BÁO CÁO VI SINH 2 ĐỊNH DANH LIÊN CẦU GR (), CẦU KHUẨN GR (+) VÀ TRỰC KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT (CHUYÊN NGÀNH XÉT NGHIỆM)

báo cáo trình bài về hình thành, tính chất, đặc điểm, các phản ứng phân biệt giữa các loại tụ cầu , liên cầu và trực khuẩn. Cũng như các hình ảnh minh họa thực tiễn cho từng phản ứng. Hơn thế, bài báo cáo còn có các sơ đồ tóm tắt quy trình định danh chung và riêng cho từng loài, bảng tóm tắt từng phản ứng phân biệt.

ĐỊNH DANH NHÓM CẦU KHUẨN GRAM (+)

STAPHYLOCOCCI

I ĐẠI CƯƠNG

Có thể nói tụ cầu khuẩn là một trong những vi khuẩn nổi tiếng nhất: được các nhà vi khuẩn học nổi tiếng quan tâm nghiên cứu, tỉ lệ gây bệnh rất cao, có khả năng gây nhiều bệnh nặng cũng như

đề kháng kháng sinh rất mạnh Các nhà vi khuẩn học lừng danh như Robert Koch (1878) và Louis

vi sinh vật học

Có thể tìm thấy tụ cầu trên da, niêm mạc mũi và hầu, họng của người khỏe mạnh Tính gây bệnh của tụ cầu khuẩn thường được xem xét liên kết với khả năng làm đông huyết tương bởi men coagulase của vi khuẩn trong phòng thí nghiệm và vi khuẩn thường được phân chia thành 2 nhóm: Coagulase (+) và Coagulase (-) Loài gây bệnh chủ yếu là Coagulase (+), các loài trong nhóm Coagulase (-) thường sống hoại sinh và không gây hại, nhưng trong một số trường hợp chúng cũng

+ Khi nhiễm vào thức ăn, tiết ra độc tố đường ruột (enterotoxin) bền với nhiệt Người

ăn trúng thức ăn có nhiễm độc tố gây ngộ độc thực phẩm nôn mửa, tiêu chảy dữ dội sau vài giờ

- Tụ cầu vàng kháng methincillin (MRSA) là một chủng cầu khuẩn có khả năng đề kháng lại hầu hết các thuốc kháng sinh thông dụng, dẫn đến việc làm tăng nguy cơ tử vong cho người bệnh MRSA là một vấn đề của y tế toàn cầu và là một thách thức lớn trong điều trị

- Kết quả KSD của MRSA trong PTN có thể là nhạy, nhưng trên thực tế MRSA có khả năng

đề kháng đối với tất cả các kháng sinh β-lactam dùng trong điều trị, ngoại trừ cephalosporin thế

hệ 5 (ceftaroline)

- Các trường hợp MRSA xâm nhập sâu vào cơ thể gây nên các bệnh như nhiễm khuẩn xương, khớp, nhiễm khuẩn máu, van tim và phổi Nếu không được điều trị kịp thời, có thể gây nguy hiểm đến tính mạng cho bệnh nhân vì đặc tính kháng đa kháng sinh của chúng

2 Staphylococcus epidermidis – Tụ cầu da ( Coagulase âm)

- Là một trong các tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện (bệnh nhân đặt các loại ống thông (catheter), vi khuẩn có tại bệnh viện sẽ nhiễm theo đường ống để vào sâu bên trong cơ thể trở thành

vi khuẩn gây bệnh

3 Staphylococcus saprophyticus ( Coagulase âm)

- Thường gặp trong nhiễm khuẩn đường tiểu ở phụ nữ trẻ

4 Staphylococcus haemolyticus ( Coagulase âm)

- Là một phần trong hỗn tạp hoại sinh trên da người, là tác nhân gây nhiễm khuẩn bệnh viện quan trọng mới nổi Từ da, vi khuẩn qua các tổn thương hay các ống thông vào sâu trong cơ thể gây viêm nội tâm mạc, van tim tự nhiên hay nhân tạo, nhiễm trùng huyết, viêm phúc mạc, nhiễm trùng đường tiết niệu, xương và khớp S.haemolyticus đa kháng thuốc và có thể hình thành màng sinh học, điều này làm cho bệnh nhân đặc biệt khó điều trị

II ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

1 Nuôi cấy:

- Là vi khuẩn hiếu khí, kị khí tùy nghi, tăng trưởng mạnh trên các loại môi trường thông thường

