Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh Hemophilia A trước làm tổ.

NGUYỄN MINH TÂM

NGUYỄN MINH TÂM

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là toàn bộ số liệu trong đề tài nghiên cứu cótên “Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR phân tích các trình tự lặp ngắn trong chẩn đoán bệnhHemophilia A trước chuyển phôi tại Hà Nội” Mã số 01C-08/11-2017-3, Sở KH và CN thànhphố Hà Nội Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là một thành viên chính.Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép

sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sỹ Các số liệu, kết quả nêu trong luận

án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2023

Nguyễn Minh Tâm

Tôi đã hoàn thành luận án này với nỗ lực và cố gắng của bản thân Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và động viên của các thầy, cô, đồng nghiệp và người thân

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Đảng ủy, Ban giám đốc Học viện Quân y, Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, Bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội, Phòng sau Đại học - Học viện Quân y, Bộ môn Giải phẫu - Học viện Quân Y đã cho phép, tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:

GS.TS Nguyễn Duy Bắc - Trưởng phòng đào tạo, Học viện Quân Y và TS Nguyễn Thanh Tùng - Phó giám đốc viện Mô phôi lâm sàng Quân đội là những người Thầy tận tình, hết lòng vì học trò, đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo, cung cấp cho tôi những kiến thức và phương pháp luận quý báu trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Trần Ngọc Anh - chủ nhiệm Bộ môn, TS Đặng Tiến Trường - phó Chủ nhiệm Bộ môn và các thầy cô trong Bộ môn Giải phẫu Học viện Quân Y đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Thị Mai - Giám đốc Trung tâm Hemophilia - Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương, ThS Lê Thị Thu Hiền - Giám đốc Bệnh viện nam học và hiếm muộn Hà Nội cùng các đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu thập số liệu và nghiên cứu.

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng Chấm luận án đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận án

Cuối cùng tôi xin gửi lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn ở bên cạnh, động viên, chia sẻ những khó khăn để tôi yên tâm học tập và hoàn thành luận án!

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Minh Tâm

MỤC LỤC

Trang

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh Hemophilia A 2

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh, chẩn đoán, nguyên tắc điều trị bệnh Hemophilia A……… 3

1.2.4 Sinh thiết phôi 14

1.2.5 Đông lạnh và rã đông phôi 16

1.2.6 Chuyển phôi 17

1.3 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A 17

1.3.1 Lựa chọn phôi có bộ nhiễm sắc thể giới tính XX 18

1.3.2 Kỹ thuật chẩn đoán trực tiếp đột biến gen F8 19

1.3.3 Kỹ thuật chẩn đoán gián tiếp thông qua phân tích liên kết

1.4.1 Trên thế giới 28

1.4.2 Tại Việt Nam 29

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU31

2.1 Đối tượng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 31

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 31

2.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 32

2.2.2 Phương pháp chọn mẫu và cách tính cỡ mẫu 32

2.2.3 Phương tiện và vật liệu nghiên cứu 33

2.2.4 Các kỹ thuật được sử dụng 34

2.3 Các chỉ tiêu nghiên cứu 50

2.4 Xử lý số liệu 53

2.5 Sơ đồ nghiên cứu 53

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 55

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 56

3.1 Đánh giá tính đa hình của bộ chỉ thị STR liên kết với gen F8 phục vụ chẩn đoán trước làm tổtrên các mẫu phôi bào ở phụ nữ mang gen bệnh Hemophilia A 56

3.1.1 Kết quả các STR lựa chọn bằng công cụ Tin sinh học 56 3.1.2 Kết quả tối ưu hóa quy trình multiplex PCR khuếch đại các

3.1.3 Chỉ số dị hợp tử của các STR 63

3.1.4 Chuẩn hóa quy trình PGT - M trên mẫu tế bào phôi 67

3.2 Đánh giá kết quả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho một số cặp vợ chồng mang

3.2.2 Kết quả điều trị IVF/ICSI 75

3.2.3 Kết quả chẩn đoán trước làm tổ cho các gia đình mang gen bệnh 77

4.1.2 Kết quả tối ưu hóa quy trình multiplex PCR khuếch đại các

4.1.3 Chỉ số dị hợp tử của các STR 90

4.1.4 Chuẩn hóa quy trình PGT - M trên mẫu tế bào phôi 92

4.2 Đánh giá kết quả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho một

số cặp vợ chồng mang gen bệnh 96

4.2.1 Một số đặc điểm của các gia đình tham gia nghiên cứu

96

4.2.2 Kết quả điều trị IVF/ICSI 99

4.2.3 Kết quả chẩn đoán trước làm tổ của các gia đình mang gen bệnh 102

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

1 ADO : Allele dropout (mất alen)

2 AF : Amplification failure (khuếch đại thất bại)

3 AFC : Antral Follicle Count (số lượng nang thứ cấp)

5 ASRM : American Society for Reproductive Medicine (Hiệp hội y học

sinh sản Hoa Kỳ)

7 DOP PCR : Degenerate Oligonucleotide Primed PCR (PCR bằng mồi thoái

hóa)

8 ESHRE : European Society for Human Reproduction and Embryology

(Hiệp hội phôi và sinh sản người Châu Âu)

9 FISH : Fluorescence in situ hybridization (kỹ thuật lai huỳnh quang tại

chỗ)

10 FSH : Follicle Stimulating Hormone (hormone kích thích nang trứng)

11 hCG : Human Chorionic Gonadotropin (Gonadotropin chiết xuất từ

nước tiểu thai phụ)

12 Ho : Observed Heterozygosity (tần số dị hợp tử quan sát)

13 He : Expected Heterozygosity (tần số dị hợp tử lý thuyết)

13 hMG : Human Menopausal Gonadotropin (Gonadotropin chiết xuất từ

nước tiểu phụ nữ mãn kinh)

14 ICSI : Intracytoplasmic Sperm Injection (tiêm tinh trùng vào bào tương

20 PCR : Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi polymerase)

21 PGD : Preimplantation Genetic Diagnosis (chẩn đoán di truyền trước

chuyển phôi)

22 PGDIS : PGD International Society (hiệp hội Quốc tế PGD)

chuyển phôi)

24 PGT-A : Preimplantation genetic testing for aneuploidy (xét nghiệm di

truyền phát hiện các bất thường lệch bội nhiễm sắc thể)

25 PGT-M : Preimplantation genetic testing for monogenic disorders (xét

nghiệm di truyền trước chuyển phôi cho bệnh di truyền đơn gen)

27 SNP : Single nucleotide polymorphism (đa hình đơn nucleotide)

28 STR : Short Tandem Repeat (trình tự lặp ngắn)

29 Single PCR : Single PCR (PCR đơn mồi)

30 WGA : Whole Genome Amplification (khuếch đại toàn bộ hệ gen)

Bảng Tên bảng Trang

Bảng 2.1 Thành phần D2 42

Bảng 2.2 Thành phần Mastermix 42 Bảng 2.3 Trình tự mồi khuếch đại các chỉ thị STR 44 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng Singleplex PCR (tổng thể tích phản ứng 20µl) 45

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng Singleplex PCR 46

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng Multiplex PCR gắn màu huỳnh quang 46 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR gắn màu huỳnh quang 47

Bảng 2.8 Thông tin mồi huỳnh quang 47

Bảng 2.9 Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản 47

Bảng 2.10 Chu trình nhiệt biến tính DNA 48 Bảng 2.11 Phân loại phôi nang 57

Bảng 3.1 Thông tin các STR lựa chọn được 61 Bảng 3.2 Nồng độ mồi trong phản ứng multiple PCR cho DNA từ máu 66 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR tối ưu cho DNA từ máu 68

Bảng 3.4 Tần số alen của 13 STR 69 Bảng 3.5 Kết quả tính toán chỉ số Ho, He 70

Bảng 3.6 Kết quả định lượng sản phẩm WGA đo bằng phương pháp Qu-bit 74

Bảng 3.7 Nồng độ mồi tối ưu cho DNA từ phôi 76

Bảng 3.8 Chu trình nhiệt phản ứng Multiplex PCR tối ưu cho DNA từ phôi 76

Bảng 3.9 Một số đặc điểm của các gia đình tham gia nghiên cứu 77

Bảng 3.10 Tình trạng mang thai và sinh con của các cặp vợ chồng 78

Bảng 3.11 Tần suất các đột biến gen F8 ở các gia đình 79

Bảng 3.12 Kết quả điều trị IVF/ICSI79

Bảng 3.14 Tỷ lệ ADO của các markers 81

Bảng 3.15 Số lượng phôi, số phôi được chuyển, kết quả chuyển phôi của các gia đình

82

Bảng 3.16 Phân loại phôi theo đột biến di truyền 83Bảng 3.17 Kết quả rã đông và chuyển phôi nang trên 19 chu kỳ 83

Hình Tên hình Trang

Hình 1.1 Sơ đồ đông máu theo con đường nội sinh và ngoại sinh 5

Hình 1.2 Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia7

Hình 1.3 Vị trí gen F88

Hình 1.4 Cấu trúc gen và protein FVIII 9

Hình 1.5 Cơ chế gây đột biến đảo đoạn intron 1 và intron 22 của gen F8 (b1, b2) 11 Hình 1.6 Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A ở Việt Nam 13 Hình 1.7 Sinh thiết thể cực 17

Hình 1.8 Sinh thiết phôi đoạn phân cắt 17

Hình 1.9 Sinh thiết phôi nang 18

Hình 1.10 Kiểm soát hiện tượng ADO trong phân tích kết quả khuếch đại STR 25 Hình 2.1 Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để lựa chọn 39 Hình 2.2 Giao diện phân tích kết quả phần mềm Genemapper 4.0.48

Hình 2.3 Chuẩn bị đĩa sinh thiết phôi 51

Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu 59

Hình 3.1 Sơ đồ vị trí các STR trên NST X sử dụng trong nghiên cứu 62

Hình 3.2 Kết quả tối ưu hóa các mồi X1 đến X5 ở dải nhiệt độ 55, 60, 650C 63 Hình 3.3 Kết quả tối ưu hóa các mồi X6 đến X10 ở dải nhiệt độ 55, 60, 650C 63 Hình 3.4 Kết quả tối ưu hóa các mồi X11 đến X15 ở dải nhiệt độ 55, 60, 650C 64 Hình 3.5 Kết quả điện di mao quản phản ứng multiplex PCR 14 cặp mồi có cùng nồng độ phản ứng là 0,2µM 65

Hình 3.6 Kết quả điện di mao quản phản ứng multiplex PCR 14 cặp mồi sau khi đã hiệu chỉnh nồng độ phản ứng 67

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm sau WGA 73

Hình 3.8 Kết quả điện di mao quản sau khi tối ưu hóa nồng độ mồi bằng phản ứng Multiplex PCR 75

Hình 3.9 Minh họa kết quả chẩn đoán trước sinh 84 Hình 3.10 Kết quả điện di mao quản của các marker STR trong gia đình 09 86 Hình 3.11 Kết quả điện di mao quản của các marker STR trong gia đình 11 88 Hình 3.12 Kết quả điện di mao quản của các marker STR trong gia đình 14 89

Hình 4.1 Minh họa quy trình PGT-M bệnh Hemophilia A 99 Hình 4.2 Sự di truyền bệnh Hemophilia A qua các thế hệ 103

Biểu đồ Tên biểu đồ Trang

Biểu đồ 1.1 Các dạng đột biến trên bệnh nhân Hemophilia A ở Việt Nam (A) và phân bố

tỷ lệ các dạng đột biến trên các vùng của gen F8 (B) 12

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ phần trăm mẫu máu theo số lượng chỉ thị dị hợp tử 71

Biểu đồ 3.3 Tỉ lệ phần trăm mẫu dị hợp tử theo số lượng chỉ thị nằm phía trước và phía sau gen F8 (n=103) 72

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền liên kết nhiễm sắc thể (NST) X, do đột

biến gen F8, giảm yếu tố VIII, gây chảy máu khó đông, có thể dẫn tới tử vong Trên thế giới, tỷ lệ

mắc bệnh khoảng 1/5000 ở nam giới Điều trị Hemophilia A chủ yếu bằng truyền máu tươi hoặcyếu tố VIII nên kinh phí điều trị rất cao và không giải quyết được nguyên nhân bị bệnh Vì vậy,việc dự phòng không sinh con bị bệnh hoặc không mang gen là rất cần thiết

Kỹ thuật chẩn đoán trước sinh giúp tránh sinh con bị bệnh dựa trên việc chọc ối ở thời điểmthai 16 tuần tuổi Tuy nhiên, cặp vợ chồng mang gen phải đối mặt với nguy cơ đình chỉ thai khithai nhi bị bệnh Để khắc phục hạn chế này, chẩn đoán trước làm tổ (Preimplantation GeneticTesting - PGT) được ưu tiên sử dụng PGT là sự kết hợp giữa kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm(In vitro fertilization - IVF) tạo phôi với việc xét nghiệm di truyền nhằm lựa chọn phôi không bịbệnh Việc lựa chọn trên nhiều phôi giúp khả năng chọn được phôi và mang thai không bị bệnhcao hơn nhiều việc chỉ lựa chọn trên một thai nhi trong chẩn đoán trước sinh

Gen F8 lớn, đột biến trong bệnh Hemophilia A phức tạp nên khó có một kỹ thuật xác định trực tiếp các đột biến gen F8 trên tế bào phôi Bên cạnh đó, hiện tượng mất alen (allele dropout -

ADO) ở mẫu tế bào phôi, được xác định trên 40% các ca chẩn đoán trước làm tổ có thể dẫn tớichẩn đoán sai Ngoài ra, ngoại nhiễm cũng là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây chẩn đoán saitrong chẩn đoán trước làm tổ Do vậy, kỹ thuật phân tích liên kết gen sử dụng nhiều trình tự lặpngắn (Short Tandem Repeat - STR) giúp chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A được ưutiên lựa chọn vì giúp kiểm soát ADO và ngoại nhiễm

Các trình tự lặp ngắn phục vụ chẩn đoán trước làm tổ phải có tính đa hình cao và nằm gầngen đột biến để đảm bảo tính liên kết Tần số dị hợp tử quan sát là một trong những chỉ tiêu quantrọng đánh giá tính đa hình của các trình tự lặp ngắn, quyết định giá trị của trình tự lặp ngắn trongchẩn đoán Tần số dị hợp tử quan sát càng cao, giá trị trình tự lặp ngắn trong chẩn đoán càng cao.Ngược lại, tần số dị hợp tử quan sát thấp, sử dụng các trình tự lặp ngắn này trong chẩn đoán ít cógiá trị, gây lãng phí về kinh tế, thời gian và công lao động Trên thế giới, một số nghiên cứu đãđánh giá tính đa hình trên quần thể người Brazil, New Zealand, Trung Quốc nhằm lựa chọn các

trình tự lặp ngắn phục vụ chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A , , , , Ngoài ra, lựa chọn cáctrình tự lặp ngắn nằm càng gần gen đột biến giúp hạn chế hiện tượng trao đổi chéo gây chẩn đoánsai

Tại Việt Nam có rất ít nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán trước làm tổ cho bệnh

Hemophilia A dựa trên phân tích trình tự lặp ngắn , Chưa có nghiên cứu đề cập đến tần số dị

hợp tử quan sát, tần số dị hợp tử lý thuyết và tỷ lệ ADO của các trình tự lặp ngắn ở quần thể ngườiViệt Nam được sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A, một số trình tự lặp

ngắn nằm khá xa gen F8 Vấn đề đặt ra cần xây dựng bộ STR có các chỉ số dị hợp tử cao, nằm trong gen hoặc gần gen F8 có thể ứng dụng trong chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử

trong chẩn đoán bệnh di truyền Hemophilia A trước làm tổ” nhằm các mục tiêu sau:

1 Đánh giá tính đa hình của bộ chỉ thị STR liên kết với gen F8 phục vụ chẩn đoán trước

làm tổ trên các mẫu phôi bào ở phụ nữ mang gen bệnh Hemophilia A

2 Đánh giá kết quả chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A cho một số cặp vợ chồngmang gen bệnh

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh Hemophilia A

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh Hemophilia A

Từ thời kỳ cổ đại, loài người đã biết đến bệnh máu khó đông, tuy nhiên không có tên gọichính thức cho nó Trong các văn tự cổ của người Do Thái từ thế kỷ thứ II trước công nguyên đãmiêu tả những đứa trẻ chết do chảy máu không cầm được sau khi cắt bao quy đầu (theo tục lệ củangười Do Thái: trẻ em trai sinh ra được cắt bao quy đầu) Bệnh máu khó đông được nhận thấy là

có tính di truyền hàng trăm năm qua các thế hệ trong một gia đình Vào những năm 1880, bệnhmáu khó đông đã được phát hiện di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính, các nhà khoa học

nhận thấy chỉ có nam giới mắc bệnh và không có khả năng truyền bệnh cho con trai, người mẹmang gen bệnh và truyền cho con trai mình

