BÁO CÁO VI SINH 3 ĐỊNH DANH CẦU KHUẨN GR (+) VÀ TRỰC KHUẨN GR () (trực khuẩn mủ xanh) (CHUYÊN NGÀNH XÉT NGHIỆM)

báo cáo trình bài về hình thành, tính chất, đặc điểm, quy trình phản ứng và giải thích các phản ứng phân biệt giữa các loại tụ cầu , liên cầu và trực khuẩn. Cũng như các hình ảnh minh họa thực tiễn cho từng phản ứng. Hơn thế, bài báo cáo còn có các sơ đồ tóm tắt quy trình định danh chung và riêng cho từng loài, bảng tóm tắt từng phản ứng phân biệt.

KHOA Y

BÁO CÁO VI SINH 3

Lớp: DH20XET01

NHÓM 3

1 Phùng Thị Thùy Ngân - 201406

2 Trịnh Thúy Anh - 200488

3 Trần Ngọc Quỳnh Anh - 200168

4 Lê Trương Ngọc Hân - 2010155

5 Chung Đình Khôi - 200223

6 Kim Thị Hồng Hà - 201186

7 Nguyễn Thị Ngọc Hân - 200725

Cần Thơ – 2023

ĐỊNH DANH NHÓM TRỰC KHUẨN GRAM (-)

A QUY TRÌNH

B ĐỊNH DANH

I NHUỘM GRAM

a) Mục đích:

Phân biệt hình thể, gram dương hay gram âm , cách sắp xếp ,… của vi khuẩn

b) Nguyên tắc:

+ Hình thể: Cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn, cầu trực khuẩn,

+ Tính chất bắt màu: Gram âm (bắt màu đỏ), Gram dương (bắt màu tím)

+ Cách sắp xếp: Đứng đơn lẻ, xếp thành từng cặp, xếp thành chuỗi, xếp thành từng đám,… + Bán định lượng kết quả nhuộm soi được đánh giá dựa trên bảng sau

c) Kĩ thuật:

- Lấy 1 lượng vi khuẩn cần nhuộm bằng que cấy

- Cố định trên lam bằng đèn cồn

- Để nguội

- Tiến hành nhuộm

+ Phủ dung dịch Crystal Violet trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch , để khô lame

+ Phủ dung dịch Lugol trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch , để khô lame

NHUỘM GRAM

Cầu khuẩn Gram (+) Trực khuẩn Gram (-)

Sinh hóa 6 ống (Định danh) Trực khuẩn Mủ xanh(Pseudomonas aeruginosa)

Sinh hóa 6 ống (Kiểm tra)

+ Phủ dung dịch cồn trong vong 30s

+ Rửa sạch , để khô lame

+ Phủ dung dịch Safranin trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch , để khô lame

- Quan sát dưới vật kính 100X

d) Kết quả:

Trực khuẩn Gram (-), bắt màu đỏ hồng

II THỬ NGHIỆM OXIDASE

a) Công dụng :

Phân biệt khúm trực khuẩn mủ xanh với các khúm trực khuẩn Gram âm Họ đường ruột và nhóm trực khuẩn Gram ( - ) không lên men đường khác

b) Nguyên tắc :

Vài giống VK sản xuất men Oxidase oxid hoá thuốc thử Tetramethyl paraphenylene diamin dihydrocloride (1%) tạo thành những chất đổi màu từ hồng đến tím than

c) Thuốc thử:

- Tetramethyl-p-Phenylenediamine dihydrochloride 0,1 g

( hay Dimethy-p-Phenylenediamine monohydrochloride )

- Nước cất (ED) 10 ml

Cân 0,1 g thuốc thử và pha loãng với 10 ml ED, lắc đều cho tan Để yên 15 phút trước khi dùng Thuốc này không bền rất dễ hỏng và chỉ có thể dùng trong 2 ngày

d) Kỹ thuật:

* Phương pháp 1:

Dimethyl-p-Phenylenediamine dihydrochclride + α.naphthol Oxidase Indophenolblue + H2O

Cytochrome

- Đặt một mãnh giấy lọc vào hộp petri Nhỏ một giọt thuốc thử lên giấy lọc, dùng khuyên cấy chạm vào khúm vi khuẩn nghi ngờ, phết vi khuẩn vào chổ đã nhỏ thuốc thử Cũng thực hiện như vậy với gốc kiểm chứng dương

Đọc kết quả:

+ Dương tính: phết VK chuyển từ màu hồng sang màu tím thang trong vòng 10 giây đến 1 phút

+ Âm tính: Phết vi khuẩn không đổi màu

+ Pseudomonas aeruginosa cho phảm ứng Oxidase (+)

* Phương pháp 2:

- Đặt một đĩa giấy có tẩm thuốc thử oxidase trên một mặt phẳng, nhỏ một giọt nước muối sinh

lý lên đĩa giấy

- Dùng khuyên cấy, phết vi khuẩn nghi ngờ lên đĩa giấy tẩm thuốc thử Oxidase (Tetramethyl-p-Phenylenediamine dihydrochloride)

Đọc kết quả:

+ Nếu TN (+) phết vi khuẩn sẽ đổi sang màu tím than, trong khoảng từ 10 giây đến 1 phút + Cũng làm như vậy với góc kiểm chứng dương

* Ghi chú: cũng có thể nhỏ một giọt thuốc thử Oxidase trực tiếp lên trên khúm vi khuẩn nghi ngờ trong hộp petri Đọc KQ phản ứng bằng cách quan sát sự đổi màu của khúm

Phản ứng dương tính: khi khúm vi khuẩn đổi thành màu hồng nhạt đến đậm và sau cùng màu đen trong vài phút (khi khúm khuẩn đồi màu đen: vi khuẩn đã chết)

e) Kết quả:

Oxidase (+) => Trực khuẩn Mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)

III SINH HÓA

1 Thử nghiệm K.I.A (kligler iron agar)

a) Môi trường

- KIA là môi trường dùng để khảo sát sự lên men đường Glucose, Glactoso, khả năng sinh khi

có CO, H2, H2S Môi trường đặc, được pha chế dưới dạng nghiên sâu

- Chỉ thị màu Ph (acid-base) dùng trong môi trường là Phenol Red

b) Kỹ thuật

- Cấy cắm sâu 2/3 ở phần môi trường sâu và cấy vạch zigzag ở phần môi trường nghiêng

c) Giải thích kết quả thử nghiệm

* Chủng vi khuẩn có phản ứng Glucose âm, Lactose âm

- Vi khuẩn không có khả năng lên men cả hai loại đường, chỉ có khả năng biến dưỡng pentone trong môi trường, sản phẩm biến dưỡng chủ yếu có tính kiềm: do đó cả hai phần nghiêng và phần sâu có của môi trường điều bị kiềm hóa, có màu đỏ với chỉ thị phenol red

* Chủng vi khuẩn có phản ứng Glucose dương, Latose âm

- Phần sâu acid bị biến đổi thành màu vàng, phần nghiên bị kiềm hóa: có màu đỏ

- Ban đầu vi khuẩn lên men đường Glucose acid hóa hai phần nghiêng và sâu của môi trường tiếp đó, sản phẩm acid ở phần nghiêng phía trên bị oxy hóa mất đi; thêm nửa vì phần nghiêng vi khuẩn mọc nhanh và nhiều, lượng glucose ở phần nghiêng bị cạn kiệt hết trước phần sâu, VK phần nghiêng chuyển sang biến dưỡng pentone, tạo ra NH3 làm môi trường ở phần này bị kiềm hóa trở lại Cuối cùng phần sâu: vàng, phần nghiêng: đỏ