- Coagulase: làm đông huyết tương, tạo huyết cục trong tĩnh mạch, gây nhiễm khuẩn di căn và nhiễm khuẩn huyết

- Hyaluronidase: phá hủy chất cơ bản của mô giúp vi khuẩn có thể phát tán trong mô

- Desoxyribonuclease: thủy phân AND, gây tổn thương mô

- β-lactamlase: phá hủy vòng β-lactam => kháng penicillin và cephalosporin

- Leucocidin (độc tố diệt bạch cầu): bản chất là protein không chịu nhiệt, làm mất tính di động

và phá hủy nhân bạch cầu

- Hemolysin (dạng huyết tố): bản chất protein, có tính kháng nguyên, gây tan hồng cầu Một vài loại gây hoại tử da tại chổ và giết chết súc vật thí nghiệm

- Ngoại độc tố sinh mủ (pyogenic exotoxin): shock, hoại tử gan và cơ tim

- Exfoliative toxin & Toxic shock syndrome toxin: gây hội chứng phỏng rộp và chốc lở da

- Độc tố ruột (Enterotoxin)

3 Con đường lây truyền

- Lây truyền qua tiếp xúc trực tiếp: da và niêm mạc

4 Khả năng đề kháng

- Hiện nay, việc sử dụng kháng sinh rộng rãi, không đúng cách, không đúng liều đã tạo ra các chủng cầu khuẩn kháng Methicilin, kháng đa kháng sinh (MRS) Các chủng đề kháng kháng sinh thường gặp là MRSA

- Sự kháng lại kháng sinh của tụ cầu vàng là một đặc điểm lưu ý Đa số tụ cầu kháng lại Penicillin

G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase nhờ gen của R-plasmid

- Hiện nay, một số rất ít tụ cầu còn đề kháng được với cephalosporin các thế hệ

- Ngoài ra, tụ cầu vàng còn có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn

- Tụ cầu vàng cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường

III ĐỊNH DANH

1 Bệnh phẩm:

- Có thể là máu, mủ, phân, … tùy theo loại bệnh của tụ cầu

2 Sơ đồ định danh cầu khuẩn:

MÔI TRƯỜNG PHÂN LẬP (BA, CA, NA)

Chọn khúm NHUỘM GRAM

CẦU KHUẨN GRAM (+), Catalase (+)

+ Hình thể: Cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn, cầu trực khuẩn,

+ Tính chất bắt màu: Gram âm (bắt màu đỏ), Gram dương (bắt màu tím)

- Cố định trên lam bằng đèn cồn

- Để nguội

- Tiến hành nhuộm

+ Phủ dung dịch Crystal Violet trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch , để khô lame

+ Phủ dung dịch Lugol trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch , để khô lame

+ Phủ dung dịch cồn trong vong 30s

+ Rửa sạch , để khô lame

+ Phủ dung dịch Safranin trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch , để khô lame

- Quan sát dưới vật kính 100X

* Kết quả:

- Staphylococci có dạng hình cầu, d = 0,8 - 1 µm, đứng thành đám nhỏ, đơn lẻ hoặc chuỗi 3

- Bắt màu Gram (+) xanh tím

- Không vỏ, không lông, không sinh nha bào

- Tụ cầu khuẩn có enzym catalase sẽ làm giải phóng oxy từ nước oxy già tạo hiện tượng sủi bọt

* Kĩ thuật

- Nhỏ 1 giọt oxy già dược dụng 3% lên lam kính sạch

- Lấy vi khuẩn bằng cách chấm khuyên cấy vô khuẩn vào phần trên của khúm khuẩn tinh khiết muốn thử

- Cho khuyên cấy vi khuẩn chạm vào giọt oxy già

- Quan sát sự sủi bọt và kết luận

* Kết quả:

b) Thử nghiệm nuôi cấy trên MSA:

* Mục đích:

- Xác định khả năng tăng trưởng và lên men đường mannitol trên MSA

- Phân biệt S.aureus với những loại tụ cầu khác

* Nguyên tắc

- Các loại tụ cầu khuẩn tăng trưởng trong môi trường MSA chứa 7,5% NaCl Thường đa số gốc gây bệnh Staphylococcus aureus có khả năng lên men được đường manitol nên sẽ tạo một vùng màu vàng (với chỉ thị màu phenol red) bao quanh khóm khuẩn Môi trường làm thí nghiệm MSA

có thể được pha chế ở dạng ống thạch nghiêng hay hộp petri

- Phản ứng (-)  môi trường không đổi màu  Tụ cầu khác

- Ủ 18 – 24h ủ ở 37 oC

* Kết quả:

