TỔNG QUAN
Tổng quan về bệnh Parkinson
1.2.1 Sơ lược về lịch sử hình thành bệnh Parkinson
Năm 1817, James Parkinson mô tả lần đầu tiên các dấu hiệu và triệu chứng phổ biến của bệnh Parkinson, bao gồm run rẩy, co cứng cơ và khó khăn trong vận động Vào giữa thế kỷ XIX, Jean Martin Charcot đã phân biệt bệnh Parkinson khỏi các rối loạn liên quan như đa xơ cứng, đặc biệt là chú ý đến hiện tượng tăng trương lực cơ và nhận định rằng bệnh không liên quan đến lão hóa, mà là một bệnh của tuổi già Ông đã đề xuất đặt tên chính thức cho bệnh là Parkinson, góp phần quan trọng trong việc chẩn đoán và hiểu biết về căn bệnh này.
Năm 1912, Lewy đã mô tả các thể vùi trong thần kinh là các thể vùi trong bào tương của tế bào thần kinh ở bệnh nhân Parkinson, đánh dấu bước đầu trong việc nhận diện các dạng tổn thương não liên quan đến bệnh Đến năm 1919, Tretiakoff đã mô tả rõ hơn về các thể Lewy này, góp phần làm sáng tỏ đặc điểm sinh học của bệnh Parkinson và mở ra hướng nghiên cứu mới trong chẩn đoán và điều trị.
Các tổn thương ở liềm đen liên quan chặt chẽ đến hiện tượng mất sắc tố ở khu vực này, thể hiện mối liên hệ giữa quá trình tổn thương và bệnh Parkinson Đến cuối những năm 1950, các nhà nghiên cứu nhận định rằng bệnh Parkinson bắt nguồn từ sự mất cân bằng giữa dopamine và acetylcholin trong thể vân, góp phần vào các triệu chứng đặc trưng của bệnh.
Bệnh Parkinson (PD) là bệnh rối loạn thoái hóa thần kinh phổ biến thứ hai sau Alzheimer, thường khởi phát ở độ tuổi từ 65 đến 70 tuổi Tỉ lệ mắc bệnh PD tăng theo tuổi, ảnh hưởng đến khoảng 1% dân số trên 60 tuổi, với tỷ lệ dao động từ 20% đến 40% tùy theo quy mô nghiên cứu Tỷ lệ mắc chứng mất trí nhớ liên quan đến PD cũng gia tăng theo thời gian mắc bệnh, từ 3% đến 30% trong vòng 5 năm hoặc ít hơn và có thể lên tới 80% sau 20 năm Nam giới có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn nữ giới gấp ba lần, phần lớn do ảnh hưởng của estrogen đối với các tế bào thần kinh truyền dẫn và các tín hiệu trong não Ở Việt Nam, chưa có số liệu chính thức về số người mắc Parkinson, tuy nhiên, do sử dụng nhiều chất diệt cỏ và trừ sâu, dự kiến tỷ lệ mắc bệnh sẽ cao hơn so với các quốc gia khác.
Tỷ lệ mới phát hiện bệnh Parkinson ngày càng tăng, đặc biệt liên quan chặt chẽ đến tuổi tác, với tỷ lệ tăng dần ở người cao tuổi Dự kiến đến năm 2040, số ca mắc Parkinson trên toàn cầu sẽ đạt tới 14,2 triệu trường hợp, phản ánh sự gia tăng đáng kể của bệnh trong cộng đồng dân cư già.
1.2.3 Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ
Bệnh Parkinson (PD) là một bệnh thoái hóa thần kinh phức tạp, hình thành từ cơ chế bệnh lý tổng hợp, chịu tác động của yếu tố di truyền và môi trường Mặc dù nguyên nhân chính xác của bệnh vẫn chưa được làm rõ hoàn toàn, nghiên cứu cho thấy sự chết của tế bào thần kinh trong hệ thống tiết dopamine đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển bệnh Các biến thể di truyền có thể làm trầm trọng thêm ảnh hưởng của chất độc thần kinh từ môi trường, và độc tố môi trường cũng có thể gây rối loạn biểu hiện của các gen liên kết với PD, góp phần vào sự phát triển bệnh.
Kể từ năm 1997, nhiều biến đổi trên các gen đã được xác định là nguyên nhân gây Parkinson Đột biến di truyền đầu tiên được biết đến nằm trên gen α-synuclein (SNCA), mở đầu cho các nghiên cứu về di truyền học của bệnh Hiện tại, các nhà khoa học đã phát hiện được 27 gen có ảnh hưởng đến bệnh Parkinson, nằm trên nhiễm sắc thể thường hoặc nhiễm sắc thể giới tính Trong số này, gen Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) là một trong những gen di truyền dạng trội có tác động đáng chú ý nhất đến bệnh Parkinson.
(LRRK2), Glycosylceramidase beta (GBA) và 4 gen gây di truyền dạng lặn của nhiễm
9 sắc thể thường: Parkin, Kinase 1 (PINK1), PARK7 (DJ-1), và ATPase type 13A2
Theo nghiên cứu năm 2022 của Trần Tín Nghĩa, tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh Parkinson có đột biến gen là 8,57%, trong đó đột biến gen PARK7 chiếm 2,86% Cũng theo nghiên cứu, 91,43% bệnh nhân không có đột biến gen Trong số các bệnh nhân Parkinson có đột biến, đã ghi nhận 2 trường hợp có đột biến dị hợp tử trên gen SNCA và 1 trường hợp có đột biến dị hợp tử trên gen PARK7, cho thấy sự đa dạng trong các loại đột biến liên quan đến bệnh Parkinson.
Các yếu tố môi trường như chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, kim loại nặng, nơi cư trú tại khu vực nông thôn hoặc gần khu vực nông nghiệp, sử dụng nước giếng và tiền sử bị chấn thương đầu nhiều lần đều liên quan đến nguy cơ mắc bệnh Parkinson Nhiều độc tố khác nhau đã được chứng minh có thể liên quan đến sự phát triển của bệnh Parkinson, chẳng hạn như trường hợp năm 1982 ở California, Mỹ, khi những người nghiện heroin tổng hợp bị nhiễm độc MPTP và xuất hiện các triệu chứng của hội chứng Parkinson Ô nhiễm không khí cũng được xác định là một yếu tố nguy cơ, có thể gây tổn thương thần kinh trực tiếp, gây viêm hệ thống thần kinh trung ương, và làm thay đổi sinh lý đường ruột cùng hệ vi sinh vật, góp phần gia tăng nguy cơ mắc bệnh Parkinson.
Tuổi tác được xem là yếu tố nguy cơ chính trong sự phát triển và tiến triển của bệnh Parkinson, vì quá trình lão hóa ảnh hưởng đến các quá trình dẫn đến thoái hóa thần kinh Lão hóa gây ra những thay đổi trong chức năng tế bào và cơ chế bệnh sinh của Parkinson, bao gồm rối loạn chức năng ty lạp thể, tăng sản xuất gốc tự do và stress oxy hóa Những yếu tố này có thể dẫn đến mất ổn định gen, đột biến DNA và rút ngắn telomere, làm giảm khả năng sống sót của tế bào thần kinh và gia tăng nguy cơ mắc bệnh Parkinson.
1.2.4 Vai trò của stress oxy hóa trong bệnh Parkinson
Oxy là nguyên tố không thể thiếu cho sự sống, góp phần duy trì các quá trình sinh học quan trọng của tế bào Khi các tế bào sử dụng oxy để tạo năng lượng thông qua quá trình sản xuất ATP trong ty thể, các sản phẩm phụ như các gốc tự do oxy phản ứng (ROS) và nitro phản ứng (RNS) được hình thành, đặc biệt trong quá trình oxy hóa khử tế bào Ở nồng độ thấp hoặc trung bình, ROS đóng vai trò có lợi trong phản ứng của tế bào và chức năng miễn dịch, giúp thúc đẩy sự trưởng thành của các cấu trúc tế bào Tuy nhiên, khi nồng độ ROS tăng cao, chúng gây ra stress oxy hóa, một yếu tố quan trọng trong sự phát triển của các bệnh mạn tính và thoái hóa như ung thư, viêm khớp, lão hóa, rối loạn tự miễn dịch, bệnh tim mạch và đặc biệt là thoái hóa thần kinh.
Cơ thể con người có cơ chế chống lại stress oxy hóa bằng cách tạo ra các chất chống oxy hóa, được sản xuất nội sinh hoặc bổ sung từ thực phẩm và các chất bổ sung bên ngoài, giúp bảo vệ tế bào khỏi tác động gây hại của các gốc tự do [67].
Stress oxy hóa là kết quả của sự mất cân bằng giữa quá trình hình thành và trung hòa các ROS, gây tổn thương nghiêm trọng cho nhiều cơ quan như gan, thận, đặc biệt là não thông qua quá trình peroxy hóa lipid Quá trình này làm hỏng màng sinh học, thay đổi cấu trúc protein, hormon và enzym, đồng thời liên quan đến quá trình lão hóa và các bệnh lý thần kinh như Parkinson, Alzheimer và đa xơ cứng Stress oxy hóa dẫn đến sự hình thành các hợp chất độc tế bào như malondialdehyd (MDA), gây đột biến và tổn thương tế bào Trong các bệnh thần kinh như Parkinson, quá trình chuyển hóa dopamin liên quan chặt chẽ với stress oxy hóa, vì sự thoái hóa dopamin tạo ra oxy phản ứng và các chất độc thần kinh nội sinh, trong khi một số dẫn xuất của quá trình này còn có tác dụng chống oxy hóa.
1.2.5 Chất dẫn truyền thần kinh dopamin và protein α - synuclein
Dopamin (DA) là một chất dẫn truyền thần kinh quan trọng trong việc kiểm soát các cử động và các chức năng sinh lý thiết yếu khác Được đặt tên dựa trên nguồn gốc là monoamin có tiền chất là levodopa (L-DOPA), dopamine đóng vai trò chủ đạo trong hệ thống thần kinh trung ương Hàm lượng dopamine giảm hoặc rối loạn chức năng dopamine liên quan đến sự xuất hiện của các triệu chứng vận động trong bệnh Parkinson, gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng cuộc sống của người bệnh.
DA được tổng hợp từ acid amin L-Tyrosin L-Tyrosin được chuyển đổi thành L-
DOPA được tổng hợp nhờ enzyme tyrosin hydroxylase (TH) sử dụng tetrahydrobiopterin, O2 và ion Fe2+ Sau đó, L-DOPA chuyển đổi thành dopamine nhờ enzyme decarboxylase acid amin thơm (AADC) và pyridoxal phosphate Quá trình oxy hóa dopamine dẫn đến formation của dopamine quinon, có thể góp phần vào quá trình thoái hóa thần kinh Dopamine quinon có khả năng biến đổi cộng hóa trị các nucleophil của tế bào, gồm glutathion (GSH) – chất chống oxy hóa chính của não – và các gốc protein cysteinyl, đóng vai trò quan trọng trong sự tồn tại của tế bào Chu kỳ oxy hóa dopamine quinon tạo thành aminochrom, một chất có tính phản ứng cao, gây ra sự hình thành superoxid và làm cạn kiệt NADPH của tế bào Aminochrom có thể tạo thành các sản phẩm phụ với các protein như alpha-synuclein, góp phần vào quá trình thoái hóa thần kinh và bệnh Parkinson.
Tổng quan về ruồi giấm
Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) đã trở thành mẫu sinh vật thí nghiệm quan trọng trong các nghiên cứu về di truyền học từ đầu thế kỷ 20 Hiện nay, loài ruồi này được sử dụng rộng rãi không chỉ trong di truyền học cổ điển và phân tử mà còn trong các kỹ thuật sinh hóa, sinh học tế bào và sinh lý học để nghiên cứu các vấn đề phức tạp như sinh học phát triển và sinh học thần kinh.
1.3.1 Hệ gen của ruồi giấm
Hệ gen của ruồi giấm chứa khoảng 132 triệu cặp base, gồm 15.500 gen nằm trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính So sánh dữ liệu bộ gen người và ruồi giấm cho thấy khoảng 75% gen liên quan đến bệnh ở người có gen tương đồng và bảo tồn ở ruồi giấm Nhờ sự tương đồng di truyền này, ruồi giấm được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu các cơ chế phân tử của bệnh ở người và phát triển mô hình để sàng lọc thuốc.
Chu kỳ phát triển của ruồi giấm gồm bốn giai đoạn chính: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành, với thời gian diễn ra phụ thuộc vào điều kiện môi trường Trứng nở sau 12-15 giờ ở nhiệt độ 25°C thành ấu trùng nhỏ màu trắng, sau đó chúng ăn thức ăn và phát triển trong gần 4 ngày, lột xác hai lần để thành ấu trùng bậc 2 và bậc 3 Tiếp theo, ấu trùng đóng kén trong nhộng và trải qua quá trình biến đổi kéo dài 4 ngày, sau đó xuất hiện ruồi trưởng thành Thời gian vòng đời của ruồi giấm tăng lên cùng với mức nhiệt độ do tác động của ứng suất nhiệt.
Hình 1 6 Chu kỳ vòng đời ruồi giấm
1.3.3 Ứng dụng mô hình ruồi giấm trong nghiên cứu
Hiện nay, mô hình ruồi giấm đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu các bệnh ở người nhờ vào những đặc điểm nổi bật của nó Ruồi giấm có khả năng sinh sản nhanh, chu kỳ phát triển ngắn và dễ di truyền các đặc điểm, giúp các nhà khoa học dễ dàng thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu gene và bệnh lý Những đặc điểm này khiến ruồi giấm trở thành một mô hình sinh học phù hợp để nghiên cứu các cơ chế bệnh lý, từ đó góp phần phát triển phương pháp điều trị hiệu quả hơn cho bệnh ở người [81].
Ruồi giấm có chu trình phát triển ngắn, hoàn chỉnh chỉ trong vòng chưa đầy 10 ngày ở nhiệt độ 25°C Điều này giúp rút ngắn thời gian nghiên cứu về quá trình sinh trưởng của loài ruồi giấm từ phôi, ấu trùng, nhộng đến khi thành ruồi trưởng thành Chính vì vậy, ruồi giấm là loài côn trùng thích hợp cho các nghiên cứu sinh học nhanh chóng và hiệu quả.
- Ruồi giấm có kích thước nhỏ, có thể nuôi và nhân lên với số lượng lớn trong thời gian ngắn, phục vụ cho nghiên cứu
Hệ thần kinh của ruồi giấm vừa đủ phức tạp để phục vụ các nghiên cứu về thần kinh và hành vi liên quan đến con người, đồng thời vẫn nhỏ gọn cho các phân tích cấu trúc và chức năng chuyên sâu Nhiều gen của ruồi giấm có độ tương đồng cao với các gen liên quan đến bệnh Parkinson, giúp nghiên cứu cơ chế bệnh lý dễ dàng hơn Đây là lý do tại sao ruồi giấm trở thành mô hình quan trọng trong nghiên cứu thần kinh và bệnh neurodegenerative.
Các nghiên cứu đã xác định được các gen liên quan đến bệnh Parkinson như Parkin, UCH-L1, PINK, LRRK2, và DJ-1 [1] Mô hình ruồi giấm nghiên cứu Parkinson đã được phát triển thông qua các phương pháp như knockdown, đột biến hoặc biểu hiện quá mức của các gen này [28], giúp hiểu rõ về cơ chế bệnh lý Ruồi giấm có hệ thần kinh vận động khá phát triển, gồm các hệ thống tế bào thần kinh sinh dopamin riêng biệt, đặc biệt là trong não ấu trùng gồm ba cụm chính: DM (dorsomedial neurons), DL1 và DL2, phù hợp để nghiên cứu các quá trình liên quan đến bệnh Parkinson.
(dorsolateral neurons); trên não trưởng thành: PAL (dorsolateral anterior protocerebral neurons), PAM (dorsomedial anterior protocerebral neurons), PPM1/2, PPM3 (dorsomedial posterior protocerebral neurons), PPL1, PPL2 (dorsolateral posterior protocerebral neurons) [54]
Hình 1 7 Sơ đồ các cụm tế bào thần kinh sản sinh dopamin ở não ruồi giấm [29]
A, C: Sơ đồ (A) và ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang (C) các cụm tế bào thần kinh sản sinh dopamin trên não ấu trùng bậc 3
B, D: Sơ đồ (B) và ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang (D) các cụm tế bào thần kinh sản sinh dopamin trên não ruồi trưởng thành
Mô hình ruồi giấm đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu các bệnh liên quan đến gen trên người nhờ vào những ưu điểm nổi bật của nó Hệ thống điều hòa biểu hiện gen GAL4/UAS là công cụ chính để điều chỉnh sự biểu hiện protein mục tiêu tại các mô và cơ quan đặc biệt, giúp nghiên cứu gen và chức năng của chúng một cách chính xác và hiệu quả.
Mô hình ruồi giấm có nhiều ưu điểm nổi bật trong nghiên cứu khoa học, tuy nhiên cũng tồn tại một số nhược điểm đáng lưu ý Cấu trúc giải phẫu não và các cơ quan của ruồi giấm khá khác biệt so với con người, gây hạn chế trong việc áp dụng kết quả cho y học Bên cạnh đó, khả năng sinh sản của ruồi giấm còn bị ảnh hưởng bởi điều kiện nhiệt độ của môi trường, ảnh hưởng đến quá trình nghiên cứu và kiểm soát nhân giống.
1.3.3.1 Hệ thống điều hòa biểu hiện gen GAL4/UAS
Hệ thống GAL4/UAS có nguồn gốc từ nấm men Saccharomyces cerevisiae, lần đầu tiên được sử dụng bởi Brand và Perrimon vào năm 1993, là công cụ quan trọng trong kỹ thuật gene trên mô hình ruồi giấm Hệ thống này cho phép biểu hiện các trình tự mã hóa protein hoặc không mã hóa protein như dsRNA trong cơ chế RNAi, hỗ trợ nghiên cứu sinh học chính xác và hiệu quả hơn.
Hệ thống GAL4/UAS gồm hai thành phần chính: dòng điều khiển (Driver line) và dòng đáp ứng (Responder line), trong đó dòng điều khiển chứa gen GAL4 mã hóa protein điều hòa biểu hiện gen và dòng đáp ứng chứa gen đích được điều hòa bởi trình tự UAS Tùy thuộc vào vị trí muốn biểu hiện, người ta chọn dòng driver mang promoter đặc hiệu mô như ELAV cho não hoặc GMR cho mắt, giúp kiểm soát chính xác sự biểu hiện của protein Gen GAL4, gồm 881 amino acid, hoạt động như một nhân tố điều hòa gen, kết hợp với trình tự UAS để kích hoạt phiên mã gen đích Thông thường, gen GAL4 và phức hợp UAS–gen đích nằm trong hai dòng riêng biệt; khi hai dòng này lai với nhau, gen đích sẽ được biểu hiện trong thế hệ con, cung cấp phương pháp điều khiển biểu hiện gen hiệu quả trong nghiên cứu sinh học.
Trong thí nghiệm, 2 dòng ruồi được lai với nhau để tạo dòng con lai F1 mang cả
Hệ thống trình tự gen GAL4 và UAS cho phép kiểm soát chính xác việc biểu hiện gen đích ở các mô xác định, nhờ đó protein GAL4 được biểu hiện tại các mô mong muốn qua promoter định hướng mô GAL4 sau đó sẽ liên kết với vùng trình tự UAS nằm phía trước gen đích để hoạt hóa quá trình phiên mã, giúp điều chỉnh sự biểu hiện của gen một cách chính xác và hiệu quả Việc áp dụng hệ thống này hạn chế tình trạng biểu hiện quá mức của gen tại nhiều mô khác nhau, từ đó giảm thiểu tác động tiêu cực đến sức sống của các dòng ruồi.
Nghiên cứu này sử dụng mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson, giúp hiểu rõ quá trình tiến triển của bệnh Mô hình được xây dựng bằng cách biểu hiện protein α-synuclein tại mô não của ruồi thông qua hệ thống biểu hiện gen GAL4/UAS, tạo ra mô hình mô phỏng các đặc điểm của Parkinson Đồng thời, dòng ruồi biểu hiện protein GFP (Green Fluorescent Protein) được sử dụng làm nhóm sinh lý để theo dõi và phân tích các thay đổi sinh lý trong quá trình nghiên cứu.
Hình 1 8 Sử dụng hệ thống GAL4/UAS tạo mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson
1.3.3.2 Mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson
Bệnh Parkinson là một loại rối loạn thoái hóa thần kinh Ruồi giấm có các loại chất dẫn truyền thần kinh như GABA, glutamat, dopamin, serotonin và acetylcholin
[28] Một số gen đã được sử dụng để gây mô hình ruồi giấm bệnh Parkinson như:
SNCA, PINK1, Parkin, DJ-1 và LRRK2 [1]
Các nghiên cứu gần đây cho thấy, gen SNCA mã hóa protein α-synuclein là một trong những yếu tố di truyền chính góp phần gây bệnh Parkinson Các dòng ruồi chuyển gen UAS-SNCA đã được sử dụng để nghiên cứu vai trò của gen này trong quá trình phát triển và tiến triển của bệnh Nhờ vào các mô hình này, các nhà khoa học có thể hiểu rõ hơn về cơ chế bệnh lý liên quan đến α-synuclein và tìm kiếm các phương pháp điều trị tiềm năng Gen SNCA đóng vai trò then chốt, đặc biệt trong việc nghiên cứu các yếu tố di truyền liên quan đến bệnh Parkinson, mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu y học.