* Chủng vi khuẩn có phản ứng glucose dương, lactose dương

- Cả hai phần nghiêng và phần sâu đều bị acid hóa đổi thành màu vàng

- Vi khuẩn lên men cả hai loại đường, môi trường trở nên rất acid, các chất có tính kiềm được phóng thích từ sự biến dưỡng pentone ở phần nghiêng không thể trung hòa được hết tất cả chuyển hóa có tính acid cả hai loại đường Do đó, cả hai phần nghiêng và phần sâu đều mang tính acid và

có màu vàng

* Chủng vi khuẩn sinh khí CO, H2

- Trong ống nghiệm chứa môi trường, có xuất hiện các bong bóng khí ở phần sâu, là do VK trong quá trình chuyển hóa đường đã sinh ra khí CO và 𝐻2, khi khí có nhiều sẽ làm nứt vỡ dịch chuyển thạch, nếu có ít, cho dù chỉ có một bọt nhỏ vẫn đọc kết quả là: khí dương

* Chủng vi khuẩn sinh H2S

- VK có khả năng thủy phân Sodium thiosulfate sẻ tạo ra khí hydrogen sulfide H2S có phản ứng với sắt đã được pentone hóa trong môi trường, tạo ra sulfure sắt (FeS) kết tủa có màu đen

- Tùy theo loại vi khuẩn có khả năng sinh H2S nhiều hay ít màu đen có khi chỉ một vệt đen, một vòng nhẫn đen ở giữa hai phần nghiêng và sâu hay làm đen hết cả ống nghiệm

d) Kết luận

=> Glucose (-) , Lactose (-) , Gas (+) , H2S (-)

2 Thử nghiệm khảo sát tính di động (Motility) và H 2 S (SIM)

a) Nguyên tắc

- Thạch mềm là điều kiện thuận tiện để những vi khuẩn có khả năng di động mọc lan ra khỏi đường cấy như hình rể cây hay làm môi trường quanh đường cấy

- Hỗn hợp ion protein (peptonized iron) và sodium thiosulphate trong môi trường là các chất chỉ thị cho sự sản xuất H2S H2S được sinh ra sẽ phản ứng với hỗn hợp protein đã ion hoá để hình thành sắt sulfide có kết tủa màu đen Những vi sinh vật có khả năng di động sẽ giúp tăng cường phản ứng của H2S

b) Môi trường

- Môi trường SIM Medium: là môi trường thạch mềm

c) Kỹ thuật

- Dùng kim cấy lấy khúm vi khuẩn, đâm thẳng và sâu vào giữa đường thạch một đường duy

Lactose (-)

Gas (+) Glucose (-)

H2S (-)

37 0 C, 24h

nhất, dài bằng 2/3 chiều cao của thạch, không chạm đáy

- Ủ 37oC trong 18 – 24 giờ

d) Kết quả

- Di động: quan sát cách mọc của vi khuẩn theo đường cấy và môi trường quanh đường cấy: nếu

VK mọc lan làm đục môi trường hay mọc giống chùm rể cây là: Di động dương (+) Nếu đường cấy hiện lên rỏ nét và môi trường xung quanh đường cấy trong: Di động âm (-)

- Có kết tủa đen tại môi trường thạch: H2S (+) và ngược lại

e) Kết luận

=> Motility (+) , H 2 S (-)

3 Thử nghiệm Citrate

a) Nguyên tắc

- Một số VK có khả năng sử dụng citrate trong môi trường nuôi cấy như là một nguồn cung

Blue, môi trường sẽ chuyên màu từ xanh lá sang xanh dương đậm

b) Môi trường

- Môi trường thạch Simmons Citrate được pha chế theo dạng nghiêng với chỉ thị màu Bromthymol Blue (khoảng đổi màu pH từ 6,9: xanh lá; sang pH 7,6: xanh dương)