- Phản ứng (+)  môi trường đổi sang màu vàng  Tụ cầu vàng

c) Thử nghiệm nhạy cảm với Novobiocin

- Pha vi khuẩn cần định danh với nước muối sinh lý

- Dùng tâm bông tẩm dung dịch vi khuẩn đã pha trải đều lên bề mặt môi trường MHA

- Đặt đĩa Novobiocin lên bề mặt môi trường

- Đo đường kính vòng vô khuẩn sau thời gian ủ

* Kết quả:

d < 16 mm => Staphylococcus saprophyticus

ĐỊNH DANH LIÊN CẦU KHUẨN GRAM (+)

STREPTOCOCCI

I KHÁI QUÁT VÀ PHÂN LOẠI

Chuỗi cầu khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi trong thiên nhiên, là thành phần trong hỗn tạp vi khuẩn đường hô hấp, ở đường tiêu hoá của người và động vật Tùy loại và tùy vị trí nhiễm khuẩn, chuỗi cầu khuẩn là tác nhân gây bệnh hay vi khuẩn thường trú, hoại sinh

Năm 1919, Brown đã xếp loại liên cầu theo những hình thái tan máu khác nhau khi chúng phát triển trên môi trường thạch máu:

a) Tan máu α (Liên cầu nhóm Viridans)

Gây nhiễm khuẩn đường hô hấp, là căn nguyên chính gây viêm màng trong tim chậm trên những người có van tim không bình thường

b) Tan máu β (Liên cầu nhóm A)

Là nhóm liên cầu gây bệnh quan trọng nhất ở người, tùy từng typ huyết thanh mà gây những bệnh cảnh khác nhau:

+ Nhiễm khuẩn tại chỗ: viêm họng, eczema, chốc lở, viêm quầng ở người lớn, nhiễm khuẩn các vết thương, viêm tai giữa, viêm hạch, viêm phổi, nhiễm trùng tử cung sau sinh, …

+ Các nhiễm khuẩn thứ phát: từ những ổ nhiễm khuẩn tại chỗ, bệnh nhân có thể bị nhiễm khuẩn huyết, viêm màng trong tim cấp

+ Bệnh tinh hồng nhiệt: thường gặp ở trẻ trên 2 tuổi và ở các nước ôn đới

+ Các bệnh khác như: viêm cầu thận sau nhiễm liên cầu nhóm A, bệnh thấp tim ,…

c) Tan máu γ ( Liên cầu nhóm D):

Gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm màng tim (hiếm)

* Bệnh do các liên cầu nhóm khác gây ra như:

+ Enterococci gây bệnh nhiễm trùng tiểu, viêm nội tâm mạc bán cấp, …

+ Liên cầu kị khí gây: tổn thương mủ phối hợp vi khuẩn kị khí khác

II ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

trắng hoặc xám, nhám hoặc lồi

- Trên thạch máu cừu: tùy loại chuỗi cầu khuẩn sẽ cho 1 trong 3 kiểu tiêu huyết:

+ Tiêu huyết α: tiêu huyết không hoàn toàn, vùng tiêu huyết nhỏ có màu xanh lục

+ Tiêu huyết β: tiêu huyết hoàn toàn, vùng tiêu huyết rộng và trong

+ Tiêu huyết γ: không tiêu huyết, vùng thạch xung quanh khúm khuẩn vẫn màu đỏ bình thường của máu

2 Các độc tố và enzym:

- Dung huyết tố (hemolysin):

+ Streptolysin O: tính kháng nguyên mạnh => Xét nghiệm ASO: chuẩn đoán viêm thấp khớp

+ Streptolysin S: tính kháng nguyên yếu

- Men streptokinase (fibrinolysin): tan tơ huyết

- Streptodornase (desoxyribonuclease): lỏng mủ đặc

- Hyaluronidase: làm tan acid hyaluronic, giúp vi khuẩn lan ra dễ dàng

- Diphospho pyridine nucleotidase (DPNase): giết chết Bạch cầu

- Proteinase: phân hủy protein

III CHUẨN ĐOÁN VI SINH VẬT

1 Bệnh phẩm:

Có thể là máu, mủ, đờm giải, nước tiểu, nước não tủy, …

2 Sơ đồ định danh dòng liên cầu:

- Hình thể: Cầu khuẩn, trực khuẩn, xoắn khuẩn, cầu trực khuẩn,

- Tính chất bắt màu: Gram âm (bắt màu đỏ), Gram dương (bắt màu tím)

