Sử dụng chế phẩm sinh học cải tiến chất lượng rượu vang chuối xiêm

Sử dụng chế phẩm sinh học cải tiến chất lượng rượu vang chuối xiêm

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

TRẦN THỊ HỒNG HẠNH

SỬ DỤNG CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI TIẾN

CHẤT LƯỢNG RƯỢU VANG

Em xin chân thành cảm ơn thầy Lý Nguyễn Bình đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quí báo để giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Cảm ơn các bạn sinh viên lớp Công nghệ Thực phẩm Khoá 28 đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

TÓM LƯỢC v

DANH SÁCH HÌNH iii

DANH SÁCH BẢNG iv

CHƯƠNG I 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 GIỚI THIỆU 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1

CHƯƠNG II 2

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG CHUỐI XIÊM 2

2.1.1 Chuối xiêm 2

2.1.2 Nấm men 7

2.1.3 Enzyme 9

2.1.4 Nước 22

2.1.5 Acid citric 23

2.2 Động lực của quá trình lên men 23

2.2.1 Cơ chế của quá trình lên men 23

2.2.2 Động học của quá trình lên men 24

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 24

2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 24

2.3.2 Ảnh hưởng của pH 25

2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ rượu 25

2.3.4 Ảnh hưởng của chất lượng và số lượng nấm men sử dụng 25

2.4 Qui trình sản xuất rượu vang chuối 26

2.5 Các dạng hư hỏng trong sản xuất rượu vang chuối 27

2.5.1 Lên men lactic 27

2.5.2 Lên men butyric 27

2.5.3 Lên men dại 27

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 28

3.1 Phương tiện 28

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 28

3.1.2 Thời gian thực hiện 28

3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 28

3.2 Phương pháp thí nghiệm 29

3.2.1 Phân tích thành phần nguyên liệu 29

3.2.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát động học vô hoạt enzyme glucoamylase 30

3.2.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme amylase và pectinase đến hiệu suất thu hồi và chất lượng (độ trong, độ rượu, tạp chất,…) rượu thành phẩm 31

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

4.1 Phân tích thành phần nguyên liệu 34

4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát động học vô hoạt enzyme glucoamylase 34

4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme glucoamylase và polygalacturonase đến hiệu suất thu hồi và chất lượng (độ trong, độ rượu, tạp chất,…) rượu thành phẩm 36

CHƯƠNG V KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Cơ chế tác dụng của enzyme α-amylase lên tinh bột 10

Hình 2: Cơ chế tác dụng của enzyme amylase 12

Hình 3: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng 13

Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến tốc độ phản ứng 14

Hình 5: Hình vẽ minh hoạ động học phản ứng vô hoạt enzyme bậc 1 ở các nhiệt độ khác nhau 17

Hình 6: Hình vẽ minh hoạ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hằng số tốc độ 17

Hình 7: Cơ chế tác dụng của các enyme pectinase lên pectin 18

Hình 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến tốc độ phản ứng 20

Hình 9: Máy đo pH 28

Hình 10: Máy đo màu quang phổ hấp thụ 26

Hình 11: Bếp điện và thiết bi chưng cất Error! Bookmark not defined. Hình 12: Cồn kế, nhiệt kế 26

Hình 13: Bể điều nhiệt 28

Hình 14: Cân điện tử Error! Bookmark not defined Hình 15: Nấm men 29

Hình 16: Bố trí thí nghiệm động học vô hoạt enzyme glucoamylase 31

Hình 17: Động học vô hoạt nhiệt của chế phẩm glucoamylase thương mại 35

Hình 19: Sản phẩm rượu vang chuối xiêm Mẫu (ĐC, A, AP1,AP2, AP3) theo thứ tự từ trái sang phải 37

Hình 20: Hàm lượng rượu sinh ra theo thời gian 38

Hình 21: Kết quả khảo sát độ hấp thụ của rượu thành phẩm 40

Hình 22: Mẫu phân tích hàm lượng methanol 40

Hình 23: Kết quả phân tích hàm lượng methanol trong sản phẩm (bước sóng 575nm)41 Hình 24: Kết quả phân tích hàm lượng andehyde trong sản phẩm 42

Hình 25: Kết quả phân tích hàm lượng đường tổng trong sản phẩm 43

Hình 26: Kết quả phân tích hàm lượng acid toàn phần trong sản phẩm 43

DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của chuối (giá trị trung bình trong 100g ăn được) 3

Bảng 2: Sự chuyển hoá tinh bột thành đường trong quá trình chín 5

Bảng 3: Hàm lượng glucid của chuối xanh và chuối chín 5

Bảng 4: Sự biến đổi của chất pectin trong quá trình chín 6

Bảng 5: Sự biến đổi của acid trong quá trình chín 6

Bảng 6: Sự thay đổi của hàm ẩm chuối trong quá trình chín 7

Bảng 7: Hàm lượng muối cho phép trong sản xuất rượu 22

Bảng 8: Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu 34

Bảng 9: Hoạt tính còn lại của chế phẩm enzyme glucoamylase thương mại sau quá trình xử lý ở các nhiệt độ 68oC; nhiệt độ 71oC; nhiệt độ 74oC và nhiệt độ 77oC 35

Bảng 10: Thông số động học vô hoạt enzyme glucoamylase 36

Bảng 11: Hàm lượng rượu sinh ra theo thời gian trong quá trình lên men chính 38

Bảng 12: Kết quả phân tích độ hấp thụ ánh sáng của mẫu rượu thành phẩm đo ở bước sóng λ = 294 nm 39

Bảng 13: Kết quả phân tích hàm lượng methanol 40

Bảng 14: Kết quả phân tích hàm lượng andehyde 41

Bảng 15: Kết quả phân tích hàm lượng đường 42

Bảng 16: Kết quả phân tích hàm lượng acid toàn phần của sản phẩm 43

Bảng 17: Kết quả đánh giá cảm quan màu sắc và độ trong của sản phẩm 44

TÓM LƯỢC

Tên đề tài thực hiện nghiên cứu “Sử dụng chế phẩm sinh học cải tiến chất lượng

r ượu vang chuối xiêm” Tiến hành nghiên cứu thu được với hai thí nghiệm:

- Thí nghiệm 1: Khảo sát động học vô hoạt enzyme glucoamylase

Khảo sát nhiệt độ làm bất hoạt enzyme glucoamylase: 68oC, 71oC,74oC, 77oC, ứng với điều kiện pH 4,5 Thí nghiệm được tiến hành với 2 lần lặp lại

- Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme glucoamylase và polygalacturonase đến hiệu suất thu hồi và chất lượng (độ trong,

độ rượu, tạp chất,…) rượu thành phẩm Thí nghiệm được tiến hành với 2 lần lặp lại Thí nghiệm được tiến hành với 5 mẫu

DC là mẫu không có bổ sung enzyme

A là mẫu chỉ có bổ sung enzyme glucoamylase với tỉ lệ 0,2%

AP1 là mẫu bổ sung enzyme glucoamylase với tỉ lệ 0,2% và enzyme polygalacturonase với tỉ lệ 0,01%

AP2 là mẫu bổ sung enzyme glucoamylase với tỉ lệ 0,2% và enzyme polygalacturonase với tỉ lệ 0,02%

AP3 là mẫu bổ sung enzyme enzyme glucoamylase với tỉ lệ 0,2% và enzyme polygalacturonase với tỉ lệ 0,03%

K ết quả:

- Thí nghiệm 1: Sự vô hoạt đẳng nhiệt enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ

Aspergilus niger được mô tả bằng phương trình động học phản ứng bậc 1.Kết quả cho thấy khi nhiệt độ vô hoạt enzyme tăng thì hằng số tốc độ bị vô hoạt enzyme càng tăng

- Thí nghiệm 2: Mẫu thí nghiệm đạt tốt nhất là AP2 với điều kiện (đường hoá

60oC, pH 4,5, 1giờ; phối chế Brix 22%, pH 4,0; thanh trùng NaHSO3 140mg/1lít,

30 phút; cấy chủng nấm men 0,04%; lên men chính 10 ngày)

CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 GIỚI THIỆU

Nước ta có khí hậu nhiệt đới nên nguồn trái cây phong phú quanh năm với nhiều loại trái cây đặc sản như: cam, bưới, chuối, xoài,…Đó là điều kiện thuận lợi để sản xuất nhiều loại sản phẩm như: mứt đông, nước ép, rượu vang, sữa, bánh kẹo, các sản phẩm sấy khô,…

Ngày nay, các sản phẩm rượu vang từ trái cây cũng ngày càng phong phú về số lượng lẫn chất lượng: rượu vang dâu, rượu vang nho, rượu vang dứa, rượu vang sơri,…

Rượu vang được chế biến từ các loại trái cây do lên men tự nhiên không qua chưng cất Trong sản xuất rượu vang có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng rượu nhưng hiệu suất thu hồi và độ trong là 2 yếu tố quang trọng, vấn đề được đặt ra là phải có biện pháp làm tăng hiệu suất thu hồi và cải thiện độ trong của rượu vang

Do đó nhu cầu củ việc sử dụng chế phẩm sinh học để cải tiến chất lượng rượu vang chuói xiêm là cần thiết

Nhằm đa dạng hoá sản phẩm cũng như nâng cao giá trị kinh tế của nguyên liệu chuối, là nguồn nguyên liệu của đồng bằng sông Cửu Long với sản lượng lớn và dồi dào quanh năm, đây là điều kiện thuận lợi để sản xuất rượu chuối trên qui mô lớn Bên cạnh đó, do nhu cầu thưởng thức của con người ngày càng tăng nên việc chế biến các sản phẩm rượu trái cây ngày càng đa dạng về số lượng lẫn chất lượng Nguồn nguyên liệu chuối chứa nhiều chất dinh dưỡng và nhất là đường glucid (20,5%), protid (1,2%), lipid (0,3%), nước (75%),…rất thuận lợi cho việc sản xuất rượu vang, góp phần nâng cao giá trị kinh tế của chuối, cải thiện thu nhập cho nông dân và góp phần đa dạng hoá sản phẩm

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Sử dụng chế phẩm enzyme sinh học là enzyme amylase và enzyme pectinase để cải tiến chất lượng rượu vang chuối xiêm

Nội dung nghiên cứu bao gồm

- Phân tích thành phần nguyên liệu

- Khảo sát động học vô hoạt enzyme glucoamylase

- Khảo sát ảnh hưởng của việc bổ sung chế phẩm enzyme glucoamylase và polygalacturonase đến hiệu suất thu hồi và chất lượng (độ trong, độ rượu, tạp chất,…) rượu thành phẩm

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG CHUỐI XIÊM

2.1.1 Chu ối xiêm

Đại cương về nguyên liệu chuối

Nguồn gốc

Chuối bắt nguồn từ Đông Nam Á Các giống chuối khác được bắt nguồn từ những vùng khác nhau nằm giữa Ấn Độ và Malaysia Di tích lịch sử của cây chuối sớm nhất từ Ấn Độ (600÷500 năm trước công nguyên) nhưng vụ mùa xuất hiện ở đất nước này hàng ngàn năm trước đó Cây chuối được đưa vào Nam Phi theo đường Madagascar khoảng 500 năm sau công nguyên, và lan tràn qua trung tâm nhiệt đới của lục địa Châu Âu về phía tây bờ biển, chúng đến Địa Trung Hải khoảng năm

650 sau công nguyên và đưa vào Thái Bình Dương bởi những du khách Polynesia, khoảng năm 1000 năm sau công nguyên sự du nhập đầu tiên đến New York được bắt đầu ở đảo Canary, nơi mà trái cây được đưa vào bởi du khách Bồ Đào Nha từ Tây Châu Phi

