịch hóa học (phần triệu) trong phổ NMR

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ

Trang

Bảng 1.1 Biểu hiện của HDAC ở một số loại ung thư trên người 5

Bảng 1.2 Tình hình nghiên cứu lâm sàng của một số chất ức chế HDAC 7

Bảng 3.1 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất IVa-e 29

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá khả năng ức chế HDAC tổng và độc tính trên một số

dòng tế bào ung thư 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.2 Các nhóm HDAC và vị trí phân bố các HDAC trong tế bào 3

Hình 1.4 Phân loại các chất ức chế HDAC theo cấu trúc hóa học 6

Hình 3.1 Phổ hồng ngoại IR của dẫn chất IVa 40

Hình 3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H-NMR của dẫn chất IVa 42

Hình 3.5 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13C-NMR của dẫn chất IVa 43

Hình 3.7 Biểu đồ so sánh độc tính tế bào của các dẫn chất IVa-e với SAHA và ADR

Hình 3.8 So sánh khả năng ức chế HDAC tổng của các dẫn chất IVa-e với SAHA 46

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 1.2 Cơ chế phản ứng Heck được xúc tác bởi Pd(OAc)2 liên kết với các phối tử phosphin do Heck đề xuất 12

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp các dẫn chất IVa-e 23

Sơ đồ 3.9 Cơ chế đề xuất cho phản ứng tổng hợp dẫn chất trung gian IIa-e 36

Sơ đồ 3.10 Cơ chế tạo 2 đồng phân của phản ứng N-alkyl hóa 5-bromo-1H-indazol 37

Sơ đồ 3.12 Cơ chế phản ứng tạo acid hydroxamic của các dẫn chất 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo số liệu của Tổ chức Y Tế thế giới (WHO) năm 2020, có khoảng 10 triệu ca

tử vong liên quan đến bệnh lý ung thư, chiếm 1/6 tổng số ca tử vong [32] Gánh nặng ung thư tiếp tục gia tăng trên toàn cầu, gây ảnh hưởng tiêu cực về thể chất, tinh thần, tài chính cho cá nhân, gia đình, cộng đồng và hệ thống y tế Vì vậy, việc tìm kiếm các phương pháp điều trị ung thư mới luôn là vấn đề được quan tâm hàng đầu

Hiện nay, ngoài các phương pháp điều trị truyền thống được áp dụng rộng rãi như phẫu thuật, xạ trị, hóa trị; liệu pháp nhắm mục tiêu phân tử nổi lên như một tiến bộ mới trong điều trị nội khoa đối với ung thư [5] Các thuốc chống ung thư mới ra đời hầu hết đều bắt nguồn từ mục tiêu phân tử nhằm tăng hiệu quả điều trị và giảm độc tính [2] Trong đó, đích HDAC được biết đến như một mục tiêu đầy hứa hẹn để điều trị ung thư [6] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự huy động quá mức các HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã, làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [39, 40] Cho đến nay, đã có bốn chất ức chế HDAC được FDA phê duyệt trong điều trị ung thư bao gồm: vorinostat (SAHA) (Zolinza), romidepsin (Depsipeptid), panobinostat (Farydax) và belinostat (Beleodaq) [4]

Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra hàng loạt dẫn chất mang khung indazol

ức chế các protein mục tiêu trong bệnh lý ung thư [10, 12, 41] Đặc biệt, một số thuốc mang khung indazol đã được cấp phép điều trị như nirapanid, pazopanib, bendazac, benzydamin [13]

Trên cơ sở những nghiên cứu về các chất ức chế HDAC và hoạt tính kháng ung thư của các dẫn chất indazol, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược – khoa Công nghệ Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công

bố một số dẫn chất mang khung indazol hướng ức chế HDAC [42] Tiếp cận theo hướng

nghiên cứu này, đề tài “Tổng hợp, thử tác dụng gây độc tế bào và ức chế histon

deacetylase của một số dẫn chất 1H-indazol-5-yl-N-hydroxyacrylamid” được tiến

hành với hai mục tiêu:

1 Tổng hợp được 5 dẫn chất 1H-indazol-5-yl-N-hydroxyacrylamid

2 Thử tác dụng gây độc tế bào và ức chế histon deacetylase của các dẫn chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 HISTON DEACETYLASE

1.1.1 Khái niệm histon deacetylase

Nucleosom là đơn vị cơ bản cấu tạo nên nhiễm sắc thể của hầu hết sinh vật nhân thực Nucleosom chứa 146 cặp base của ADN quấn quanh một lõi của 8 protein histon (bao gồm hai bản sao của mỗi H2A, H2B, H3, H4) [9] Bốn cặp histon này có hai phần quan trọng: phần đuôi C nằm trong nucleosom, phần đuôi N với acid amin kết thúc là lysin nằm bên ngoài nucleosom Phần đuôi N của histon là nơi diễn ra nhiều quá trình biến đổi khác nhau trong phiên mã bao gồm quá trình acetyl hóa [3] Trạng thái acetyl hóa của histon được điều chỉnh nhờ 2 enzym là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC) Trạng thái này quy định sự tiếp cận của các yếu tố phiên mã tới ADN từ đó ảnh hưởng tới biểu hiện gen [9]

Quá trình acetyl hóa histon được thực hiện bởi HAT Quá trình này làm trung hòa điện tích dương của lysin ở đầu tận cùng N dẫn tới tương tác giữa ADN và histon bị suy yếu, tăng khoảng cách giữa ADN và histon, từ đó làm tăng khả năng tiếp cận của các yếu tố phiên mã Ngược lại, quá trình loại bỏ nhóm acetyl được thực hiện bởi HDAC, làm phục hồi điện tích dương trên lysin, dẫn đến cô đặc nhiễm sắc thể, giảm khả năng tiếp cận của các yếu tố phiên mã, từ đó kìm hãm quá trình phiên mã (Hình 1.1) [7, 16-18] Ngoài ra, HDAC còn tham gia loại bỏ nhóm acetyl của các protein không phải là histon bao gồm các yếu tố phiên mã như chất ức chế khối u p53, STAT3 và tiểu đơn vị NF-ĸB Thay đổi trạng thái acetyl hóa của các protein không phải là histon dẫn đến thay đổi chức năng, tương tác protein-protein và tính ổn định của protein [35]

Hình 1.1 Tác dụng của HAT và HDAC

1.1.2 Phân loại histon deacetylase

Cho đến hiện tại, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC ở người Dựa vào đặc điểm tương đồng với HDAC ở nấm men, HDAC được chia thành bốn nhóm (Hình 1.2):

- Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8

- Nhóm II: được chia thành nhóm IIa và IIb bao gồm các HDAC: HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7, HDAC9, HDAC10