- Tiến hành nhuộm

+ Phủ dung dịch Crystal Violet trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch , để khô lame

+ Phủ dung dịch Lugol trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch , để khô lame

+ Phủ dung dịch cồn trong vong 30s

+ Rửa sạch , để khô lame

+ Phủ dung dịch Safranin trong vòng 1 phút

+ Rửa sạch , để khô lame

- Đọc kết quả dưới vật kính 100X

* Kết quả:

- Streptococci là những vi khuẩn hình cầu, xếp thành chuỗi dài ngắn khác nhau (đan xen thành chùm, thành đôi, thành ba, …)

- Gram (+) bắt màu xanh tím, kích thước 0,6 – 0,8 µm

- Không di động, không bào tử, vài loài có vỏ bằng hyaluronic acid

Gram (+) xếp thành chuỗi  nếu bệnh phẩm là dịch não tủy, phải báo ngay cho lâm sàng (có thể gây viêm màng não tử vong).

b) Catalase:

* Mục đích:

- Dùng phân biệt giữa tụ cầu, liên cầu và phế cầu

* Nguyên tắc:

- Liên cầu khuẩn không có enzym catalase  không thể làm phóng thích oxy từ oxy già  không có hiện tượng sủi bọt

* Kĩ thuật:

- Nhỏ 1 giọt oxy già dược dụng 3% lên lam kính sạch

- Lấy vi khuẩn bằng cách chấm khuyên cấy vô khuẩn vào phần trên của khúm khuẩn tinh khiết muốn thử

- Cho khuyên cây vi khuẩn chạm vào giọt oxy già

- Quan sát sự sủi bọt và kết luận

* Kết quả

Catalase (-)  Liên cầu (Staphylococcus)

c) Bacitracin test và Optochin test (Trắc nghiệm Taxo A và Taxo P):

* Nguyên tắc Taxo P:

- Phế cầu khuẩn nhạy cảm với Optochin (ethyl hydrocuprein hydrochloride) tạo vùng không có

vi khuẩn mọc quanh đĩa giấy tẩm thuốc

- Taxo P (+) khi vòng vô khuẩn quanh đĩa giấy có d ≥ 14 mm và ngược lại

* Kỹ thuật:

- Dùng que cấy lấy một lượng vi khuẩn từ mẫu muốn định danh, trải đều lên bề mặt môi trường

thạch BA theo hình ziczac với nhiều hướng

- Đặt 2 đĩa kháng sinh Taxo A và Taxo P lên bề mặt thạch ở 2 phía đối diện nhau

- Vạch 1 đường dài chủng Staphylococci aureus theo đường kính, giữa mặt thạch

- Lấy chủng vi khuẩn tiêu huyết β cần định danh, vạch 1 đường vuông góc với đường cấy chủng Staphylococci aureus cách nhau 1 cm

Kết quả:

- Không có vùng hợp đồng tiêu huyết hình mũi tên => Không phải liên cầu tiêu huyết β nhóm B

e) Thử nnghiệm Bile Esculin:

* Mục đích:

Dùng để định danh Streptococci nhóm D gồm: Enterococci và Non – Enterococci

* Nguyên tắc:

- Streptococci nhóm D có khả năng thủy phân eesculin

- Esculetine kết hợp với muối sắt có trong môi trường thành hợp chất có màu đen

- Thành phần muối mật (bile) trong môi trường có tác dụng ức chế các vi khuẩn khác

- Môi trường sẽ chuyển sang màu đen => bile esculin (+)

- Môi trường không đổi màu => bile esculin (-)

* Kỹ thuật:

- Cấy vi khuẩn lên mặt ống thạch nghiêng bile esculin

* Kết quả:

- Chuỗi cầu nhóm D cho thử nghiệm Bile esculin (+): môi trường chuyển sang màu đen

f) Thử nghiệm tăng trưởng trong canh cấy có 6,5% NaCl:

* Mục đích:

- Dùng để định danh phân biệt Enterococci và Non – Enterococci trong chuỗi cầu khuẩn nhóm

D

* Nguyên tắc:

- Enterococci tăng trưởng và làm đục môi trường lỏng có 6,5% NaCl

- Non – Enterococci không chịu được nồng độ muối 6,5% NaCl nên không mọc, canh cấy trong