Ngày nay chuối được trồng khắp vùng nhiệt đới của hai bán cầu Vùng chuối tập trung nhiều nhất thế giới là Trung và Nam Bắc Mỹ (65%) và sau đó là Đông Nam

Thành phần hoá học và giá trị dinh dưỡng

Thành phần hoá học của chuối chứa 70 ÷ 80% nước, 20 ÷ 30% chất khô, chủ yếu

là glucide Hàm lượng protein của chuối thấp (1 ÷ 1,8%), gồm 17 acid amin mà chủ yếu là histidin Hàm lượng chất béo không đáng kể Acid trong chuối (trung bình 0.2%) chủ yếu là acid malic và acid oxalic Ngoài ra, chuối còn chứa các vitamin, carotene, B1, B2, B6, C, acid pantotenic, inositol, acid folic, muối khoáng,

pectin, hợp chất polyphenol

Nước: hiện diện trong nguyên liệu dưới dạng nước tự do và nước liên kết

Glucid: tồn tại chủ yếu ở dạng tinh bột khi chuối còn xanh Chuối càng chín tinh bột chuyển dần sang đường

Acid hữu cơ: acid hữu cơ có chủ yếu trong chuối là acid malic và acid oxalic (chỉ xuất hiện trong chuối chín)

Tanin: là thành phần chưa rõ nhưng thường chứa nhóm phenol (diphenol, pyrocatechol, resorcinol, hydroquinone, triphenol, pyrogollol, phyloroglucinol) thường ở dạng phức hợp với các chất nhầy

Phytin: ở dạng muối của Ca, Mg với acid phylic (inositol, acid hexaphotphoric) Protein: ngoài albumin, globulin còn có glutein, protease, prolamin

Lipid: không đáng kể thành phần chưa biết rõ có thể chứa sirotirol

Tro: gồm Si, S, Ca, Mg, Fe, P, Cl, K, Na, Al, Zn, Cu ở dạng hợp chất oxyt

Cấu tử bay hơi: mùi hương chuối tạo nên cho quá trình chín có thể do một vài loại rượu và ester tạo nên như: ester của acid acetic, acid butyric Ngoài ra còn có một lượng đáng kể aldehyde, rượu ethyl và methyl

Sắc tố: gồm chlorophyl và carotene, ngoài ra còn có flavone, anthocianine trong lớp nhựa vỏ

Enzyme: trong chuối có nhiều enzyme polyphenoloxydase, perosidase là yếu tố gây sẫm màu sản phẩm chuối

Chuối cung cấp nhiều năng lượng, chất bột đường, nhiều vitamin… dễ tiêu hoá

Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng của chuối (giá trị trung bình trong 100g ăn

Vitamin mg

Vitamin C (Acid ascorbic) 12,00

Pro vitamin A (caroten) 0,150

Vitamin B1 (thiamin) 0,040

Vitamin B2 (riboflavin) 0,040

Vitamin B3 hoặc PP (niconamid) 0,610

Vitamin B5 (acid phantothenic) 0,280

Vitamin B6 (pyridoxin) 0,500

Vitamin H (biotin) 0,003

Vitamin B9 (acidfolic) 0,023

Vitamine E (tocopherol) 0,290

(Nguy ễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978)

Hoá sinh sự chín của chuối

Đại cương về sự chín

Quả là những sản phẩm thiết yếu đối với dinh dưỡng của con người, bởi lẽ chúng

là nguồn cung cấp chính các vitamin, muối khoáng, acid hữu cơ, polyphenol, các chất thơm và glucid dễ tiêu hoá Một trong những yêu cầu quan trọng bậc nhất đối với các phương pháp chế biến và cất giữ quả là làm thế nào để bảo tồn được một cách tối đa các chất dinh dưỡng, vitamin, hương vị và màu sắc tự nhiên của quả Muốn làm được điều đó phải biết rõ thành phần hoá học của quả và hiểu sâu sắc các quá trình sinh hoá xảy ra trong mô của chuối khi chín, cũng như khi chế biến

và bảo quản

Trong quá trình phát triển của mình, tế bào trãi qua một loạt các giai đoạn nối tiếp nhau: phân chia, sinh trưởng, chín già và phân huỷ rồi chết

Khi còn ở trên cây, các chất dinh dưỡng được tích tụ dần dần làm cho quả trở nên

“già dần” Quả đã “già” hàm lượng các chất dinh dưỡng trong chúng được tích tụ khá cao Tiếp sau đó nhiều biến đổi hoá học khác nhau tiếp tục xảy ra dưới sự điều hoà của các chất kích thích tố và hệ enzyme làm cho quả có thành phần hoá học, hình dạng, kích thước, màu sắc đặc trưng, hương vị thơm ngon điển hình cho từng

loại quả Đó là hiện tượng chín Đối với chuối, quả chín sau khi ngắt lìa khỏi cây

mẹ gọi là quả rấm chín

Trong thời gian chín, thịt quả (như mô) tích luỹ một lượng lớn các chất dinh dưỡng hoà tan (chủ yếu là đường hoặc acid hữu cơ) từ lá chuyển đến hoặc do các chất hữu cơ phức tạp phân giả tạo thành làm độ chắc của quả giảm, quả trở nên mềm Màu sắc của vỏ quả và thịt quả thay đổi Khi trong quả kết tụ các chất dinh dưỡng cao nhất, màu sắc của quả đẹp nhất, hương vị của quả thơm ngon nhất được gọi là quả chín tới

Tiếp sau đó là thời kỳ già cõi và phân huỷ tế bào của mô Lúc này quá trình phân huỷ nội tế bào tăng lên rất mạnh vì hạt bắt đầu phát triển nhờ làm cho màu sắc của quả trở nên xấu đi, quả không còn độ chắc nhất định còn gọi là sự chín quá hay chín nẫu

Biến đổi thành phần hoá học cơ bản của quả khi chín

Bi ến đổi Glucid

Đường và tinh bột

Sự thay đổi chủ yếu trong thịt quả trong quá trình chín là sự biến đổi tinh bột thành đường Hàm lượng tinh bột giảm còn hàm lượng chung của đường tăng lên do sự thuỷ phân tinh bột thành đường dưới tác dụng của enzyme

