Nguyễn ánh phương tổng hợp, đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của một số dẫn chất n hydroxybenzamid mới mang dị vòng benzimidazol khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

Hiện nay, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu, tổng hợp và công bố một số dẫn chất có khả năng kháng ung thư mạnh, trong đó có nhóm dẫn chất acid hydroxamic.. Nhóm nghiên cứu tại bộ

LỜI CẢM ƠN

Trước khi trình bày phần nội dung đề tài khóa luận của mình, tôi xin gửi lời cảm

ơn chân thành đến những người trong suốt thời gian qua đã luôn hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành một cách tốt nhất khóa luận tốt nghiệp

Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với những người thầy, người cô

đáng kính của tôi: GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Phan Thị Phương Dung, TS

Đỗ Thị Mai Dung, TS Dương Tiến Anh - Bộ môn Hóa Dược - Khoa công nghệ Hóa

dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô đã không chỉ tạo những điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi hoàn thành khóa luận mà đã luôn có những chỉ dẫn chính xác, kịp thời

và động viên tôi những lúc khó khăn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và tất cả thành viên đang tham gia nghiên cứu khoa học tại bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là

chị Nguyễn Thị Thu Hằng, anh Nguyễn Quang Thế Vũ, anh Nguyễn Đức Thịnh, bạn

Vũ Hà Vy, bạn Bùi Phương Mai, bạn Nguyễn Thị Thu Huyền, bạn Vũ Anh Minh,

em Nguyễn Thị Nga, em Nguyễn Đức Tú, em Trần Thị Thu Huyền và các em K75,

K76 nhóm nghiên cứu Tổng hợp hóa dược Sự đồng hành và giúp đỡ của mọi người là nguồn động viên to lớn đối với tôi trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu

Hà Nội, ngày 15 tháng 05 năm 2023

Sinh viên

Nguyễn Ánh Phương

MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH VẼ

DANH MỤC SƠ ĐỒ

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ……….1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ENZYM HISTON DEACETYLASE 2

1.1.1 Giới thiệu về enzym histon deacetylase 2

1.1.2 Phân loại HDAC 3

1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym histon deacetylase 4

1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi) 4

1.2.1 Cấu trúc và liên quan cấu trúc tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi) 4

1.2.2 Phân loại các chất ức chế HDAC (HDACi) 5

1.2.3 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi) 6

1.3 CÁC DẪN CHẤT HYDROXAMIC CÓ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ 7

1.3.1 Acid hydroxamic 7

1.3.2 Một số dẫn chất của acid hydroxamic tiềm năng trong nghiên cứu ung thư 8

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT CỦA ACID HYDROXAMIC 10

1.4.1 Tổng hợp dẫn chất của acid hydroxamic từ acid carboxylic 10

1.4.2 Tổng hợp dẫn chất của acid hydroxamic từ este 11

1.4.3 Tổng hợp dẫn chất của acid hydroxamic từ aldehyd 11

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 13

2.1.1 Hóa chất 13

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 13

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.2.1 Tổng hợp hóa học 14

2.2.2 Đánh giá tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được 14

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.3.1 Tổng hợp hóa học 14

2.3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học 15

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 HÓA HỌC 17

3.1.1 Tổng hợp hóa học 17

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 28

3.1.3 Xác định cấu trúc 29

3.2 THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ 35

3.3 BÀN LUẬN 35

3.3.1 Tổng hợp hóa học 35

3.3.2 Khẳng định cấu trúc 39

3.3.3 Thử hoạt tính sinh học 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ……….46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon

(Carbon-13 nuclear magnetic resonance)

(Proton nuclear magnetic resonance)

(U.S Food and Drug Administration)

HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors)

IC50 : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration)

(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)

MDA-MB-231 : Dòng tế bào ung thư vú

NaHCO3 : Natri bicarbonat

NH2OH.HCl : Hydroxylamin hydrochlorid

SnCl2.2H2O : Tin (II) clorid dihydrat

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hiệu suất toàn phần của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d 28

Bảng 3.2 Giá trị Rf và tºnc của dẫn chất VIIa-d và IXa-d 29

Bảng 3.3 Kết quả phổ IR của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d 29

Bảng 3.4 Kết quả phổ MS của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d 30

Bảng 3.5 Kết quả phổ 1H-NMR của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d 31

Bảng 3.6 Kết quả phổ 13C-NMR của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d 33

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độc tính trên một số dòng tế bào ung thư 35

DANH MỤC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Vai trò của HDAC và HAT trong điều hòa quá trình phiên mã 2

Hình 1.2 Phân loại các HDAC phụ thuộc Zn2+ 3

Hình 1.3 Cấu trúc một số chất ức chế HDAC 5

Hình 1.4 Phân loại các chất ức chế HDAC 6

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 7

Hình 1.6 Phức chất của SAHA tương ứng với Zn(II) và Fe(III) 9

Hình 1.7 Cấu trúc của một số dẫn chất N-hydroxybenzamid 10

Hình 3.1 Phổ hồng ngoại IR của dẫn chất IXa 40

Hình 3.2 Phổ khối lượng MS của dẫn chất VIIa 40

Hình 3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của dẫn chất VIIa 42

Hình 3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của dẫn chất VIIa 43

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Dạng ceto và dạng iminol của acid hydroxamic 8

Sơ đồ 1.2 Quá trình phân ly của acid hydroxamic 8

Sơ đồ 1.3 Quy trình tổng hợp acid hydroxamic từ hydroxylamin được bảo vệ 11

Sơ đồ 1.4 Quy trình tổng hợp acid hydroxamic sử dụng SOCl2 11

Sơ đồ 1.5 Quy trình tổng hợp acid hydroxamic từ este 11

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp các dẫn chất VIIa-d và IXa-d 17

Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng hợp hỗn hợp chất trung gian II và III 18