Bệnh máu khó đông còn được biết đến như căn bệnh của hoàng gia vì nữ hoàng AnhVictoria (1838-1901) mang gen bệnh và truyền bệnh cho nhiều thế hệ hoàng gia khác , , Năm

1937, Patek và Taylor phát hiện ra rằng họ có thể kiểm soát những khiếm khuyết của quá trìnhđông máu bằng cách thêm một chất chiết xuất từ huyết tương, chất này được gọi là globulin chốngchảy máu Bệnh máu khó đông được gọi là bệnh Hemophilia A, theo tên gọi của một trong cácyếu tố tham gia quá trình đông máu (yếu tố chống ưa chảy máu Hemophilia A - yếu tố VIII).Năm 1944, Pavlosky nghiên cứu ở Buenos Aires cho thấy máu của một bệnh nhân Hemophilia

có thể điều trị triệu chứng rối loạn đông máu của bệnh nhân Hemophilia khác và ngược lại, khitình cờ ông gặp hai bệnh nhân bị thiếu hụt hai protein khác nhau - yếu tố VIII và yếu tố IX Những phát hiện này cho phép chẩn đoán chính xác và xây dựng cơ sở khoa học cho việc điều trịbệnh rối loạn đông máu di truyền

1.1.2 Cơ chế bệnh sinh, chẩn đoán, nguyên tắc điều trị bệnh Hemophilia A

Hội nghị quốc tế năm 1959 về đông máu, đã quy định tên gọi của 12 các yếu tố đông máubằng các chữ số La Mã Có 12 yếu tố đông máu là: Fibrinogen (yếu tố I); Prothrombin (yếu tốII); Prothrombin của mô hoặc các yếu tố mô (yếu tố III); Ion canxi (yếu tố IV); Proaccelerin (yếu

tố V); Proconvectin (yếu tố VII); Yếu tố chống Hemophilia A (yếu tố VIII); Yếu tố chống

Hemophilia B (yếu tố IX); Yếu tố Stuart (yếu tố X); Yếu tố tiền thromboplastin huyết tương - yếu

tố chống Hemophilia C (yếu tố XI); Yếu tố Hageman - yếu tố chống Hemophilia D (yếu tố XII).Gần đây, đã phát hiện hai protein của huyết tương mới được xếp vào các nhóm yếu tố đôngmáu huyết tương là prekallikrein và kininogen trọng lượng phân tử cao

Quá trình đông máu của huyết tương là sự kết hợp giữa hai con đường đông máu nội sinh

và đông máu ngoại sinh Các hoạt động kế tiếp nhau của các enzyme trong chuỗi các phản ứngnối tiếp dẫn tới hình thành thrombin và chuyển fibrinogen thành fibrin, trong đó yếu tố VIII thamgia như một đồng yếu tố ,

Hình 1.1 Sơ đồ đông máu theo con đường nội sinh và ngoại sinh

biến dạng khớp, teo cơ do chảy máu nhiều lần ở khớp, cơ; tiền sử gia đình: có người nam giới liênquan họ mẹ bị chảy máu lâu cầm

- Xét nghiệm cận lâm sàng: thời gian đông máu kéo dài có thể hơn một giờ; chất lượng cụcmáu đông kém; thời gian Howel kéo dài; định lượng yếu tố VIII (FVIII) giảm hoặc không có; xét

nghiệm DNA phát hiện đột biến gen F8; yếu tố Von - Willebrand bình thường; số lượng tiểu cầu

bình thường; thời gian máu chảy bình thường; thời gian prothrombin bình thường; thời gianthrombin bình thường

* Chẩn đoán mức độ:

Hemophilia A được chia làm ba mức độ: nặng, trung bình và nhẹ

Mức độ nặng: hoạt tính FVIII dưới 1%, thường bị chảy máu vài lần trong tháng

Mức độ trung bình: hoạt tính FVIII từ 1-5%, chỉ bị chảy máu sau những chấn thương nhẹ.Mức độ nhẹ: hoạt tính FVIII từ 5-<40% so với mức bình thường, chỉ bị chảy máu sau phẫuthuật hoặc những chấn thương nặng, sau những động tác mạnh khi chơi thể thao ,

* Chẩn đoán phân biệt:

- Bệnh Von-Willebrand

- Các nguyên nhân khác gây APTT kéo dài: thiếu yếu tố XI bẩm sinh; thiếu yếu tốXII/prekalikrein/kininogen trọng lượng phân tử cao bẩm sinh (Hemophilia mắc phải; kháng thểkháng phospholipid)

1.1.2.3 Nguyên tắc điều trị

Ngay khi nghi ngờ có chảy máu cần áp dụng RICE để hỗ trợ cầm máu (RICE là chữ viếttắt của từ tiếng Anh: Rest = nghỉ ngơi, Ice = chườm đá; Compression = băng ép, Elevation = nângcao chỗ tổn thương)

Bổ sung yếu tố VIII đủ để cầm máu cho người bệnh càng sớm càng tốt khi có chảy máu.Nếu nghi ngờ chảy máu cần điều trị ngay Yếu tố VIII là chế phẩm sinh học có từ các nguồn sau:huyết tương tươi, huyết tương tươi đông lạnh, yếu tố VIII cô đặc nguồn gốc huyết tương người,yếu tố VIII cô đặc tái tổ hợp, yếu tố VIII có nguồn gốc từ lợn, yếu tố VIII tác dụng kéo dài Nồng

độ yếu tố VIII cần đạt phụ thuộc vào vị trí chảy máu, mức độ chảy máu và mục đích điều trị (để

cầm máu hay phòng chảy máu, phòng chảy máu khi mổ,…) Không dùng thuốc ảnh hưởng đếnchức năng tiểu cầu, hạn chế tiêm bắp tối đa

1.1.3 Di truyền và tỷ lệ mắc bệnh Hemophilia A

Hemophilia A là bệnh di truyền lặn liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X không có alentương ứng trên NST Y

Người mẹ sẽ truyền bệnh cho con trai, hoặc truyền gen bệnh cho con gái ở trạng thái dị hợp

tử Những người con gái dị hợp tử này khi xây dựng gia đình, sinh con lại có thể truyền bệnh chocon trai và các con gái của mình ở trạng thái dị hợp tử Tuy nhiên, khoảng 1/3 các trường hợp là dođột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố mẹ

Hình 1.2 Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia

đó có 178.500 bệnh nhân Hemophilia Với 99 triệu dân, theo công thức trên, Việt Nam cókhoảng 6583 bệnh nhân Hemophilia Tuy nhiên, theo điều tra năm 2014, số bệnh nhân được chẩnđoán trên toàn quốc mới chỉ là 2373 người, chiếm xấp xỉ 40%, còn tới 60% bệnh nhân vẫn chưađược chẩn đoán

exon, trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp - 262 bp và 2 exon lớn nhất exon 14 (3106 bp) vàexon 26 (1958 bp) ,

Chức năng gen F8: gen F8 mã hóa cho protein FVIII Protein FVIII gồm 2332 acid amin

và trọng lượng phân tử khoảng 300 kD, có chức năng như một đồng yếu tố cần thiết cho sự kíchhoạt phân giải protein của yếu tố X kích hoạt bởi yếu tố IX trong con đường đông máu nội sinh.Protein FVIII có chuỗi nặng (90 - 220 kD) và chuỗi nhẹ (80 kD) Protein FVIII có cấu trúc vùngA1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2 Chuỗi nặng gồm các vùng A1-A2-B, chuỗi nhẹ gồm các vùngA3-C1-C2

Hình 1.4 Cấu trúc gen và protein FVIII

* Nguồn: Graw J., Brackmann H.H., Oldenburg J và cộng sự (2005)

a) Gen F8 bao gồm 25 intron và 26 exon trong đó phần lớn exon 26 mã hóa cho vùng 3’ UTR; vùng intron 22 chứa 2 gen F8A và F8B b) Phân tử mRNA được phiên mã có kích thước 9 kb và các bước hoàn thiện phân tử protein F8 thành một FVIII hoàn chỉnh được hoạt hóa c) và d) Các bước hoàn thiện phân tử protein F8 thành một yếu

tố VIII hoàn chỉnh được hoạt hóa

Đầu tiên, protein FVIII được tổng hợp ở lưới nội bào, sau đó được chuyển vào thể Golgi,được lưu thông dưới dạng tiền “cofactor” không hoạt động Protein FVIII được hoạt hóa nhờ quátrình xúc tác phân giải bởi thrombin hoặc yếu tố Xa

Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp protein FVIII gây nên

bệnh Hemophilia A

1.1.4.2 Các dạng đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A

Có nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A, trong đó đột biến điểm, đột biến

đảo đoạn (intron 1 hoặc intron 22), đột biến mất đoạn gen , , ,

Đột biến điểm: Đột biến điểm gen F8 khi có sự thay đổi nucleotid trên gen Shima M và

cộng sự (1989) đã chỉ ra đột biến thay thế arginin thành cysteine tại vị trí 372 gây biến đổi vị trí cắtcủa thrombin, làm quá trình hoạt hóa yếu tố VIII bị rối loạn, hoạt tính yếu tố VIII giảm mạnh

xuống còn 3 - 5% Jacquemin M và cộng sự (2000) đã chứng minh đột biến thay thế serin thànhtyrosin tại vị trí 2119 (vùng C2) làm giảm đột ngột khả năng tương tác giữa yếu tố VIII và vWF,dạng đột biến này thường gặp ở mức độ nhẹ và trung bình Điều đáng chú ý là các đột biến gâyHemophilia A nằm rải rác trên 26 exon mà không tập trung vào một vùng hotspot Goodeve A.C.

và cộng sự (2003), Graw J và cộng sự (2005) chỉ ra phần lớn các đột biến điểm đều có xu hướngxuất hiện ở đoạn trình tự CpG gây thay thế acid amin arginin thành một acid amin khác hoặccodon kết thúc, ví dụ: tại vị trí Arg527, Arg531, Arg593, Arg1689, Arg1781, Arg1941, Arg2209,Arg2304… , , , Phần lớn các bệnh nhân mang đột biến ở arginin đều ở mức độ nặng ,

Đột biến đảo đoạn: Mặc dù không có vai trò trong việc mã hóa hay tham gia vào quá trình

hoạt hóa yếu tố VIII nhưng các vùng intron của gen F8 lại là tác nhân chính gây ra các dạng đột

biến đảo đoạn ở các bệnh nhân Hemophilia A mức độ nặng Dạng đột biến đảo đoạn phổ biến

nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm tới 50% các bệnh nhân mắc bệnh ở mức độ nặng Cách gen F8

một đoạn 500kb về phía đầu mút, nhiễm sắc thể X tồn tại hai vùng int22h2 và int22h3 có trình tự

tương đồng đến 99,9% với một đoạn thuộc intron 22 gen F8 (vùng int22h1) Quá trình tái tổ hợp tương đồng giữa vùng int22h1và một trong hai vùng int22h2 và int22h3 chia cắt gen F8 thành 2

đoạn (exon1 - 22 và exon23 - 26) cách nhau 400kb gây bất hoạt hoàn toàn gen mã hóa yếu tốVIII Hiện tượng tái tổ hợp tương tự cũng diễn ra giữa intron 1 (int1h1) và vùng trình tự tương

đồng int1h2 cách gen F8 một đoạn 140kb về phía đầu mút nhiễm sắc thể gây nên dạng đột biến

đảo đoạn intron 1 xuất hiện ở 5% các bệnh nhân mức độ nặng , ,

Hình 1.5 Cơ chế gây đột biến đảo đoạn intron 1 và intron 22 của gen F8 (b1, b2)

* Nguồn: Shim Y.J., Lee K.S (2010)

b1) Cơ chế gây đột biến đảo đoạn intron 1, dạng đột biến này phát hiện ở 5% số bệnh nhân mức độ nặng b2) Do đoạn trình tự int22h1 của intron 22 có độ tương đồng rất cao với hai vùng int22h2 và int22h3 nằm

ngoài gen F8 nên hiện tượng tái tổ hợp tương đồng diễn ra trên nhiễm sắc thể X tại vị trí gen F8, phân cắt gen F8

thành 2 mảnh; đột biến đảo đoạn intron22 chiếm tới 50% các bệnh nhân mức độ nặng

Đột biến mất đoạn và chèn đoạn: Đột biến mất đoạn lớn chiếm 2 - 5% bệnh nhânHemophilia A mức độ nặng Có thể mất một exon hoặc mất toàn bộ gen Đột biến chèn đoạn lớn

và hiện tượng alu làm đứt gãy gen F8 gây bệnh Hemophilia A mức độ nặng Mất đoạn và chèn

đoạn nhỏ cũng thường gặp trong Hemophilia A mức độ nặng, trong đó thay đổi từ 1 - 55nucleotid Phổ biến nhất là mất hoặc chèn nucleotid adenin vào exon 14, thường xảy ra trong vùng

từ c.3637 đến c.4379

1.1.4.3 Bản đồ đột biến gen F8 đối với bệnh nhân Hemophilia A tại Việt Nam

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Lưu Vũ Dũng năm 2014, đột biến đảo đoạn intron 22chiếm tỷ lệ cao nhất 38,1% Tiếp theo là đột biến sai nghĩa chiếm tỷ lệ 23,9%

Trên các vùng của gen F8: đột biến đảo đoạn intron 22 chiếm tỷ lệ cao nhất (38%); đột biến

vùng B chiếm 19,6%

Biểu đồ 1.1 Các dạng đột biến trên bệnh nhân Hemophilia A ở Việt Nam (A) và phân bố tỷ lệ

các dạng đột biến trên các vùng của gen F8 (B)

* Nguồn: Lưu Vũ Dũng (2014)

Vào năm 2014, bản đồ đột biến gen F8 của các bệnh nhân Hemophilia ở Việt Nam đã

được xây dựng nhằm hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh

Hình 1.6 Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A ở Việt Nam

* Nguồn: Lưu Vũ Dũng (2014)

1.2 Quy trình thụ tinh trong ống nghiệm

Quy trình thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro Fertilization - IVF) là công cụ hỗ trợ sinh sản

được phát triển từ năm 1977 bởi Edwards R và cộng sự Kỹ thuật này được áp dụng cho nhữngcặp vợ chồng hay những người phụ nữ vì bất kỳ nguyên nhân nào, tinh trùng không thể thụ tinhcho trứng bằng phương pháp tự nhiên Quy trình thụ tinh trong ống nghiệm gồm rất nhiều bướctheo thứ tự, mỗi bước trong đó đều là một mắt xích quan trọng giúp hướng đến kết quả tốt của chu

kỳ điều trị Sau đây là một số bước liên quan đến quy trình IVF:

1.2.1 Kích thích buồng trứng

Kích thích buồng trứng là việc sử dụng các thuốc khác nhau theo nhiều phác đồ khác nhaunhằm tăng sự phát triển của nang noãn, tăng trưởng thành và phóng noãn Các thuốc và phác đồ

sử dụng trong kích thích buồng trứng có thể phân thành các nhóm:

- Thuốc uống: Clominphene citrate, Aromatase inhibitor

+ GnRH antagonists: gồm Cetrorelix acetate và Ganirelix acetate

Có rất nhiều phác đồ có thể sử dụng, nhưng phổ biến được dùng hiện nay là GnRHantagonists , ,

Người phụ nữ được sử dụng thuốc để kích thích nang trứng phát triển và trưởng thành.Sau đó, trứng được chọc hút dưới hướng dẫn của siêu âm qua âm đạo

1.2.2 Chọc hút noãn

Trong lịch sử, chọc hút noãn đã từng được thực hiện bằng các kỹ thuật khác nhau như chọckim qua da đường bụng hoặc xuyên bàng quang dưới hướng dẫn siêu âm hay qua nội soi trongnhững thập niên đầu tiên sau khi phát triển IVF Sau khi kỹ thuật khảo sát buồng trứng bằng siêu

âm qua đường âm đạo là một bước đột phá cho thụ tinh trong ống nghiệm và rất nhanh sau đó đãđược chấp thuận trên toàn thế giới

- Kỹ thuật chọc hút noãn qua nội soi hiện nay rất hiếm được chỉ định, chỉ có thể cân nhắctrong những trường hợp không thể tiếp cận được buồng trứng qua đường âm đạo như buồngtrứng nằm quá cao so với khung chậu

- Kỹ thuật chọ hút noãn qua da - bàng quang với hướng dẫn siêu âm: Kỹ thuật này ưu điểmhơn so với hút noãn qua nội soi là thành công cao hơn và không xâm nhập, không cần thực hiệntại phòng mổ Chỉ gây tê tại chỗ chọc kim Tuy nhiên, nhược điểm là có thể gặp tai biến (chảymáu bàng quang, bí tiểu), nhìn không rõ, khó chịu cho bệnh nhân

- Kỹ thuật chọc hút noãn qua đường âm đạo với hướng dẫn siêu âm: là kỹ thuật hiện nayđược sử dụng thông dụng nhất, có thể thực hiện được cho bệnh nhân ngoại trú, chỉ cần gây tê tạichỗ hoặc an thần đường tĩnh mạch Phương pháp đơn giản, hiệu quả, tuy nhiên cũng có một sốbiến chứng xảy ra như chảy máu âm đạo (10 - 15%), sang chấn cơ quan vùng chậu và nhiễmkhuẩn (0,3%)

1.2.3 Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm cổ điển và tiêm tinh trùng vào bào tương noãn

Kỹ thuật IVF cổ điển là kỹ thuật nuôi cấy noãn có lớp cumulus bên ngoài cùng với mộtlượng tinh trùng di động (phân lập từ tinh dịch) trong một khoảng thời gian Sau khi đồng nuôicấy, noãn được kiểm tra để xác định sự thụ tinh xảy ra giữa noãn và tinh trùng hay chưa dựa trên

sự hình thành tiền nhân thấy được trong tế bào chất của noãn tại thời điểm đánh giá 16-18 giờ hoặc

sự phân chia tế bào sau khi tiền nhân được hòa nhập vào ngày 1 sau thụ tinh Thông thường, sựphân chia giai đoạn sớm của phôi thường được ghi nhận 29 giờ sau thụ tinh

Tiêm tinh trùng vào bào tương noãn (Intracytoplasmic Sperm Injection - ICSI) là kỹ thuậtđưa một tinh trùng vào một noãn, bỏ qua tất cả các bước đặc trưng của quá trình thụ tinh tự nhiên

Do bước kết hợp tinh trùng - noãn bị bỏ qua ICSI nên sự phát triển của tiền nhân đực thường đòi

hỏi sự hoạt hóa noãn bào ở hầu hết các loài thử nghiệm Ở người, những bệnh nhân mang thai đầutiên từ ICSI xuất hiện từ năm 1992, và kể từ đó, hàng triệu em bé ra đời nhờ kỹ thuật ICSI Kỹthuật này đã giúp các cặp vợ chồng với các nguyên nhân vô sinh do yếu tố nam có cơ hội có thaivới tỷ lệ tương tự như ở những bệnh nhân được điều trị bằng IVF cổ điển với các giao tử bìnhthường Không có tiêu chuẩn chung nào trong lựa chọn bệnh nhân thực hiện ICSI Ưu điểm củaICSI là cho dù chất lượng tinh trùng có bất thường đến đâu, chỉ cần có ít nhất một tinh trùng sốngthì sự thụ tinh đều có thể xảy ra, phôi có thể phát triển và có thể có thai thành công Do đó, có một

sự đồng thuận rộng rãi là ICSI được thực hiện khi mẫu tinh trùng chất lượng kém Ngoài ra,những trường hợp thất bại trong các chu kỳ IVF cổ điển, cho dù chất lượng tinh tùng bình thường,nên chỉ định ICSI Mặc dù vẫn còn tranh luận, ICSI ngày càng được chỉ định rộng rãi đối với cáctrường hợp vô sinh không do yếu tố nam ,

1.2.4 Sinh thiết phôi

Sinh thiết tế bào để làm chẩn đoán di truyền có thể thực hiện ở các giai đoạn khác nhautrong quá trình phát triển phôi:

+ Giai đoạn hợp tử: sinh thiết các thể cực

+ Giai đoạn phân chia của phôi vào ngày thứ 3, khoảng 6-8 tế bào: sinh thiết 1-2 phôi bào.+ Giai đoạn phôi nang: sinh thiết các tế bào thuộc lớp tế bào lá nuôi

- Sinh thiết thể cực: có ưu điểm là ít ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi, vì đây là các sảnphẩm phụ bị loại bỏ trong quá trình phát triển của trứng và hợp tử Ngoài ra, sinh thiết thể cực cóthể được phối hợp với sinh thiết phôi bào để tăng độ chính xác của các chẩn đoán di truyền Tuynhiên, sinh thiết thể cực có nhược điểm lớn là chỉ có thể chẩn đoán các bất thường từ mẹ do thểcực chỉ chứa các NST xuất phát từ trứng Ngoài ra, trong quá trình phát triển thể cực thứ nhất hay

bị vỡ thành mảnh nhỏ, có thể dẫn đến việc thất thoát vật liệu di truyền, làm ảnh hưởng đến kết quảchẩn đoán

Hình 1.7 Sinh thiết thể cực

* Nguồn: Montag M., Koster M., Strowitzki T và cộng sự (2013)

- Sinh thiết ở giai đoạn phân chia của phôi: được thực hiện vào ngày thứ 3 sau thụ tinh Ởgiai đoạn này, phôi có từ 6 - 8 phôi bào Một đến hai phôi bào sẽ được sinh thiết để làm chẩn đoán

về di truyền Tuy nhiên, việc sinh thiết có thể gặp nhiều khó khăn

Hình 1.8 Sinh thiết phôi đoạn phân cắt

* Nguồn: Kahraman S., Beyazyurek C (2013)

Phôi bào sinh thiết cần được chẩn đoán di truyền sớm để phục vụ chọn phôi đưa vào buồng

tử cung vào 1 - 2 ngày sau Số lượng tế bào ít gây khó khăn cho chẩn đoán di truyền Hiện tượngkhảm (mosaicism) vẫn có thể xảy ra ở giai đoạn này, nên chẩn đoán di truyền trên phôi bào sinhthiết được có thể đúng nhưng sau đó phôi có hiện tượng sửa chữa rất mạnh nên chẩn đoán khôngcòn phù hợp với cấu trúc di truyền của phôi

- Sinh thiết phôi nang: phôi được nuôi cấy đến ngày thứ 5 hoặc 6 sau khi thụ tinh Sau khilàm thủng màng trong suốt, tế bào lá nuôi bắt đầu thoát ra khỏi màng trong suốt qua lỗ thủng Một

số tế bào (5-10 tế bào) thuộc lớp tế bào lá nuôi sẽ được sinh thiết để làm chẩn đoán di truyền

Kỹ thuật này có một số ưu điểm nhất định: có nhiều tế bào hơn để thực hiện chẩn đoán ditruyền, phôi được sinh thiết ở giai đoạn này thường có sức sống cao hơn so với phôi giai đoạnphân chia

Hình 1.9 Sinh thiết phôi nang

* Nguồn: Lê Minh Tâm (2022)

Do có nhiều ưu điểm nên hiện nay, phương pháp sinh thiết phôi nang thường được ưu tiên

áp dụng

1.2.5 Đông lạnh và rã đông phôi

Nguyên tắc của đông lạnh là giảm nhiệt độ của môi trường chứa phôi xuống nhiệt độ rấtthấp (như -196οC) nhằm khiến các hoạt động sinh học nội bào bị ngừng lại Tế bào sống ở dạngtiềm sinh và được bảo quản trong một thời gian dài Đông lạnh phôi nhằm lưu trữ những phôi cóchất lượng tốt còn lại sau thụ tinh ống nghiệm, khi đã chuyển phôi tươi hoặc chờ đợi cơ hộichuyển phôi khi tử cung được chuẩn bị cho phôi làm tổ Bệnh nhân có thể thực hiện các chu kỳchuyển phôi trữ mà không phải kích thích buồng trứng và chọc hút noãn, nhờ đó giảm được chiphí điều trị và các nguy cơ kích thích buồng trứng Chuyển phôi đông lạnh giúp tránh được nguy

cơ của hội chứng quá kích buồng trứng, tăng tính đáp ứng của nội mạc tử cung, thực hiện kỹ thuậtchẩn đoán phôi trước làm tổ, từ đó có thể tăng tỷ lệ có thai sau chuyển phôi Do khả năng ứngdụng và ưu điểm của chuyển phôi đông lạnh nên hiện nay nhiều trung tâm hỗ trợ sinh sản chọn

chiến lược đông lạnh phôi toàn bộ Có nhiều phương pháp đông lạnh phôi, trong đó, thủy tinh hóa