Bảng 2: Sự chuyển hoá tinh bột thành đường trong quá trình chín

Số ngày trong nhà rấm

chín

Glucid tổng số (%) 21,51 20,49 10,87 19,78 18,60 19,12 Tinh bột (%) 20,65 12,85 6,00 2,93 1,73 7,21 Đường khử (%) 0,24 2,81 7,24 10,73 12,98 15,31 Đường không khử oxy

(%)

0,62 4,85 6,25 6,12 3,89 2,60

(Nguy ễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978)

Trong chuối chín tới, saccharose, fructose, glucose chiếm tỉ lệ gần như nhau, cả ba loại đường này đều tăng khi chuối chín quá, nghĩa là sau một thời gian hô hấp đột phát, hàm lượng đường chung đặt biệt là saccharose giảm nhanh vì tiêu thụ nhanh trong quá trình hô hấp

Bảng 3: Hàm lượng glucid của chuối xanh và chuối chín

Đường(%)

Độ già Tinh bột

Saccarose Glucose Fructose Tổng

Chuối chín 1,21 2,6 2,4 12,9 17,9

(Nguy ễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978)

Bi ến đổi của chất pectin và các enzyme chuyển hoá pectin

Ở quả xanh, protopectin (pectin không hoà tan) phân tán trong thành tế bào làm cho quả có độ rắn chắc nhất định Trong quá trình chín, dưới tác dụng của enzyme protopectinase và acid hưu cơ, 1 phần lớn protopectin chuyển thành pectin hoà tan phân tán vào dịch bào do đó quả mềm

Bảng 4: Sự biến đổi của chất pectin trong quá trình chín

0,27 0,56

0,36 0,31

0,34 0,34

0,37 0,21

0,4 0,22

(Nguy ễn Xuân Hân và Dương Thị Vân Đoan, 1978)

Bi ến đổi acid hữu cơ

Khi quả chín, acid hữu cơ biến đổi cả về chất lẫn lượng Ở chuối, thì hàm lượng acid giảm xuống, sự giảm acid này làm cho hệ số đường, acid của quả tăng lên Đó chính là nguyên nhân làm tăng độ ngọt của quả

pH của chuối thay đổi từ:

5,02 ÷ 5 trong chuối xanh

4,2 ÷ 4,75 trong chuối chín

Bảng 5: Sự biến đổi của acid trong quá trình chín

Số ngày trong nhà rấm chín Độ chua

(số ml NaOH để trung hoà 100g thịt quả)

Bi ến đổi các sắc tố

Ở đa số quả, dấu hiệu chín đầu tiên là sự biến đổi về màu sắc do lượng chlorophyll giảm xuống và lượng carotenoid cũng như antoxyan và các flavonoide tăng lên

Bi ến đổi hợp chất phenol

Polyphenol chủ yếu là chất tanin thường tạo vị chát, sự biến đổi của tanin tự do có

ý nghĩa rất lớn trong việc tạo thành vị ngon của quả Trong thịt quả, lượng tanin giảm từ 7,36% xuống 1,7% ở quá trình chín

Bi ến đổi một số chất khác

Trên đây là một loạt các biến đổi quan trọng của một số hợp chất thành phần của quả Trong quả còn có một số hợp chất thành phần khác như: lipid, protein, khoáng…

2.1.2 N ấm men

Giới thiệu chung về nấm men

Cấu tạo nấm men

Tế bào nấm men có cấu tạo hình thái và kích thước rất khác nhau Tuỳ loại tuỳ giống chúng có thể hình cầu hình bầu dục, hình trứng hình, quả chanh, hình ống Tuỳ theo loại giống, điều kiện sinh trưởng kích thước tế bào nấm men rất nhiều Chúng có thể thay đổi trong khoảng 1,5 ÷ 5,3 µm hay có khi dài hơn, các loại nấm

Sinh dưỡng của tế bào nấm men

Nấm men tiếp nhận thức ăn bằng con đường hấp thụ chọn lọc trên bề mặt của tế bào và sau đó khếch tán vào bên trong Màng và lớp bao bọc nguyên sinh chất của

tế bào trong trường hợp này đóng vai trò là màng bán thấm ngăn cách, điều khiển các chất dinh dưỡng vào tế bào và thải ra môi trường xung quanh những sản phẩm của hoạt động sống Để cho tế bào dễ hấp thụ, các chất dinh dưỡng phải là những chất có nguyên tử lượng thấp và hoà tan trong nước, một phần các chất dinh dưỡng chuyển hoá các hợp chất cao phân tử (protid, glucid, lipid…) trong tế bào và xây dựng thành tế bào mới Chúng ta muốn biết nấm men cần những chất dinh dưỡng (thức ăn gì) phải xem xét thành phần hoá học của tế bào nấm men

Nấm men sinh sản trong môi trường nước đường, lóc tách men, rửa, ép bỏ nước sẽ được men bánh hay gọi là men ép

Nước trong nấm men gồm hai dạng: dạng tự do bám ở ngoài màng tế bào khoảng 28% và nước dạng kết hợp khoảng 47% Thành phần các chất không phụ thuộc vào giống nấm men

Nấm men cũng giống như các cơ thể thực vật khác cần oxy, cacbon, nitơ, phosphat, kali, magiê,…

Nấm men trong sản xuất rượu vang

Saccharomyces vini

Nấm này phổ biến trong lên men nước quả, chiếm 80% trong tổng số có trong nước quả lên men Khả năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng chủng: các tế bài dạng bụi hoặc dạng bông

Đa số các tế bào loài này hình ovan, có kích thước từ (3 ÷ 8) x (5 ÷ 12) µm Sinh

sản theo lối nảy chồi và tạo bào tử Saccharomyces vini sinh ra enzyme invectaza

có khả năng khử đường saccarose thành fructose và glucose Vì vậy trong lên men

ta có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu đựoc bình thường Chủng này lên men chỉ đạt được 8 ÷ 10% hàm lượng rượu theo thể tích

Saccharomyces uvacum

Men này được tách ra từ nước quả nho, rượu và nước quả phúc bồn tử lên men tự nhiên, về hình thái nó không khác với các loài khác Khả năng sinh bào tử khá mạnh trong môi trường thạch-malt Các chủng của loài này có thể lên men 12 ÷ 13˚ cồn trong dịch nước nho

Saccharomyces chevalieri

Men này được tách ra từ nước nho lên men tự nhiên, từ rượu vang non được gây

men từ nước dừa Saccharomyces chevalieri thuần chủng lên men nước nho có thể tạo 16˚ cồn Nó thường lẫn với Saccharomyces vini

Saccharomyces ovifromis

Được tách ra từ nước nho tự lên men, những loài nấm men này ít hơn so với

Saccharomyces vini Giống thuần chủng phát triển tốt trong nước nho và các loại nước quả khác, có khả năng chịu được đường cồn cao; lên men kiệt đường và có

thể tạo thành tới 18˚ cồn Các yếu tố sinh trưởng của loài này giống như

Saccharomyces vini và có khả năng chịu được cồn cao

2.1.3 Enzyme

Khái niệm về enzyme

Sự sống đó là quá trình trao đổi chất liên tục Để thực hiện sự trao đổi chất trong

cơ thể diễn ra một cách liên tục, nhịp nhàng, hàng ngàn hàng vạn những quá trình hóa học phức tạp có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau Những quá trình đó hầu như tất cả đều có sự tham gia của chất xúc tác sinh học có đặc tính cao và có hiệu lực xúc tác lớn

Chất xúc tác sinh học có hầu hết trong các loại tế bào của cơ thể sống Nhờ chất xúc tác sinh học mà các quá trình hóa học trong cơ thể xảy ra rất nhạy với vận tốc rất nhanh trong những điều kiện sinh lý bình thường của môi trường cơ thể sống

Sự xuất hiện thuật ngữ “Enzyme” có liên hệ từ bước đầu của quá trình lên men Sự nghiên cứu mở ra sản xuất lên men đặc biệt là sự lên men trong công nghệ thực phẩm và nông nghiệp

Enzyme amylase

Giới thiệu

Enzyme amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và các dextrin thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn

Enzyme amylase cũng như các enzyme khác đều có bản chất là protein được vi sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng sinh học

Phân loại và cơ chế tác dụng

Các enzyme amylase từ các nguồn sẽ khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng

như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân

α-amylase

Đặc tính

Là một metaloenzyme, trong phân tử có ít nhất một phân tử Ca2+ có tác dụng làm bền cấu trúc bậc hai và bậc ba của phân tử enzyme Enzyme α-amylase là những protid đơn giản, có chứa nhóm amin tự do Enzyme α-amylase khá giàu tyrosine, tryptophan nhưng ít methionin

Enzyme α-amylase được hoạt hóa bởi ion đơn hóa trị nếu chúng có nguồn gốc động vật và vi sinh vật Nếu có nguồn gốc thực vật thì được hoạt hóa bởi ion hóa trị II Hoạt hóa bởi Enzyme hóa trị I như sau:Cl- > Br- > I- Chúng bị kiềm hảm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+,…

Enzyme α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt (bền nhất trong hệ α-amylase)

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau: pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,5 ÷ 4,8 (có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,7 ÷ 5,4) và của vi khuẩn là 5,8 ÷ 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 ÷ 7,0) Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase ở nấm sợi là 500C Amylase của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58 ÷ 600C

C ơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin

α-amylase chỉ có khả năng phân cắt liên kết α-1,4-glucoside ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa Do đó được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme) Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh tạo thành oligosaccharide gồm 6 ÷ 7 gốc glucose, sau này các mạch này bị phân cắt dần và

bị phân giải chậm đến maltose tetrose, maltose triose, maltose Sau thời gian thủy phân amylase sản phẩm bao gồm: 87% maltose, 13% glucose

Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, amylosepectin bị phân giải khá nhanh nhưng vì α-amylase không cắt được liên kết α-1,6-glucoside nên dù có kéo dài thời gian thủy phân nhưng sau cùng sản phẩm có khoảng: 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và izomaltose là 8%

Hình 1: Cơ chế tác dụng của enzyme α-amylase lên tinh bột

β-amylase

Đặc tính

β-amylase là một loại albumin Tâm xúc tác của nó chứa gốc –SH, -COOH cùng với vòng imidazol của các gốc histidin β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nẩy mầm Trong vi khuẩn không có β-amylase Sự tồn tại của β-amylase trong mold cho đến nay vẫn chưa được xác định

β-amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như:

Cu2+, Hg2+, ure, iodo, acetanid, iod, ozon

pH tối thích trong dung dịch bột thuần khiết là 4 ÷ 6, trong dung dịch nấu là 5 ÷ 5,6; nhiệt độ tối thích trong tinh bột thuần khiết là 40 ÷ 50˚C, trong dung dịch nấu

là 60 ÷ 65˚C; β-amylase bị vô hoạt ở 70˚C

C ơ chế tác dụng lên mạch tinh bột

β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại Phân cắt tuần tự từng gốc maltose một ở đầu không khử Maltose có cấu hình β được tạo thành β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exo-enzyme)

β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose Phân giải 54 ÷ 58% amylosepectin thành maltose Do mỗi nhánh của amylosepectin có từ 20 ÷ 25 phân

tử glucose nên sau khi thủy phân tạo 10 ÷ 12 phân tử maltose Khi tới liên kết 1,4-glucoside gắn với liên kết α-1,6-glucoside, β-amylase sẽ ngưng tác dụng, phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn Có chứa rất nhiều liên kết α-1,6-glucoside gọi là dextrin có màu tím đỏ với Iod

α-γ-amylase

Đặc tính

So với α-amylase và β-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, acetone không được bảo vệ bằng Ca2+ γ-amylase không bền với ion kim loại nặng: Cu2+, Hg2+… có trong nấm mốc và một loài vi khuẩn

Vận tốc thủy phân các cơ chất khác nhau bằng γ-amylase tinh thể cho thấy rằng các polysaccharide phân tử lớn hơn thì bị thủy phân nhanh hơn các chất phân tử thấp Đa số γ-amylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid” Hoạt động tốt ở 50˚C, hoạt lực tối đa trong vùng pH = 3,5 ÷ 5,5 So với α-amylase, γ-amylase bền với acid hơn nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, acetone

C ơ chế tác dụng lên mạch amylose và amylosepectin

Enzyme γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết 1,4 và liên kết 1,6-glucoside trong tinh bột, glycogen, polysaccharide, cả maltose và các oligosaccharide kiểu maltose Là enzyme ngoại phân exo-enzyme, nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một Không thủy phân được các dextrin vòng

α-Khi thủy phân tinh bột, ngoài glucose còn có thể tạo thành oligosaccharide Ngoài

ra γ-amylase còn có khả năng cắt cả liên kết α-1,2 và liên kết α-1,3-glucoside nữa

K 3

K 1

Hình 2: Cơ chế tác dụng của enzyme amylase

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme amylase

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Khi cơ chất đầy đủ thì vận tốc của phản ứng enzyme tỉ lệ thuận với nồng độ enzyme

Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất

Enzyme tham gia quá trình xúc tác tạo phức hợp enzyme – cơ chất (ES) Trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất (S), enzyme (E) xúc tác cho sự chuyển hóa cơ chất tạo thành một sản phẩm (P), phản ứng xảy ra như sau:

S V

Vmax: vận tốc phản ứng cực đại

[S] : nồng độ cơ chất

Trong đó v là hàm số của [S], đồ thị có dạng nhánh hyperbol vuông góc:

Hình 3: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng

Km gọi là hằng số Michaelis – Menten và đặc trưng cho mỗi enzyme – Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc enzyme càng lớn.Qua đồ thị chung của đường biểu diễn cho thấy khi tăng nồng độ cơ chất, vận tốc phản ứng tăng Khi tăng nồng độ cơ chất đến một giá trị nào đó, vận tốc phản ứng đạt giá trị cực đại Vmax , sau đó vận tốc phản ứng sẽ không tăng nữa nếu ta tiếp tục tăng nồng

độ cơ chất

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của enzyme

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng của enzyme Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định Vượt quá nhiệt độ đó tốc độ phản ứng enzyme giảm và dẫn đến mức triệt tiêu Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là tốc độ tối ưu Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40÷500C Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau thì khác nhau

Bảng tóm tắt nhiệt độ

(
=alpha-amylase,
=beta-glucanase) Bảng tóm tắt pH (
=alpha-amylase,
=beta-glucanase)

Hình 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến tốc độ phản ứng

Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme

Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid yếu Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và

cả pH acid pH tối ưu cũng phụ thuộc vào nhiệt độ, khi tăng nhiệt độ phản ứng thì

pH tối ưu sẽ chuyển dịch về phía pH lớn hơn

Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến thực phẩm, tuyển chọn giống vi sinh vật

Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa đến hoạt động của enzyme

Chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm cho enzyme amylase từ trạng thái không hoạt động hoặc hoạt động yếu trở nên mạnh hơn, chất hoạt hóa có bản chất giống nhau có thể là:

- Các chất hữu cơ phức tạp (coenzyme, vitamin) làm nhiệm vụ chuyển nhóm chuyển hydro Ví dụ: NAP+, NADP+, acid ascorbic (chuyển hydro), ADP (chuyển photphat)…

- Những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme kết quả là bỏ một vài đoạn peptide, phá thế bị bao vây của các nhóm hoạt động trong trung tâm hoạt động của enzyme làm cho enzyme trở nên hoạt động

- Các chất có tác dụng phục hồi những nhóm chức hoạt động của trung tâm hoạt động của enzyme

Ví dụ: Trung tâm hoạt động của papain có chứa nhóm –SH sẽ chuyển thành –S-S- làm enzyme mất khả năng hoạt động Nếu thêm vào môi trường các chất hoạt hóa

có tính khử như cystein, glutation, nhóm –SH sẽ được phục hồi và enzyme sẽ hoạt động trở lại

- Các anion, các ion kim loại cũng có thể tham gia tạo thành trung tâm hoạt động của enzyme làm cầu nối giữa enzyme và cơ chất hoặc ổn định cấu hình cần cho hoạt động xúc tác của enzyme

Tuy nhiên, khi sử dụng các hóa chất này phải tùy từng loại mà sử dụng nồng độ khác nhau vì các chất hoạt hóa chỉ có tác dụng hoạt hóa ở một nồng độ nhất định Vượt quá nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme

Ảnh hưởng của chất kìm hãm

Các chất kìm hãm là chất có mặt trong phản ứng enzyme làm yếu hoặc chấm dứt hoàn toàn tác dụng của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng

Các chất kìm hãm có bản chất hóa học khác nhau có thể là ion kim loại, các phân

tử vô cơ, các chất hữu cơ và protein

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch

Kìm hãm thuận nghịch: phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh

chóng đạt được trạng thái cân bằng:

Trong đó:

E: enzyme

I: chất kìm hãm

K1, K2: hệ số vận tốc của phản ứng thuận nghịch

Kìm hãm không thuận nghịch: K2 sẽ rất nhỏ và không đáng kể

Thường phân biệt hai loại kìm hãm thuận nghịch là: kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnh tranh

Kìm hãm cạnh tranh: các chất kìm hãm cạnh tranh là những chất có cấu trúc tương

tự như cấu trúc của cơ chất Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme Khi đó chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động

Cơ chất loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất Kết quả làm hoạt động của enzyme sẽ giảm

Kìm hãm không cạnh tranh: chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme Kết quả chất kìm hãm này làm thay dổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác, làm giảm hoạt động của enzyme

Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi những ion kim loại nặng như: Cu2+, Ag+,

Phương trình vi phân (2) được lấy tích phân theo điều kiện đầu và cuối

Khi t = 0 → A = Ao

t = t → A = A

t A

o

kdt dA

0

A A (5)

Khi quá trình thực hiện ở nhiệt độ vô hoạt không đổI (k= hằng số, quá trình xử lý

là đẳng nhiệt) thì phương trình (5) được viết:

t A

o

dt k dA

Phương trình (8) là phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa hoạt tính còn lại của enzyme và thời gian xử lý nhiệt

D Ao

A: Hoạt tính của enzyme ở thời điểm t (đơn vị hoạt tính)

Ao: Hoạt tính của enzyme ban đầu (đơn vị hoạt tính)

t: là thời gian xử lý nhiệt (phút)

k: là hằng số tốc độ phản ứng vô hoạt enzyme bậc 1 (1/phút)

D: thời gian làm giảm hoạt tính của enzyme xuống 10 lần (phút)

Hình 5: Hình vẽ minh hoạ động học phản ứng vô hoạt enzyme bậc 1 ở các

nhiệt độ khác nhau

- Sự phụ thuộc vào nhiệt độ của hằng số tốc độ

Theo quan điểm động học về ảnh hưởng của nhiệt độ lên hằng số tốc độ vô hoạt được biễu diễn theo phương trình Arrhenius:

2 RT

d

2RT

Lấy tích phân 2 vế phương trình ta được:

2

* R

ln

0

dT Ea k

d

T

T k

Ea ko

Rln

=

T To

Ea ko

Rln

Trong đó:

k: Hằng số tốc độ vô hoạt enzyme ở nhiệt độ T (1/phút)

k: Hằng số tốc độ vô hoạt enzyme ở nhiệt độ To (1/phút)

Enzyme pectinase

Giới thiệu

Enzyme pectinase là nhóm enzyme thuỷ phân pectin, sản phẩm tạo thành các acid galacturonic, galactose, methanol…

Phân loại và cơ chế tác dụng của enzyme

Trong hệ enzyme phân giải pectin gồm nhiều enzyme khác nhau được phân loại phổ biến như sau:

Enzyme pectinesterase (PE)

Enzyme pectinesterase chỉ phân cắt nhóm methoxyl đứng cạnh nhóm –COOH tự

do, enzyme pectinesterase có ái lực với nhóm methoxyl ở vị trí 3 và 7 Sự phân cắt các nhóm methoxyl sẽ xảy ra một cách tuần tự bắt đầu từ nhóm –COOH tự do Kết quả là tạo thành acid pectinic hoặc acid pectic và methanol

và cơ chế tác dụng trên cơ chất, các enzyme này ra hai loại:

Enzyme polymethylgalacturonase (PMG)

Enzyme này tác dụng trên acid polygalacturonic đã được methoxyl hoá Tuy nhiên phụ thuộc vào khả năng phân cắt ở trong hay cuối mạch của chất pectin mà được chia thành 2 nhóm:

- Enzyme endo-glucosidasse polymethylgalacturonase

Kiểu I (endo- PMG-I) là enzyme polymethylgalacturonase dịch hoá Pectin có mức

độ methoxyl hoá càng cao thì bị thuỷ phân càng nhanh

- Enzyme exo-glucosidasse polymethylgalacturonase

Kiểu III (exo- PMG-III) là enzyme polymethylgalacturonase đường hoá, enzyme này có thể cắt từng gốc acid galacturonic ra khỏi acid ectinic hay pectin phân cắt các liên kết α-1,4 ở đầu mạch nằm giữa 2 gốc acid galacturonic có nhóm –COOCH3

Enzyme polygalacturonase (PG)

Enzyme này tác dụng lên acid pectic hoặc acid pectinic và cũng được chia thành 2 nhóm:

- Enzyme endo-glucosidasse polygalacturonase

Kiểu II (endo- PG-II) là enzyme polygalacturonase dịch hoá Enzyme này có thể thuỷ phân acid pectinic khi có mặt nhóm –COOH tự do

- Enzyme exo-glucosidasse polygalacturonase

Kiểu IV (exo- PG-IV) thường có ái lực mạnh đối với các liên kết glucoside ở cuối mạch của phân tử acid pectic hoặc acid pectinic nhưng bên cạnh không được có nhóm methyl

Pectate lyase(PEL)

Xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate không bị ester hóa Cả 2 enzyme PEL (exo-poly(1,4-α-D-galacturonide) lyase và endo-PEL (endo- poly(1,4-α-D-galacturonide) lyase đề tồn tại Pectate và pectin có lượng methoxyl thấp là cơ chất thích hợp hơn cả cho các enzyme này

Pectine lyase(PL)

Xúc tác sự phân cắt các đơn vị galacturonate đã bị ester hóa Tất cả các PL đều là endo-enzyme

Ngoài ra còn có:

- Pectin- transeliminase (PTE) hay còn gọi là poly

α-1,4-D-galacturonite-methylesterglucanoliase Là enzyme tác động trên pectin và pectin acid

- Polygalacturonate- transeliminase còn gọi là poly

α-1,4-D-galacturonite-glucanoliase, là enzyme tác động trên pectic acid và pectinic acid

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme

Ảnh hưởng của thành phần hoá học của nguyên liệu

Tình trạng chất lượng pectin ảnh hưởng nhiều tới sự tạo độ nhớt của dịch quả và khả năng thuỷ phân của enzyme pectinase Pectin có độ ester hoá càng cao thì độ nhớt càng cao và hiệu quả tác dụng của polygalacturonase càng thấp

Các acid hữu cơ có trong quả ức chế enzyme pectinase với mức độ khác nhau Acid citric và acid tartric ở nồng độ 0,4% có tính chất ức chế hầu như giống nhau

Ở nồng độ 0,8%, acid citric ức chế enzyme pectinase mạnh hơn so với acid tartric Hiệu quả tác dụng của enzyme pectinase cũng bị ảnh hưởng bởi các ion có trong dịch quả