Sơ đồ 3.3 Phản ứng tổng hợp chất trung gian IV và V 19

Sơ đồ 3.4 Phản ứng tổng hợp chất trung gian VIa 19

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIIa 20

Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIIb 21

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIIc 22

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIId 23

Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp dẫn chất IXa 24

Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp dẫn chất IXb 25

Sơ đồ 3.11 Quy trình tổng hợp dẫn chất IXc 26

Sơ đồ 3.12 Quy trình tổng hợp dẫn chất IXd 27

Sơ đồ 3.13 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất trung gian II và III 36

Sơ đồ 3.14 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất trung gian IV và V 37

Sơ đồ 3.15 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất trung gian VIa-d, VIIIa-d 37

Sơ đồ 3.16 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất dẫn chất VIIa-d, IXa-d 38

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Kết quả độc tính tế bào của các dẫn chất VIIa-d, IXa-d 45

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư là nhóm các bệnh lý lớn đặc trưng bởi sự phát triển nhanh chóng và bất thường của các tế bào phân chia không kiểm soát, có khả năng xâm lấn, phá hủy các mô của cơ thể Đồng thời, các tế bào này di chuyển đến nhiều cơ quan khác nhau, phát triển, hình thành nên di căn và cuối cùng có thể gây tử vong [22] Bởi vậy, trong vài thập kỷ qua, một số phương pháp tiềm năng đã được đề xuất để điều trị ung thư Trong đó phương pháp điều trị hướng đích được kỳ vọng nâng cao hiệu quả, cải thiện tính chọn lọc và giảm độc tính Một trong những đích phân tử mục tiêu mà hiện nay đang thu hút

sự quan tâm của nhiều nhà khoa học là enzym histon deacetylase (HDAC) [17]

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, sự huy động quá mức các enzym HDAC có khả năng gây nên các sai lệch trong quá trình phiên mã và làm kích thích sự phát triển của các tế bào ung thư [32] Vì vậy, các chất ức chế enzym histon deacetylase (HDACi) đang dần trở thành tác nhân chống ung thư đầy triển vọng [17], [22] Hiện nay, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu, tổng hợp và công bố một số dẫn chất có khả năng kháng ung thư mạnh, trong đó có nhóm dẫn chất acid hydroxamic SAHA (Zolinza®)

là chất ức chế enzym HDAC (HDACi) đầu tiên được FDA cấp phép lưu hành năm 2006 cho điều trị u da tế bào lympho T Sau đó là belinostat (Beleodaq®) năm 2014 và gần đây nhất panobinostat (Farydax®) cũng được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị một

số bệnh ung thư vào năm 2015 [35], [19] Bên cạnh đó, một số chất ức chế HDAC (HDACi) khác cũng đang được nghiên cứu và trải qua các pha thử nghiệm lâm sàng như entinostat, mocetinostat…[19]

Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp, thử hoạt tính và công bố nhiều dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC cho hoạt tính kháng một số dòng tế bào ung thư thử nghiệm Trong đó, một số dẫn chất

là N-hydroxybenzamid cho tác dụng ức chế HDAC mạnh và tiềm năng trên độc tính tế

bào [20], [4], [3]

Trên cơ sở các nghiên cứu trên, đề tài “Tổng hợp, đánh giá tác dụng gây độc

tế bào ung thư của một số dẫn chất N-hydroxybenzamid mới mang dị vòng

benzimidazol” được thực hiện với hai mục tiêu:

1 Tổng hợp được 8 dẫn chất

4-((6-(benzylamino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-N-hydroxybenzamid

2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 ENZYM HISTON DEACETYLASE

1.1.1 Giới thiệu về enzym histon deacetylase

Histon deacetylase (HDAC) là nhóm enzym xúc tác cho quá trình loại bỏ nhóm acetyl khỏi đầu lysin của các protein histon Enzym này có ảnh hưởng đến việc sao chép

và biểu hiện gen Quá trình acetyl hóa và quá trình loại bỏ nhóm acetyl ở đuôi lysin của protein histon được nghiên cứu rộng rãi do có liên quan đến khả năng gây biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể Hai quá trình này được kiểm soát bởi hai họ enzym là histon deacetylase (HDAC) và histon acetyltransferase (HAT) [40]

Quá trình acetyl hóa histon được thực hiện bởi enzym HAT Enzym này tác động

lên nhóm ε-amino của lysin tận cùng Quá trình acetyl hóa làm mất tương tác ion của

histon mang điện tích dương với nhóm phosphat mang điện tích âm của ADN, từ đó làm cho nhiễm sắc thể tháo xoắn và tạo điều kiện cho quá trình phiên mã diễn ra Ngược lại, quá trình loại bỏ nhóm acetyl trên được thực hiện bởi HDAC, enzym này làm cho đầu

N của histon tích điện dương lớn, làm tăng tương tác với ADN, tạo ra cấu trúc chất nhiễm sắc nhỏ gọn hơn, giảm khả năng tiếp cận ADN, gây ức chế quá trình phiên mã [18], [6]

Hình 1.1 Vai trò của HDAC và HAT trong điều hòa phiên mã

3

1.1.2 Phân loại HDAC

Cho đến thời điểm hiện tại, các nhà khoa học đã xác định được mười tám loại enzym histon deacetylase có mặt ở người Các HDAC này được chia thành 4 nhóm căn

cứ vào sự tương đồng của chúng với HDAC ở nấm men [16], [18], [40]

Nhóm I tương đồng với enzym HDA trong nấm men, bao gồm HDAC1, HDAC2, HDAC3 và HDAC8 Các enzym nhóm này được biểu hiện khắp nơi trong các tế bào và

mô của con người [16]

Nhóm II tương đồng với HDB của nấm men và được chia thành hai phân nhóm nhỏ: phân nhóm IIa (HDAC4, HDAC5, HDAC7 và HDAC9) và phân nhóm IIb (HDAC6 và HDAC10) Nhóm II biểu hiện đặc hiệu ở mô và có thể di chuyển giữa nhân

và tế bào chất Điều này cho thấy rằng các HDAC nhóm II có thể tham gia vào quá trình acetyl hóa với cả các protein không phải histon [16], [18]