đã được thực hiện thường quy trên thế giới trong những năm gần đây với hiệu quả rất cao, cho tỷ

lệ phôi toàn vẹn sau rã đông xấp xỉ tới 99% ở cả phôi phân cắt và phôi nang Từ đó, mở ra cáchướng phát triển khác nhau như sinh thiết phôi, chẩn đoán di truyền phôi trước làm tổ, chiến lượcđông lạnh phôi toàn bộ

Trước khi đông lạnh phôi, số lượng phôi trên mỗi cryotop đã được quyết định Trong cácchu kỳ chuyển phôi đông lạnh, tùy theo mong muốn của bệnh nhân và quyết định của bác sĩ lâmsàng, chuyên viên phôi học tiến hành rã đông cryotop thích hợp và nuôi cấy phôi sau rã đông đểchuẩn bị chuyển vào buồng tử cung

1.2.6 Chuyển phôi

Chuyển phôi là một bước quan trọng trong quy trình IVF Kỹ thuật yêu cầu độ chính xác rấtcao Siêu âm có thể thực hiện qua đường bụng hay qua đường âm đạo, giúp định hướng vào củacatheter và vị trí đặt phôi trong buồng tử cung, thường ở vị trí cách đáy tử cung khoảng 1-1,5cm.Chuyển phôi dưới hướng dẫn của siêu âm đường bụng có các điểm bất lợi như bệnh nhân phảinhịn tiểu để làm căng bàng quang và điều này có thể gây khó chịu cũng như kích thích các cơn cothắt tử cung Hình ảnh niêm mạc tử cung qua siêu âm đường bụng thường rõ ràng, đặc biệt sẽ khóxác định vị trí đầu catheter ở bệnh nhân thành bụng dày, béo phì, tử cung ngả sau Siêu âm quađường âm đạo giúp giải quyết những nhược điểm của siêu âm đường bụng, có được hình ảnhbuồng tử cung tối ưu, nhưng đòi hỏi kỹ năng của người thực hiện cao hơn vì phải vừa thực hiệnsiêu âm vừa chuyển phôi

1.3 Một số kỹ thuật di truyền sử dụng trong chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A

Chẩn đoán trước làm tổ được báo cáo lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1990 với tên làPGD (Preimplantation Genetic Diagnosis) Cho đến nay chẩn đoán trước làm tổ đã được sửdụng một cách rộng rãi Thuật ngữ chẩn đoán trước làm tổ hiện nay đã được thay thế bằngPGT-M (Preimplantation Genetic Testing for Monogenic disorders, chẩn đoán trước làm tổbệnh lý đơn gen) Chẩn đoán trước làm tổ là phương pháp chẩn đoán các bất thường di truyềncủa phôi trước khi được chuyển vào tử cung của mẹ Chẩn đoán trước làm tổ có thể giải quyết cácvấn đề của các phương pháp chẩn đoán trước sinh, cho phép các cặp vợ chồng có nguy cơ mắc

các bệnh lý di truyền cho con có cơ hội sinh con khoẻ mạnh, không mắc bệnh, không phải bỏ thaikhi phát hiện bệnh lý ở thai

Toàn bộ quá trình chẩn đoán trước làm tổ diễn ra theo trình tự sau: người mẹ trải qua quáthụ tinh trong ống nghiệm tạo thành các phôi, các phôi được tiến hành sinh thiết và xét nghiệm ditruyền, các phôi khỏe mạnh được đưa vào buồng tử cung của mẹ để mang thai và sinh ra các em

bé khỏe mạnh

Chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A có các kỹ thuật sau:

- Kỹ thuật lựa chọn phôi có bộ NST giới tính XX để phòng ngừa sinh trẻ bị bệnh

- Kỹ thuật chẩn đoán trực tiếp đột biến gen F8.

- Kỹ thuật chẩn đoán gián tiếp thông qua phân tích liên kết gen

1.3.1 Lựa chọn phôi có bộ nhiễm sắc thể giới tính XX

Có nhiều cách tiếp cận chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A Trong đó, cách tiếp cậnđơn giản nhất là sàng lọc giới tính của phôi Kỹ thuật thường được sử dụng cho hướng tiếp cậnnày là: kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (fluorescence in situ hybridization - FISH)

Nguyên lý: FISH là kỹ thuật di truyền tế bào được sử dụng để phát hiện có hay không sựhiện diện của một trình tự DNA đặc hiệu trên các NST Các đoạn dò DNA được đánh dấu huỳnhquang sẽ được lai gắn lên các vị trí tương ứng trên NST đích của người Sau lai, sản phẩm đượcquan sát dưới kính hiển vi để tìm tín hiệu huỳnh quang của các đoạn dò được lai Sự có mặt haykhông có tín hiệu huỳnh quang giúp suy ra có hay không có sự hiện diện của NST đặc hiệu tươngứng

Ưu điểm: đơn giản, dễ phân tích kết quả, cho kết quả nhanh

Nhược điểm: Theo quy luật di truyền Mendel cho bệnh lý đơn gen, phương pháp này chỉgiúp lựa chọn được 50% số phôi có thể sử dụng cho chuyển phôi, 25% phôi nam không bị bệnh

bị loại đi một cách không cần thiết Điều này rất bất lợi, đặc biệt là đối với những cặp vợ chồng có

số phôi hạn chế

1.3.2 Kỹ thuật chẩn đoán trực tiếp đột biến gen F8

Sử dụng kỹ thuật chẩn đoán trực tiếp đột biến gen F8 gây bệnh Hemophilia A khá phức

tạp do trong tự nhiên có nhiều dạng dị hợp và các dạng đảo đoạn lớn , Sau đây là một số kỹ thuật

thường được sử dụng để phát hiện trực tiếp đột biến gen F8.

- Kỹ thuật Southern Blot:

Được sử dụng để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22

Nguyên lý: Cắt DNA bằng enzyme BclI, sử dụng mẫu dò đánh dấu phóng xạ P32 để xác

định đột biến Ở người bình thường, enzyme sẽ cắt DNA làm 3 đoạn có kích thước 21,5kb; 16kb

và 14kb Nếu kết quả có kích thước 20kb; 17,5kb; 14kb hay 20kb; 16kb; 15,5kb tương ứng vớiđột biến đảo đoạn intron 22 typ 1 (int22h2) và typ 2 (int22h3)

Ưu điểm: kết quả nhanh, thuận tiện

Nhược điểm: Không phát hiện được các đột biến khác của gen F8 Có thể xảy ra sai sót khi

tiến hành trên mẫu phôi với lượng DNA rất nhỏ

- Kỹ thuật Longrange PCR:

Được sử dụng để phát hiện đột biến đảo đoạn intron 22

Nguyên lý: Kỹ thuật Longrange PCR với sự kết hợp của hai loại enzyme: enzyme đọc sửa

và enzyme có hoạt tính tổng hợp đoạn ADN lớn cho phép khuếch đại các vùng DNA tái tổ hợpnày tạo ra sản phẩm PCR có kích thước 10 kb và 12 kb Sản phẩm PCR này được phát hiện khiđiện di trên agarose và đọc trên hệ thống đọc gel

Ưu điểm: kết quả nhanh, thuận tiện

Nhược điểm: Có thể xảy ra sai sót khi tiến hành trên phôi với lượng DNA rất nhỏ

- Kỹ thuật Inversion - PCR:

Nguyên lý: Kỹ thuật trải qua 3 bước: cắt DNA bằng enzyme BclI,

nối bằng T4 ligate, khuếch đại bằng phản ứng Multiplex PCR

Ưu điểm: dễ tiến hành, enzyme BclI tác dụng rất đặc hiệu nên sản phẩm cắt enzyme có tính

đặc hiệu cao Sản phẩm PCR được khuếch đại dễdàng trong thời gian khoảng 30 phút do các đoạn DNA có kích thước ngắn

(487 và 559 bp) Xét nghiệm phân tích gen được tiến hành nhanhchóng, kết quả thu được có độ tin cậy cao, dễ thực hiện.

