Kiểm tra vi sinh vật

Kiểm tra định tính, định lượng• Định tính: Có hay không có sự hiện diện của vi khuẩn mục tiêu trong 25 g mẫu • Định lượng: Mật độ Colony Forming Unit CFU/ 10 hay 25 g mẫu... A CFU/g ha

KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG SẢN

PHẨM THỦY SẢN

Nguyễn Hoàng Nam Kha

Bộ môn Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy Sản

ĐH Nông Lâm TPHCM.

Khai Thác TS

CBTS

Bảo quản, vận chuyển nguyên liệu

SPTS

Kiểm tra chất lượng sản phẩm thủy sản

• Chất lượng: Sự thỏa mãn của người tiêu dùng với chi phí đã chi trả

• Kiểm tra: Vi sinh, hóa học và cảm quan theo tiêu chuẩn

– Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN)

KIỂM TRA VI SINH

-Định tính

-Định lượng

Kiểm tra định tính, định lượng

• Định tính: Có hay không có sự hiện diện của vi khuẩn mục tiêu

trong 25 g mẫu

• Định lượng: Mật độ (Colony Forming Unit) CFU/ 10 hay 25 g

mẫu

– Tên gọi: Total Plate Count (TPC), Aerobic

Plate Count (APC), Total Viable Count (TVC), Standard Plate Count (SPC)

• Phương pháp cấy mẫu:

– Cấy trang (trải mẫu): Spread plate

– Đổ mẫu: (Pour plate)

Đồng nhất và pha loãng mẫu theo hệ số 10

Chuyển 1 ml mẫu pha loãng vào đĩa petri

(Mỗi nồng độ 2 đĩa)

Rót vào mỗi đĩa 15-20 ml PCA (45 o C) (Plate count Agar)

Lắc đều cho mẫu phân tán đều trong PCA

Ủ 30 o C, 72 h

Đếm khuẩn lạc trong đĩa có số lượng trong khoảng 25-250

Tính kết quả: Tổng số VSV hiếu khí (CFU/g hay CFU/ml)

Xác định Tổng số Vi khuẩn hiếu khí

A (CFU/g hay ml) = N

n1Vf1+…+ ni Vfi

A: Tổng số vi khuẩn hiếu khí trong 1 g hay ml mẫu N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

ni: Số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: Thể tích (ml) mẫu đã cấy vào mỗi đĩa

fi: Độ pha loãng tương ứng tại đĩa đã đếm

Coliforms, Coliforms chịu nhiệt,

Coliforms phân và E coli

• Coliforms: Trực khuẩn gram âm không sinh bào

tử, hiếu hoặc kỵ khí tùy ý, hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, ruột người và động vật

– Vi sinh vật chỉ thị khả năng hiện diện của các

Coliforms, Coliforms chịu nhiệt,

Coliforms phân và E coli

• Coliforms chịu nhiệt: Coliforms lên men Lactose sinh hơi

ở 44,5oC trong môi trường canh EC

• Coliforms phân (Faecal coliforms) hay E coli giả định: Coliforms chịu nhiệt sinh indol trong canh Trypton ở 44,5oC

– Có nhiều trong phân người và động vật máu nóng nên có giá trị trong chỉ thị nhiễm phân

• E coli: Coliforms phân cho IMViC ++ (Indol +, Methyl red +, Voges Proskauer -, Citrate -)

Định lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt,

Coliforms phân và E coli

Đồng nhất mẫu và pha loãng theo hệ số 10

Cấy 1 ml các mẫu vào đĩa Petri, rót 5 ml TSA (45 o C)

(Tryptic Soy Agar), lắc đều, để yên trong 1-2 h

Rót 10-15 ml VRBA (45oC) (Violet Red Bile Agar),

để đông, ủ 37 o C, 24-48h

Đếm số khuẩn lạc màu đỏ đậm, có vòng tủa muối mật,

Đường kính >0,5 mm, chọn 5 khuẩn lạc

Violet Red Bile Agar: VRBA

Crystal Violet + bile salt: ức chế vk Gram (+)

Cấy vào canh BGBL, ủ 37 o C, 24-48 h

(Brilliant Green Bile Lactose Broth)

Đếm ống canh (+) (sinh hơi)