- Các Streptococci khác (A, B, C … K, H, N) cũng không mọc trong NaCl 6,5%

* Kỹ thuật:

- Dùng que cấy lấy một lượng vi khuẩn cần định danh

- Khuấy que cấy vào trong ống đựng NaCl 6,5%

* Kết quả:

- Thử nghiệm NaCl 6,5% (+)  làm đục dung dịch NaCl 6,5% => Enterococci

2 Kết luận:

Tiêu huyết TAXO P TAXO A CAMP BE

CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA ĐỊNH

DANH NHÓM TRỰC KHUẨN GRAM (-)

I ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN GRAM (-)

Vi khuẩn gram âm là nhóm vi khuẩn có màu đỏ hoặc hồng, do thành của vi khuẩn gram âm có

độ thấm cao hơn vi khuẩn gram dương nên chất cồn dễ thấm vào tẩy màu sau khi phân hủy lớp màng ngoài, quan sát dưới kính hiển vi sẽ thấy có màu đỏ hoặc hồng

Cấu tạo của vi khuẩn gram âm: khá giống với vi khuẩn gram dương, bao gồm các thành phần acid amin, lipid Khác biệt của 2 nhóm đó chính là tỷ lệ lipid ở vi khuẩn gram âm cao hơn nhiều so với gram dương và không có acid teichoic Ngoài tác dụng giữ hình thể ổn đinh và bảo vệ vi khuẩn, thành tế bào còn có chức năng mang những kháng nguyên của vi khuẩn

II CÁC LOẠI VI KHUẨN THƯỜNG GẶP

1 Escherichia coli (E coli, trực khuẩn đại tràng):

Là vi khuẩn sống cộng sinh, chiếm 80% vi khuẩn ở ruột Vi khuẩn tổng hợp ra một số vitamin

B, K, E và giữ cân bằng quần thể vi khuẩn đường ruột

a) Đặc điểm sinh học

- Hình thể: Trực khuẩn Gram âm, kích thước 1 - 4 x 0,4 - 0,7 mm Có lông quanh thân, không bào tử, một số ít có vỏ

- Nuôi cấy:

+ Trên môi trường lỏng làm đục môi trường tạo thành váng mỏng hoặc vòng trắng quanh ống nghiệm Môi trường đặc khuẩn lạc dạng S, màu trắng, những ngày sau khuẩn lạc chuyển sang màu xám xanh, mọc lan rộng ra xung quanh Có thể gặp khuẩn lạc R hoặc

M

thường

- Kháng nguyên : có 3 loại

+ Kháng nguyên O : phức tạp (khoảng 150 yếu tố)

+ Kháng nguyên H : có 40 typ, không chịu nhiệt, cồn, men tiêu protein

+ Kháng nguyên K : có kháng nguyên L,B là không chịu nhiệt, A,M là kháng nguyên

chịu nhiệt ( khoảng 100 kháng nguyên K khác nhau)

+ Gây bệnh cơ hội khi sức đề kháng của cơ thể giảm sút

+ Gây viêm dạ dày ruột, thường gặp ở trẻ nhỏ

+ Gây nhiễm khuẩn mủ vết thương, vết bỏng

+ Gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu, là căn nguyên chủ yếu nhất trong các căn nguyên

vi khuẩn, đặc biệt hay gặp trong các trường hợp thai nghén, sỏi tiết niệu hay thủ thuật thông niệu đạo, niệu quản ngược dòng

+ Viêm phế quản, phổi, đường mật, đường viêm não màng não, viêm xoang…

+ Chưa gây được bệnh thực nghiệm

+ Có khả năng sinh độc tố ruột (enterotoxin), làm tan máu (hemolysin)

+ Có thể gây nhiễm khuẩn huyết ở trẻ sơ sinh do khả năng diệt khuẩn của hệ miễn dịch của trẻ sinh non, dinh dưỡng kém là rất yếu ớt, gây viêm màng não ở trẻ em

- Hình thể: Trực khuẩn ngắn, 1 - 3mm, hai đầu tròn, không vỏ, không lông, không sinh bào

tử, bắt màu Gram âm

Nuôi cấy: Dễ nuôi trên môi trường nuôi cấy thông thường, ưa khí tuỳ ngộ Trên môi trường lỏng làm đục đều, môi trường đặc sau 24h có khuẩn lạc dạng S, có thể chuyển thành R

- Đề kháng: