Nghiên cứu nhân nhanh giống cây chùm ngây (Moringa Oleifera L) chất lượng cao bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

 Nội dung của đề tài - Xác định công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro; - Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi; - Ảnh hưởng của chất ĐHST đ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT



TRẦN VĂN TIẾN

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG CÂY CHÙM NGÂY

(MORINGA OLEIFERA L.) CHẤT LƢỢNG CAO BẰNG

KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hà Nội, Tháng 9-2013 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT



TRẦN VĂN TIẾN

NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG CÂY CHÙM NGÂY

(MORINGA OLEIFERA L.) CHẤT LƢỢNG CAO BẰNG

KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thiện đề tài luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của thầy (cô) và anh (chị) công tác tại Viện CNSH Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình tới Thầy giáo hướng dẫn tôi Tiến sĩ Hà Văn Huân đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình tới các Thầy, Cô tại Viện sinh thái Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Đặc biệt là Thạc sỹ Phạm Thị Đỗ Loan đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong thời gian học tại Viện

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ đã dành thời gian đọc và góp ý cho luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và người thân đã động viên, giúp đỡ tôi có được luận văn này

Hà Nội, tháng 9 năm 2013

Tác giả

Trần Văn Tiến

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, có sự hỗ trợ từ giáo viên hướng dẫn là TS Hà Văn Huân Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo Ngoài ra, đề tài còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác và cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo

Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng như kết quả luận văn của mình

Hà Nội, tháng 09 năm 2013

Tác giả

Trần Văn Tiến

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Giới thiệu về cây Chùm Ngây 3

1.1.1 Vị trí và phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm sinh thái học 3

1.1.3 Giá trị sử dụng của cây Chùm Ngây 5

1.1.3.1 Giá trị dinh dưỡng 6

1.1.3.2 Giá trị dược học 7

8

9

9

9

10

1.4 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào 11

1.4.1 Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào 11

1.4.2 Quy trình nhân giống in vitro 12

1.4.3 Các điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro 13

1.4.3.1 Môi trường nuôi cấy 13

1.4.3.2 Vật liệu nuôi cấy 17

1.4.3.3 Điều kiện vô trùng 17

1.5 Một số thành tựu về nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô-tế bào ở Việt Nam 18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG – VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Phương pháp luận 21

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm 21

2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro 21

2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro 23

2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro 24

2.2.2.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi chùm Ngây in vitro 25

5: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ của chồi Chùm Ngây in vitro 25

2.2.2.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi 26

2.2.2.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Chùm Ngây in vitro ở vườn ươm 27

2.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi và thu thập 27

2.2.3.1 Chỉ tiêu thu thập: 27

2.2.3.2 Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng chương trình Excel 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Xác định công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro 29

3.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro 31

3.3 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro 32

3.4 Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 35

3.5 ồi 37

3.6 Ảnh hưởng của nông độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi 40

3.7 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Chùm Ngây in vitro ở vườn ươm 42

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 Kết luận 45

4.2 Kiến nghị 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Chùm Ngây in vitro

trồng ở vườn ươm 42

Danh mục hình ảnh

Hình 1.1 Cây Chùm Ngây 5

1.2. Ngây 7

Hình 2.1 Hạt cây Chùm Ngây 20

Hình 3.1 Hạt Chùm Ngây nảy mầm trên môi trường MS 30

Hình 3.2 Chồi Chùm Ngây trên môi trường CT1 (A) và môi trường CT2 (B) 35

Hình 3.3 Chồi Chùm Ngây trên môi trường CT7 sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B) nuôi cấy 37

Hình 3.4 Rễ Chùm Ngây trên môi trường CR6 sau 1 tuần (A) và sau 2 tuần (B)39 Hình 3.5 Cây Chùm Ngây in vitro hoàn chỉnh 39

Hình 3.6 Rễ Chùm Ngây trên môi trường TN2 sau 1 tuần (A) và sau 2 tuần (B)41 Hình 3.7 Cây Chùm Ngây in vitro hoàn chỉnh 42

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Danh mục từ viết tắt

FAO : Food and Agriculture Organization

2.4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

MỞ ĐẦU

Chùm Ngây có tên khoa học là Moringa oleifera L., là một loài cây đa tác dụng,

nên còn gọi là cây “Thần Diệu” (Miracle Tree), cây “Độ Sinh” (Tree of Life) Cây Chùm Ngây có xuất xứ từ vùng Nam Á, phổ biến ở cả Châu Á và Châu Phi Giá trị sử dụng của cây Chùm Ngây được chia làm hai nhóm chính: (1) sử dụng làm thuốc chữa bệnh, (2) sử dụng làm nguồn lương thực giàu chất dinh dưỡng Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức nông lương thế giới (FAO) đã khuyến cáo, sử dụng loài cây này là giải pháp ưu việt cho các bà mẹ thiếu sữa, trẻ em suy dinh dưỡng và là giải pháp lương thực cho “thế giới thứ ba” nên cây Chùm Ngây được trồng và nghiên cứu ở nhiều Quốc gia trên thế giới Các bộ phận của cây Chùm Ngây, như: lá, hoa, thân, vỏ, bộ rễ chứa nhiều khoáng chất quan trọng, rất giàu chất đạm, Vitamin C, beta-caroten, acid amin và một hỗn hợp gồm các chất rất hiếm trong hệ thực vật, như: zeatin, quercetin, alpha-sitosterol, caffeoylquinic acid, kaempferol,… Trong cây Chùm Ngây có hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp và các chất khoáng đa dạng không kém các sản phẩm từ động vật Đặc biệt, trong lá Chùm Ngây rất giàu dinh dưỡng, hàm lượng Vitamin C cao hơn 7 lần

so với vitamin C trong quả cam, hàm lượng Vitamin A cao hơn 4 lần so với vitamin A trong củ cà rốt, hàm lượng Canxi cao hơn 4 lần so với Canxi trong sữa Giá trị làm thuốc của cây Chùm Ngây đã được khoa học chứng minh là có khả năng chống viêm,

kháng khối u, đặc biệt là những khối u ở vùng bụng (Harwell et al., 1967-1971), kháng nấm gây bệnh (Chuang et al

(Rao et al., 2001), kích thích hoạt động của tim và hệ tuần hoàn, làm giảm lượng cholesterol trong máu (Mehta et al., 2003) Ngoài ra, Chùm Ngây còn được sử dụng làm

mỹ phẩm c

Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, giá trị dinh dưỡng, giá trị dược liệu của Chùm Ngây Tuy nhiên, các nghiên cứu về kỹ thuật nhân, chọn tạo giống Chùm Ngây còn rất hạn chế Hiện nay, Chùm Ngây chủ yếu được nhân

, hiệu quả nhân giống không cao, chất lượng giống khô

Nhằm tạo ra nguồn giống chất lượng cao với số lượng lớn phục vụ gây trồng vùng nguyên liệu trên quy mô lớn theo hướng sản xuất hàng hóa đáp ứng cho nhu cầu tiêu dùng và làm nguyên liệu cho các cơ sở sản xuất

dược phẩm, thực phẩm, mỹ phẩm,…Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu nhân nhanh giống cây Chùm Ngây (Moringa oleifera L.) chất lượng cao bằng kỹ thuật nuôi cấy mô” Sự thành công của đề tài sẽ có đóng góp quan trong vào việc phát

triển, mở rộng diện tích gây trồng loài cây đa tác dụng này, từ đó góp phần nâng cao thu nhập, cải thiện đời sống của người dân

 Mục tiêu của đề tài

Mục tiêu chung:

Góp phần xây dựng quy trình kỹ thuật nhân nhanh giống cây Chùm Ngây bằng

kỹ thuật nuôi cấy mô, đạt hiệu quả nhân giống cao

Mục tiêu cụ thể:

- Xác định được các công thức môi trường, điều kiện nuôi cấy thích hợp cho từng

giai đoạn trong quy trình nhân giống cây Chùm Ngây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô;

- Đưa được cây Chùm Ngây từ điều kiện in vitro ra trồng ở điều kiện tự nhiên

(Vườn ươm)

 Nội dung của đề tài

- Xác định công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro;

- Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi;

- Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh chồi;

- Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ;

- Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Chùm Ngây in vitro ở vườn ươm

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về cây Chùm Ngây

Loài : Moringa oleifera Lam

1.1.2 Đặc điểm sinh thái học

0,6-1

[10]

ậu (Võ Văn Chi, 1999) [11]

Cây Chùm Ngây dễ trồng, có thể trồng từ hạt, hom cành, hom củ và trồng được quanh năm Vùng thiếu nước nên trồng vào mùa mưa, tức khoảng tháng 4, tháng 5 Cây

ưa đất ráo nước, nhiều cát, dù là đất xấu cũng dễ mọc, chịu được hạn hán, ưa nắng, hầu như không bị sâu bệnh hại do đó chăm sóc cây không cần điều kiện gì đặc biệt về phân bón và nước tưới Tuy nhiên, cây không chịu được úng ngập và dễ chết nếu không được thoát nước tốt Hệ thống rễ phát triển mạnh nếu được trồng từ hạt, phình to như củ màu trắng với những rễ bên thưa Nếu trồng bằng cách giâm cành, hệ thống rễ sẽ không được như vậy Cây bắt đầu cho quả từ thân và nhánh từ sau 6 đến 8 tháng trồng [25]

Ở Việt Nam cây trổ hoa vào tháng 1-2 Cây ra hoa rất sớm, thường ra ngay trong năm đầu tiên, khoảng 6 tháng sau khi trồng Cây khoảng 12 năm tuổi là cho hạt tốt nhất Quả chín, hạt giống phát tán khắp nơi theo gió và nước, hoặc được mang đi bởi những loài động vật ăn hạt

Khả năng nảy mầm của hạt còn mới là 60–90% Tuy nhiên khả năng này không giữ được nếu hạt được lưu giữ ở điều kiện thường quá 2 tháng Tỉ lệ nảy mầm giảm dần

từ 60%, 48% và 7,5% tương ứng với thời gian lưu trữ hạt là 1, 2 và 3 tháng (kết quả thử nghiệm ở Ấn Độ) [26]

Cây có thể trồng bằng hạt hoặc bằng cách giâm cành: trồng bằng hạt là phương pháp dễ dàng nhất Cây trồng từ hạt trong giai đoạn còn non, cây yếu nên cần được chăm sóc trong điều kiện bóng mát Biện pháp giâm cành cũng có thể thực hiện tuy nhiên hiệu quả không bằng gieo hạt, thường tiến hành giâm cành vào mùa mưa, khi điều kiện không khí đạt được độ ẩm thích hợp [33]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Hình 1.1: Cây Chùm Ngây [33]

Phân bố

Chùm Ngây là cây nhiệt đới và cận nhiệt đới, thích hợp trồng ở những điều kiện đất đai khô cằn và trong điều kiện khí hậu khắc nghiệt, chịu được hạn hán, nên ở nhiều nơi trên thế giới chùm Ngây được trồng làm hàng rào xanh che chắn cho các khu sản xuất nông nghiệp, che bóng cho các cây công nghiệp dài ngày, chắn gió, chắn cát Cây cũng có khả năng cải tạo đất tốt, lá già làm phân hữu cơ và thức ăn bổ sung cho gia súc rất tốt Ngoài ra, cây còn được làm cảnh (dáng cây thon, thân óng, tán đẹp,

lá xanh mướt)

Chùm Ngây được trồng phổ biến ở Châu Á và Châu Phi Ở Việt Nam, Chùm Ngây mọc tự nhiên ở Ninh Thuận, Bình Thuận Tuy nhiên, trong những năm gần đây do nhiều nghiên cứu đã chứng minh công dụng tuyệt vời của loài cây này mà diện tích gây trồng được mở rộng nhiều, chủ yếu ở các tỉnh phía Nam [6], [7]

1.1.3 Giá trị sử dụng của cây Chùm Ngây

Ngây (Moringa oleifera

Si Ngây

?

Ngây (Moringa oleifera

Ngây

Trong cây Chùm Ngây chứa hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp (bao gồm 7 loại vitamin, 6 loại khoáng chất, 18 loại acid amin, 46 chất chống ôxi hóa),

Ngây

-, quercetin-, β-sitosterol caff

Trong lá rất giàu dinh dưỡng, hàm lượng vitamin C nhiều hơn trái cam 7 lần, vitamin A nhiều hơn Cà-rốt 4 lần, Canxi nhiều hơn sữa 4 lần, chất sắt nhiều hơn cải bó xôi 3 lần, còn chất đạm nhiều hơn Ya-ua 2 lần và kali nhiều hơn trái chuối 3 lần [27], [34], [30]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

: http://www.moringa.net/medicinaluse.htm)

Ngây

[30] Chất dầu trong hạt có phẩm chất tốt, màu vàng tươi sáng với một hương vị dễ chịu

có được so sánh chất lượng với dầu olive, để rất lâu không hỏng và được sử dụng làm dầu ăn hoặc dầu máy [44]

1.1.3.2 Giá trị dược học

Ngây

c nhau Ở một số quốc gia khác, như: Pakistan, Trung

Mĩ, Saudi Arabia, và Việt Nam cũng sử dụng Chùm Ngây

Các quốc gia đang phát triển sử dụng Chùm Ngây như dược liệu kết hợp chữa hàng trăm loại bệnh hiểm nghèo, bệnh thông thường như phòng và trị ung thư, tiểu đường, thiếu máu, còi xương, tim mạch, kinh phong, sưng tấy, viêm nhiễm, mỡ máu, đau dạ dày, ngừa thai, ung loét, lão hóa, suy nhược cơ thể, suy nhược thần kinh, trị chứng bất lực và tăng cường khả năng ham muốn tình dục [37] Đặc biệt, hợp chất zeatin, với năng lực chống lão hóa mạnh mẽ, trong chùm Ngây cao gấp vài ngàn lần so

Lá Chùm Ngây

với bất kỳ một loại cây nào khác Thêm vào đó, chùm Ngây cũng có 2 loại hợp chất phòng ung thư và chặn đứng sự tăng trưởng của khối u, khiến cây được mệnh danh là loại cây phòng ung thư [42]

Ngây

-[16]

a Chuang Ngây

châu Phi, Trung Mỹ, Nam Mỹ, Đông Nam Á, Sri Lanka,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Ngây C

-20

) [44], [38]

c

Nam Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu nhân giống in vitro loài cây Chùm

Ngây với mục đích tạo ra một số lượng cây lớn phục vụ gây trồng và phát triển loài cây này ở các tỉnh phía Bắc

Chùm Ngây được xem là một cây đa công dụng, rất hữu ích tại những quốc gia nghèo Vì vậy nó được nghiên cứu rất nhiều về nhân giống, trồng trọt và thu hái; cũng như nghiên cứu về các hoạt tính y dược học và giá trị dinh dưỡng Đa số các nghiên cứu được thực hiện tại Ấn Độ, Philippines và Châu Phi Nghiên cứu nhiều nhất về giá trị của

cây Chùm Ngây (Moringa oleifera) là tại Đại Học Nông Nghiệp Falsalabad-Pakistan [2]

Ngây

Ngây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

1.4 Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào

1.4.1 Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào

Cơ sở của sự phân hóa và phản phân hóa tế bào là tính toàn năng của tế bào Mỗi

tế bào đã chuyên hóa đều chứa một lượng thông tin di truyền (bộ nhiễm sắc thể) giống với toàn bộ các tế bào khác trong một cơ thể trưởng thành và giống tế bào hợp tử Nếu những tế bào đã chuyên hóa để trong điều kiện nhất định tế bào đó có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn năng của tế bào Như vậy bất cứ một tế bào nào cũng có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh và đó

cũng là cơ sở của phương pháp nuôi cấy in vitro Về mặt di truyền phân tử có thể nói

rằng toàn bộ quá trình phát triển cá thể của cây từ hợp tử cho đến khi cây chết ở tuổi tối

đa đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN đặc trưng cho loài Đời sống của cây là quá trình thực hiện dần dần chương trình di truyền đó

Quá trình biệt hóa TB

Quá trình phản biệt hóa TB

năng

Sơ đồ thể hiện sự biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào

Cơ sở thứ hai của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào là sự biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào Sự biệt hóa tế bào là quá trình tế bào chuyển từ giai đoạn sinh trưởng tế bào sang giai đoạn chuyên hóa chức năng Các tế bào trong giai đoạn này đã có các đặc trưng khác nhau về cấu trúc và chức năng Sự phản phân hóa tế bào là quá trình diễn ra ngược lại, các tế bào đã biệt hóa trong các mô chức năng không mất đi khả năng phân chia mà trong những điều kiện nhất định chúng có thể quay trở lại đóng vai trò như mô phân sinh và có khả năng phân chia để cho ra các tế bào mới [3], [1]

1.4.2 Quy trình nhân giống in vitro

Nhân giống in vitro là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của

cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện

vô trùng có môi trường thích hợp và được kiểm soát

Một quy trình nhân giống in vitro bao gồm 5 giai đoạn nối tiếp, mỗi giai đoạn đều

có vai trò rất quan trọng vì nếu thất bại ở một giai đoạn nào đó thì sẽ dẫn đến thất bại cả

quy trình Các giai đoạn chính trong quy trình nhân giống in vitro:

- Giai đoạn tạo mẫu sạch in vitro: Trong giai đoạn này người ta thường sử dụng

các loại hóa chất như: HgCl2, NaClO, Ca(OCl)2, H2O2… để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ các nguồn nấm, vi khuẩn và tạo sự chủ động về nguồn mẫu cấy Nguồn mẫu ban đầu có thể là chồi, hạt hoặc các bộ phận khác của cây Mục đích của giai đoạn này là tạo

ra nguồn vật liệu sạch để đưa vào nuôi cấy ở các giai đoạn tiếp theo

Giai đoạn 5:

Đưa cây ra ngoài vườn ươm

Giai đoạn 4:

Tạo cây con hoàn chỉnh (Tạo rễ)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

- Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy: Mục tiêu để tạo ra các chồi mới từ mô nuôi cấy,

về nguyên tắc thì tất cả các bộ phận của cây như thân, rễ, lá, hoa đều có khả năng nuôi cấy để tái sinh thành cây Tuy nhiên, một số các yếu tố như tuổi sinh lý của mô, thời điểm thu mẫu, mẫu non hay già đều có ảnh hưởng đến khả năng tái sinh Các chỉ tiêu đánh giá kết quả là: Tỉ lệ mẫu nhiễm thấp, tỉ lệ mẫu tái sinh cao, chồi sinh trưởng tốt

- Giai đoạn nhân nhanh: Nhóm các chất điều hoà sinh trưởng như: Auxin,

Cytokinin, Gibberellin,… và các chất phụ gia khác như nước dừa, chuối, khoai tây,…

có vai trò rất quan trọng, vì chúng thúc đẩy sự phân hoá cơ quan, đặc biệt là chồi Mục tiêu của giai đoạn này là tạo ra số lượng chồi, chồi sinh trưởng và phát triển tốt nhất để chủ động sản xuất lượng lớn cây giống cung cấp cho thị trường

- Giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh: Khi các chồi đạt kích thước nhất định từ môi

trường nhân nhanh được cấy chuyển sang môi trường tạo rễ Thông thường, trong môi trường tạo rễ hàm lượng Cytokinin giảm xuống, ngược lại tăng hàm lượng Auxin Các chất ĐHST như: α - NAA, IBA, IAA ở nồng độ 0,1 - 5,0 mg/l thường được sử dụng để tạo rễ cho hầu hết các loài cây trồng Ở giai đoạn này, cây mô rất nhạy cảm với độ ẩm, ánh sáng và dễ nhiễm bệnh do hoạt động của lá và rễ mới sinh ra vì vậy phải lưu ý đến yếu tố môi trường trong nuôi cấy

- Giai đoạn đưa cây ra ngoài vườn ươm: Ở giai đoạn này, cây được huấn luyện

cho thích nghi dần dần với môi trường bên ngoài Chú ý đảm bảo độ ẩm, chế độ ánh sáng (tránh ánh sáng trực xạ cho cây con trong 2 - 3 tuần đầu), những ngày sau chế độ chăm sóc như cây hom hoặc cây ươm từ hạt ngoài vườn ươm [3], [1], [8], [12]

1.4.3 Các điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro

1.4.3.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy bao gồm hai loại: Môi trường hoá học và môi trường vật lý,

chúng quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in vitro

Môi trường nuôi cấy

MT Hóa học

MT Vật lí

Nhóm các nhân

tố vi lượng

Các chất điều hòa sinh trưởng

Các thành phần khác

Các vitamin Nguồn

các bon

Do vậy, khi tiến hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và với từng đối tượng nuôi cấy cụ thể:

* Môi trường hoá học: Cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự

sinh trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro Thành phần của

môi trường hoá học thay đổi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôi cấy, nhưng thường có các nhóm chất sau:

- Nhóm các nguyên tố đa lượng

Nguyên tố đa lượng là những nguyên tố muối khoáng như: N, P, K, S, Mg và Ca, được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm Các nguyên tố này có chức năng tham gia vào quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường và xây dựng nên thành tế bào Môi trường nhiều Nitơ thích hợp cho việc hình thành chồi, với môi trường nhiều Kali sẽ giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ

- Nhóm các nguyên tố vi lượng

Nguyên tố vi lượng là những nguyên tố khoáng được sử dụng ở nồng độ dưới 30 ppm, gồm có: Fe, Cu, Zn, Mo, Co, Mn, Bo,… Tuy chỉ cần một lượng nhỏ trong môi trường nuôi cấy, nhưng chúng là thành phần không thể thiếu cho sự sinh trưởng và phát triển của mô Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào từng môi trường nuôi cấy

và từng đối tượng nuôi cấy

- Nguồn cacbon

Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu, vì vậy buộc phải bổ sung nguồn cacbon để mẫu nuôi cấy có thể tổng hợp được các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia Thông thường nguồn cacbon bổ sung là đường Sucrose và glucose với liều

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

lượng 20 - 30g/l dung dịch Trong trường hợp cần thiết có thể thay thế bằng các loại đường khác như: Maltose, lactose hay fructose

- Các vitamin

Theo Czocowoki (1952) thì mô và tế bào thực vật khi nuôi cấy in vitro vẫn có

khả năng tự tổng hợp được một số vitamin cần thiết nhưng không đáp ứng đủ nhu cầu của chúng Vì vậy, phải bổ sung các vitamin cần thiết vào môi trường nuôi cấy để góp phần tạo các cô enzyme xúc tác các phản ứng sinh hoá trong tế bào [8] Các vitamin thường được sử dụng như: B1 (Thiamin), B2 (Ribofravin), B3 (Axit panthotenic), B5

(Axit nicotinic), B6 (piridoxin) với nồng độ phổ biến là 1mg/l Myo – inositol cũng hay được sử dụng vì nó có vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp thành tế bào thực vật

- Các chất phụ gia hữu cơ

Các chất phụ gia được đưa và môi trường nuôi cấy nhằm kích thích sự sinh trưởng của mô sẹo và các cơ quan như: nước dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết nấm men Trong thành phần của nước dừa chứa các axit amin, axit hữu cơ, đường, Myo - inositol

và các chất có hoạt tính Auxin, các gluoxit của Cytokinin Ngoài ra, khoai tây và chuối cũng hay được sử dụng, vì trong thành phần của chúng có chứa một số vitamin và các kích thích tố có tác dụng tích cực đến sự sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy

- Các chất điều hoà sinh trưởng

Các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò hết sức quan trọng đến kết quả nuôi cấy

in vitro, quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nuôi cấy Nó ảnh hưởng tới sự

biệt hoá, phản biệt hoá và sự sinh trưởng của tế bào, đặc biệt là sự biệt hoá các cơ quan như chồi và rễ Nhu cầu về chất điều hòa sinh trưởng đối với từng loài cây và từng giai