Nhược điểm: Có thể xảy ra sai sót khi tiến hành trên phôi với lượng DNA rất nhỏ

- Multiplex PCR phát hiện đột biến đảo đoạn intron 1:

Thiết kế hai phản ứng Multiplex PCR có thể phát hiện được các bệnhnhân bị đột biến Phản ứng 1 có chứa các cặp mồi đặc hiệu cho int1h1 cộng với một mồi đặc hiệucho chuỗi int1h2; phản ứng 2 chứa cặp mồi đặc hiệu cho int1h2 cộng với một mồi đặc hiệu cho

nhau của các đoạn DNA sau khi điện di để phát hiện đột biến Trường hợpkhông có đột biến đảo đoạn intron 1, phản ứng 1 chỉ có mồi int1h1 bắt cặpcho kích thước 1908 bp Ở phản ứng 2 chỉ có mồi đặc hiệu cho int1h2 bắt cặpcho kích thước 1191 bp Nếu đột biến xảy ra, mồi int1h1 bắt cặp với int1h2 ở

cả hai phản ứng sẽ cho các kích thước 1323 bp và 1776 pb tương ứng ở phảnứng 1 và phản ứng 2

Ưu điểm: dễ thực hiện

Nhược điểm: Có thể xảy ra sai sót khi tiến hành trên phôi với lượng DNA rất nhỏ

- Kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification):

Là phương pháp được ưu tiên lựa chọn trong chẩn đoán mất đoạn, lặp đoạn gen F8 Ngoài

ra còn dùng chẩn đoán dị hợp tử

Nguyên lý: Thiết kế các probe gắn đặc hiệu với 26 exon của gen Trong mỗi phản ứngPCR, có thể khuếch đại đồng thời các probe đặc hiệu cho 26 exon của gen mà chỉ sử dụng duynhất một cặp mồi Chỉ cần tiến hành 2 phản ứng PCR, có thể khảo sát đột biến ở các exon của gen

F8.

Ưu điểm: Cho kết quả nhanh

Nhược điểm: Có thể xảy ra sai sót khi tiến hành trên phôi với lượng DNA rất nhỏ

- Giải trình tự gen:

Đây là phản ứng chứa hỗn hợp của deoxynucleotid và dideoxynucleotid được sử dụngtrong phản ứng với nồng độ sao cho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các

deoxynucleotid thường gắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp Sự gắn của cácdideoxynucleotid sẽ làm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo

ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau Nucleotid tận cùng trên mỗi sợi DNA đượcxác định bằng cách chạy một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loại dideoxynucleotid được đánhdấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệu khác nhau Sản phẩm sau phản ứng giải trình tự sẽđược đọc trình tự bằng máy giải trình tự tự động sử dụng các mao quản Tín hiệu được mắt cảmquang truyền về máy tính để hiển thị thành các đỉnh cường độ sáng Sau đó, trình tự gen của mẫunghiên cứu sẽ được đối chiếu với trình tự gen tham chiếu trên ngân hàng gen thế giới (GenBank)

và được phân tích để xác định vùng hoặc điểm đột biến

Ưu điểm: có thể quan sát được trực tiếp đột biến

Nhược điểm: nếu gen giải trình tự dài cần lập nhiều phản ứng, yêu cầu rất nghiêm ngặt đốivới các thiết bị, hóa chất kèm theo, đòi hỏi kỹ thuật viên phải thật có kinh nghiệm trong lĩnh vựcđọc trình tự để phát hiện ra trình tự đột biến, đặc biệt là đối với đột biến điểm

Như vậy, chưa có phương pháp nào có thể phát hiện 100% các đột biến của gen F8 Các

kỹ thuật phát hiện trực tiếp đột biến tuy được sử dụng hiệu quả trên mẫu máu, mẫu dịch ối cho kếtquả chính xác nhưng có nhiều khả năng xảy ra sai sót khi sử dụng chẩn đoán trên mẫu phôi Chẩn

đoán các đột biến của gen F8 ở các mẫu với lượng lớn DNA thu được từ máu hoặc dịch ối cho

kết quả chính xác và không bị ảnh hưởng quá nhiều nếu có một vài alen bị khuếch đại hỏng

Ngược lại, chẩn đoán các đột biến của gen F8 ở các mẫu có lượng DNA rất nhỏ thu được từ một

vài tế bào phôi sinh thiết bị ảnh hưởng rất nhiều, thậm chí sai lệch hoàn toàn khi có hiện tượngADO Có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng tới chỉ số ADO như quá trình vận chuyển và bảo quảnmẫu, điều kiện PCR làm ảnh hưởng cấu trúc DNA hay lượng DNA đưa vào thí nghiệm không

đủ

Ngoài nguy cơ ADO, cũng do vật liệu di truyền đầu vào có số lượng ít nên yếu tố ngoạinhiễm có thể ảnh hưởng rất lớn tới tính chính xác của kết quả ADO và nhiễm vật liệu di truyềnngoại lai là hai nguyên nhân quan trọng dẫn đến chẩn đoán sai Nguồn DNA ngoại lai rất phongphú nhưng chủ yếu thường xảy ra trong các giai đoạn trước bước tiến hành PCR đó là sinh thiếtphôi và rửa tế bào phôi DNA ngoại nhiễm có thể từ kỹ thuật viên sinh thiết phôi hoặc DNA trong

khu vực sinh thiết, rửa tế bào Mẫu media blank xuất hiện DNA cũng có thể do quá trình sinh thiếtphôi không thành công khiến tế bào bị vỡ làm thất thoát DNA vào giọt rửa

Hình 1.10 Kiểm soát hiện tượng ADO trong phân tích kết quả khuếch đại STR

* Nguồn: Zhao M., Chen M., Tan A.S.C và cộng sự (2017)

1.3.3 Kỹ thuật chẩn đoán gián tiếp thông qua phân tích liên kết gen F8

Để khắc phục các nhược điểm của các kỹ thuật trên, nhiều nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹthuật phân tích liên kết gen Các gen được gọi là có liên kết khi chúng luôn được di truyền cùngnhau, hoặc không bị trao đổi chéo trong quá trình giảm phân Do đó, nhờ việc xác định các genliên kết với gen bệnh có thể nghiên cứu được các đột biến gen phức tạp Quá trình phân tích gồmxác định kiểu gen của các thành viên trong gia đình mang gen bệnh, lập sơ đồ phả hệ nhằm xemxét sự di truyền của nhóm gen liên kết với gen bệnh

Phân tích liên kết gen sử dụng các STR có tần số dị hợp tử cao kết hợp với multiplex PCRgiúp có nhiều thông tin nhất cho chẩn đoán Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu chọn lọcSTR cho Hemophilia A ở các quần thể người bệnh khác nhau như Brazil, New Zealand, Trung

Quốc , , Việc tiến hành nghiên cứu phát hiện gián tiếp đột biến gen F8 thông qua các đoạn trình

tự lặp ngắn đa hình STR liên kết với gen này vừa giúp việc chẩn đoán dễ dàng hơn, vừa hạn chếđược hiện tượng mất một trong hai alen ở tế bào thể dị hợp, vừa góp phần kiểm soát tình trạngnhiễm DNA

Nguyên lý của phương pháp này là việc so sánh các loci đặc hiệu trong mẫu DNA từ 2 haynhiều cá thể khác nhau Một STR là tập hợp 10 - 60 lần lặp lại đoạn trình tự khoảng 2 đến 6 bp, sựđặc thù ở mỗi cá thể của các STR cho phép nhận biết DNA của từng cá thể hoặc phân tích ditruyền liên kết giữa các thế hệ trong cùng một gia đình Sự đặc thù này thể hiện ở số lần lặp củađoạn trình tự và được phát hiện thông qua phản ứng nhân gen PCR kết hợp điện di mao quản.PCR giúp nhân bản thông tin từ một lượng nhỏ DNA có trong mẫu sinh phẩm Sản phẩm nhânSTR có kích thước khoảng 100 - 500bp, và có thể tiến hành Multiplex PCR để nhân bản cùng lúcnhiều đoạn STR, sử dụng các mồi được thiết kế gắn màu huỳnh quang khác nhau và nhân các sảnphẩm có kích thước khác nhau

Mặc dù hệ gen người chứa hàng nghìn chỉ thị STR, nhưng chỉ có một số lượng nhỏ các lociđược lựa chọn để sử dụng trong chẩn đoán Những loci này được gọi là loci hạt nhân (core loci),với chỉ số dị hợp tử thông tin cao cho phép so sánh và nhận dạng di truyền giữa các cá thể

Việc sử dụng chỉ thị STR có ý nghĩa lớn: với tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ

và mang tính đặc trưng cá thể (số lần các đoạn lặp có thể khác nhau rất nhiều giữa các cá thể khácnhau), việc kiểm soát nguồn ngoại nhiễm và mất thông tin do ADO trong quá trình khuếch đại trởnên dễ dàng hơn Ngoài ra, với kích thước các đoạn lặp không quá lớn (dưới 500bp), chỉ thị STR

có tính bền vững cao và ít bị đứt gãy khi gặp tác động nên quy trình vận chuyển, bảo quản mẫucũng thuận lợi hơn so với chẩn đoán trực tiếp bằng các đoạn DNA có kích thước lớn khác

- Các chỉ số dị hợp tử di truyền:

Các chỉ số dị hợp tử di truyền được tính toán dựa trên tần số alen thu được từ thực nghiệm,dùng để đánh giá lượng thông tin của một chỉ thị sử dụng trong các thử nghiệm phụ/mẫu hệ(parentage testing)

Tần số dị hợp tử quan sát (Observed Heterozygosity - Ho): là tổng tần số các kiểu gen dịhợp tử quan sát được trong toàn bộ mẫu nghiên cứu.

Tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected Heterozygosity - ):

Trong đó: k là tổng số alen nghiên cứu; Pi là tần số của alen thứ i trong tổng số k alen.Chỉ số dị hợp tử càng cao chứng tỏ càng có giá trị Đến nay chưa có nhóm nghiên cứu nào

xây bộ chỉ thị STR liên kết với gen F8 đáp ứng các tiêu chuẩn về chỉ số dị hợp tử áp dụng cho

chẩn đoán trước làm tổ bệnh Hemophilia A trên quần thể người Việt Nam

Trong việc lựa chọn chỉ thị cần chú ý tới vị trí locus chứa các STR để lựa chọn được các chỉthị nội gen và ngoại gen nằm về cả 2 phía so với gen bệnh để tăng độ tin cậy của kết quả chẩnđoán

Khoảng cách từ chỉ thị đó đến vị trí đột biến cũng là một yếu tố quan trọng, vì những chỉ thị

ở xa gen F8 sẽ có tần số tái tổ hợp tăng dần Hai gen càng gần nhau thì khả năng trao đổi chéo của

chúng sẽ càng giảm trong suốt quá trình giảm phân, tần số tái tổ hợp giữa 2 gen trên cùng NSTcàng thấp thì chúng càng liên kết chặt chẽ với nhau và càng ở gần nhau Tần số tái tổ hợp có thểtính từ số cá thể con xuất hiện kiểu hình khác với bố mẹ do quá trình trao đổi chéo các alen khácnhau trên gen

Càng có nhiều chỉ thị liên kết tốt với gen có đột biến, khả năng xác định đột biến đó sẽ càngchính xác Khoảng cách tương ứng với 1% tần số tái tổ hợp là centimorgan (cM) Theo nghiêncứu của Harvey Lodish và cộng sự, dựa trên kết quả so sánh khoảng cách vật lý thực tế giữa cácgen đã được xác định tần số tái tổ hợp bằng phân tích phân tử, thì trung bình 1 cM ở người tươngứng với khoảng 7,5.105 bps, hay xấp xỉ 1 Mb Theo khuyến cáo của Hội sinh sản và Phôi họcChâu Âu, khi lựa chọn chỉ thị chỉ nên tiến hành nghiên cứu trong phạm vi từ 1 đến 3 Mb để đảm

bảo độ liên kết giữa chỉ thị và gen cần xác định đột biến Chính vì thế, trong thiết kế bộ chỉ thị

STR nhằm xác định gián tiếp đột biến trên F8, cần đảm bảo các chỉ thị được lựa chọn nằm ở 2

bên gen này để nếu xảy ra hiện tượng trao đổi chéo dù với xác suất nhỏ, vẫn đảm bảo có các chỉthị được di truyền cùng gen

* Kỹ thuật Multiplex PCR:

Multiplex PCR là kỹ thuật nhân gen được giới thiệu lần đầu vào năm 1988 trong mộtnghiên cứu phát hiện mất đoạn gen Với kỹ thuật này, nhiều trình tự DNA sẽ được khuếch đạicùng lúc, giúp tiết kiệm thời gian, thao tác, chi phí chẩn đoán nói chung Tuy vậy việc thiết kế mồi

và tối ưu hóa phản ứng cần được đặc biệt chú trọng để đảm bảo hiệu suất khuếch đại cho từngđoạn DNA đích là tương đối đồng đều, phục vụ cho bước phân tích được hiệu quả

Phản ứng Multiplex PCR nói chung có thể chia làm 2 loại:

- Multiplex PCR sử dụng 1 loại khuôn DNA: kỹ thuật này sử dụng một khuôn DNA tổng

số với nhiều cặp mồi xuôi và ngược để khuếch đại nhiều vùng đặc hiệu trong một khuôn đó

- Multiplex PCR sử dụng nhiều khuôn DNA: kỹ thuật này sử dụng nhiều khuôn DNA vànhiều bộ mồi trong cùng một ống phản ứng Sự tồn tại của nhiều mồi có thể dẫn tới bắt cặp chéogiữa các mồi với nhau và khả năng bắt cặp nhầm giữa mồi và template của mồi khác

Trong việc thiết kết mồi cho Multiplex PCR cần đặc biệt lưu ý tới các thông số sau để đảmbảo hiệu suất phản ứng đạt mức cao nhất:

- Độ dài mồi: phản ứng Multiplex PCR cần số lượng lớn các mồi, vì vậy các mồi được thiết

kế phải có độ dài phù hợp Thông thường, các mồi với kích thước ngắn, trong khoảng 18 - 22 bp

sẽ được sử dụng

- Nhiệt độ ly giải: các mồi với Tm giống nhau, thích hợp nhất là 55°C -60°C Cho các trình

tự với tỉ lệ GC cao, khuyến cáo sử dụng các mồi với Tm cao hơn (thường là 75°C-80°C) Khoảngchênh lệch chấp nhận được giữa các mồi trong cùng 1 ống phản ứng là vào khoảng 3°C - 5°C

- Độ đặc hiệu: việc cân nhắc độ đặc hiệu của các mồi được thiết kế cho các trình tự đích làrất quan trọng khi chuẩn bị phản ứng Multiplex PCR, đặc biệt là do sự tồn tại cạnh tranh của cáctrình tự đích trong cùng ống phản ứng

- Tránh tạo Mồi Dimer (sản phẩm do các mồi bắt cặp với nhau tạo thành): các mồi đượcthiết kế phải được kiểm tra việc tạo mồi dimer, với tất cả các mồi tồn tại trong cùng hỗn hợp phảnứng Việc tạo mồi dimer sẽ dẫn tới khuếch đại không đặc hiệu.

Ngoài các thông số trên, những yếu tố khác về cơ bản giống với thiết kế mồi cho PCRthông thường Với kỹ thuật Multiplex PCR, kỹ thuật viên có thể tiến hành khuếch đại đồng thờicác chứng nội để hạn chế âm tính giả, đồng thời tiết kiệm chi phí hóa chất cũng như thời gian làmthí nghiệm so với việc sử dụng nhiều phản ứng PCR đơn lẻ Ngoài ra, Multiplex PCR còn chophép tiến hành xét nghiệm với lượng DNA đầu vào không quá nhiều (có thể chỉ cần 1 ng hay íthơn )

* Kỹ thuật điện di mao quản:

Sản phẩm Multiplex PCR có thể phân tích bằng điện di gel agarose hoặc điện di mao quản.Trong ứng dụng để phân tích di truyền liên kết, thường sử dụng điện di mao quản vì với phươngpháp này có độ phân giải cao hơn (1 bp) so với điện di gel agarose (khoảng 5 bp)

Các cặp mồi để PCR phân tích bằng điện di mao quản được đánh dấu bằng các chấtnhuộm huỳnh quang khác nhau, vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các locus được gắn các chấtnhuộm huỳnh quang tương ứng Các locus này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màuhuỳnh quang Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng của chấtnhuộm màu huỳnh quang Các hạt huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đóphát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn) Một màng lọc sáng được sửdụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó

Nguyên lý của phương pháp là dùng máy điện di có 2 cực: 1 cực âm và 1 cực dương SợiDNA mang điện tích âm khi điện di chạy về cực dương, các đoạn DNA có kích thước khác nhau

sẽ phân tách thành các băng vạch khác nhau

Phương pháp điện di mao quản có nhiều ưu điểm giúp khắc phục những hạn chế củaphương pháp điện di thông thường:

- Có độ phân giải đến 1 nucleotid Do vậy, các alen của các STR chỉ cần khác nhau 1nucletide có thể phân biệt được