Mật độ Coliforms phân

Thử nghiệm IMViC

Đếm số ống canh EC(+) và IMViC + + - -, tính % E coli

Mật độ E coli

Chọn ống canh (+)(sinh hơi)

Cấy vào ống canh EC,

Ủ 45 o C, 24-48 h

Coliform chịu nhiệt

Brilliant Green Bile Lactose Broth:

Bile salt + Brilliant green ức chế vk G(+)

Sinh gas: coliform

EC broth:

Bile salt ức chế vk G(+)

Sinh gas: coliform

• Methyl red: chỉ thị màu (acid),lên men glucose

• VP: khả năng tạo và oxi hóa acetoin

• Biến dưỡng citrate: khả năng sử dụng citrate làm nguồn carbon.

• IMViC: dùng phân biệt các loài trong họ Enterobacteriaceae.

Sử dụng citrate

Khả năng

sinh

Indole

Tổng coliforms

• Coliforms: Gram-negative, rod-shaped facultatively anaerobic bacteria.

• The coliform group includes species from the

genera Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, and Citrobacter, and includes E coli.

of total coliforms and E coli in water and food samples.

Tổng coliforms

enzyme for coliforms, -D-galactosidase cleaves the

Salmon-GAL substrate and causes a salmon to red colour of the coliform colonies.

X-glucoronide is used for the identification of

-D-glucoronidase, which is characteristic of E coli E coli cleaves both Salmon-GAL and X-glucoronide ,

so that the positive colonies take on a dark-blue to violet colour.

Coliforms E coli

Tổng coliforms

• Petrifilm E coli/Coliform Count (EC) plates contain

Violet Red Bile (VRB) nutrients.

• Most E coli (about 97%) produce beta-glucuronidase which produces a blue precipitate associated with the colony.

• Coliform colonies growing on the Petrifilm EC plate produce acid which causes the pH indicator to make the gel color darker red

• E coli = 49

(blue colonies with gas)

• Total

coliform = 87 (red and blue colonies with gas)

• Trực khuẩn gram âm, hiếu hay kỵ khí tùy nghi, di

động, lên men glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men lactose và saccharose, indol (-), sinh

H2S.

• Gây bệnh thương hàn

• Có hơn 2339 serotype (kiểu huyết thanh)

– Kháng nguyên thân O (somatic) và kháng nguyên tiêm mao H (flagella)

– Loài: Tên riêng như Enteritidis (S enteritidis),

Typhimurium (S typhimurium), Paratyphi (S

paratyphi)

Salmonella – Quy trình định tính 4 bước

• Phục hồi

• Tăng sinh chọn lọc

• Phân lập

• Khẳng định

Kiểm tra phát hiện Salmonella

Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml BPW, ủ 37 o C, 18-24 h

Cấy 0,1 ml sang 2 loại canh tăng sinh chọn lọc RV (Rappaport Vassiliadis) ,…, ủ 42 o C, 18-24 h

Ria phân lập khuẩn lạc đơn trên 2 loại thạch chọn lọc

phân biệt như XLD (Xylose Lysine Desoxycholate), ủ 37 o C, 24 h

Cấy chuyển khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella sang

BHIA hay TSA, ủ qua đêm

Thử nghiệm sinh hóa:

Trên KIA/TSI: đỏ/vàng, có/không H2S, sinh hơi/không

Urea (-), Indol (-), VP (-), LDC (+), ODC (+), Mannitol (+), Sorbitol (+)

Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh Poly O, Poly H

Kết luận: Salmonella dương tính/âm tính trong 25g mẫu

Yeast extract 3g/lL-Lysine 5g/l

Lactose 7.5g/l

Sucrose 7.5g/lSodium deoxycholate 1g/l

Salmonella species: red colonies, some with black centers The agar itself

will turn red due to the presence of Salmonella type colonies.

Shigella species: red colonies.

Coliforms: yellow to orange colonies.

Pseudomonas aeruginosa: pink, flat, rough colonies This type of colony

can be easily mistaken for Salmonella due to the color similarities.

Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar) is a selective growth medium used in the isolation of Salmonella and Shigella species from clinical

samples and from food [1][2] It has a pH of approximately 7.4, leaving it with

a bright pink or red appearance due to the indicator phenol red Sugar

fermentation lowers the pH and the phenol red indicator registers this by

changing to yellow Most gut bacteria, including Salmonella, can ferment

the sugar xylose to produce acid; Shigella colonies cannot do this and therefore remain red After exhausting the xylose supply Salmonella

colonies will decarboxylate lysine, increasing the pH once again to

alkaline and mimicking the red Shigella colonies Salmonellae metabolise

thiosulfate to produce hydrogen sulfide, which leads to the formation of colonies with black centers and allows them to be differentiated from the

similarly coloured Shigella colonies.

Other Enterobacteria such as E coli will ferment the lactose and sucrose present in the medium to an extent that will prevent pH reversion by

decarboxylation and acidify the medium turning it yellow.

Phát hiện Salmonella

1 Tiền tăng sinh: môi trường tăng sinh không

chọn lọc (peptone kiềm): 37 0 C-18-24h.

2 Tăng sinh: môi trường tăng sinh chọn lọc

(Rappaport-Vassiliadis Soy Peptone Broth)

42 0 C-24h.

3 Phân lập: môi trường rắn chọn lọc

Xylitol-Lysine-Desoxycholate (XLD) agar hay Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS): 37 0 C-24h.

4 Khẳng định: PƯSH định danh

Rappaport Vassiliadis

• Typical Composition (g/litre)

• Peptone from soymeal 4.5;

magnesium chloride hexahydrate 29.0; sodium chloride 8.0 ; dipotassium hydrogen phosphate 0.4; potassium dihydrogen phosphate 0.6;

malachite green 0.036.

• Malachite green: ức chế VSV, vi khuẩn

• magnesium chloride: ASTT cao

• E coli on BPLS • Salmonella on BPLS

Thử nghiệm sinh hóa

• G (-), trực khuẩn, di động

• Lactose (-), Sucrose (-), Glucose (+), Urease (-), Indole (-), VP (-), TDA (-), Manitol (+).

• Phát hiện Salmonella bằng phương pháp ELISA

Thử nghiệm sinh hóa

Phát hiện Shigella

1 Tiền tăng sinh: môi trường tăng sinh không

chọn lọc (TSB): 37 0 C-16-20h.

2 Tăng sinh: môi trường tăng sinh chọn lọc

Gram Negative broth (GN) 37 0 C-16-24h.

3 Phân lập: môi trường rắn chọn lọc

Xylitol-Lysine-Desoxycholate (XLD) agar hay Hektoen Enteric (HEA): 37 0 C-48h.

4 Khẳng định: PƯSH định danh

Salmonella enterica (ATCC ® 14028)

colonies growing on XLD Agar (Cat no.

G65) Incubated aerobically for 24 hours

at 35 deg C.

growing on XLD Agar (Cat no G65) Incubated aerobically for 24 hours at 35 deg C

growth inhibited on XLD Agar (Cat no.

G65) Incubated aerobically for 24 hours at

35 deg C

Hektoen Enteric Agar

Salmonella-Shigella(SS) agar

Salmonella-Shigella(SS) agar

SS Agar - uninoculated SS Agar - E coli

SS Agar - Shigella

SS Agar - Salmonella

Vibrio (Phẩy khuẩn)

• Gram âm, hình que hơi cong hay

hay đầu không đều, di động,

catalase (+) và oxidase (+), lên men

glucose không sinh hơi, H2S (-)

• Phát triển tốt trong môi trường kiềm

(pH 9,6)

– V cholera: Gây bệnh tả (hội

chứng tiêu chảy cấp), có nhiều

trong môi trường nước ngọt

– V parahaemolyticus, V

vulnificus, V alginolyticus, có

nhiều trong nước lợ, biển, thuộc

hệ vi khuẩn của động vật biển

Vibrio (Phẩy khuẩn)

– Vi khuẩn hiện diện trong ruột cá biển, giáp xác

– Mật độ rất cao trong cơ thể nhuyễn thể

• Gây đau bụng, tiêu chảy

Kiểm tra phát hiện VIBRIO

Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 ml APW

ủ 37 o C,16-24 h Cấy phân lập trên Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar , ủ 37 o C, 24 h

Chọn khuẩn lạc đặc trưng - V cholera: khuẩn lạc vàng, Ф 2-3 mm

- V parahaemolyticus KL xanh, Ф 3-4 mm

Cấy thuần TSA chứa 1% NaCl, ủ 24 h, 37 o C

Thử nghiệm sơ bộ - KIA: đỏ/vàng, H2S (-), gas (-)

– Dung huyết beta

– Khuẩn lạc màu xám hay vàng nhạt

• Môi trường Baird Parker Agar:

– Potassium tellurite

– Tạo khuẩn lạc lồi, đen bóng, có vòng sáng bao quanh

• Tổng hợp enterotoxin ở nhiệt độ trên 15oC

• Phân bố rộng rãi tuy nhiên được phân lập nhiều từ da, vết thương màng nhày của

người và động vật máu nóng

– Vệ sinh công nhân

– Kiểm soát nhiệt độ lạnh trong chế biến, bảo quản

Staphylococcus aureus

Định lượng Staphylococcus aureus

Đồng nhất, pha loãng mẫu theo hệ số 10

Trải lên BPA (Baird Parker)

ủ 37 o C, 24-48 h

Trải lên thạch máu, ủ 37 o C, 24 h

Cấy thuần 5 khuẩn lạc đặc trưng

Tính tỷ lệ khuẩn lạc không đặc trưng coagulase (+)

Mật độ S aureus (CFU/g hay ml)

Dung huyết (haemolysis): alpha, beta, gama

Coagulase dương tính

Coagulase

âm tính

Mẫu âm tính

Đối chứng âm

Đối chứng dương

Mẫu dương tính

• Gram (+), hình que, kỵ khí, sinh bào tử

• Vi khuẩn ưa nhiệt, phân hủy chất hữu cơ trong điều kiện yếm khí tạo mùi khó chịu

– Lên men yếm khí saccharose tạo thành acetic, butyric acid, rượu

– Phân hủy protein tạo các sản phẩm trung gian

– Khử sulphite thành sulphur

• Hiện diện nhiều trong đất

– Một số gây bệnh cho người

– Một số gây ngộ độc thực phẩm: C perfringens,

C botulinum

• Nấm mốc: Đa bào, nấm dạng sợi, sinh sản bằng

– Gây bệnh đường hô hấp, dị ứng, độc tố hư hại gan

• Nấm men: Đơn bào, nấm dạng sợi giả, sinh sản kiểu nảy chồi

• Khuẩn lạc nấm phát triển có thể từ bào tử, tế

Nấm men, nấm mốc

• Sinh vật ưa mát: 20-28oC

• Phát triển trên cơ chất có nước hoạt tính khoảng 85%

• Môi trường nuôi cấy

– Nhiều chất bột đường: Tinh bột

– Có kháng sinh ức chế sự phát triển của vi khuẩn

– DG18: Dichloran Glycerol Agar, dùng nhiều cho ngũ cốc

– DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol dùng cho thực phẩm có hàm lượng nước cao

– Potato Dextrose Agar

– Sabouraud Dextrose Agar

Định lượng tổng số nấm men, nấm mốc

Đồng nhất mẫu, pha loãng theo hệ số 10

Trải 0,1 ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc DG18, ủ ngửa đĩa ở 25 o C, 5-7 ngày

Đếm khuẩn lạc nấm men, nấm mốc, tính mật độ (CFU/g)

Cấy thuần lên thạch nghiêng SDA, ủ 30 o C, 7 ngày

Định danh

Dichloran

(2mg/l): hóa chất kháng nấm

(antifungi): kiểm soát kích thước

và chiều rộng của khuẩn lạc nấm mốc và nấm men, đếm dễ dàng hơn

<0.95)

DG18: Dichloran Glycerol Agar

Rose Bengal

Chloramphenicol Agar

Rose Bengal: ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và hạn chế các loài vi sinh phát triển

nhanh (mould): giảm kích thước khuẩn lạc mold +nấm men KL hồng

Chloramphenicol:

kháng sinh

Potato Dextrose Agar

tartaric acid (10%)

to lower the pH of this medium to 3.5 +/- 0.1, inhibiting bacterial growth

Chloramphenicol

chloramphenicol