đoạn nuôi cấy là khác nhau Vì vậy, để nuôi cấy in vitro thành công cần phải tiến hành

các nghiên cứu cụ thể để tìm ra nồng độ cũng như tỷ lệ các chất điều hoà sinh trưởng phù hợp Trong nuôi cấy mô - tế bào thường sử dụng 3 nhóm chất chính là Auxin, Cytokinin và Gibberellin

+ Auxin: Tác dụng kích thích sự giãn tế bào, sự hình thành rễ bất định và mô sẹo

Trong nuôi cấy mô tế bào thường sử dụng bốn loại Auxin là: IAA (Indol axetic axit), IBA (Indol butyric), NAA (Naphthyn axetic axit) và 2.4-D (2,4 dicloro phenoxy axetic axit), với nồng độ từ 0,1 - 5mg/l tuỳ từng loài cây, từng loại chất và từng giai đoạn nuôi cấy

+ Cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào và hình thành chồi,các chất thường

được sử dụng là: Kinetin và BAP (benzil amino purin) Tỉ lệ giữa Auxin và Cytokinin quy định sự biệt hoá của mô - tế bào theo hướng tạo chồi, tạo rễ hoặc hình thành mô sẹo Theo những nghiên cứu của Milleer và Skoog cho thấy trong môi trường nuôi cấy nếu tỉ lệ Auxin/Cytokinin cao thì mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo rễ, nếu thấp mô sẽ biệt hoá theo hướng tạo chồi, còn nếu tỉ lệ này gần bằng 1 thì mẫu nuôi cấy sẽ biệt hoá theo hướng tạo mô sẹo Theo Das (1958) và Nistach (1968) cho rằng chỉ khi có tác dụng đồng thời của Auxin và Cytokinin thì mới kích thích mạnh mẽ sự tổng hợp ADN dẫn đến quá trình phân chia tế bào

+ Gibberellin: Đây là chất có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lóng, đốt

thân, cành cây Ngoài ra, nó còn có tác dụng phá tính ngủ nghỉ ở củ, hạt, ức chế tạo rễ phụ cũng như tạo chồi phụ Chất thường được sử dụng nhất trong nhóm này là GA3 (Gibberellin)

Ngoài ba nhóm chất trên còn có các chất có tác dụng ức chế sự sinh trưởng và phát triển khác như Etylen Chất này cũng gây ảnh hưởng khá rõ đến sự phát sinh hình thái của

một số cây trồng trong nuôi cấy in vitro [3], [5], [12], [13]

- Các chất làm đông cứng môi trường (giá thể)

Một số chất được sử dụng để làm môi trường nuôi cấy đông đặc lại để tạo thành giá thể cho mẫu cấy phát triển như Agar Đây là một loại polysacharid làm từ rong biển

và có khả năng ngậm nước cao, ở 800C agar ngậm nước và tồn tại ở trạng thái lỏng, còn

ở dưới 400C nó lại tồn tại ở trạng thái rắn Trong môi trường có tính axit cao Agar không có khả năng đông đặc, Agar thường được sử dụng ở nồng độ 6 – 10 g/l [13]

- Độ pH của môi trường: Là yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng trực tiếp tới quá

trình hấp thụ các chất dinh dưỡng từ môi trường vào mẫu cấy Thực tế đã chứng minh khi pH thấp (pH< 4,5) hoặc cao (pH >7) đều gây ra ức chế sinh trưởng, phát triển của

mô và tế bào nuôi cấy Nếu pH của môi trường giảm mạnh sẽ làm rối loạn quá trình trao đổi Fe, làm giảm hay ngừng hẳn quá trình sinh trưởng của mẫu cấy, thường độ pH dao động trong khoảng từ 5,5 - 6,5 trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật

* Môi trường vật lý:

Nhiệt độ và ánh sáng là hai nhân tố vật lý có ảnh hưởng cơ bản và quan trọng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

- Nhiệt độ: Là nhân tố vật lý quan trọng ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào

và các quá trình trao đổi chất trong mô cấy, đồng thời nó ảnh hưởng tới sự hoạt động của Auxin do đó nó ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng ra rễ của cây mô Nhiệt độ nuôi cấy cần được giữ ổn định ở 25 ± 20

C

- Ánh sáng: Các nghiên cứu đã cho thấy ánh sáng rất cần thiết cho sự phát triển

và phát sinh hình thái của mẫu cấy Nó phụ thuộc rất nhiều vào thời gian chiếu sáng, cường độ và chất lượng ánh sáng Đặc biệt thời gian chiếu sáng phải phù hợp với đặc tính sinh vật học của loài cây và bộ phận nuôi cấy Thời gian chiếu sáng thường biến động từ 8 - 16 giờ/ngày

Cường độ ánh sáng có ảnh hưởng lớn tới quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo, cường độ thấp lại gây nên sự tạo chồi

Ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2.000-3.000 Lux, tương đương với khoảng cách 30 cm từ đèn chiếu sáng tới mô nuôi cấy hoặc dùng ánh sáng tự nhiên với

cường độ thấp là phù hợp với nuôi cấy in vitro Trong nhiều trường hợp ở giai đoạn

nuôi cấy tạo mô sẹo có thể không cần ánh sáng

Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ tới kết quả nuôi cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng Ánh sáng xanh ức chế sự vươn cao, nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sinh trưởng của mô sẹo [12]

1.4.3.2 Vật liệu nuôi cấy

Về nguyên tắc mọi tế bào của mô chuyên hoá như: thân, rễ, lá, chồi… trên cơ thể sinh vật đều có khả năng làm vật liệu nuôi cấy Tuy nhiên trong thực tế cho thấy tuỳ vào loại tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau, vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao Khi chọn vật liệu nuôi cấy cần chú ý đến mùa vụ lấy vật liệu, kích thước vật liệu, tuổi cây mẹ, vị trí lấy vật liệu trên cây mẹ và dòng cây mẹ [13]

1.4.3.3 Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định đến sự thành bại của quá trình nuôi

cấy in vitro Do môi trường nuôi cấy rất giàu dinh dưỡng nên nó sẽ là môi trường phát

triển hết sức thuận lợi cho nấm và các vi sinh vật khác Nếu điều kiện vô trùng không