- Nhóm III: Các sirtuin

- Nhóm IV: HDAC11

HDAC nhóm I, II, IV là những enzym phụ thuộc Zn2+, có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo phức chelat với Zn2+ Trong khi HDAC nhóm III không bị ức chế bởi những hợp chất đó, là những enzym phụ thuộc NAD+ [2]

1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym histon deacetylase

Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC được xác định bằng phương pháp kết tinh tạo tinh thể và chụp tia X HDAC8 là HDAC đầu tiên ở động vật có vú xác định được cấu trúc 3 chiều Sau đó, cấu trúc trung tâm hoạt động của các HDAC khác cũng được xác định [11]

Nhìn chung, các HDAC đều có trung tâm hoạt động gồm 2 phần chính: ion Zn2+

và kênh enzym (Hình 1.3):

+ Ion Zn2+ là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym Trong phân tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 5 liên kết phối trí: 4 liên kết phối trí với các acid amin, 1 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl của lysin ở đầu N của histon, từ đó xúc

tác loại nhóm acetyl [11] Cụ thể, chất ức chế HDAC như các acid hydroxamic - nhóm gắn kẽm được sử dụng phổ biến nhất, ion Zn2+ sẽ tạo 2 liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm carbonyl và hydroxy của nhóm hydroxamic Đặc biệt, liên kết giữa acid hydroxamic và kẽm đã được chứng minh là yếu tố quyết định hoạt động ức chế của các acid hydroxamic [11, 39]

+ Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa cơ chất và tham gia liên kết Van der Waals với cơ chất Kênh này được cấu tạo từ các acid amin thân dầu: Phe, Tyr, Pro, His Đáy túi có một vài phân tử nước, có nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng loại bỏ nhóm acetyl và tham gia tạo liên kết hydro khi không có -OH của Tyr [2] Cấu trúc túi rất linh động, có thể biến đổi để tương tác với chiều dài của các cơ chất khác nhau Các hợp chất hydroxamic có chiều dài cầu nối khoảng 5-6 liên kết carbon là tối ưu với chiều dài của kênh enzym Bề rộng của túi được giới hạn bởi hai vòng thơm

và chúng được tìm thấy trên cùng một vị trí ở nhiều HDAC khác nhau Trên miệng túi

có một vành nhỏ được tạo nên từ một vài vòng xoắn protein (phần vành sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC) [11]

Hình 1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC

Nghiên cứu về cấu trúc trung tâm hoạt động của HDAC là cần thiết để xác định cơ chế tác dụng của HDAC cũng như thiết kế công thức cho các chất ức chế HDAC mới Đặc biệt, hiện nay để tối ưu tác dụng và giảm tác dụng không mong muốn, nhiều nghiên cứu tập trung vào hướng thiết kế các chất ức chế HDAC chọn lọc

1.1.4 Mối quan hệ của histon deacetylase và ung thư

Hiện nay, các HDAC đã được xác định là biểu hiện quá mức trong nhiều loại ung thư (Bảng 1.1) [4] Nghiên cứu năm 2005 của Fraga MF, Yamakawa M, Semba S và

cộng sự cho thấy mức độ acetyl hóa histon của mô hạch bạch huyết bình thường lớn hơn

so với u lympho, trong biểu mô đại tràng bình thường lớn hơn trong ung thư biểu mô tuyến đại tràng [40] Bên cạnh đó, so sánh các sửa đổi sau dịch mã đối với histon H4 trong mô bình thường, dòng tế bào ung thư và khối u nguyên phát cho thấy các tế bào ung thư đã mất đi các dạng monoacetyl hóa và trimethyl hóa của histon H4 Những thay đổi này xuất hiện sớm và được tích lũy trong quá trình tạo khối u [14] Các HDAC nhóm

I được chứng minh là có liên quan đến việc điều chỉnh tăng sinh tế bào, được phát hiện

có biểu hiện quá mức trong hàng loạt khối u: HDAC1 trong ung thư dạ dày, HDAC2 trong ung thư đại trực tràng, HDAC3 trong ung thư ruột kết Trong khi đó, các HDAC nhóm II chủ yếu liên quan đến sự phát triển tế bào và biệt hóa tế bào [15]

Bảng 1.1 Biểu hiện của HDAC ở một số loại ung thư trên người [6]

U nguyên bào thần kinh HDAC8, HDAC10

1.2 CHẤT ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE

1.2.1 Phân loại các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC có thể được phân loại theo nhiều cách khác nhau: phân loại dựa trên tính chọn lọc đối với các loại HDAC, phân loại dựa trên nguồn gốc và phân loại theo cấu trúc hóa học [39]

Phân loại dựa trên tính chọn lọc đối với các loại HDAC

Các chất ức chế HDAC có thể được chia thành 2 loại:

+ Các chất ức chế HDAC không chọn lọc: ba trong bốn chất ức chế HDAC được FDA phê duyệt đều ức chế không chọn lọc các HDAC bao gồm: vorinostat (SAHA),

belinostat, panobinostat [6]

+ Các chất ức chế HDAC chọn lọc: romidepsin ức chế chọn lọc HDAC nhóm I,

là chất ức chế chọn lọc HDAC duy nhất được FDA phê duyệt cho đến thời điểm hiện tại Ngoài ra, nhiều dẫn chất khác có tác dụng ức chế HDAC chọn lọc đang được thử

nghiệm lâm sàng như ricolinostat ức chế chọn lọc HDAC6 [6]

Phân loại dựa trên nguồn gốc của các chất ức chế HDAC

+ Các chất ức chế HDAC có nguồn gốc tổng hợp: các chất được tổng hợp trong

phòng thí nghiệm hóa học như vorinostat (SAHA), entinuler…

+ Các chất ức chế HDAC có nguồn gốc tự nhiên như vi khuẩn, nấm, thực vật, sinh

vật biển Ví dụ như triclostatin A có nguồn gốc từ Streptomyces hygroscopicus có hoạt

tính ức chế mạnh đối với nhiều loại HDAC [39]

Phân loại theo cấu trúc hóa học

Các chất ức chế HDAC được phân loại thành 5 nhóm, bao gồm: các acid hydroxamic, các benzamid, các acid béo chuỗi ngắn, các peptid vòng và các dẫn chất ceton (Hình 1.4) Mỗi nhóm đều có ưu nhược điểm riêng, trong đó nhóm các benzamid

và các acid béo có tác dụng yếu, dẫn chất ceton bị khử hóa trong huyết tương, các peptid vòng có cấu trúc quá phức tạp [3] Trong khi đó, các acid hydroxamic bị nhanh thải trừ, nhưng có ưu điểm là ức chế ở nồng độ rất thấp (cỡ nM) và cấu trúc đơn giản [2] Đặc biệt, ba trong bốn chất ức chế HDAC được FDA phê duyệt trong điều trị ung thư thuộc nhóm các acid hydroxamic Điều này cho thấy tiềm năng phát triển của các acid hydroxamic hướng tới mục tiêu có hoạt tính kháng tế bào ung thư