Nhóm III hay còn gọi là sirtuins (SIRT1-7), bao gồm một nhóm protein tương đồng với họ protein Sir2 của nấm men Sự phân bố trong tế bào và biểu hiện ở các mô

cụ thể của lớp này vẫn chưa được nghiên cứu nhiều [16]

Nhóm IV chỉ có HDAC11 là đại diện duy nhất Cấu trúc của HDAC11 không có

sự tương đồng với HAD và HDB của nấm men [16]

Các HDAC nhóm I, II và IV nhạy cảm với chất ức chế HDAC cổ điển như trichostatin A (TSA), là những enzym phụ thuộc Zn2+ Vị trí xúc tác của chúng có dạng túi với một ion Zn2+ ở đáy nên những enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn2+ như acid hydroxamic Trong khi các HDAC nhóm III là những sirtuin không bị ức chế bởi những hợp chất như vậy và có cơ chế hoạt động phụ thuộc vào NAD+ [16], [2]

Các HDAC khác nhau có chiều dài khác nhau và phụ thuộc vào số lượng acid amin Số chuỗi acid amin trong các HDAC dao động từ 347-1215 HDAC6 có chiều dài lớn nhất, HDAC11 có chiều dài ngắn nhất Tuy nhiên, cấu trúc vùng xúc tác cho quá trình deacetyl hóa vẫn được duy trì [18]

Hình 1.2 Phân loại các HDAC phụ thuộc Zn 2+

4

1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym histon deacetylase

Nhìn chung, trung tâm hoạt động của các HDAC bao gồm 2 phần chính là ion

Zn2+ và kênh enzym:

+ Kênh enzym: có dạng túi hình ống hẹp, là nơi chứa cơ chất, tham gia liên kết Van der Waals với cơ chất Đáy túi có một vài phân tử nước, có nhiệm vụ vận chuyển nhóm acetyl trong phản ứng loại nhóm acetyl Kênh enzym được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như: Phenylalamin, Tyrosin, Prolin, Histidin Miệng túi có một vài vòng xoắn protein để tương tác với nhóm nhận diện bề mặt của HDAC [12]

+ Ion Zn2+: là coenzym của HDAC, nằm dưới đáy kênh enzym và cũng là thành phần tham gia liên kết mạnh nhất với phần đuôi histon qua liên kết phối trí Trong phân

tử HDAC, ion Zn2+ có thể tạo 4 liên kết phối trí với các acid amin và một liên kết phối trí với nguyên tử oxy của nhóm acetyl ở đầu N lysin của histon từ đó xúc tác loại nhóm acetyl Các chất ức chế HDAC liên kết càng mạnh với Zn2+ thì tác dụng ức chế HDAC

và độc tính tế bào càng mạnh Ví dụ như acid hydroxamic ức chế HDAC bằng cách tạo hai liên kết phối trí với Zn2+ qua 2 nguyên tử oxy [42]

Nhóm gắn kẽm (ZBG) có vai trò tương tác với coenzym Zn2+ đáy kênh enzym,

bao gồm một số nhóm chính như: acid hydroxamic, thiol, acid carboxylic, orthor-amino

anilid [26]

Ảnh hưởng của nhóm gắn kẽm (ZBG) trong hoạt động của enzym vẫn chưa rõ ràng Nghiên cứu của Zhang và cộng sự vào năm 2018 cho thấy nhóm ZBG đóng vai trò quyết định trong việc gắn với trung tâm hoạt động của HDAC qua đó xác định hiệu lực của các HDACi Nghiên cứu chỉ ra rằng, nhóm acid hydroxamic thường được sử dụng làm nhóm gắn kẽm do có khả năng tạo phức chelat bền vững với kẽm Bên cạnh

đó, một số dẫn chất benzamid cũng được sử dụng để ức chế các HDAC nhóm I [49]

b, Vùng cầu nối

Vùng cầu nối (Linker) có vai trò tạo liên kết Van der Waals với kênh enzym, tạo nên tương tác với các thành phần nằm trong lòng kênh và giúp cơ chất cố định trong kênh Cấu trúc vùng linker thường là các nhóm sơ nước, gồm các hydrocarbon thân dầu, mạch thẳng hoặc mạch vòng, có thể no hoặc không no [10]

5

Chiều dài carbon của vùng cầu nối phù hợp với chiều dài của kênh enzym Các chất ức chế HDAC có vùng cầu nối dài 5-6 C thì hoạt tính của chúng thường là tối ưu [34] Năm 2013, nghiên cứu của Di Micco đã đưa ra kết luận các chất ức chế HDAC có vùng cầu nối chứa vòng thơm cho ái lực mạnh hơn với đích do vòng thơm tạo tương tác

xếp chồng π- π với hai nhóm phenylalanin trong lòng kênh enzym [9]

Năm 2010, nghiên cứu của T Sundarapandian và cộng sự đã chỉ ra các dẫn chất

có nhóm nhận diện bề mặt thân dầu cho hoạt tính tốt hơn các dẫn chất không chứa nhóm này [45]

Hình 1.3 Cấu trúc một số chất ức chế HDAC

1.2.2 Phân loại các chất ức chế HDAC (HDACi)

Dựa vào cấu trúc hóa học, các chất ức chế HDAC (HDACi) được chia thành các nhóm chính: các acid hydroxamic, các peptid vòng, các acid béo, benzamid và các dẫn chất ceton (hình 1.4) [24], [39]

Trichostatin A (TSA) - sản phẩm lên men của nấm Streptomyces spp là acid

hydroxamic đầu tiên được tìm thấy có tác dụng ức chế HDAC Nhóm acid hydroxamic

6

có tác dụng ức chế ở nồng độ thấp (cỡ nM), cấu trúc đơn giản, dễ tổng hợp, nhưng có nhược điểm là bị chuyển hoá nhanh và ức chế không chọn lọc lên các loại enzym HDAC Các peptid vòng là nhóm có cấu trúc phức tạp nhất, tác dụng ức chế HDAC mạnh tương

tự các acid hydroxamic Trong khi đó, các acid carboxylic cho tác dụng ức chế HDAC yếu [23]