37 0 C, 24h

c) Kỹ thuật

- Cấy zigzag VK cần thử nghiệm lên bề mặt thạch nghiêng

- Nới lỏng nắp ống nghiệm trước khi ủ 37ºC trong 18-24 giờ để lửa cấy được thông khí bình thường

d) Kết quả:

- Thử nghiệm dương: vi khuẩn mọc trên mặt thạch nghiêng với sự đổi màu thành màu xanh dương

- Thử nghiệm âm: vi khuẩn không mọc trên thạch, môi trường vẫn xanh lá không đổi

e) Kết luận

=> Citrate (+)

4 Thử nghiệm tìm Indol ( DEV Tryptone)

a) Nguyên tắc

- Một số vi khuẩn có khả năng sản xuất ra enzyme Tryptophanase thủy phân Trytophan trong môi trường, thành Indol, chất này kết hợp với Para dimethyl-amino benzal dehyde trong thuốc thử Kovac cho ra một hợp chất lỏng muối dimethyl ammonium màu đỏ nằm trên bề mặt ống thạch sâu

37 0 C, 24h

Trytophanase

b) Thuốc thử

- Thuốc thử Kovac (Kovac’s Reagent)

+ Para dimethylamino benzaldehyde 5 gram

+ Amyl alcohol hay butyl alcohol 75 ml

+ HCL đậm đặc 25 ml

- Thuốc thử được bảo quản trong chai nâu và luôn đậy nắp kín, khi thuốc thử bị đổi sang màu nâu sẫm thì đổ bỏ

c) Kĩ thuật

- Lấy khúm khuẩn tinh khiết riêng lẻ từ lứa cây trên hộp thạch hay lấy vi khuẩn mọc trên mặt nghiêng của môi trường K.I.A bằng que cấy

- Cấy lên thành ống gần mặt chất lỏng indol, nghiêng ống để vi khuẩn trên thành ống hòa vào dung dịch

- Ủ 37oC trong 18 – 24 giờ

- Nhỏ 3-5 giọt thuốc thử Kovac, hơi nghiên ống nghiệm để trộn nhẹ và quan sát

d) Kết quả

Nếu lớp thuốc thử có màu hồng cánh sen: Indol dương (+), nếu vẫn màu vàng: Indol âm (-)

d) Kết luận

=> Indol (-)

37 0 C, 24h

5 Thử nghiệm tìm urease

a) Nguyên tắc

- Một số vi khuẩn sản xuất enzyme ureas trong môi trường thành CO2 và NH3 môi trường sẽ

bị kiềm hóa và chuyển sang màu hồng cánh sen

- Môi trường Urea lỏng: chỉ thị màu Ph dùng là Phenol Red, giống như trong urea đặc

b) Kỹ thuật

- Lấy khúm khuẩn tinh khiết riêng lẻ từ lứa cây trên hộp thạch hay lấy vi khuẩn mọc trên mặt nghiêng của môi trường K.I.A bằng que cấy

- Cấy lên thành ống gần mặt chất lỏng ure, nghiêng ống để vi khuẩn trên thành ống hòa vào dung dịch

- Ủ 37oC trong 18 – 24 giờ

c) Kết quả

- Thử nghiệm urea dương: môi trường chuyển sang màu hồng cánh sen

- Thử nghiệm urea âm: môi trường không đổi màu

d) Biện luận

- Với urea lỏng

+ Proteus cho phản ứng dương sau 24 giờ

+ Đối với một số loại vi khuẩn khác, dạng môi trường lỏng do ít nhạy nên khó tìm thấy phản ứng dương

e) Kết luận

=> Dung dịch không đổi màu  Ure (-)

CO2 + H2O + NH3

(NH2)2CO + 2 H2O

Urease

37 0 C, 24h

6 Thử nghiệm MR – VP (Methyl Red – Voges Proskauer)

a) Nguyên tắc:

- Thử nghiệm MR dùng để phân biệt các loại vi khuẩn theo hai phương thức biến dưỡng đường glucose (lứa cấy già ít nhất là 48 giờ):