được đảm bảo thì mẫu cấy sẽ bị tạp nhiễm và chết dẫn đến các giai đoạn sau bị ngừng lại Vì vậy, trong quá trình nuôi cấy phải đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối hay là phải có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng cấy, bàn cấy vô trùng, đặc biệt các thao tác nuôi cấy phải hết sức cẩn thận [13]

1.5 Một số thành tựu về nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy

mô-tế bào ở Việt Nam

Nuôi cấy mô-tế bào thực vật là một phương pháp nhân giống cây trồng tiên tiến đem lại hiệu quả cao, phạm vi ứng dụng rộng Phương pháp nhân giống này có nhiều ưu điểm, như: Cây giống tạo ra vẫn giữ nguyên được phẩm chất di truyền của cây mẹ, đồng đều, sạch bệnh, có thể sản xuất cây giống ở quy mô lớn, trong phạm vi không gian hẹp, không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết Ngoài ra, kỹ thuật nuôi cấy mô-tế bào thực vật cũng được ứng dụng để nhân nhanh sinh khối tế bào thông qua việc nuôi cấy tế bào đơn hoặc phôi soma trong bioreactor để sản xuất các hợp chất thứ sinh có hoạt tính ứng dụng trong y-dược và công nghiệp hóa mỹ phẩm Ở nước ta việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô-tế bào thực vật để nhân nhanh một số giống cây trồng đã được tiến hành từ những năm 1980, đến nay đã đạt được những kết quả đáng kể Các đối

tượng cây trồng đã được nhân giống thành công bằng phương pháp nuôi cấy in vitro,

như: (1) Các loài cây có giá trị kinh tế phục vụ gây trồng quy mô lớn, như Cây hoa: hoa lan, cúc, đồng tiền, lily, phăng, cẩm chướng, lay ơn, hoa hồng; Cây lương thực, thực phẩm: khoai tây, cà chua, súp lơ, khoai sọ, khoai môn, sắn; Cây ăn quả: chuối, dứa, dâu tây, cam, quýt, bưởi; Cây công nghiệp: mía, cà phê, thuốc lá; Cây lâm nghiệp: bạch đàn, keo, hông, tếch, thông, tùng, sưa, dó bầu, lõi thọ, Xoan ta, song mật; (2) Các loài cây dược liệu quý hiếm như: sâm ngọc linh, trinh nữ hoàng cung, lan kim tuyến, hoàn ngọc;

(3) Các loài cây có khả năng tái sinh sinh tự nhiên thấp

Hiện nay, trong cả nước có khoảng 40 tỉnh thành có cơ sở nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô-tế bào thực vật Chỉ riêng tỉnh Lâm đồng có 52 cở sở, trong

đó có gần 40 cơ sở là do tư nhân đầu tư; mỗi năm các cơ sở nuôi cấy mô-tế bào này đã cung cấp cho thị trường trong và ngoài nước trên 20 triệu cây giống các loại Lâm Đồng hiện là địa phương được đánh giá có hoạt động ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô-tế bào thực vật trong nhân nhanh giống cây trồng phát triển mạnh nhất trong cả nước

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Các cán bộ khoa học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sau nhiều năm nghiên cứu đã thu được nhiều kết quả quan trọng trong lĩnh vực công nghệ tế bào thực vật, như: Đã hoàn thiện được nhiều quy trình công nghệ nhân nhanh, phục tráng giống, làm sạch vi rút đối với nhiều giống cây trồng nông- lâm nghiệp, cây dược liệu có giá trị cao, như: Cây khoai lang, khoai mỡ, măng cụt, chanh không hạt, cây sung Mỹ, hồ tiêu, điều, cây Paulownia, cây tre, dó bầu, xoan chịu hạn, lõi thọ, keo lai, lát Mêhicô, phong lan, hồng môn, cẩm chướng, đồng tiền, cây xả, trinh

nữ hoàng cung, sâm Ngọc linh Điển hình là Viện đã triển khai ứng dụng sản xuất giống khoai tây bằng củ bi và đã cung cấp gần 400.000 củ bi giống cho vùng sản xuất Đà Lạt;

Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật nhân giống chuối (Cavendish Sp.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và đã được đưa vào sản xuất trên quy mô công nghiệp, mỗi năm

cung cấp hàng triệu cây giống chuối nuôi cấy mô cho sản xuất

Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Hoa, Cây cảnh - Viện Nghiên cứu Rau quả cũng xây dựng thành công hơn 30 quy trình kỹ thuật nhân giống, trồng và chăm sóc hoa thương phẩm điển hình là: Quy trình kỹ thuật nhân giống hoa lan Hồ Điệp trên quy

mô công nghiệp, quy trình này đã được chuyển giao áp dụng cho 11 tỉnh, thành trong cả

nước, góp phần đưa công nghệ sản xuất hoa ở Việt Nam tiếp cận với các nước trong khu vực; Quy trình sản xuất hoa lily áp dụng cho các tỉnh phía Bắc, giúp cho miền Bắc Việt Nam từ chỗ không sản xuất được hoa lily đến nay quy mô sản xuất đã đạt trên 10 triệu

củ (cây)/năm; Các Quy trình trên đã và đang được chuyển giao ứng dụng cho hơn 40 tỉnh, thành trên cả nước, góp phần đáng kể vào sự nghiệp nghiên cứu, phát triển sản xuất hoa, cây cảnh ở Việt Nam

Viện Di truyền Nông nghiệp đã hoàn thiện được quy trình nhân giống in vitro cho 2 giống hoa cúc (giống CN97 và CN98) Quy trình nhân nhanh in vitro một số giống hoa Lilium spp và tếch đã được công nhận là tiến bộ kỹ thuật và quy trình nhân

nhanh các giống hoa đồng tiền bằng phương pháp nuôi cấy lớp cắt mỏng đã được công nhận giống tạm thời Các quy trình này đã được chuyển giao cho các cơ sở sản xuất Đối với nhân giống cây lâm nghiệp cũng đã đạt được nhiều thành quả đáng kể, chủ yếu tập trung ở một số cơ sở nhân giống cây lâm nghiệp lớn, như: Trung tâm Khoa học

và Sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh, Viện Nghiên cứu Cây nguyên liệu giấy Phù Ninh, Trung tâm Nghiên cứu Giống cây rừng – Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam,

Trường Đại học Lâm nghiệp, Công ty Giống lâm nghiệp Trung ương, Nhiều quy trình kỹ thuật nhân giống cây lâm nghiệp đã được xây dựng, như: Quy trình nhân giống cây Bạch đàn urô dòng U6, Bạch đàn lai, Keo, Hông, Tếch, Dó bầu, Lõi thọ, Song mật Trong đó, điển hình là Trung tâm Khoa học và Sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh triển khai nhiều đề tài, dự án cấp bộ, cấp nhà nước về nhân giống cây lâm nghiệp đạt kết quả xuất sắc Trung tâm đã sản xuất được 21 triệu cây, đem lại doanh thu cho Trung tâm từ 2,5- 4 tỷ đồng/năm, đồng thời tạo nhiều việc làm cho người dân trong và ngoài tỉnh

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG – VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu

- Đối tượng: Bộ phận của Cây Chùm Ngây (Moringa oleifera L.);

- Vật liệu: Hạt cây Chùm Ngây chín thu hoạch do Công ty TNHH Lê Hoàng, Thành

phố Hồ Chí Minh cung cấp Hạt được sử dụng để tạo cây mầm in vitro, sau đó sử dụng các bộ phận sinh dưỡng của cây mầm in vitro làm vật liệu nhân giống

Hình 2.1 Hạt cây Chùm Ngây

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30)

- Thí nghiệm được lặp lại ≥ 3 lần

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm

Sử dụng hạt làm nguồn vật liệu khởi đầu, tiến hành khử trùng và cấy vào môi trường MS cơ bản Khi mẫu tái sinh và bật chồi, sau 2-3 tuần cắt cây mầm và cấy chuyển sang môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng để nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi Khi các chồi dài khoảng 3-5 cm thì tiến hành cắt và cấy chuyển sang môi trường kích thích tạo rễ, những chồi không đủ kích thước thì tiếp tục cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh

Các môi trường thí nghiệm được chỉnh pH đến 5,8 sau đó khử trùng ở 120o

C

trong thời gian 20 phút

Các mẫu cấy được nuôi ở điều kiện ánh sáng trắng 12 giờ/ngày, cường độ 3.000 lux, nhiệt độ 25-27 o

C

Đề tài tiến hành 7 thí nghiệm với các phương pháp bố trí thí nghiệm như sau:

2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro

Có nhiều hóa chất được sử dụng để khử trùng mẫu cấy nhằm loại bỏ nguồn bệnh

và tạo được lượng lớn các mẫu sạch in vitro, nhưng hai loại hóa chất được sử dụng

nhiều nhất và có hiệu quả cao là HgCl2 và NaClO

Phương pháp khử trùng:

Khử trùng ngoài box cấy: Hạt cây Chùm Ngây được tách bỏ vỏ ngoài, loại bỏ hạt

xấu, chọn hạt đồng đều Hạt được đựng trong ống phancol, lắc rửa mạnh bằng nước sạch và dung dịch nước xà phòng để loại bỏ chất bẩn bám trên bề mặt Sau đó rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy sao cho hết xà phòng, tráng lại mẫu bằng nước cất sạch

Khử trùng trong box cấy: Hạt được rửa bằng nước cất vô trùng, lắc mạnh trong

1-2 phút để loại bỏ các chất bẩn bám trên bề mặt, lặp lại 3 lần Sau đó tiến hành rửa bằng cồn 70% trong 2 phút rồi rửa sạch bằng nước cất vô trùng (rửa 3 lần) Sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% hoặc NaClO 60% với thời gian khử trùng khác nhau, sau đó rửa lại 4-5 lần bằng nước cất vô trùng để loại bỏ hóa chất bám trên bề mặt tránh gây độc cho phôi hạt

Cấy mẫu vào môi trường: Hạt sau khi xử lý được đưa ra đĩa vô trùng, dùng giấy

thấm vô trùng để thấm khô nước trên bề mặt của hạt, sau đó cấy lên môi trường: MS + 8g/l Agar + 30g/l sucrose Thí nghiệm được bố trí như ở bảng 2.1

Bảng 2.1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng

tạo mẫu sạch in vitro

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Công

thức

Hóa chất Thời

gian (phút)

Tổng

số mẫu cấy (mẫu)

gian mẫu nẩy mầm (ngày)

Số mẫu sạch (mẫu)

Tỷ lệ mẫu sạch (%)

Số mẫu sạch nẩy mầm

Tỷ lệ mẫu sạch nẩy mầm (%)

Trong nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro, môi trường dinh dưỡng được xem là

nhân tố quan trọng, có ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả nhân giống Môi trường dinh dưỡng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và phân hóa của các mô trong suốt quá trình nuôi cấy Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp với từng đối tượng cây trồng ở từng giai đoạn cụ thể trong quy trình nuôi cấy

là việc rất cần thiết, để đạt được hiệu quả nuôi cấy cao nhất Trong thí nghiệm này, sử dụng

chồi của cây mầm in vitro để cấy vào các loại môi trường dinh dưỡng cơ bản khác nhau,

gồm: Môi trường MS, ½ MS, WPM, B5 Gamborg và Chu (N6), các loại môi trường này đều được bổ sung 0,5 mg/l BAP + 8 g/l agar + 30 g/l đường sucrose, nhằm xác định môi

trường dinh dưỡng thích hợp cho tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro Thí nghiệm được bố trí

trong bảng 2.2

Bảng 2.2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi

Chùm Ngây in vitro

Công thức

thí nghiệm trường Môi

dinh dưỡng

Tổng số mẫu cấy ban đầu (chồi)

Số mẫu tái sinh chồi

Tỷ lệ mẫu tái sinh chồi (%)

Số chồi TB/mẫu lượng Chất

Ghi chú: MS (Murashige and Skoog medium); WPM (Woody Plant Medium); B5 (Gamborg

Medium); N6 (Chu medium)

2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro

Khi đã tạo được mẫu sạch in vitro, tiến hành cắt chồi của cây mầm in vitro cấy

chuyển sang môi trường tái sinh chồi (môi trường dinh dưỡng tốt nhất ở thí nghiệm 2 có

bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau) Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng

sử dụng BAP ở nồng độ từ 0,1 – 5 mg/l có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng bật chồi của mẫu cấy Đối với cây Chùm Ngây, chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng BAP đến sự tạo thành chồi mới ở dải nồng độ từ 0,2 - 2,0 mg/l Thí nghiệm được tiến hành với 7 công thức thí nghiệm, mỗi công thức được tiến hành trên môi trường dinh dưỡng cơ bản đã xác định được ở thí nghiệm 2, bổ sung 8 g/l agar + 30 g/l sucrose và chất điều hòa sinh trưởng ở các nồng độ khác nhau Thí nghiệm được bố trí như ở bảng 2.3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Bảng 2.3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm

Ngây in vitro

CTTN

BAP (mg/l)

Tổng số mẫu cấy (mẫu)

Số mẫu tái sinh chồi (mẫu)

Tỉ lệ mẫu tái sinh chồi (%)

Số chồi TB/mẫu (chồi)

Chiều cao TB chồi (cm)

Tham khảo một số tài liệu đã nghiên cứu về nhân giống Chùm Ngây, chúng tôi

bổ sung thêm Kinetin vào môi trường nhân nhanh chồi Công thức tốt nhất ở mục 2.2.2.2 được sử dụng để tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng tổ hợp giữa BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Công thức môi trường MS + 8 g/l agar + 30 g/l sucrose + nồng độ BAP thích hợp nhất ở thí nghiệm 3 và kinetin được bổ sung ở các nồng độ khác nhau Thí nghiệm được bố trí ở bảng 2.4

Bảng 2.4: Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi chùm

Số mẫu tái sinh chồi (mẫu)

Tỉ lệ mẫu tái sinh

Số chồi TB/mẫu (chồi)

Chiều cao TB chồi (cm)

ra rễ của chồi Chùm Ngây in vitro

Chồi được tạo ra với số lượng lớn, đủ tiêu chuẩn (đạt kích thước 3-5cm) được cắt

và cấy chuyển sang môi trường tạo rễ là: Công thức môi trường MS (1962) và ½ MS (các chất khoáng đa lượng và vi lượng giảm ½) + 8 g/l agar + 0,5 mg/l IBA và bổ sung sucrose với các hàm lượng khác nhau Thí nghiệm được bố trí như ở bảng 2.5

Bảng 2.5: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ

(g/l)

Tổng số mẫu cấy (mẫu)

Số chồi

ra rễ (chồi)

Tỉ lệ chồi

ra rễ

Thời gian bắt đầu ra rễ (ngày)

Số rễ TB/ch

ồi (rễ)

Chiều dài

TB rễ (cm)

2.2.2.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi

Sau khi xác định được môi trường dinh dưỡng thích hợp cho ra rễ của chồi Chùm

Ngây in vitro, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng IBA đến

khả năng ra rễ của chồi Thí nghiệm được bố trí sử dụng môi trường dinh dưỡng thích hợp đã xác định được ở thí nghiệm 5, bổ sung IBA với các nồng độ khác nhau như ở bảng 2.6

Bảng 2.6: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi

(mg/l)

Tổng số chồi cấy (chồi)

Số chồi

ra rễ (chồi)

Tỉ lệ chồi ra

rễ (%)

Thời gian bắt đầu ra rễ (ngày)

Số rễ TB/chồi (rễ)

Chiều dài TB

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/

2.2.2.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Chùm Ngây in vitro ở vườn ươm

Giai đoạn chuyển cây in vitro từ trong bình nuôi ra trồng ở vườn ươm là giai đoạn

có ý nghĩa quan trọng, quyết định khả năng ứng dụng của toàn bộ quy trình nhân giống

cây in vitro vào trong thực tiễn sản xuất Giai đoạn này thường gặp nhiều khó khăn do cây in vitro đang trong điều kiện ổn định về mặt dinh dưỡng, nhiệt độ, độ ẩm, ánh

sáng,… khi tiến hành chuyển cây ra ngoài sẽ làm cây dễ bị “sốc” về điều kiện sống dẫn tới tỷ lệ cây bị chết là khá cao, vì bắt đầu từ đây cây phải chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang giai đoạn tự dưỡng Một trong những yêu cầu của giai đoạn này là xác định được

giá thể trồng cây phù hợp để cây Chùm Ngây in vitro sinh trưởng và phát triển tốt nhất

Để xác định ảnh hưởng của thành phần giá thể trồng cây đến tỷ lệ sống và sinh

trưởng của cây Chùm Ngây in vitro khi đưa ra trồng thử nghiệm ở vườn ươm, chúng tôi

tiến hành thử nghiệm với 4 công thức thí nghiệm là 100% đất tầng B; 100% cát; 50% đất : 50% cát; 50% đất tầng B : 30% cát : 20 % trấu hun Thí nghiệp được bố trí như trong bảng 2.7

Bảng 2.7: Ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Chùm Ngây in vitro

trồng ở vườn ươm

CTTN Thành phần giá thể Số cây cấy

(cây)

Số cây sống (cây)

Tỷ lệ cây sống (%)

Chất lượng cây con

Tỉ lệ mẫu nảy mầm = Tổng số mẫu nảy mầm x100 (%)

Tổng số mẫu cấy

+ Thí nghiệm nghiên cứu nhân nhanh chồi:

Tổng số mẫu ban đầu

Tổng số chồi + Thí nghiệm nghiên cứu khả năng ra rễ của chồi:

Tổng số chồi cấy ban đầu

Chiều dài TB của rễ= Tổng chiều dài các rễ Tổng số rễ (cm)

Số mẫu cho mỗi thí nghiệm ≥ 30 mẫu, Thời điểm thu thập số liệu sau 2 tuần nuôi cấy

Dùng phương pháp phân tích số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, các bước tiến hành như sau: mở bảng tính Excel → Data → Data analysis → Anova single factoc hoặc Anova two factoc with replication → chọn vùng dự liệu phân tích, vùng

xuất dữ liệu và độ tin cậy 0.05→ nhấn Ok