Hình 1.4 Phân loại các chất ức chế HDAC

1.2.3 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi)

Các chất ức chế HDAC (HDACi) tác động lên tế bào ung thư theo một số cơ chế chủ yếu như:

+ Các chất HDACi gián tiếp gây ra sự chết tế bào theo chương trình: chúng tác động lên những tế bào bình thường và tế bào ung thư thông qua điểm kiểm soát G2 Đây

là vị trí mà tại đó chu trình tế bào tạm thời dừng lại, chờ đến khi các điều kiện phù hợp thì chu trình lại tiếp tục Những tế bào bình thường trải qua điểm kiểm soát G2 và tiếp tục phát triển, trong khi đó những tế bào ung thư tái tạo ADN tạo thành dạng 4n ADN

và chuyển sang giai đoạn chết tế bào theo chương trình [41], [27]

+ Sự biệt hóa gây ra bởi các chất ức chế HDAC: các chất ức chế HDAC tác động lên chu kỳ tế bào bằng cách tăng cường biểu hiện gen CDKN1A (p21) mã hóa protein

Ngoài tác dụng trực tiếp lên sự phát triển và sống sót của tế bào ung thư, các chất

ức chế HDAC còn có những tác dụng gián tiếp đến sự phát triển khối u Chúng làm tăng các phản ứng miễn dịch và ức chế sự tạo mạch của khối u từ đó ngăn cản sự phát triển khối u ban đầu và sự di căn [27]

Hình 1.5 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

1.3 MỘT SỐ DẪN CHẤT HYDROXAMIC CÓ TÁC DỤNG KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ

1.3.1 Acid hydroxamic

Acid hydroxamic hay còn gọi là các N-hydroxy amid, là một acid yếu và tồn tại

ở hai dạng đồng phân khác nhau: dạng ceto và dạng iminol [11] Chúng có thể được coi

là acid lưỡng cực Trong dung môi nước, proton của nhóm hydroxyl phân ly với pKa

nằm trong khoảng từ 8,5-9,5, trong khi quá trình phân ly proton trong DMSO chủ yếu

là sự mất proton từ nhóm −NH Quá trình phân ly proton thứ nhất tạo thành anion hydroxamat còn của proton thứ hai tạo thành dianion hydroxamat Các nhóm hút điện

tử làm tăng tính acid của acid hydroxamic và sự thay thế proton của −NH bằng một nhóm đẩy điện tử như alkyl hoặc aryl làm giảm pKa [11], [47]

8

Sơ đồ 1.1 Dạng ceto và dạng iminol của acid hydroxamic

Sơ đồ 1.2 Quá trình phân ly của acid hydroxamic

Trong những năm gần đây, acid hydroxamic được chứng minh là nhóm dẫn chất

có khả năng ức chế enzym histon deacetylase (HDAC) ở người [5], [35] Nhiều dẫn chất acid hydroxamic có khả năng ức chế HDAC đã được tìm ra, tuy nhiên quá trình ức chế này thường không chọn lọc đối với các nhóm HDAC khác nhau Một số đã được thử nghiệm lâm sàng và sử dụng trong điều trị, ví dụ: panobinostat, vorinostat và belinostat Các acid hydroxamic hoạt động theo cơ chế tạo phức chelat với coenzym

Zn2+ ở đáy kênh enzym [37] Phức hợp của acid hydroxamic và Zn2+ thường được tạo thành theo cơ chế hai phía, tuy nhiên sự phối hợp theo cơ chế một phía cũng được quan sát thấy trong một số cấu trúc tinh thể của các chất ức chế mang nhóm phenyl [32]

1.3.2 Một số dẫn chất của acid hydroxamic tiềm năng trong nghiên cứu ung thư

Các dẫn chất của acid hydroxamic có nhiều ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu phát triển thuốc [29] Các nhà khoa học đã chứng minh được nhiều dẫn chất acid hydroxamic có một số tác dụng khác nhau như ức chế protease không phụ thuộc kim loại (metallicoprotease), điều trị quá liều sắt, đặc biệt là khả năng ức chế enzym histon deacetylase (HDAC) [50] Các dẫn chất acid hydroxamic là nhóm HDACi lớn, bao gồm trichostatinA (TSA), vorinostat (SAHA), panobinostat (LBH589), belinostat (PXD101), dacinostat, pracinostat (SB939), givinostat (ITF2357), abexinostat (PCI-24781 hoặc CRA-024781), tubastatin A, nexturastat A Trong đó, SAHA, PXD101 và LBH589 là các HDACi được FDA chấp thuận sử dung trong lâm sàng điều trị unng thư [44]

Trichostatin A (TSA) là một dẫn chất acid hydroxamic có nguồn gốc tự nhiên

được phân lập từ Streptomyces sp Hợp chất này được nghiên cứu nhiều nhất và có tác

dụng ức chế HDAC ở nồng độ nano [46]

Vorinostat (SAHA) là một chất ức chế HDAC được FDA chấp thuận để điều trị

u lympho tế bào T dưới da (xem cấu trúc hình 1.3) [35] SAHA là một chất ức chế không chọn lọc, tác dụng lên cả 11 loại HDAC Dẫn chất này có khả năng tạo phức hydroxamat rất ổn định với Fe(III) trong nước Mặt khác, SAHA tạo phức 2 càng hydroxamat với Zn(II) cả ở trạng thái rắn và trong dung dịch [35]

9

Hình 1.6 Phức chất của SAHA tương ứng với Zn(II) và Fe(III)

Panobinostat (LBH589) là chất ức chế histon deacetylase nhóm I, II và IV ở nồng

độ thấp (xem cấu trúc hình 1.3) Dẫn chất này có khả năng gây độc tế bào mạnh khi phối hợp với bortezomid, một chất ức chế proteasome được sử dụng trong điều trị đa u tủy LBH589 ức chế HDAC không chọn lọc và là thuốc thuộc nhóm các chất ức chế HDAC mạnh nhất hiện có trên thị trường [43]

Belinostat (PXD101) đã được FDA chấp thuận vào năm 2014 để điều trị ung thư hạch tế bào T ngoại vi, là một chất ức chế không chọn lọc các HDAC với IC50 là 27nM (xem cấu trúc hình 1.3) [37]

Pracinostat (SB939) là một chất ức chế không chọn lọc HDAC (xem cấu trúc hình 1.3) Dẫn chất này có ưu điểm là cải thiện được các thông số hóa lý và dược động

học so với các dẫn chất trong nhóm acid hydroxamic Trong nghiên cứu in vitro, SB939

có độ chọn lọc trên HDAC lớn hơn 100 lần so với các enzym, thụ thể và kênh ion không liên kết Zn2+ [31]

Ngoài các dẫn chất kể trên thì một số dẫn chất N-hydroxybenzamid là các acid hydroxamic cũng có tác dụng ức chế HDAC mạnh Một số dẫn chất N-hydroxybezamid

đã được các nhà nghiên cứu tổng hợp như: givinostat, abexinostat, tubastatin A, nexturastat A

Givinostat (ITF2357) là một chất ức chế mạnh với các HDAC nhóm I và II, có tác dụng ức chế quá trình tạo mạch, ức chế khối u và có khả năng chống viêm ITF2357 đang được thử nghiệm lâm sàng phase III trong điều trị bệnh đa hồng cầu, viêm khớp

vô căn ở vị thành niên, bệnh viêm cơ xương khớp mãn tính và bệnh lý tủy xương mãn tính [35], [25]

Abexinostat (PCI-24781 hoặc CRA-024781) là dẫn chất N-hydroxybenzamid có

tiềm năng trong các nghiên cứu tiền lâm sàng, hiện đang được thử nghiệm lâm sàng pha

I cho tác dụng điều trị ung thư Abexinostat có khả năng ức chế tất cả các HDAC nhưng mạnh nhất là trên HDAC1, tác dụng ở mức trung bình đối với HDAC 2, 3, 6, 10 và tác dụng chọn lọc trên HDAC1 gấp 40 lần HDAC8 [7], [28] PCI-24781 có tác dụng chống ung thư mạnh trên nhiều dòng tế bào khối u và có tác dụng ức chế sự tăng sinh của các

tế bào nội mô [5]

Tubastatin A là một chất ức chế HDAC6 mạnh và chọn lọc với IC50 là 15 nM Tubastatin A có tác dụng ức chế chọn lọc HDAC6 so với tất cả các HDAC khác (khoảng

10

1000 lần) ngoại trừ HDAC8 (57 lần) Tubastatin A còn có khả năng chống lại quá trình chết của tế bào thần kinh tác dụng này phụ thuộc vào liều Ngoài ra, dẫn chất này còn làm giảm sự phát triển của ung thư đường mật trong cơ thể người [8]

Nexturastat A là dẫn chất N-hydroxybenzamid có khả năng ức chế HDAC6 mạnh

và chọn lọc, gấp 190 lần so với các HDAC khác Ngoài ra dẫn chất này còn có khả năng

ức chế sự phát triển của tế bào u ác tính [20]

Hình 1.7 Cấu trúc của một số dẫn chất N-hydroxybenzamid

Dựa trên hướng nghiên cứu trên nhóm nghiên cứu trường Đại học Dược Hà Nội

đã tiến hành tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học của 8 dẫn chất N-hydroxybezamid

được trình bày ở phần sau của khóa luận

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỔNG HỢP DẪN CHẤT CỦA ACID HYDROXAMIC

Do tầm quan trọng của acid hydroxamic nên một số phương pháp tổng hợp đã được đề xuất và đi từ nhiều nguồn nguyên liệu ban đầu khác nhau Acid hydroxamic là sản phẩm thu được từ phản ứng giữa các dẫn chất của acid carboxylic như este, clorid acid, anhydrid… với hydroxylamin Hydroxylamin là tác nhân được sử dụng chủ yếu trong các phản ứng tổng hợp acid hydroxamic và thường được sử dụng ở dạng muối hydroclorid [12]

1.4.1 Tổng hợp dẫn chất của acid hydroxamic từ acid carboxylic

Phương pháp tổng hợp acid hydroxamic từ acid carboxylic thường trải qua nhiều giai đoạn và cho hiệu suất thấp [38] Acid hydroxamic có thể thu được bằng cách sử dụng các hydroxylamin có nhóm bảo vệ phản ứng với các acid carboxylic với sự có mặt của EDCl/NEt3 Các nhóm bảo vệ của hydroxylamin được loại bỏ phụ thuộc vào bản chất của từng nhóm bảo vệ Các silyl ether được loại bỏ bằng cách xử lý TBAF (tetra-

11

n-butylammonium fluorid) trong THF (tetrahydrofuran) ở nhiệt độ phòng, trong khi

nhóm O-benzyl có thể được loại bỏ bằng quá trình hydro hóa [48]

Sơ đồ 1.3 Quy trình tổng hợp acid hydroxamic từ hydroxylamin được bảo vệ

Do khả năng phản ứng của acid carboxylic tự do thấp nên các acid carboxylic thường được hoạt hóa bằng phản ứng acyl hóa với tác nhân là SOCl2 Sau đó, dẫn chất acyl clorid phản ứng với hydroxylamin để thu được acid hydroxamic Phản ứng được tiến hành trong điều kiện khan vì nước có thể gây thủy phân acyl halogenid Ngoài ra,

có thể sử dụng một số base (TEA, pyridin) để hấp thụ HCl được tạo thành trong quá trình [15]

Sơ đồ 1.4 Quy trình tổng hợp acid hydroxamic sử dụng SOCl2

1.4.2 Tổng hợp dẫn chất của acid hydroxamic từ este

Một trong những phương pháp được sử dụng nhiều nhất để tổng hợp acid hydroxamic là phương pháp đi từ este Methyl este và ethyl este thường được chọn làm nguyên liệu ban đầu để thu được acid hydroxamic Chúng phản ứng khá tốt với dung dịch hydroxylamin với sự có mặt của base (KOH hoặc NaOH) Phản ứng xảy ra ở điều kiện từ 0-5°C với hiệu suất khá cao Ngoài ra cũng có thể sử dụng KCN xúc tác để đẩy nhanh phản ứng giữa ethyl este và hydroxylamin khi không có base [21], [14]

Sơ đồ 1.5 Quy trình tổng hợp acid hydroxamic từ este

1.4.3 Tổng hợp dẫn chất của acid hydroxamic từ aldehyd

Aldehyd là một nhóm chức dễ chuyển đổi thành acid hydroxamic bằng các phản ứng khác nhau [13] Quá trình chuyển hóa aldehyd thơm bằng phản ứng oxy hóa trong dung dịch Na2N2O3 (sodium trioxodinitrat(II) monohydrat) nhanh chóng thu được sản phẩm tương ứng Ngoài ra, acid hydroxamic có thể được tổng hợp bằng cách sử dụng

N-hydroxysuccinimid và coban diacetat làm chất xúc tác Phản ứng tạo ra sản phẩm phụ

như acid carboxylic [36]

Phương pháp quang hóa đã được nghiên cứu bởi Papadopoulos và cộng sự, phản ứng xảy ra giữa aldehyd với diisopropyl azodicarboxylat (DIAD), trong đó sử dụng

12

acid phenylglyoxylic là chất xúc tác Sau 2 giờ, hydroxylamin hydroclorid và triethylamin được thêm vào để thu được acid hydroxamic tương ứng hiệu suất cao [33]

Sơ đồ 1.6 Quy trình tổng hợp acid hydroxamic từ aldehyd

Như vậy, acid hydroxamic có thể được tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau Mỗi phương pháp có ưu, nhược điểm riêng, tuy nhiên quá trình tổng hợp đi từ este

và acid carboxylic tác dụng với hydroxylamin là phổ biến hơn cả Phương pháp đi từ este có điều kiện phản ứng đơn giản, dễ tổng hợp và hiệu suất cao nên nhóm nên nhóm nghiên cứu đã tiến hành tổng hợp 8 dẫn chất trong khóa luận bằng phương pháp này

13

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất

Dung môi, hoá chất dùng phân tích, kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn HPLC

Các dung môi, hóa chất dùng cho tổng hợp hóa học được nhập từ công ty Sigma-Aldrich hoặc Merck Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua thêm bất kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:

- Bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh để chạy sắc ký lớp mỏng

- Đèn tử ngoại VILBER LOURMAT bước sóng 254 nm và 365 nm

- Cân phân tích, cân kỹ thuật Shimadzu

- Máy cất quay chân không Buchi R-200

- Tủ lạnh, tủ sấy Memmert, máy siêu âm

- Máy Melting point apparatus Smp3 để xác định nhiệt độ nóng chảy

- Máy Shimadzu FTIR Affinity-1S để xác định phổ IR

- Máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM để ghi phổ MS, đặt tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy cộng hưởng từ Bruker AV-500 để ghi phổ 1H-NMR, 13C-NMR đặt tại khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Kiểm tra độ tinh khiết

- Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được

2.2.2 Đánh giá tác dụng sinh học của các dẫn chất tổng hợp được

Thử độc tính trên một số tế bào ung thư: tế bào ung thư đại tràng (SW620), tế

bào ung thư vú (MDA-MB-231), tế bào lưỡng bội bào thai người (MRC-5)

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

+ Phản ứng khử hóa nhóm NO2 với tác nhân SnCl2/HCl

+ Phản ứng tạo amin hóa khử với tác nhân là các benzaldehyd

+ Phản ứng tạo acid hydroxamic với tác nhân hydroxylamin hydroclorid

- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

15

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Độ tinh khiết của sản phẩm sau khi tinh chế được kiểm tra bằng hai cách:

- Sử dụng sắc kí lớp mỏng

- Đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.1.3 Khẳng định cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được

Các dẫn chất sau khi được tổng hợp và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được khẳng định cấu trúc bằng các phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân proton (1H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR): ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại bộ môn Hóa

vô cơ, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội với kỹ thuật viên nén KBr, quét phổ trong vùng 4000-400 cm-1 Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm Ghi phổ ở độ phân giải 4 cm-1

- Phổ khối lượng (MS): được ghi bằng máy khối phổ LTQ Orbitrap XLTM tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hoạt động theo phương pháp ion hóa phun bụi điện tử ESI, chế độ ESI(+)-MS, dung môi MeOH

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại đặt tại khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, phổ 1H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13C-NMR đo ở tần số 125 MHz Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc

là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS), nhiệt độ ghi phổ khoảng 300K, dung

môi DMSO-d6

2.3.2 Đánh giá hoạt tính sinh học

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro được tiến

hành tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc Dòng tế bào thử nghiệm: SW620 (tế bào ung thư đại tràng), MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú) và MRC-5 (tế bào lưỡng bội bào thai người) Các dòng tế bào ung thư được lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư của Viện nghiên cứu Sinh học và Công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường RPMI bổ sung 10% FBS (huyết thanh bào thai bò) Thử độc tính tế bào theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB)

Chất đối chiếu dương tính: SAHA (Vorinostat), ADR (Adriamycin)

Bước 2: Cố định tế bào và nhuộm màu

Các tế bào được cố định bằng những lớp mỏng 50 µl dung dịch tricloroacetic 50% lạnh lên trên môi trường nuôi cấy trong mỗi đĩa và được ủ ở 4ºC trong 1 giờ để tế bào tự tái tạo, rồi sau đó rửa 5 lần với nước cất, loại bỏ phần nước dư Các đĩa được để khô trong không khí và được nhuộm với sulforhodamin B (SRB) 0,04% trong acid acetic 1% Thời gian nhuộm là 30 phút rồi rửa bằng acid acetic 1% để loại thuốc nhuộm tự do, không kết dính Loại bỏ hết acid acetic còn dư và để các đĩa khô ngoài không khí

Bước 3: Đo độ hấp thụ màu

Các đĩa sau khi được để khô ở nhiệt độ phòng, phần thuốc nhuộm còn lại được hòa tan bằng 100 ml dung dịch chứa 10 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan, đồng thời đặt đĩa trong máy lắc khoảng 10 phút Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 510 nm

Tính kết quả

Giá trị % tế bào sinh trưởng ở nồng độ 10 mM là kết quả số lượng tế bào còn khả năng sinh trưởng trên tổng số tế bào đem đi thử ở nồng độ 10 mM Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 4 lần đo độc lập với độ khác nhau không quá 5%

18

3.1.1.1 Tổng hợp hỗn hợp chất trung gian methyl 4-((6-nitro-1H-benzo[d]I 1-yl)methyl)benzoat (II) và methyl 4-((5-nitro-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)methyl)benzoat (III)

Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng hợp hỗn hợp chất trung gian II và III

Cách tiến hành

Cân 244,5 mg chất I (1,5 mmol) vào bình cầu 50 mL sạch, khô, thêm 5 mL dung

môi DMF (dimethylformanid) vừa đủ để hòa tan Thêm khoảng 300 mg K2CO3, hỗn

hợp được khuấy ở 50℃ trong 1 giờ Thêm tiếp 340,5 mg methyl 4-bromomethylbenzoat

(1,5 mmol, 1 đương lượng) và 20 mg KI Phản ứng được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng

Cách xử lý

Sau khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được tủa trên đá nước cất rồi trung hòa bằng dung dịch HCl 5%, kiểm tra bằng giấy chỉ thị vạn năng Hỗn hợp được làm lạnh ở -10℃ Tiến hành lọc tủa, sấy ở khoảng 50℃ thu được 550,6 mg sản phẩm hỗn hợp chất

trung gian II, III

Kết quả

- Cảm quan: hỗn hợp chất rắn màu trắng

- Rf = 0,43 (hệ dung môi pha động DCM : MeOH = 24:1)

3.1.1.2 Tổng hợp chất trung gian methyl yl)methyl)benzoat (IV) và methyl 4-((5-amino-1H-benzo[d]imidazol-1- yl)methyl)benzoat (V)

19

Sơ đồ 3.3 Phản ứng tổng hợp chất trung gian IV và V

Cách tiến hành

Cho toàn bộ 550,6 mg hỗn hợp chất trung gian II, III vào bình cầu 100 mL Cân

tiếp 1,83 g SnCl2.2H2O (Tin (II) clorid dihydrat) (9,67 mmol, 7 đương lượng) Thêm tiếp 20 mL ethyl acetat vào bình cầu Thêm 5-6 giọt HCl đặc vào và khuấy hỗn hợp ở nhiệt độ phòng khoảng 3 giờ và theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng

Cách xử lý

Phản ứng kết thúc, thêm dung dịch Na2CO3 vào hỗn hợp phản ứng đến pH = 11 Gạn lấy dịch lọc trong, tiến hành chiết với 30 mL ethyl acetat trong bình gạn Tiến hành chiết tương tự như vậy đến khi lớp EA không còn bắt huỳnh quang ở bước sóng 254

nm Gộp dịch chiết và cô quay dưới áp suất giảm (khoảng 65℃) đến khi thu được cắn Tiến hành tinh chế cắn thu được bằng sắc ký cột với hệ pha động DCM : MeOH (chạy

gradient từ 0% - 2% MeOH) Kết quả thu được 230,5 mg chất IV và 208,2 mg chất V

yl)methyl)-a, Tổng hợp chất trung gian methyl

4-((6-(benzylamino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIa)

Sơ đồ 3.4 Phản ứng tổng hợp chất trung gian VIa

20

Cách tiến hành

Lấy toàn bộ 230,5 mg chất IV hòa tan trong 30 mL MeOH Thêm vào trong bình

khoảng 107,8 mg (1,5 đương lượng) benzaldehyd và 5-6 giọt acid acetic băng Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút Nhỏ từ từ vào bình phản ứng 64,1 mg (1,5 đương lượng) NaBH3CN đã được hòa tan trong 3 mL Duy trì phản ứng ở nhiệt độ phòng và theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng

Cách xử lý

Phản ứng kết thúc, cất loại dung môi MeOH dưới áp suất giảm, thu được cắn Thêm tiếp khoảng 50 mL NaHCO3 bão hòa vào bình cầu Đem chiết hỗn hợp trong nước với DCM (3 lần x 30 mL) Làm khan lớp DCM thu được bằng Na2SO4 Cô quay loại DCM dưới áp suất giảm thu được cắn Tiến hành tinh chế cắn thu được bằng sắc ký cột với hệ pha động DCM:MeOH (chạy gradient từ 0% - 2% MeOH) Thu được 289,1 mg

Lấy toàn bộ 289,1 mg sản phẩm trung gian VIa vào bình cầu 100 mL Thêm tiếp

15 mL MeOH, siêu âm hỗn hợp thu được cho đến khi tạo hỗn dịch mịn Thêm tiếp 15 đương lượng hydroxylamin hydroclorid vào bình cầu Hỗn hợp được duy trì ở nhiệt độ 0℃ Sau 15 phút, thêm từ từ NaOH bão hòa vào hỗn hợp phản ứng đến pH 12, kiểm tra bằng giấy chỉ thị Khoảng 15 phút sau kiểm tra lại pH, nếu giảm thì tiếp tục thêm NaOH đến pH 12, theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng

Cách xử lý

Kết thúc phản ứng, cho hỗn hợp phản ứng ra cốc có mỏ, thêm khoảng 30 mL nước cất Thêm chậm dung dịch HCl 5% đến pH 7-8 Để hỗn hợp đã xử lý vào tủ âm,

21

khoảng 12 giờ Sau đó, tiến hành lọc tủa thu được, sấy khô sản phẩm ở nhiệt độ khoảng

50℃, thu được 304,5 mg chất VIIa

4-((6-((2-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-Sơ đồ 3.6 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIIb

4-((6-((2-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIb)

4-((6-((2-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIb)

được tổng hợp bằng phản ứng giữa amin IV và 2-Clorobenzadehyd trong môi trường

methanol xúc tác NaBH3CN và CH3COOH

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian VIa: Sử dụng 230,5 mg chất IV

và thu được 273,3 mg sản phẩm VIb

4-((6-((3-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIIc

4-((6-((3-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIc)

4-((6-((3-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIc)

được tổng hợp bằng phản ứng giữa amin IV và 3-Clorobenzadehyd trong môi trường

methanol xúc tác NaBH3CN và CH3COOH

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian VIa: Sử dụng 230,5 mg chất đầu IV và thu được 323,7 mg sản phẩm VIc

23

- Rf = 0,51 (Hệ dung môi pha động DCM : MeOH = 9:1)

- Tnc = 176,4-177,3oC

3.1.1.6 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (VIId)

4-((6-((4-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất VIId

4-((6-((4-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VId)

4-((6-((4-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VId)

được tổng hợp bằng phản ứng giữa amin IV và 4-Clorobenzadehyd trong môi trường

methanol xúc tác NaBH3CN và CH3COOH

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian VIa: Sử dụng 230,5 mg chất đầu IV và thu được 335,8 mg sản phẩm VId

24

3.1.1.7 Tổng hợp dẫn chất

4-((5-(clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IXa)

Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp dẫn chất IXa

4-((5-(clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIIIa)

4-((5-(clorobenzylamino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIIIa)

được tổng hợp bằng phản ứng giữa amin V và benzadehyd trong môi trường

methanol xúc tác NaBH3CN và CH3COOH

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian VIa: Sử dụng 208,2 mg chất đầu V và thu được 262,1 mg sản phẩm VIIIa

25

3.1.1.8 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IXb)

4-((5-((2-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp dẫn chất IXb

4-((5-((2-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIIIb)

4-((5-((2-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat

(VIIIb) được tổng hợp bằng phản ứng giữa amin V và 2-Clorobenzadehyd trong môi

trường methanol xúc tác NaBH3CN và CH3COOH

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian VIa: Sử dụng 208,2 mg chất đầu V và thu được 254,5 mg sản phẩm VIIIb

26

3.1.1.9 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IXc)

4-((5-((3-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-Sơ đồ 3.11 Quy trình tổng hợp dẫn chất IXc

4-((5-((3-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIIIc)

4-((5-((3-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat

(VIIIc) được tổng hợp bằng phản ứng giữa amin V và 3-Clorobenzaldehyd trong

môi trường methanol xúc tác NaBH3CN và CH3COOH

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian VIa: Sử dụng 208,2 mg chất đầu V và thu được 276,7 mg sản phẩm VIIIc

27

3.1.1.10 Tổng hợp dẫn chất yl)methyl)-N-hydroxybenzamid (IXd)

4-((5-((4-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-Sơ đồ 3.12 Quy trình tổng hợp dẫn chất IXd

4-((5-((4-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat (VIIId)

4-((5-((4-clorobenzyl)amino)-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl)benzoat

(VIIId) được tổng hợp bằng phản ứng giữa amin V và 2-Clorobenzaldehyd trong

môi trường methanol xúc tác NaBH3CN và CH3COOH

Quy trình tương tự như tổng hợp chất trung gian VIa: Sử dụng 208,2 mg chất đầu V và thu được 279,3 mg sản phẩm VIIId

28

Bảng 3.1 Hiệu suất toàn phần của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các sản phẩm sau khi được tổng hợp, xử lý và tinh chế bao gồm các dẫn chất VIIa-d và IXa-d đều được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) và đo

nhiệt độ nóng chảy Các kết quả về Rf và to

nc của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d được

trình bày cụ thể ở bảng 3.2

- Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 với 3 hệ dung môi khác nhau là DCM:MeOH (90:1), DCM:MeOH (14:1), DCM:MeOH (9:1), tiến hành quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Kết quả TLC cho thấy các sản phẩm đều có vết gọn, rõ, không có vết phụ

- Đo nhiệt độ nóng chảy

Các dẫn chất VIIa-d và IXa-d sau khi được kết tinh lại đều ở thể rắn, do đó có

thể tiến hành xác định nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện

Kết quả được trình bày trong bảng 3.1, nhận thấy các dẫn chất VIIa-d và IXa-d đều có

nhiệt độ nóng chảy xác định (khoảng dao động nhiệt độ hẹp)

29

Bảng 3.2 Giá trị Rf và tº nc của dẫn chất VIIa-d và IXa-d

Nhận xét: Dựa trên các kết quả khảo sát về giá trị Rf và tºnc có thể sơ bộ khẳng

định được dẫn chất VIIa-d và IXa-d là tinh khiết và có thể sử dụng để thực hiện các

bước xác định cấu trúc bằngcác phương pháp phổ IR, MS, 1H-NMR, 13C-NMR

3.1.3 Xác định cấu trúc

Các phương pháp phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng

từ hạt nhân proton (1H-NMR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13C-NMR) được sử

dụng để khẳng định cấu trúc của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d đã tổng hợp được Kết

quả ghi phổ cụ thể của các chất được trình bày trong phần phân tích phổ và phụ lục (PL1-PL4)

3.1.3.1 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR)

Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d được trình

bày trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phổ IR của các dẫn chất VIIa-d và IXa-d