+ Loại 1: lên men mạnh đường glucose thành các sản phẩm acid cuối cùng rất bền và cho phản ứng MR (+)

+ Loại 2: lên men glucose thành các sản phẩm trung gian không bền Các sản phẩm này tiếp tục biến đổi thành các sản phẩm trung tính cuối cùng và cho phản ứng MR (-)

- Thử nghiệnm VP: một số vi khuẩn biến dưỡng đường glucose thành một sản phẩm trung tính là acetyl methyl carbinol hay acetoin Chất này bị oxyt hóa trong môi trường kiềm, biến đổi thành diacetyl, xong kết hợp với α - naphthol để cho màu hồng nâu đỏ (màu đỏ rượu vang) Phản ứng sẽ chuyển màu nhanh hơn nếu được gia nhiệt

Glucose → Axit pyruvic → Acetoin Diacetyl → Phức hợp màu đỏ: VP (+)

b) Thuốc thử

* Thuốc thử của thử nghiệm MR:

- Dung dịch Methyl red 0,02%

+ Hòa tan 0,1 g Methyl red trong 300 ml Ethanol 95%

+ Thêm khoảng 200 ml nước cất cho đủ (qsp.) 500 ml giá gần sang 1

+ Lưu trữ ở 4 - 8°C trong chai nâu (DD bền trong 1 năm)

- Methyl red là chỉ thị màu pH Ở pH < 4,4 MR có màu đỏ; và ở pH:6 MR có màu vàng

* Thuốc thử của thử nghiệm VP:

- Dung dịch a-Naphthol 5%, trong cồn tuyệt đối Ethanol

- Dung dịch KOH 40%, trong nước khử khoáng

c) Kỹ thuật

- Cấy VK vào ống nghiệm có chứa 5 ml môi trường MR-VP

- Ủ 37°C/24 - 48 giờ

- Chuyển bớt 1 nửa lứa cấy ra 1 ống sạch khác, thành hai ống 1 ống dùng cho TN MR, và 1 ống dùng cho thử nghiệm VP

+ Ống MR: thêm 5 giọt thuốc thử Methyl Red, đọc kết quả

+ Ống VP thêm:

▪ 0,6 ml ( 12 giọt) α - naphthol 5% ứng với 2 ml môi trường đã cấy.

▪ 0,2 ml ( 4 giọt) dd KOH 40%, thêm vào 2 ml môi trường đã nhỏ a-naphtol trường + Đọc kết quả

d) Kết quả

- Thử nghiệm MR, VP dương: môi trường có màu đỏ cam (cherry red)

- Thử nghiệm MR, VP âm: môi trường có màu vàng

e) Kết luận

=> MR (+), VP (-)

C TỔNG KẾT

Thử nghiệm Oxidase Di

động Glucose Lactose Indol Citrate Ure … Pseudomonas

37 0 C, 24h

MR (+)

VP (-)

Trực khuẩn mủ xanh có thể gây ra các bệnh: nhiễm khuẩn tai, mắt, vết thương, vết phỏng, đường tiểu và đường hô hấp Chúng cũng gây ra chứng nhiễm khuẩn huyết và viêm màng não

Có thể gặp Pseudomonas aeruginosa ở đường tiêu hóa của người nhưng khả năng gây bệnh tại đây rất thấp

Trực khuẩn mủ xanh gây viêm có mủ và mủ có màu xanh lục do vi khuẩn tiết ra sắc tố Pyocyanin Từ nơi nhiễm khuẩn đầu tiên, trực khuẩn có thể lan tràn vào các mô sâu, phóng thích nội độc tố gây kích xúc và làm hư hoại các cơ quan nội tạng

Pseudomonas aeruginosa là một trong các tác nhân chính gây nhiễm khuẩn bệnh viện Vi khuẩn này có thể được tìm thấy trong các túi máu, huyết tương nhiễm khuẩn của ngân hàng máu

và trong cả các dung dịch sát trùng như Zephiran (Benzal konium chloride) hay các loại xà phòng như Phisohex (có Hexachlorophene)

- Đặc tính hình thể: trực khuẩn gram âm, di động (có 1 tiên mao ở 1 đầu), không bào tử, đứng một mình hay thành đôi hay thành chuỗi ngắn Hình thể thay đổi trong lứa cấy già

- Đặc tính lứa cấy: hiếu khi bắt buộc, dễ nuôi cấy và tăng trưởng tốt trên các môi trường thông thường

- Tạo được các sắc tố: pyocyanin, pyoverdin, pyorubin và pyomelanin Chỉ có duy nhất p

Aeruginosa tiết ra pyocyanin và sắc tố này hòa tan được trong nước, làm môi trường có màu xanh

lục Lứa cấy tỏa mùi thơm nhẹ

- Trên các môi trường:

+ BA: khúm vi khuẩn lớn, phẳng hay hơi lồi, biên không đều, gây tiêu huyết hoàn toàn + MC: không lên men đường lactose, khúm vi khuẩn không màu

+ Trong canh cấy lỏng: vi khuẩn hiếu khí mọc thành váng nổi trên bề mặt môi trường

- Khảo sát đặc tính lứa cấy pseudomonas aeruginosa: có sinh sắc tố, gây tiêu huyết và có

mùi thơm nhẹ trên ba, mc ủ 37oc sau 18-24 giờ

ĐỊNH DANH NHÓM CẦU KHUẨN GRAM (+)

STAPHYLOCOCCI

A ĐẠI CƯƠNG

Có thể nói tụ cầu khuẩn là một trong những vi khuẩn nổi tiếng nhất: được các nhà vi khuẩn học nổi tiếng quan tâm nghiên cứu, tỉ lệ gây bệnh rất cao, có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như đề

Pasteur (1880) đều rất quan tâm nghiên cứu tụ cầu khuẩn ngay từ thời kỳ đầu của lịch sử ngành vi sinh vật học

Có thể tìm thấy tụ cầu trên da, niêm mạc mũi và hầu, họng của người khỏe mạnh Tính gây bệnh của tụ cầu khuẩn thường được xem xét liên kết với khả năng làm đông huyết tương bởi men coagulase của vi khuẩn trong phòng thí nghiệm và vi khuẩn thường được phân chia thành 2 nhóm: Coagulase (+) và Coagulase (-) Loài gây bệnh chủ yếu là Coagulase (+), các loài trong nhóm Coagulase (-) thường sống hoại sinh và không gây hại, nhưng trong một số trường hợp chúng cũng là vi khuẩn gây bệnh

Có ít nhất 30 loài cầu khuẩn đã được nhận diện và hiện nay có 4 loài tụ cầu khuẩn có vai trò quan trọng trong y học gồm:

+ Staphylococcus aureus – Tụ cầu vàng (Coagulase dương)

+ Staphylococcus saprophyticus (Coagulase âm)

+ Staphylococcus haemolyticus (Coagulase âm)

B ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

1 Nuôi cấy:

- Là vi khuẩn hiếu khí, kị khí tùy nghi, tăng trưởng mạnh trên các loại môi trường thông thường

- Sau 18 – 24h ủ 37oC, khuẩn lạc dạng tròn, biên đều, tâm lồi, d= 2-4 mm, màu từ trắng đục đến vàng chanh, vàng kim

- Tạo sắc tố tốt ở 20oC.

- Trong môi trường canh thang: ở nhiệt độ 37oC sau 5-6 giờ làm đục môi trường, sau 24h làm đục

rõ

- Ở môi trường thạch thường: sau 24h vi khuẩn phát triển tạo khuẩn lạc dạng S, tròn lồi, bóng láng

và sinh sắc tố màu vàng