Hình 1.4 Phân loại các chất ức chế HDAC theo cấu trúc hóa học

Nhiều chất ức chế HDAC khác đã được đưa vào thử nghiệm lâm sàng trong cả khối u rắn và khối u ác tính về huyết học [6] (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Tình hình nghiên cứu lâm sàng của một số chất ức chế HDAC [6]

Các chất ức chế

Các acid hydroxamic

Các benzamid

Ricolinostat Ức chế chọn lọc HDAC6 Thử nghiệm lâm sàng pha I, II

Các acid béo chuỗi ngắn

Acid valproic (VPA) Ức chế HDAC nhóm I, II Thử nghiệm lâm sàng pha I, II

Các peptid vòng

2011

1.2.2 Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC

Mô hình đầu tiên của các chất ức chế HDAC có cấu trúc 3 phần bao gồm: vùng kết thúc gắn kẽm (ZBG), vùng cầu nối (Linker) và vùng nhận diện bề mặt (Cap-group) (Hình 1.5) [36]

Hình 1.5 Cấu trúc khung pharmacophore cổ điển của các HDACi

Vùng kết thúc gắn kẽm (ZBG)

Vùng ZBG tương tác với coenzym Zn2+, tạo phức chelat với ion kẽm nằm sâu trong

vị trí hoạt động của HDAC ở đáy kênh enzym Ví dụ, nhóm acid hydroxamic thường tương tác với ion Zn2+ bằng cách tạo phức hai càng với ion Zn2+ Thường các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC và độc tính tế bào càng tăng Cấu trúc vùng ZBG còn ảnh hưởng đến vấn đề dược động học Đặc biệt, việc

thay đổi cấu trúc vùng kết thúc gắn kẽm có thể là một hướng nghiên cứu tìm kiếm các dẫn chất mới [2]

Một số nhóm kết thúc gắn kẽm cổ điển xuất hiện trong nhiều nghiên cứu có thể kể đến như acid hydroxamic, benzamid, acid carboxylic, thiol Gần đây, nhiều nghiên cứu

đã chỉ ra một số nhóm mới cũng có thể tạo phức chelat với kẽm như imidazol thion, nhóm chelidamic, benzoyl hydrazid…[39]

Hình 1.6 Một số cấu trúc phần kết thúc gắn kẽm của các HDACi

Trong các chất ức chế HDAC được tổng hợp và công bố, nhóm các dẫn chất của acid hydroxamic có hoạt tính tốt nhất Các dẫn chất này đã được chứng minh là có hoạt tính trên các mục tiêu cụ thể liên quan đến sự tiến triển của ung thư và có độc tính với

tế bào ung thư ở nồng độ nhỏ [8] Do vậy, đề tài hướng đến tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc phần kết thúc gắn kẽm là acid hydroxamic

Vùng cầu nối (Linker)

Vùng cầu nối (Linker) liên kết vùng ZBG với vùng nhận diện bề mặt của chất ức chế Vùng cầu nối thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, có thể no hoặc không no, có vai trò tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym, tạo nên tương tác với các thành phần nằm trên kênh và giúp cho cơ chất

cố định trong kênh [2, 39]

Trung tâm hoạt động của các HDAC là dạng túi kỵ nước, có chiều dài từ miệng túi đến ion Zn2+ ở đáy túi là 4-6 C, do vậy các chất ức chế HDAC có vùng cầu nối dài tương ứng sẽ cho hoạt tính tốt hơn Vùng cầu nối của chất ức chế HDAC điển hình: SAHA có chiều dài 6C, trichostatin A có chiều dài 5C [2, 39]

Vùng nhận diện bề mặt (Cap-group)

Vùng nhận diện bề mặt có mặt trong phần lớn chất ức chế HDAC Vùng này tương tác với gốc acid amin trên bề mặt kênh enzym, còn có tên khác là nhóm mũ (Cap-group) Vùng này quyết định tính ức chế chọn lọc của các chất ức chế HDAC Thông qua những biến đổi ở vùng này, chất ức chế chọn lọc HDAC6 tubacin đã được phát hiện Nghiên cứu năm 2008 của Bieliauskas và Pflum chứng minh tính chọn lọc này là do nhóm CAP của tubacin rất lớn so với chất ức chế HDAC không chọn lọc vorinostat (SAHA) (Hình

1.7) [37] Ngoài ra, romidepsin ức chế chọn lọc các HDAC nhóm I cũng có vùng CAP cồng kềnh (Hình 1.7) [39]

Cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của các chất

ức chế HDAC Những phân tử không có nhóm nhận diện bề mặt kỵ nước thường có hoạt tính yếu [2]

Hình 1.7 Cấu trúc của một số chất ức chế chọn lọc HDAC

Ngoài 3 phần cấu trúc trên, theo quan điểm mở rộng về các chất ức chế HDAC còn

có một phần cấu trúc là “nhóm liên kết” CU (Connecting unit) (Hình 1.8) Nói chung,

“nhóm liên kết” CU là một nhóm lai hóa sp2 như ceton, được tìm thấy trong TSA hoặc SAHA Chỉ một số ít nghiên cứu được thực hiện trên phần này vì nó thường được tích hợp vào cấu trúc của nhóm nhận diện bề mặt [19]

Hình 1.8 Cấu trúc khung pharmacophore mở rộng của các HDACi

1.2.3 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Các chất ức chế HDAC có thể điều chỉnh mức độ acetyl hóa bất thường của protein trong các tế bào khối u Cơ chế hoạt động của chất ức chế HDAC trên các tế bào khối u

đã dần được làm rõ trong nhiều nghiên cứu [20-22] Các HDACi đã được chứng minh

là gây ngừng chu kỳ tế bào, thúc đẩy sự biệt hóa tế bào và quá trình chết tế bào theo

chương trình Ngoài ra, chúng còn ảnh hưởng đến sự sống sót của tế bào khối u thông qua ức chế sự hình thành mạch [6] Điều đó giúp khẳng định chất ức chế HDAC là một loại hợp chất đầy hứa hẹn để điều trị ung thư Phần tiếp theo của khóa luận sẽ trình bày một số cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Hình 1.9 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

1.2.3.1 Chất ức chế HDAC gây ngừng chu kỳ tế bào và thúc đẩy sự biệt hóa tế bào

Trong nhiều dòng tế bào khối u, sự ức chế hoặc điều chỉnh giảm của HDAC làm tăng cường biểu hiện của gen CDKN1A (p21), do vậy mã hóa protein p21 ngăn chặn dime hóa cyclin và CDK dẫn đến ngừng chu kỳ tế bào ở pha G1 đồng thời cảm ứng sự biệt hóa tế bào [4, 14] Ngoài ra, trong một số nghiên cứu, việc loại bỏ một vài loại HDAC như HDAC1, HDAC3… trong các tế bào khối u làm giảm chuyển đổi G2/M và

ức chế sự phát triển của tế bào bằng cách giảm phân bào và tăng tỷ lệ tế bào chết theo chương trình Như vậy, việc ức chế HDAC có thể gây ngừng chu trình tế bào ở pha G1/S hoặc pha G2/M, cho thấy HDAC là mục tiêu trong điều trị cho sự phát triển và tăng sinh

tế bào bất thường trong bệnh ung thư [6]

1.2.3.2 Các chất ức chế HDAC thúc đẩy sự chết tế bào theo chương trình

Việc sử dụng các chất ức chế HDAC để điều trị các tế bào khối u có thể kích hoạt trực tiếp quá trình chết tế bào theo chương trình thông qua cả 2 con đường: con đường ngoại sinh và con đường nội sinh [6]

Quá trình chết tế bào theo chương trình theo con đường ngoại sinh gây ra bởi các chất ức chế HDAC thông qua nhiều cơ chế, bao gồm: tăng biểu hiện của các receptor gây chết và/hoặc các phối tử bao gồm FasL - FasR, TNF - TNF receptor, TRAIL - TRAIL receptor; giảm mức độ của protein ức chế giống FLICE trong tế bào chất, tăng cường huy động sự hình thành DISC [6]

Sự ức chế HDAC đã được chỉ ra rằng có thể gây chết tế bào theo chương trình

thông qua con đường nội sinh trong ty thể in vitro và in vivo [9] Quá trình chết tế bào

theo chương trình theo con đường nội sinh liên quan đến sự tương tác của siêu họ protein Bcl-2: các protein hỗ trợ sự chết tế bào theo chương trình và các protein kháng lại sự chết tế bào Ức chế HDAC tạo ra quá trình chết theo chương trình nội sinh bằng cách tăng biểu hiện của các protein hỗ trợ sự chết tế bào (Bax, Bad, Bak) và giảm biểu hiện các protein kháng lại sự chết tế bào (Bcl-2, Bcl-x) [6]

1.2.3.3 Các chất ức chế HDAC giúp ức chế sự hình thành mạch

Sự phát triển và di căn của khối u phụ thuộc vào sự hình thành mạch Trong đó, sự hình thành mạch được kích hoạt bởi tình trạng thiếu oxy Phản ứng của tế bào đối với tình trạng thiếu oxy chủ yếu được điều chỉnh bởi yếu tố phiên mã HIF-1α (Hypoxia-Inducible Factor 1α) [6] Nhiều HDAC được phát hiện là có liên quan đến hoạt động của HIF-1α như HDAC1 trực tiếp khử acetyl HIF-1α; HDAC5, HDAC6 tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trưởng thành và ổn định HIF-1α bằng cách khử acetyl chaperon của nó: Hsp70, Hsp90 [6] Tác dụng ức chế tạo mạch của các chất ức chế HDAC cũng

đã được chứng minh là có liên quan đến việc giảm biểu hiện của gen tiền tạo mạch VEGF [6] Cụ thể, hoạt động tăng lên của HDAC1 đã được xác định là nguyên nhân gây

ra tăng mức HIF-1α và VEGF [14] Như vậy, sự ức chế HDAC làm tăng acetyl hóa các yếu tố phiên mã tiền tạo mạch HIF-1α, tăng cường sự thoái hóa và giảm biểu hiện của thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu VEGF [4] đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành mạch máu Điều này cho thấy ức chế HDAC là mục tiêu tiềm năng liên quan đến quá trình tạo mạch trong điều trị ung thư

1.2.3.4 Một số cơ chế khác

Bên cạnh các cơ chế kể trên, các chất ức chế HDAC cũng đã được chứng minh với các cơ chế khác như [2]:

- Làm thay đổi cấu trúc chromatin

- Tác động lên cơ chế gây đột biến và sửa chữa ADN

- Tác động đến cơ chế kiểm soát chất lượng protein

- Chống sự di căn

- Làm giảm chuyển hóa protein

- Liên quan đến ROS và con đường oxy hóa-khử thay thế [2]

1.3 PHẢN ỨNG HECK

1.3.1 Đặc điểm phản ứng Heck

Phản ứng Heck là phản ứng hình thành liên kết carbon-carbon Phản ứng này cùng với các phản ứng ghép đôi khác như Suzuki, Sonogashira… đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp hóa học hữu cơ Phản ứng Heck được phát hiện độc lập bởi Mizoroki và Heck hơn bốn thập kỷ trước Phản ứng này được ứng dụng rộng rãi với tính chọn lọc

hóa học cao, điều kiện phản ứng nhẹ nhàng; chất xúc tác có độc tính thấp, rẻ tiền, có thể tái sử dụng Đây là một phản ứng có hiệu quả cao và đơn giản [44]

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ chung của phản ứng Heck

Phản ứng Heck được mô tả là quá trình vinyl hóa hoặc aryl hóa olefin, trong đó olefin có thể là dẫn chất của acrylat, styren hoặc liên kết đôi nội phân tử Các dẫn chất aryl halogenid và vinyl halogenid của brom và iod thường có tốc độ phản ứng nhanh hơn các halogenid còn lại Trong phản ứng Heck, các xúc tác chứa palladi được dùng phổ biến nhất Các xúc tác này bền với nhiều loại nhóm chức, xúc tác tốt cho quá trình tạo liên kết carbon-carbon với chất nền phù hợp đồng thời dễ thu hồi, ít lẫn tạp trong sản phẩm và có khả năng tái sử dụng Đặc biệt, dùng xúc tác có Pd còn chọn lọc tạo đồng

phân trans-, dễ dàng cho quá trình tinh chế sau này [2, 44]

Phản ứng Heck tạo ra môi trường acid, do vậy các base hữu cơ và vô cơ như TBAB (tetrabutyl amoni bromid), TEA (triethylamin), K2CO3… được thêm vào hỗn hợp phản ứng để làm tăng tốc độ phản ứng Các dung môi điển hình cho phản ứng Heck là các

dung môi aprotic phân cực như DMF (dimethyl formanid) và NMP

(N-methyl-2-pyrrolidon) Trong một số nghiên cứu, phản ứng Heck đã được thực hiện trong điều kiện không có dung môi hoặc dung môi là H2O [44]

1.3.2 Cơ chế phản ứng Heck

phosphin do Heck đề xuất

Năm 1974, cơ chế phản ứng Heck được đề xuất bởi Dieck và Heck cho các phản ứng được xúc tác bởi Pd(OAc)2 liên kết với các phối tử phosphin được trình bày dưới dạng các phản ứng liên tiếp được mô tả thành một chu trình xúc tác (Sơ đồ 1.2) [48] Sau khi hình thành chất xúc tác Pd(0) từ tiền chất Pd(OAc)2 bằng một quy trình

khử, chu trình xúc tác được đề xuất bởi Heck gồm 4 giai đoạn: cộng oxy hóa, cộng syn, tách -hydrid (syn), tách khử và tái tạo lại Pd(0) [48]

Bước đầu tiên của chu trình xúc tác là giai đoạn cộng oxy hóa, bổ sung aryl halogenid (ArX) vào phức hợp Pd(0) Phản ứng cộng oxy hóa tạo ra -aryl-palladi(II) halogenid (ArPdXL2) cấu hình cis- Sau đó, phức trung gian này sẽ đồng phân hóa về cấu hình trans-ArPdXL2 bền hơn về mặt nhiệt động [2]

Tiếp theo trải qua quá trình cộng syn- với alken, tạo -alkyl-palladi(II) halogenid

Phản ứng của ArPdXL2 với một alken còn được gọi là quá trình hình thành liên kết

Pd-C, là nguồn gốc tính chọn lọc của phản ứng Heck Hai phức hợp đồng phân của palladi(II) halogenid có thể được hình thành trong giai đoạn này [48]

-alkyl-Sản phẩm trung gian alkyl Pd sau giai đoạn cộng syn- sẽ chuyển thành alken aryl hóa thông qua giai đoạn tách -hydrid kiểu syn Sự quay liên kết C-C trong -alkyl-

palladi(II) halogenid tạo ra một -hydro lai hóa sp3 ở vị trí syn- so với nguyên tử palladi Quá trình loại bỏ -hydrid (syn) tạo ra hydridopalladi(II) halogenid được nối với alken

aryl hóa Phản ứng này có thể thuận nghịch trong các phản ứng Heck không chứa phosphin [48]

Sau khi phân ly từ alkyl Pd, hydridopalladi(II) halogenid trải qua quá trình tách khử tái tạo phức hợp Pd(0) hoạt động Base được thêm vào giúp chuyển trạng thái cân bằng này về phía tạo chất xúc tác Pd(0) bằng cách phản ứng với các acid halogenid [48] Trong cùng điều kiện thí nghiệm, cùng alken, phối tử và base, khả năng phản ứng của aryl halogenid thường là: ArI  ArBr  ArCl [48] Các ArI thường kém bền, khó bảo quản trong khi ArCl có khả năng phản ứng kém vì vậy để tài đã lựa chọn sử dụng tác nhân ArBr để thực hiện phản ứng Heck

1.4 DẪN CHẤT INDAZOL VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA DẪN CHẤT INDAZOL

1.4.1 Indazol và một số dẫn chất chứa khung indazol

Hình 1.10 Cấu trúc đồng phân 1H-indazol, 2H-indazol

Indazol có cấu trúc đa vòng được tạo thành từ vòng pyrazol và vòng benzen

Indazol thường tồn tại dưới cả 2 dạng đồng phân: 1H-indazol và 2H-indazol trong đó 1H-indazol ổn định hơn về mặt nhiệt động, nên nó là đồng phân chiếm ưu thế [13]

Các dẫn chất của indazol ít khi xuất hiện trong tự nhiên Tuy nhiên, nhiều dẫn chất tổng hợp được phát hiện có hoạt tính dược lý đa dạng như: chống viêm, chống loạn nhịp, chống ung thư, kháng nấm, chống HIV [13] Ví dụ: niraparid được sử dụng rộng rãi như một loại thuốc chống ung thư, điều trị ung thư biểu mô tái phát buồng trứng, ống dẫn trứng hoặc ung thư phúc mạc nguyên phát, vú và tuyến tiền liệt [23]; pazopanib là một chất ức chế tyrosin kinase, đã được FDA phê duyệt để điều trị ung thư biểu mô tế bào thận [33]; bendazac và benzydamin là hai loại thuốc chống viêm [34] (Hình 1.11)

Hình 1.11 Một số dẫn chất chứa khung indazol

1.4.2 Hoạt tính kháng ung thư của dẫn chất indazol

Các nghiên cứu về ung thư đã chỉ ra hàng loạt chất mang bộ khung indazol ức chế các protein mục tiêu trong bệnh lý ung thư như FGFR, IOD1, Pim kinase, Aurora kinase…[24]

Ức chế FGFR

Sự khuếch đại sai lệch của FGFR đã được chứng minh là tồn tại trong nhiều loại ung thư [24] Năm 2015, nhóm nghiên cứu của Liu và cộng sự đã tổng hợp được các

dẫn chất 1H-indazol-3-amin có hoạt tính ức chế FGFR1 mạnh Trong đó, dẫn chất 1 nổi

bật là chất ức chế FGFR1 mạnh nhất với giá trị IC50 = 2,9 nM đồng thời cho thấy khả năng ức chế ở nồng độ nano với dòng tế bào ung thư dạ dày SNU-16 (IC50 = 40,5 nM) (Hình 1.12) [25] Sau đó, năm 2016, Yan.W và cộng sự đã công bố một dãy dẫn chất

của 1H-indazol có khả năng ức chế FGFR Dẫn chất 2 cho khả năng ức chế mạnh nhất

với giá trị IC50 trên các thụ thể FGFR1-4 tương ứng là 0,9 nM; 2,0 nM; 2,0 nM; 6,1 nM Đặc biệt, dẫn chất này có khả năng ức chế mạnh các dòng tế bào NCI-H1581, SNU-16 với giá trị IC50 nhỏ hơn 0,1 nM (Hình 1.12) [43]

Hình 1.12 Cấu trúc dẫn chất 1, 2 ức chế FGFR

Ức chế IDO1

IDO1 là một enzym đơn phân tử chứa hem, không hoạt động trong hầu hết các mô nhưng hoạt động trong một loạt các bệnh ung thư lâm sàng [24] Năm 2017, nhóm

nghiên cứu của Pradhan N và cộng sự đã báo cáo một dãy chất mang khung 1H-indazol

có khả năng ức chế IDO1 ở ngưỡng µM với giá trị IC50 trong khoảng từ 0,72 µM - 10

µM Trong đó, dẫn chất 3 và 4 cho khả năng ức chế IDO1 mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 0,77 µM; 0,72 µM (Hình 1.13) [38]

Hình 1.13 Cấu trúc dẫn chất 3, 4 ức chế IDO1

Ức chế Pim kinase

Pim kinase bao gồm Pim-1, Pim-2, Pim-3 tham gia điều chỉnh một số con đường truyền tín hiệu cơ bản cho sự hình thành khối u Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Gavara

và cộng sự đã tổng hợp được một loạt dẫn chất pyrrolo[2,3-g]indazol có tác dụng ức chế

Pim kinase Trong số các hợp chất này, hợp chất 5 và 6 có tác dụng ức chế Pim-1 và

và cộng sự đã báo cáo một loạt các dẫn chất 3-(pyrrolopyridin-2-yl)indazol có tác dụng

ức chế Aurora A và thể hiện khả năng chống tăng sinh từ trung bình đến tốt đối với 5 dòng tế bào ung thư (HL60, KB, SMMC-7721, HCT116 và A549) Trong đó hợp chất

7 là hợp chất nổi bật với giá trị IC50 lần lượt là 8,3 nM; 1,3 nM đối với các dòng tế bào HL60 và HCT116 (Hình 1.15) [12]

Ức chế HIF-1α

Biểu hiện quá mức của HIF-1α, được quan sát thấy trong nhiều loại ung thư, chẳng hạn như não, phổi, ung thư vú và tuyến tiền liệt [24] Chun và cộng sự đã tìm ra một dẫn

chất indazol-furan YC-1 (Hình 1.15) ức chế HIF-1α cả in vivo và in vitro [10, 28] Dẫn

chất này được xác định là ức chế xâm lấn và di căn hiệu quả, có thể phát triển thành một

loại thuốc chống ung thư đa năng trong tương lai [29] Lấy ý tưởng từ YC-1, Sheng và

cộng sự đã tiến hành thiết kế các dẫn chất indazol-1,2,4-oxadiazol khác và thu được các dẫn chất ức chế HIF-1α mạnh hơn ngoài ra còn làm giảm đáng kể sự di chuyển của tế

bào SKOV3 [41]

Hình 1.15 Cấu trúc dẫn chất 7, YC-1

1.5 HƯỚNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Dựa vào các nghiên cứu tổng quan về hoạt tính kháng tế bào ung thư của chất ức chế HDAC và dẫn chất indazol, chúng tôi quyết định lựa chọn tổng hợp các chất ức chế

HDAC mang khung 1H-indazol với mục tiêu có hoạt tính kháng tế bào ung thư (Hình

1.16.)

Hình 1.16 Thiết kế các dẫn chất mục tiêu của đề tài

CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

Các dung môi, hóa chất dùng cho phân tích, kiểm nghiệm: đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích Analytical Reagent – AR Các dung môi, hóa chất dùng cho kiểm nghiệm: đạt tiêu chuẩn AR dùng cho tổng hợp hóa dược, được đặt mua từ các nhà cung cấp trong nước hoặc nước ngoài (Sigma-Aldrich hoặc Merch) Một số dung môi dùng để chiết tách, phân lập được mua từ các nhà cung cấp của Trung Quốc Các hóa chất này được

sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:

Các dung môi, hóa chất khác như: nước cất, n-hexan, ethyl acetat, methanol,

dimethylformanid (DMF), dicloromethan, methanol, KI, K2CO3, NaOH

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml và 100 ml có nút mài, bình nón, bình chiết, phễu thủy tinh, pipet, ống đong, cốc có mỏ các loại, cột sắc ký lỏng, sinh hàn hồi lưu

- Silica gel 60, 0,06-0,2 mm

- Bình chạy sắc ký Camag, bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck) để chạy sắc ký lớp mỏng, đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 365 nm

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

- Máy cất quay chân không Buchi R-200, máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC, máy

đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert

- Máy siêu âm

- Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR Affinity − IS, đặt tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

- Máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM (Thermo Scientific), đặt tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng phương pháp ion hóa phun bụi điện từ ESI, dung môi là MeOH, chế độ ESI(+)-HR-MS

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 MHz để ghi phổ 1H-NMR và 13C-NMR, đạt tại khoa Hóa học – trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội

- Tủ nuôi cấy Vision scientific Co Ltd (model VS-9180 MS), tủ làm thực nghiệm (Vision bio-safety clean bench)

- Tủ lạnh giữ môi trường nuôi cấy, bồn làm ấm môi trường nuôi cấy đến 37oC Jeio tech SWB-03, tủ giữ mẫu -18 oC (DIOS)

- Pipet Gilson các loại: 1000, 200, 20, 1-10, 2-20 µl

- Máy đo độ hấp thụ huỳnh quang VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), đặt tại khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy

- Khẳng định cấu trúc các dẫn chất tổng hợp được bằng phổ IR, MS, 1H-NMR,

2.2.2 Thử hoạt tính sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

- Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro trên 3 dòng tế bào ở người bao gồm:

tế bào ung thư đại tràng (SW620), tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PC3), tế bào ung thư vú (MDA-MB-231)

- Thử tác dụng ức chế histon deacetylase

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Hóa học

2.3.1.1 Tổng hợp hóa học

Dựa trên những nguyên tắc, phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tiến hành tổng hợp 5 dẫn chất theo thiết kế Các phản ứng đã được sử dụng bao gồm:

• Phản ứng N-alkyl hóa 5-bromo-1H-indazol

• Phản ứng ghép cặp Heck (xúc tác palladi)

• Phản ứng tạo acid hydroxamic (bằng tác nhân hydroxylamin)

Các phản ứng được theo dõi và kiểm soát bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Độ tinh khiết của sản phẩm được xác định bằng sắc ký lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy sau khi sản phẩm được tinh chế

- Nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

- Sắc ký lớp mỏng: dùng để theo dõi quá trình phản ứng, xác định thời diểm kết thúc phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm sau quá trình tinh chế Sắc ký lớp mỏng được tiến hành:

+ Pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254 được hoạt hóa ở 110℃ trong 30 phút

+ Hệ dung môi pha động tùy thuộc vào chất phân tích

+ Chất phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và đưa lên bản mỏng với thể tích khoảng 2 µl

+ Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi ở điều kiện phòng và để pha động chạy trên bản mỏng Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

2.3.1.3 Khẳng định cấu trúc

Các chất sau tổng hợp và được đánh giá sơ bộ là tinh khiết được xác định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR,

13C-NMR, HSQC, HMBC)

Phổ hồng ngoại (IR): được ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học

- trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm-1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr

đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Phổ được ghi ở độ phân giải 4 cm-1

Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại khoa Hóa học - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và Agilent 6530 Accurate Mass QTOF LC/MS (Agilent technology, Santa Clara, California, United States) – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử dung môi hòa tan là MeOH hoặc MeCN Tùy theo phương pháp bẫy ion ESI (+) hoặc ESI (-) mà ion trên phổ được ghi nhận là dương hay âm

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker

AV-500 MHz tại khoa Hóa học - trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội,

phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz Độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội

tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300 K, dung môi DMSO-d 6

Các phổ 2D-NMR như HMBC và HSQC sử dụng các kỹ thuật xử lý tín hiệu kết hợp phổ 1H-NMR và 13C-NMR thu được trước đó để tái khẳng định cấu trúc của dẫn chất bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân

2.3.2 Thử hoạt tính sinh học

2.3.2.1 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (thử độc tính tế bào) in vitro của các chất đã

tổng hợp, được thực hiện tại khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp SRB [30] và giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probits [26]

Dòng tế bào thử nghiệm

Tế bào ung thư đại tràng (SW620), tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt (PC3),

tế bào ung thư vú (MDA-MB-231) được mua từ ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) bổ sung: L-glutamin, penicillin/streptomycin, amphotericin B, heparin, chất kích thích tăng trưởng tế bào và huyết thanh bào thai bò (FBS), được lấy từ GIBCO Co Ltd (Grand Island, New York, Hoa Kỳ)

Chất đối chiếu dương tính: acid suberoylanilid (SAHA) và adriamycin (ADR)

bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là nhỏ hơn 0,1%

Bước 2: Cố định tế bào và nhuộm màu

Các tế bào được cố định bằng những lớp mỏng 50 µl dung dịch tricloroacetic 50% lạnh lên trên môi trường nuôi cấy trong mỗi đĩa và được ủ ở 4ºC trong 1 giờ để tế bào

tự tái tạo, rồi sau đó rửa 5 lần với nước cất, loại bỏ phần nước dư

Các đĩa được để khô trong không khí và được nhuộm với sulforhodamin B (SRB) 0,04% trong acid acetic 1% Thời gian nhuộm là 30 phút rồi rửa bằng acid acetic 1% để loại thuốc nhuộm tự do, không kết dính Loại bỏ hết acid acetic còn dư và để các đĩa khô ngoài không khí

Bước 3: Đo độ hấp thụ màu

Các đĩa sau khi được để khô ở nhiệt độ phòng, phần thuốc nhuộm còn dính lại sẽ được hòa tan bằng 100 ml dung dịch chứa 10 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan 21 không đệm (pH 10,5), đồng thời đặt đĩa trong máy lắc khoảng 10 phút Độ hấp thụ được

đo ở bước sóng 510 nm

Xử lý số liệu

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (mẫu trắng là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Giá trị này được tính bằng

phần mềm GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ) theo phương pháp

Probits và kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần thử nghiệm độc lập với độ lệch chuẩn không quá 10%

2.3.2.2 Thử tác dụng ức chế histon deacetylase

Thử tác dụng ức chế histon deacetylase của các chất đã tổng hợp, được thực hiện tại khoa Dược, trường Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp huỳnh quang

Nguyên tắc

Thử tác dụng ức chế enzym HDAC trên hỗn hợp HDAC tổng tách từ tế bào Hela được thực hiện bằng phương pháp huỳnh quang với bộ Fluorogenic HDAC Assay Kit (Enzo Life Sciences Inc.) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Các HDAC ở đây có tác dụng xúc tác cho quá trình phân cắt nhóm acetyl từ acetyllysin trong protein được biến tính Trong phép thử này, các phân tử thuốc nhuộm huỳnh quang được gắn vào một peptid có chứa acetyllysin cùng với các peptid có tác dụng làm tắt huỳnh quang Sau khi

xử lý các peptid với các HDAC, phản ứng được trộn lẫn với một dung dịch riêng của nhà sản xuất nhằm phát hiện các peptid có chứa lysin bị cắt nhóm acetyl Nếu lysin bị cắt nhóm acetyl bởi HDAC, dung dịch này sẽ giải phóng thuốc nhuộm có phát huỳnh quang do đó khả năng huỳnh quang sẽ đánh giá được hoạt tính của enzym HDAC Thành phần của kit định lượng HDAC bao gồm: HDAC tổng chiết từ tế bào Hela,

cơ chất phát quang HDAC, chất khai triển định lượng HDAC (HDAC Assay Developer) (2x), trichostatin A, dung dịch đệm HDAC buffer

Cách tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử

Trước khi tiến hành đánh giá tác dụng ức chế HDAC, các mẫu thử nghiệm dạng bột được hòa tan trong dimethyl sulfoxid (DMSO) để tạo dung dịch gốc nồng độ 10mg/ml Các dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) không có huyết thanh để tạo các dung dịch ở nồng độ 0,01; 0,03; 0,1; 0,3 µg/ml Nồng độ DMSO cuối cùng không vượt quá 0,1% và mẫu đối chứng DMSO được thêm vào một nhóm lỗ thử để có nồng độ DMSO đúng bằng nồng độ DMSO ở các lỗ có mẫu thử

Thêm lần lượt các chất sau vào trong các giếng thử:

+ Dung dịch gốc của nhà sản xuất: 5 µl cơ chất phát huỳnh quang HDAC Fluorogenic (200 µM) + 5 µl BSA (1 mg/ml) + 30 µl dung dịch đệm HDAC Assay Buffer

+ 5 ml dung dịch của các chất cần đánh giá (Test Inhibitor) đã được chuẩn bị sẵn như trên Đối với giếng chứa chất chứng dương (Positive Control) và mẫu trắng (Blank), thêm 5 ml dung dịch tương tự mà không chứa chất ức chế gọi là dung dịch đệm ức chế (Inhibitor Buffer) Thêm 5 µl dung dịch pha loãng Trichostatin A (20 µM) vào giếng chứng ức chế (Inhibitor Control)

+ 5 ml HDAC Assay Buffer vào các giếng trắng (Blank)

+ Bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 5 µl enzym HDAC pha loãng (1 ng/µl) vào các giếng chứng dương (Positive Control), giếng các chất cần đánh giá (Test Inhibitor)

và giếng chất chứng ức chế (Inhibitor Control) Ủ ở 37ºC trong 30 phút

Bước 2: Tiến hành thử

Thêm 50 µl HDAC Assay Developer (2x) vào mỗi giếng

Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 phút

Bước 3: Đọc kết quả

Đọc kết quả của mẫu trong máy đo hấp thụ huỳnh quang VICTOR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA), có khả năng kích thích ở bước sóng trong khoảng 360 nm và phát hiện bước sóng phát ra trong khoảng 460 nm (độ hấp thụ được đo 2 lần ở mỗi bước sóng) Giá trị của giếng trắng (Blank) được trừ khỏi tất cả các giá trị khác Kết quả độ hấp thụ (của 2 lần thí nghiệm) được đưa vào phần mềm excel tính toán để thu được phần trăm trung bình mẫu thử gắn với HDAC Giá trị IC50 được tính bằng GraphPad Prism 5.0 (Phần mềm GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ) bằng phương pháp xây dựng đường cong biểu thị quan hệ giữa phần trăm tế bào sống và logarit của nồng độ chất thử Độ lệch chuẩn tương đối không quá 10%

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hợp hóa học

Các dẫn chất 1H-indazol-5-yl-N-hydroxyacrylamid mục tiêu (IVa-e) được tổng

hợp qua 3 bước như mô tả trong sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp các dẫn chất IVa-e 3.1.1.1 Tổng hợp dẫn chất (E)-3-(1-benzyl-1H-indazol-5-yl)-N-hydroxyacrylamid (IVa)

a Tổng hợp chất trung gian 1-benzyl-5-bromo-1H-indazol (IIa)

Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng hợp chất trung gian IIa

Tiến hành phản ứng

Cân 783,6 mg 5-bromo-1H-indazol (I) (4,0 mmol) vào bình cầu đáy tròn sạch dung

tích 50 ml, thêm 15 ml DMF để hòa tan Sau đó thêm K2CO3 (685 mg, 5,0 mmol, 1,25 đương lượng) trong DMF (15 ml), khuấy và đun nóng hỗn hợp ở 80oC Sau 60 phút, thêm KI (33,2 mg, 0,2 mmol, 0,5 đương lượng) Sau khi khuấy thêm 15 phút, thêm từ

từ benzylbromid (679,8 mg, 4,0 mmol, 1 đương lượng) đã được pha loãng với DMF (2 ml) vào hỗn hợp phản ứng Hỗn hợp phản ứng tiếp tục được khuấy ở 60oC trong khoảng

6 giờ Phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Xử lý phản ứng

Sau khi phản ứng kết thúc, kết tủa sản phẩm bằng cách đổ hỗn hợp thu được vào

đá nước cất Tiến hành lọc, rửa tủa với nước cất và sấy chân không ở khoảng 40oC trong

24 giờ Sản phẩm N-alkyl hóa của 5-bromo-1H-indazol với benzylbromid tạo ra hỗn hợp sản phẩm gồm 2 đồng phân: N-1, N-2 Sản phẩm sau đó được tinh chế bằng sắc ký cột gradient với hệ dung môi pha động EA - n-hexan (10-40% EA), thu đồng phân N-1

Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt

- Hiệu suất: 40,6% (464,5 mg)

b Tổng hợp chất trung gian ethyl (E)-3-(1-benzyl-1H-indazol-5-yl)acrylat (IIIa)

Sơ đồ 3.3.Phản ứng tổng hợp chất trung gian IIIa

Tiến hành phản ứng

Hòa tan 464,5 mg (1,6 mmol) 1-benzyl-5-bromo-1H-indazol (IIa) vào 10 ml DMF

trong bình cầu sạch đáy tròn dung tích 50 ml sau đó thêm triethylamin khan (0,5 ml) và ethyl acrylat (0,5 ml) Sau khi khuấy 15 phút, thêm dung dịch chứa triphenylphosphin (105 mg, 0,4 mmol trong 0,5 ml DMF) và palladium diacetat (45 mg, 0,2 mmol) vào hỗn hợp phản ứng Tiến hành khuấy ở nhiệt độ 110oC trong 10 giờ Phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Xử lý phản ứng

Hỗn hợp phản ứng được làm nguội đến nhiệt độ phòng, sau đó đổ vào đá nước cất Lọc lấy chất rắn và sấy chân không ở 40oC trong 24 giờ Chất rắn thu được được tinh chế bằng sắc ký cột với silica gel, chạy đẳng dòng hệ dung môi DCM:MeOH = 100:5

Tiến hành phản ứng

Hòa tan 323,5 mg (1,0 mmol) ethyl (E)-3-(1-benzyl-1H-indazol-5-yl)acrylat vào 10

ml methanol Thêm tiếp hydroxylamin.HCl (685 mg, 10,0 mmol), khuấy hỗn hợp này ở nhiệt độ 0oC trong 15 phút Sau đó thêm từ từ từng giọt dung dịch NaOH (400 mg trong

1 ml nước) đến khi hỗn hợp phản ứng có pH 11 Hỗn hợp này được theo dõi pH và khuấy ở 0oC đến khi phản ứng kết thúc (1-2 giờ) Phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng (TLC), hệ dung môi DCM:MeOH:AcOH = 90:5:1

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp dẫn chất IVb

a Tổng hợp chất trung gian 5-bromo-1-(2-fluorobenzyl)-1H-indazol (IIb)

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian IIa: sử dụng 783,5 mg (4,0 mmol) chất đầu I và 751,5 mg (4,0 mmol) 1-(bromomethyl)-2-fluorobenzen thu được 502,2 mg sản phẩm IIb

Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt

- Hiệu suất: 41,3% (502,2 mg)

b Tổng hợp chất trung gian ethyl (E)-3-(1-(2-fuorobenzyl)-1H-indazol-5-yl)acrylat

Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp dẫn chất IVc

a Tổng hợp chất trung gian 5-bromo-1-(3-fluorobenzyl)-1H-indazol (IIc)

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian IIa: sử dụng 783,8 mg (4,0 mmol) chất đầu I và 751,6 mg (4,0 mmol) 1-(bromomethyl)-3-fluorobenzen thu được 494,9 mg sản phẩm IIc

Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt

- Hiệu suất: 40,7% (494,9 mg)

b Tổng hợp chất trung gian ethyl (E)-3-(1-(3-fuorobenzyl)-1H-indazol-5-yl)acrylat

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp dẫn chất IVd

a Tổng hợp chất trung gian 5-bromo-1-(4-fluorobenzyl)-1H-indazol (IId)

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian IIa: sử dụng 783,5 mg (4,0 mmol) chất đầu I và 751,5 mg (4,0 mmol) 1-(bromomethyl)-4-fluorobenzen thu được 498,6 mg sản phẩm IId

Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt

- Hiệu suất: 41,0% (498,6 mg)

b Tổng hợp chất trung gian ethyl (E)-3-(1-(4-fuorobenzyl)-1H-indazol-5-yl)acrylat

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất IVe

a Tổng hợp chất trung gian 5-bromo-1-(4-methylbenzyl)-1H-indazol (IIe)

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian IIa: sử dụng 783,8 mg (4,0 mmol) chất đầu I và 736,0 mg (4,0 mmol) 1-(bromomethyl)-4-methylbenzen thu được 501,7

mg sản phẩm IIe

Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu vàng nhạt

- Hiệu suất: 41,8% (501,7 mg)

b Tổng hợp chất trung gian ethyl (E)-3-(1-(4-methylbenzyl)-1H-indazol-5-yl)acrylat

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các dẫn chất IVa-e sau khi được tổng hợp và tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết

bằng hai phương pháp: sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo nhiệt độ nóng chảy Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1 dưới đây

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 với 3 hệ dung môi DCM:MeOH = 9:1; DCM:MeOH = 15:1; DCM:MeOH:AcOH = 90:5:1

Sắc ký đồ được quan sát bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Kết quả cho thấy

các dẫn chất IVa-e đều có vết tròn, gọn, rõ, không có vết phụ

Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy

Các chất sau khi được tinh chế đều ở trạng thái rắn, do đó có thể kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy với máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt

điện Kết quả cho thấy các dẫn chất IVa-e đều có nhiệt độ nóng chảy xác định (khoảng

dao động hẹp, 1-2oC)