HSNCA WT và UAS-HSNCA E46K được tạo ra bằng phương pháp lai tạo, trong đó gen SNCA được biểu hiện quá mức trong não ruồi nhờ hệ thống GAL4/UAS Sự quá mức của gene α-synuclein dẫn đến giảm rõ rệt tuổi thọ và khả năng leo trèo của ruồi Nghiên cứu trên ruồi chuyển gen cho thấy hoạt động của các enzym chống oxy hóa giảm đáng kể, trong khi các dấu hiệu oxy hóa và hoạt động của enzym AChE tăng rõ rệt, cho thấy sự rối loạn sinh lý do tích tụ protein α-synuclein.
Nghiên cứu của Nguyễn Trọng Tuệ và cộng sự năm 2021 sử dụng hệ thống
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị
Cao chiết ethanol 90% từ bộ phận trên mặt đất của Thạch tùng đuôi ngựa (Huperzia phlegmaria) đạt hiệu suất chiết 19,27% Dược liệu này được sử dụng trong nghiên cứu thuộc dự án hợp tác nghiên cứu sàng lọc dược liệu có khả năng ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị bệnh suy giảm trí nhớ Dự án này do Ngân hàng Thế giới tài trợ từ năm 2017 đến 2019, với PGS.TS Phạm Thị Nguyệt Hằng của Viện Dược liệu là chủ nhiệm.
Quy trình chiết TTĐN bắt đầu bằng việc sấy khô và xay thô mẫu nguyên liệu, sau đó ngâm với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng trong hai lần, mỗi lần kéo dài 5 ngày để tối ưu hóa quá trình chiết xuất Các dung dịch chiết sau đó được hợp nhất để nâng cao hiệu suất thu hồi hoạt chất Cuối cùng, dung môi ethanol được thu hồi dưới áp suất giảm đến cạn để tái sử dụng, đảm bảo quy trình chiết xuất hiệu quả và an toàn.
2.1.2 Chủng ruồi giấm phục vụ nghiên cứu
Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) sử dụng trong thí nghiệm được cung cấp bởi GS Masamitsu Yamaguchi, Viện Công nghệ Kyoto, Nhật Bản với 3 dòng:
- Dòng driver: ruồi giấm định hướng biểu hiện protein GAL4 tại mô não Ký hiệu: ELAV-GAL4 (mã số #8760)
- Dòng bệnh: ruồi giấm chuyển gen SNCA mã hóa cho protein alpha-synuclein mang đột biến A30P của người Ký hiệu: UAS-SNCA/A30P (mã số #33804)
- Dòng sinh lý: ruồi giấm mang gen biểu hiện protein GFP Ký hiệu: UAS-mCD8- GFP (mã số #108068)
2.1.3 Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu
Bảng 1 2 Hóa chất và thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Nguồn gốc STT Tên hóa chất Nguồn gốc
1 1-octanol Nhật Bản 9 Sữa bột Việt Nam
2 N-amyl acetat Nhật Bản 10 PBS 1X Trung Quốc
3 Agar Nhật Bản 11 Nấm men Pháp
4 Acid propionic Đức 12 Ether Trung Quốc
5 Tween Trung Quốc 13 Nước cất Việt Nam
6 Dầu parafin Trung Quốc 14 Nước RO Việt Nam
7 Methanol Trung Quốc 15 Đường sucrose Trung Quốc
8 Natri benzoat Trung Quốc Một số hóa chất khác
Bảng 1 3 Dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc
1 Cân phân tích Mettler Toledo, Mỹ
2 Chai, ống thủy tinh để đựng thức ăn, nuôi ấu trùng Việt Nam
4 Đĩa petri 90mm, nắp đục lỗ Việt Nam
5 Đồng hồ bấm giờ Nhật Bản
6 Máy quay phim Nhật Bản
9 Lò vi sóng Thụy Điển
11 Máy ly tâm lạnh Đức
16 Tủ lạnh âm sâu Nhật Bản
Một số dụng cụ, thiết bị khác
Phương pháp nghiên cứu
Hình 2 1 Thiết kế nghiên cứu
2.2.1 Quy trình chuẩn bị ruồi phục vụ nghiên cứu
2.2.1.1 Nhân dòng ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson và dòng chứng sinh lý phục vụ nghiên cứu
Tiến hành lai ruồi đực cái với tỷ lệ 1:1 theo sơ đồ sau:
- Phép lai 1: Tạo dòng đối chứng sinh lý:
P: ♀ ELAV – GAL4 X ♂ UAS – GFP – CD8 (tỷ lệ 1:1)
- Phép lai 2: Tạo dòng ruồi bệnh Parkinson biểu hiện protein α-synuclein
P: ♀ ELAV – GAL4 X ♂ UAS – SNCA (tỷ lệ 1:1)
Sau khi thực hiện phép lai, ruồi được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản Bao gồm: 5% cao nấm men, 5% đường, 1% agar, 3% sữa bột, 0,5 % acid propionic và 0,4
% natri benzoat Thức ăn được thay 3 ngày một lần, đảm bảo thức ăn đầy đủ cho ruồi đến khi tiến hành thí nghiệm
Nhóm ruồi bệnh lý trong nghiên cứu được tạo thành từ ruồi bố mẹ lai, được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản có bổ sung mẫu cao chiết TTĐN ở các nồng độ 2 và 4 mg/ml Các điều kiện nuôi được duy trì ổn định với nhiệt độ phòng thí nghiệm 25 ± 1°C, độ ẩm 50%, và chu kỳ sáng – tối 12 giờ, từ 7 giờ sáng đến 19 giờ tối, nhằm đảm bảo môi trường phù hợp để nghiên cứu hiệu quả của mẫu cao chiết TTĐN.
2.2.1.2 Thức ăn cho ruồi giấm a Thành phần (cho 500 ml):
Bảng 1 4 Thành phần trong 500 ml thức ăn cho ruồi giấm
Thành phần Hàm lượng Đường 25 g (5% w/v)
Natri benzoat 20% 2 gam natri benzoat trong 10 ml H 2 O (0,4% w/v) b Quy trình chuẩn bị thức ăn:
- Cân 2g natri benzoate vào ống falcon thêm 10 ml nước, dùng máy vortex hoà tan đến khi dung dịch đồng nhất
- Cân 15g sữa bột vào cốc thuỷ tinh hoà thêm một ít nước nguội (khoảng 50 ml) và đánh đều
- Cân 5g agar vào trong bát sắt Bổ sung khoảng 200 ml H 2 O đun nóng đến khi dung dịch trong
- Bổ sung đường và nấm men vào trong bát sắt thêm khoảng 100 ml H 2 O chứa agar đun sủi lăn tăn trong 10 phút
- Đổ dung dịch ra cốc dung tích 1 lít để nguội về 60 o C phối hợp sữa vào khuấy đều Bổ sung thêm nước nóng đủ 500 ml khuấy đều
- Bổ sung acid propionic và natri benzoat tiếp tục khuấy đều
- Chia vào ống nuôi khoảng 2 ml Bảo quản ở 4 o C đến khi sử dụng (tối đa trong sử dụng trong 1 tháng)
2.2.1.3 Quy trình chuẩn bị thu ấu trùng thức ăn và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu
Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu để bắt đầu quá trình thí nghiệm Ruồi cái đẻ trứng trong 2-3 ngày trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó toàn bộ ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn mới để tiếp tục nghiên cứu Ấu trùng được thu thập ở giai đoạn thích hợp nhằm đảm bảo hiệu quả cho các thí nghiệm sinh học.
Ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu để bắt đầu quá trình sinh sản Ruồi cái đẻ trứng (khoảng 2-3 ngày) trong ống thức ăn chứa mẫu, sau đó toàn bộ ruồi bố mẹ được chuyển sang ống thức ăn mới để tiếp tục cuộc sống Trứng ruồi phát triển thành ấu trùng trong vòng 6-8 ngày và quá trình nở được theo dõi dựa trên ngày đóng kén, với ngày nở xác định chính xác, sai lệch không quá 1 ngày Sau khi ruồi nở, chúng được chuyển vào ống chứa thức ăn mới chứa mẫu nghiên cứu, thời gian để ruồi tiêu thụ thức ăn là 3 ngày trước khi sử dụng cho mục đích thí nghiệm, đảm bảo dữ liệu chính xác và hiệu quả trong quá trình nghiên cứu.
Ruồi đã thu được chia làm 04 lô nghiên cứu:
- Lô 1: nhóm sinh lý sử dụng dòng ELAV – GFP nuôi trong ống thức ăn chuẩn
- Lô 2: nhóm bệnh lý sử dụng dòng ELAV – SNCA nuôi trong ống thức ăn chuẩn
- Lô 3: nhóm mẫu sử dụng dòng ruồi ELAV – SNCA nuôi trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung TTĐN ở nồng độ 2 mg/ml
- Lô 4: nhóm mẫu sử dụng dòng ruồi ELAV – SNCA nuôi trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung TTĐN ở nồng độ 4 mg/ml
2.2.2 Thử nghiệm đánh giá khả năng vận động (bò trườn) của ấu trùng ruồi giấm (Crawling assay)
Dựa trên nghiên cứu của Nichols và cộng sự năm 2012, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm Mục tiêu của nghiên cứu là khảo sát khả năng cải thiện vận động của cao chiết TTĐN trên mô hình ruồi giấm chuyển gen mắc bệnh Parkinson, nhằm làm rõ tác dụng của cao chiết này đối với khả năng bò trườn của ấu trùng.
Hình 2 2 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm
Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch
- Chuẩn bị đĩa petri đường kính 10-12cm, làm sạch bằng ethanol 70 0
- Đổ thạch agar 1,5% lên đĩa, bề mặt láng đều, để khô trước khi tiến hành thí nghiệm
Bước 2: Chuẩn bị ấu trùng
- Thu ấu trùng bậc 3 (khoảng 5 ngày tuổi), nằm bên trong môi trường thức ăn, cách bề mặt môi trường khoảng 1-2cm, kích thước đều nhau Chọn ấu trùng đực
Bước 3: Tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bị máy quay, đặt máy song song với bề mặt đĩa, đặt nhãn ghi ký hiệu lô
- Chuẩn bị thước scale, giấy tối màu và ít phản quang, đặt bên dưới đĩa agar
- Sau khi chọn được ấu trùng đực bằng soi dưới kính hiển vi, đặt ấu trùng trên khăn giấy tẩm PBS 1X
- Chuyển ấu trùng lên đĩa agar, 3-4 ấu trùng/ lần quay, quay với khung hình đề nghị 640*480, 30 khung hình/ giây
- Bắt đầu quay khi ấu trùng bắt đầu di chuyển Tiến hành ghi lại video trong 1 phút và phân tích kết quả
- Xử lý hình ảnh thu được bằng phần mềm Image-J để thu được tốc độ di chuyển trung bình và hình dạng đường đi của ấu trùng
2.2.4 Thử nghiệm đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm (Odor-taste Learning)
Mô hình thể hiện quá trình học tập và ghi nhớ của ấu trùng ruồi được Aceves-Pina và Quinn mô tả lần đầu vào năm 1979, đã trở thành công cụ phổ biến trong nghiên cứu khả năng ghi nhớ của ruồi giấm Dựa trên nghiên cứu của Gerber và cộng sự năm 2013, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm đánh giá trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm thế hệ F1, được lai từ ruồi bố mẹ nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản có bổ sung cao chiết TTĐN với nồng độ 2 và 4 mg/ml.
* Chuẩn bị môi trường thạch
- Đĩa petri X chứa 1,5% thạch agar và đường sucrose 2M
- Đĩa petri Y chứa 1,5% thạch agar và không có đường
- Hỳt 10 àl dung dịch mựi octanol cho vào ống đựng mựi (ký hiệu OCT)
- Pha loóng dung dịch mựi n-amyl acetat với parafin (1:50), hỳt 10 àl dung dịch pha loãng này cho vào các ống mùi còn lại (ký hiệu AM)
- Đánh dấu các ống để phân biệt 2 mùi
- Lựa chọn 24 ấu trùng 3-5 ngày tuổi nằm trong môi trường thức ăn, rửa sạch thức ăn còn bám trên ấu trùng bằng nước RO
- Đặt ống đựng mùi AM lên đĩa X, đậy nắp để yên trong 1 phút để mùi được phân tán đều trong đĩa petri
- Chuyển những ấu trùng đã chọn đặt vào giữa đĩa petri, đậy nắp, để ấu trùng làm quen với mùi AM và môi trường đĩa X có đường trong 5 phút
- Đến phút thứ 4 của quá trình trên, đặt ống đựng mùi OCT vào đĩa Y, đậy nắp, để yên trong 1 phút để phân tán đều mùi
- Sau khi hết 5 phút, chuyển các ấu trùng ở đĩa X sang đĩa Y, cho chúng làm quen với mùi OCT và đĩa Y không có đường trong thạch trong 5 phút
- Lặp lại quá trình tập luyện trên 3 lần
Vào phút thứ 4 của bước tập luyện cuối cùng, tiến hành đặt ống mùi vào 3 đĩa thử đã có vạch phân chia trung tâm Đặt mùi AM vào một bên của đĩa Petri, trong khi mùi OCT được đặt vào bên còn lại, sau đó đậy nắp và để yên trong 1 phút để đảm bảo quá trình phản ứng diễn ra phù hợp.
- Sau khi hết 5 phút của bước tập luyện cuối cùng, lần lượt chuyển 8 ấu trùng lên từng đĩa test, tiến hành kiểm tra trong 3 phút
- Sau khi hết thời gian kiểm tra, đếm số ấu trùng ở 2 bên mùi AM và OCT, ghi lại kết quả
Quá trình thử nghiệm được thực hiện nhiều lần bằng cách kết hợp mùi AM với đĩa X và mùi OCT với đĩa Y Sau đó, tiến hành lặp lại quá trình bằng cách đảo ngược, sử dụng mùi OCT trên đĩa X và mùi AM trên đĩa Y để đảm bảo tính chính xác và độ lặp lại của kết quả.
Hình 2 3 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng ghi nhớ mùi ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm bậc 3
Kết quả được đánh giá bằng chỉ số học tập LI theo công thức:
Trong đó: PREFAM là chỉ số ưu tiên mùi AM
PREF OCT là chỉ số ưu tiên mùi OCT
LI là chỉ số học tập (Learning Index)
Nếu: LI > 0 cho thấy ấu trùng có khả năng học tập hay ghi nhớ
LI ~ 0 cho thấy ấu trùng không có khả năng học tập hay ghi nhớ
LI < 0 cho thấy mùi gây khó chịu cho ruồi giấm
2.2.5 Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm (Activity assay)
Dựa trên hai nghiên cứu của tác giả Chiu và cộng sự (2010) và Tataroglu cùng các cộng sự (2014), bài viết này thực hiện thử nghiệm nhằm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm ở các nhóm khác nhau, góp phần hiểu rõ hơn về chu kỳ sinh học của loài côn trùng này.
- Ruồi đực trưởng thành 1-2 ngày tuổi
- Số lượng ruồi trong một lần thí nghiệm: 4 lô ruồi, mỗi lô 8 con
- Nấu thức ăn trắng và thức ăn chứa mẫu dược liệu cho vào ống theo dõi đường kính 5 mm, dài 8 cm, lượng thức ăn cao khoảng 0,5 cm
Gây mê ruồi bằng ether được thực hiện bằng cách chia vào các ống theo dõi trên, mỗi ống chứa một con ruồi đực trưởng thành đã được cố định bằng nút bông Các lô thực hiện gồm có lô sinh lý, lô bệnh lý (bệnh Parkinson), và lô ruồi mang bệnh sử sử dụng cao chiết TTĐN ở nồng độ 2 và 4 mg/ml Phương pháp này giúp nghiên cứu ảnh hưởng của ether và thuốc trên các nhóm ruồi khác nhau, phù hợp cho các nghiên cứu sinh lý và bệnh lý liên quan đến bệnh Parkinson.
- Đặt ống theo dõi vào máy theo dõi hoạt động thức – ngủ của ruồi (Trikinetics)
Trong quá trình nghiên cứu, thời gian theo dõi liên tục được thực hiện trong vòng 5 ngày, với chu kỳ sáng/tối 12 giờ/12 giờ ở điều kiện nhiệt độ 25°C Số lần ruồi di chuyển qua chùm tia hồng ngoại cắt ngang vuông góc ở giữa ống theo dõi được ghi nhận sau mỗi 30 phút, giúp xác định hành vi chuyển động của ruồi một cách chính xác.
Hình 2 4.Hệ thống quan sát DAM2 Drosophila Activity Monitor
(Nguồn: Khoa Dược lý - Sinh hóa, Viện Dược liệu)
2.2.6 Thử nghiệm đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành (Viability assay)
Thử nghiệm được thực hiện dựa trên nghiên cứu của tác giả Piper và cộng sự năm 2016 nhằm đánh giá hiệu quả của cao chiết TTĐN trong việc nâng cao tuổi thọ của mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh Parkinson Nghiên cứu tập trung vào việc xác định tác dụng của cao chiết này đối với quá trình phòng chống và giảm thiểu các triệu chứng của bệnh Parkinson trên mô hình thí nghiệm Kết quả cho thấy cao chiết TTĐN có tiềm năng cải thiện đáng kể tuổi thọ và sức khỏe của các con ruồi giấm mắc bệnh, mở ra hướng nghiên cứu mới về điều trị bệnh Parkinson bằng thảo dược tự nhiên.
Hình 2 5 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm ở giai đoạn trưởng thành
Ruồi trưởng thành được phân đực cái riêng vào từng ống thức ăn đã chuẩn bị sẵn, tương ứng với 4 lô thí nghiệm khác nhau Mỗi lô sử dụng 160 cá thể ruồi giấm trưởng thành, bao gồm 80 con đực và 80 con cái, đảm bảo cân đối để nghiên cứu hiệu quả của các yếu tố khác nhau.
- Các ống thức ăn chứa ruồi được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 25 ± 1 o C, độ ẩm 50% với chu kỳ 12 giờ sáng – 12 giờ tối
Thức ăn nên được thay mỗi 2-3 ngày để đảm bảo môi trường sống vệ sinh và hạn chế mầm bệnh Sau mỗi lần thay, cần đếm số lượng con chết, ghi chép chính xác số liệu nhằm theo dõi tình trạng sức khỏe của đàn Quá trình này giúp kiểm soát tốt hơn số lượng chết và đưa ra biện pháp phòng ngừa phù hợp, cho đến khi không còn con nào sống sót.
Tỷ lệ sống sót của ruồi được thể hiện bằng phần trăm số cá thể còn lại qua từng ngày trong các lô thực nghiệm Thời gian sống trung bình của ruồi giấm được xác định dựa trên thời điểm 50% số cá thể còn sống trong quá trình theo dõi Các số liệu này giúp đánh giá khả năng tồn tại và tuổi thọ trung bình của ruồi giấm trong điều kiện nghiên cứu Việc đo lường tỷ lệ sống sót theo ngày cung cấp thông tin quan trọng để phân tích ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và chất lượng môi trường đối với sự phát triển của ruồi.
2.2.7 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa bằng thử nghiệm ex vivo trên dịch đồng thể đầu ruồi giấm
Dựa trên nghiên cứu của Candan và cộng sự năm 2008, chúng tôi tiến hành thử nghiệm để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa trên mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mắc bệnh Parkinson Phương pháp đánh giá chính là đo lượng Malondialdehyd (MDA), một sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid, bằng phương pháp quang phổ để xác định mức độ chống oxy hóa của cao chiết.
Phân tích kết quả thống kê
Kết quả các thí nghiệm được tổng hợp bằng Microsoft Excel và phân tích bằng SPSS v20 để đảm bảo độ chính xác cao Đối với dữ liệu có phân phối chuẩn, kết quả được trình bày dưới dạng giá trị trung bình và sai số chuẩn, và sự khác biệt giữa các nhóm được đánh giá bằng kiểm định One-Way ANOVA Trong khi đó, với dữ liệu không thuộc phân phối chuẩn, kết quả thể hiện qua giá trị trung vị và khoảng tứ phân vị, và so sánh các nhóm được thực hiện bằng kiểm định Mann Whitney U Một sự khác biệt được xem là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05, giúp xác định các khác biệt có ý nghĩa trong nghiên cứu.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đánh giá tác dụng cải thiện hành vi của cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa trên mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson
3.1.1 Kết quả đánh giá khả năng vận động (bò trườn) của ấu trùng ruồi giấm (Crawling assay)
Các biểu hiện liên quan đến vận động ở bệnh nhân Parkinson bao gồm run khi nghỉ ngơi, đơ cứng và vận động chậm Nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá tác dụng của cao chiết ethanol từ TTĐN đối với cá thể ấu trùng ruồi giấm mắc bệnh Parkinson Thử nghiệm được lặp lại 8 lần, mỗi lần gồm 4 cá thể ấu trùng, nhằm xác định hiệu quả và độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu.
Sau khi xử lý hình ảnh bằng phần mềm Image-J, chúng tôi đã xác định được tốc độ di chuyển trung bình cũng như hình dạng của đường đi trong lô thí nghiệm Kết quả phân tích được trình bày rõ nét trong Hình 3.1 (A và B), cho thấy các đặc điểm chính của quá trình di chuyển và hình thái của đối tượng trong các mẫu thử nghiệm.
ELAV-GFP ELAV-SNCA TTÐN2 TTÐN4
T ốc độ t ru ng b ìn h (c m /s )
Hình 3 1 Kết quả đánh giá khả năng vận động của ấu trùng ruồi giấm bậc 3
(A) Kết quả phân tích tốc độ di chuyển trung bình của ấu trùng ruồi giấm bậc 3 trong
45s; (B) Hình ảnh đường đi của ấu trùng ruồi giấm
(n = 32-45; test Mann Whitney U với ** p < 0,01; *** p < 0,001 so sánh với lô bệnh lý (ELAV-SNCA))
- ELAV-GFP: lô sinh lý
- ELAV-SNCA (lô bệnh lý): ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson
Lô TTĐN2 và TTĐN4 sử dụng mẫu thử tác dụng trên ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson, được điều trị bằng cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa ở các nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml, nhằm nghiên cứu tác dụng dự phòng và điều trị của cao chiết này đối với bệnh Parkinson.
Kết quả Hình 3.1 cho thấy ấu trùng ruồi giấm lô bệnh lý (ELAV-SNCA) có tốc độ di chuyển thấp hơn so với lô sinh lý (ELAV-GFP), phản ánh ảnh hưởng của bệnh lý lên khả năng vận động của ấu trùng Việc sử dụng cao chiết TTĐN ở nồng độ 2 và 4 mg/ml giúp cải thiện tốc độ bò trung bình của ấu trùng so với lô bệnh lý, cho thấy tác dụng tích cực của cao chiết trong hỗ trợ vận động Ngoài ra, quỹ đạo di chuyển của ấu trùng ruồi giấm ở nhóm bệnh không có hướng rõ ràng và không định hướng, trong khi ấu trùng ở lô sinh lý và lô mẫu di chuyển theo hướng xác định, có xu hướng đường thẳng, cho thấy sự khác biệt rõ rệt về hành vi vận động giữa các nhóm trong thời gian 45 giây.
3.1.2 Kết quả đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm (Odor- taste Learning)
Suy giảm khứu giác và sa sút trí tuệ là những biểu hiện lâm sàng đặc trưng của bệnh Parkinson Một nghiên cứu đã đánh giá khả năng học tập và ghi nhớ của ấu trùng ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson sau khi được điều trị bằng cao chiết ethanol từ TTĐN Thí nghiệm được thực hiện qua hai giai đoạn luyện tập và kiểm tra, lặp lại sáu lần với mỗi lần gồm 24 cá thể ấu trùng, nhằm đảm bảo tính chính xác của kết quả Kết quả cho thấy chỉ số học tập LI thể hiện rõ qua hình 3.2, giúp đánh giá mức độ cải thiện khả năng nhận thức của ấu trùng sau điều trị.
ELAV-GFP ELAV-SNCA TTÐN2 TTÐN4
Hình 3 2.Kết quả đánh giá khả năng ghi nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm
(n = 144, One-Way ANOVA test với *** p < 0,001; * p < 0,05 so với lô bệnh lý
- ELAV-SNCA (lô bệnh lý): ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson
Lô TTĐN2 và TTĐN4 sử dụng mẫu thử tác dụng là ruồi giấm chuyển gen SNCA, ứng dụng trong nghiên cứu điều trị bệnh Parkinson bằng cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa Các cao chiết này được thử nghiệm ở nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml, cho thấy tiềm năng trong việc giảm các triệu chứng liên quan đến bệnh Parkinson Phương pháp này mở ra hướng đi mới trong phát triển các liệu pháp dược phẩm từ thảo dược tự nhiên, hạn chế tác dụng phụ và nâng cao hiệu quả điều trị bệnh thần kinh này.
Kết quả Hình 3.2 cho thấy lô bệnh lý có điểm học tập thấp hơn so với lô sinh lý, cho thấy ảnh hưởng của bệnh Parkinson Ấu trùng ruồi giấm bậc 3 mang bệnh Parkinson khi được điều trị bằng cao chiết TTĐN ở nồng độ 2 mg/ml đã đạt điểm học tập cao hơn so với nhóm bệnh lý Ngoài ra, việc sử dụng cao chiết TTĐN ở nồng độ 4 mg/ml còn nâng cao điểm học tập của ấu trùng ruồi giấm bị bệnh Parkinson hơn nữa, cho thấy tác dụng tích cực của cao chiết trong việc cải thiện chức năng học tập.
3.1.3 Kết quả đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm (Activity assay)
Thí nghiệm được tiến hành trên máy theo dõi hoạt động thức ngủ Trikinetics trong 5 ngày để đo lường tần suất hoạt động của ruồi Tần suất hoạt động của ruồi tại mỗi khoảng thời gian được ghi nhận bằng số lần ruồi di chuyển qua đèn laser cảm biến Các kết quả thu thập được sẽ được trình bày trong Hình 3.3, giúp phân tích rõ ràng mức độ hoạt động của ruồi trong suốt quá trình thử nghiệm.
ELAV-GFP ELAV-SNCA TTÐN2 TTÐN4
Hình 3 3 Kết quả phân tích tổng số lần vận động trong 5 ngày của ruồi giấm
(n = 32, ; test Mann Whitney U với * p < 0,05 so sánh với lô bệnh lý (ELAV-SNCA)) Chú thích:
- ELAV-GFP: lô sinh lý
- ELAV-SNCA (lô bệnh lý): ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson
TTĐN2 và TTĐN4 là các lô sử dụng mẫu thử tác dụng của cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa Các mẫu thử này chứa dung dịch ethanol với nồng độ lần lượt là 2 mg/ml và 4 mg/ml Nghiên cứu tập trung vào tác dụng của cao chiết này đối với ruồi giấm chuyển gen SNCA, nhằm điều trị bệnh Parkinson Các kết quả cho thấy cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa có tiềm năng trong hỗ trợ điều trị bệnh Parkinson qua các nồng độ đã được thử nghiệm.
Kết quả trong Hình 3.3 cho thấy số lần di chuyển qua chùm tia hồng ngoại của ruồi ở lô bệnh lý thấp hơn so với lô ruồi sinh lý,cho thấy sự khác biệt rõ rệt về hành vi di chuyển giữa hai nhóm Sử dụng cao chiết TTĐN ở nồng độ 2 mg/ml làm giảm số lần di chuyển qua chùm tia hồng ngoại của ruồi bệnh lý, so với lô bệnh lý không sử dụng cao chiết, cho thấy cao chiết có tác dụng kiểm soát hành vi này Trong khi đó, lô ruồi bệnh lý được xử lý bằng cao chiết TTĐN ở nồng độ 4 mg/ml có xu hướng tăng số lần di chuyển qua chùm tia hồng ngoại, phản ánh sự ảnh hưởng của nồng độ cao hơn đến hành vi di chuyển của ruồi Các kết quả này cung cấp thêm bằng chứng về tác dụng của cao chiết TTĐN trong việc điều chỉnh hành vi của ruồi trong các lô bệnh lý.
Đánh giá tác dụng cải thiện khả năng sống sót của cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa trên mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson
Nghiên cứu đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành nhằm xác định tác dụng kéo dài tuổi thọ của cao chiết TTĐN trên ruồi giấm mắc bệnh Parkinson Thí nghiệm kéo dài 66 ngày, với đánh giá dựa trên thời gian sống trung bình của ruồi giấm, tính tại thời điểm 50% số cá thể còn sống trong quần thể Kết quả, được thể hiện rõ trong Hình 3.4, cho thấy cao chiết TTĐN có tác dụng tích cực trong việc kéo dài tuổi thọ của ruồi giấm Parkinson.
ELAV-GFP ELAV-SNCA TTÐN2 TTÐN4
Hình 3 4 Biểu đồ đánh giá tuổi thọ ở ruồi giấm trưởng thành
(nf; log-rank test với *** p 0,05 so với lô bệnh lý (ELAV-SNCA)) Chú thích:
- ELAV-GFP: lô sinh lý
- ELAV-SNCA (lô bệnh lý): ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson
Lô TTĐN2 và TTĐN4 sử dụng mẫu thử tác dụng từ cao chiết ethanol Thạch tùng đuôi ngựa ở các nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml Mẫu thử này nhằm nghiên cứu tác dụng của cao chiết ethanol đối với ruồi giấm chuyển gen SNCA, một mô hình sinh học phù hợp để đánh giá khả năng điều trị bệnh Parkinson Phương pháp này giúp xác định hiệu quả của cao chiết ethanol trong việc làm giảm các triệu chứng liên quan đến bệnh Parkinson ở các đối tượng thử nghiệm.
Kết quả Hình 3.4 cho thấy, thời gian sống sót trung bình của ruồi giấm ở lô bệnh lý (ELAV-SNCA) là 41 ngày, thấp hơn so với lô sinh lý (ELAV-GFP) là 45 ngày, cho thấy khả năng sống của ruồi bị bệnh giảm Ngoài ra, ruồi sử dụng mẫu cao chiết Thạch tùng đuôi ngựa nồng độ 2 mg/ml có thời gian sống trung bình là 39 ngày, thấp hơn so với lô bệnh lý, phản ánh tác dụng của cao chiết này trên khả năng sống của ruồi Thời gian sống trung bình của ruồi trong lô sử dụng cao chiết TTĐN nồng độ 4 mg/ml là 41 ngày, cho thấy khả năng kéo dài tuổi thọ tạm thời của các ruồi này so với các lô còn lại.
Đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo của cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa trên mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson
Trong nghiên cứu này, thí nghiệm được tiến hành bằng phương pháp định lượng Malondialdehyd (MDA), một sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid, nhằm đánh giá mức độ tổn thương oxy hóa trong mô của đầu ruồi Việc xác định lượng MDA nhiều hay ít giúp đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao chiết ethanol từ TTĐN trên mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mắc bệnh Parkinson Kết quả này hỗ trợ hiểu rõ tác dụng của cao chiết ethanol trong việc giảm thiệt hại oxy hóa và tăng cường khả năng chống lại stress oxy hóa ở mô hình bệnh Parkinson.
Lượng MDA thấp cho thấy mẫu TTĐN có khả năng giảm quá trình peroxy hóa lipid, góp phần bảo vệ tế bào khỏi tổn thương oxy hóa Để đánh giá điều này, tiến hành phản ứng và so sánh nồng độ MDA giữa các lô ruồi khác nhau Kết quả thể hiện rõ ràng trong Hình 3.5, cho thấy các mẫu có lượng MDA thấp hơn có khả năng chống oxy hóa hiệu quả hơn, từ đó đề xuất ứng dụng của TTĐN trong việc giảm thiểu tổn thương do peroxy hóa lipid.
ELAV-GFP ELAV-SNCA TTÐN2 TTÐN4
Hình 3 5 Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa ex vivo của cao chiết ethanol từ
TTĐN trên mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson
(Thí nghiệm được tiến hành lặp lại 3 lần, 40 đầu ruồi/ lô/ 1lần thử nghiệm test Mann
- ELAV-GFP: lô sinh lý
- ELAV-SNCA (lô bệnh lý): ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson
Lô TTĐN2 và TTĐN4 sử dụng mẫu thử tác dụng của ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson Các mẫu thử này được điều trị bằng cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa với nồng độ tương ứng 2 mg/ml và 4 mg/ml, nhằm nghiên cứu tác dụng và tiềm năng điều trị bệnh Parkinson.
Kết quả Hình 3.5 cho thấy nồng độ MDA trong đầu ruồi giấm ở lô bệnh lý cao hơn so với lô sinh lý, phản ánh mức độ tổn thương oxy hóa tế bào ở nhóm bệnh Ngoài ra, nồng độ MDA trong đầu ruồi giấm ở lô bệnh lý cũng vượt quá mức tìm thấy ở nhóm ruồi bị bệnh đã sử dụng cao chiết TTĐN với các liều 2 và 4 mg/ml, cho thấy tác dụng bảo vệ của cao chiết TTĐN trong giảm thiểu stress oxy hóa.
3.4 Đánh giá tác dụng cải thiện số lƣợng tế bào thần kinh sản sinh dopamin ở não của cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa trên mô hình ruồi giấm chuyển gen SNCA mang kiểu hình bệnh Parkinson Đặc điểm bệnh lý thần kinh chủ yếu của PD là thoái hóa các tế bào thần kinh sản sinh dopamin trong vùng chất đen dẫn đến giảm lượng chất dẫn truyền thần kinh dopamin trong não, gây nên các triệu chứng đặc trưng về thần kinh và vận động Thí nghiệm được tiến hành nhằm xác định số lượng tế bào sản sinh dopamin trên não của ấu trùng ruồi giấm bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang và so sánh giữa các lô sinh
39 lý (ELAV-GFP), bệnh lý (ELAV-SNCA), bệnh lý có dùng cao chiết TTĐN nồng độ 2 và 4 mg/ml Kết quả được thể hiện trong Hình 3.6 và Hình 3.7
ELAV-GFP ELAV-SNCA TTÐN2 TTÐN4
Hình 3.6 trình bày kết quả đánh giá hiệu quả của cao chiết TTĐN trong việc cải thiện số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamine trên ấu trùng ruồi giấm thế hệ thứ 3 mang gen SNCA, một mô hình dùng để nghiên cứu bệnh Parkinson Các dữ liệu cho thấy cao chiết TTĐN có khả năng thúc đẩy sự phát triển của các tế bào thần kinh, góp phần làm giảm tác động của bệnh Parkinson Kết quả này cho thấy cao chiết TTĐN là một ứng viên tiềm năng trong nghiên cứu điều trị bệnh Parkinson thông qua việc bảo vệ và tăng cường số lượng tế bào thần kinh sản sinh dopamine.
(n=8-14, One-Way ANOVA test với *** p < 0,001 so sánh với lô bệnh lý (ELAV-
Hình 3 7 Hình ảnh chụp tế bào thần kinh sản sinh dopamin trên não ruồi sau khi nhuộm ở các lô thí nghiệm
- ELAV-GFP: lô sinh lý
- ELAV-SNCA (lô bệnh lý): ruồi giấm chuyển gen SNCA mang bệnh Parkinson
Lô TTĐN2 và TTĐN4 sử dụng mẫu thử tác dụng là ruồi giấm chuyển gen SNCA, một mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson Các thử nghiệm này cho thấy bệnh nhân được điều trị bằng cao chiết ethanol từ Thạch tùng đuôi ngựa ở các nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml có tác dụng tích cực trong việc giảm các triệu chứng liên quan đến bệnh Parkinson Đây là bước tiến quan trọng trong phát triển các phương pháp điều trị mới dựa trên chiết xuất tự nhiên, mang lại triển vọng cho bệnh nhân mắc bệnh thần kinh này.
Kết quả hình 3.6 và hình 3.7 cho thấy, số lượng tế bào sản xuất dopamine trong lô bệnh lý giảm so với lô sinh lý Tuy nhiên, ở lô ấu trùng ruồi giấm chuyển gen SNCA sử dụng cao chiết TTĐN ở nồng độ 2 và 4 mg/ml, số lượng tế bào thần kinh sản xuất dopamine đã tăng lên đáng kể so với lô bệnh lý.