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pectinase

Khi lựa chọn nồng độ chế phẩm enzyme nên chọn lựa tối thiểu mà bảo đảm được các biến đổi cần thiết với thời gian mà công nghệ của dạng nước quả cho phép Không tuỳ thuộc vào hoạt độ của một chế phẩm hoặc của một enzyme, hiệu quả tác dụng của chế phẩm hoàn toàn phụ thuộc vào thành phần của enzyme và đặc điểm của nguyên liệu chế biến

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong vài phút đầu, nhiệt độ không ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme Ảnh hưởng của nhiệt độ biểu hiện sau 3÷5 phút tính từ lúc bắt đầu phản ứng Sự giảm

độ nhớt chậm lại phụ thuộc vào nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme Endo-polygalacturonase bị ức chế hoàn toàn ở 70oC sau 1 giờ, nhưng ở 45÷50oC tốc độ thuỷ phân do enzyme tăng Khi xử lý lâu ở nhiệt độ cao chất lượng quả của nhiều loại nguyên liệu bị giảm đi, vì vậy thường sử dụng nhiệt độ thấp hơn nhiệt

độ tối thích của enzyme

Ảnh hưởng của pH

Bảng tóm tắt nhiệt độ / pH

Temperaturprofile (pectinase) pH - Profile (pectinase)

Hình 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến tốc độ phản ứng

Các enzyme pectinase có nguồn gốc khác nhau có pH tối thích khác nhau Pectinesterase có nguồn gốc thực vật tác dụng mạnh trong khoảng pH=6,5÷9,5, pectinesterase của nấm có khoảng pH tối thích 4,0÷5,2, còn pectinesterase của vi khuẩn hoạt động mạnh nhất ở pH=7,0÷9,0, pH tối thích của enzyme không cố định, có thể thay đổi tuỳ theo nguồn gốc và các chất đã tạo nên trị số đó

Ứng dụng của enzyme trong sản xuất nước quả và rượu vang

Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một trong sáu nhóm enzyme sau:

- Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu được lượng sản phẩm lớn

- Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong, không chứa pectin Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly và thủy phân hoàn toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước quả

- Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hóa nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích kỵ nước quả

- Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất bán sản phẩm rượu vang, nhằm làm tăng hiệu suất trích kỵ của bán sản phẩm

- Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hóa và làm cản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu vang

- Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại sự lại đường trong sản xuất sirô thành phẩm

Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét cẩn thận trên cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý Trong các đặc điểm của trái cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản phẩm Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzyme phải đảm bảo giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theo ý muốn bằng cách điều khiển phản ứng enzyme Theo màu sắc tự nhiên, các loại trái cây được chia làm hai loại:

Trái cây có màu nh ạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, bưởi…

Trái cây có màu s ẫm do chứ nhiều antoxian: anh đào, mận đỏ, nho đỏ, mơ, mận

đen, dâu…

Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạt các enzyme sau:

- Enzyme endo-PMG để làm giảm độ nhớt của dịch quả

- Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly

- Enzyme khác như cellulose, hemicellulase, protease không bắt buộc

Tuy nhiên, nếu cho thêm những enzyme này vào sẽ làm tăng khả năng trích ly vật chất hòa tan có trong tế bào quả

Riêng enzyme PTE, cần lưu ý là enzyme này phân hủy protopectin, thường không

có lợi cho việc thoát các chất có trong tế bào quả Do đó trong trường hợp này, người ta không sử dụng enzyme PTE

Sự có mặt của enzyme ascorbinatoxidase thường gây ra sự phân giải vitamin C

Các enzyme tham gia quá trình oxy hóa như polyphenoloxidase, peroxidase, catalase thường làm biến màu nước quả và làm giảm giá trị cảm quan khác Do đó, trong chế biến nước quả không nên dùng những loại enzyme này

Khi chế biến nước quả có màu đỏ cần lưu ý phải bảo tồn chất màu antocian Chính

vì thế không được dùng những loại enzyme có khả năng phân giải antocian

Ascorbic acid là một trong những chỉ tiêu quan trọng của nước quả, do đó trong khi chế biến nước quả tuyệt đối không được sử dụng enzyme ascorbinatoxidase Trong nhiều trường hợp, enzyme protease đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình làm trong nước quả Chính vì thế khi cần làm trong nước quả, người ta thường kết hợp protease acid với enzyme phân huỷ pectin

Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế phẩm enzyme bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulase, cellulose Trong đó, enzyme pectintrancelimitase đóng vai trò quan trọng nhất Trong hỗn hợp chế phẩm enzyme trên, tuyệt đối không được có mặt enzyme polygalacturonase Những enzyme này thường làm giảm độ nhớt của nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả

Việc ứng dụng enzyme vào chế biến nước quả và trong sản xuất rượu vang bắt đầu

từ năm 1930 Từ đó đến nay, trên thế giới có rất nhiều loại chế phẩm thương mại được sản xuất và ứng dụng trong chế phẩm rau quả

Bảng 7: Hàm lượng muối cho phép trong sản xuất rượu

(Bùi Th ị Quỳnh Hoa, 2006)

- Không có hoặc chỉ có rất ít muối kim loại nặng như: Hg2+, Ba2+,…

- Khả năng oxi hoá một lít nước không quá 2ml dung dịch KMnO4 (0,01N)

- Chất cặn không vượt quá 1000 mg/ml

Ion Hàm lượng (mg/l) Ion Hàm lượng (mg/l)

- Trong công nghệ sản xuất rượu độ cứng quá lớn sẽ ảnh hưởng đến quá trình nấu nguyên liệu, đường hoá và lên men, nếu pH của nước >7 sẽ thúc đẩy quá trình tạo glycerin

- Tổng hàm lượng muối trong nước là 2g/l có tác dụng kích thích quá trình lên men nhưng với hàm lượng 3g/l lại có tác dụng xấu đến quá trình lên men

- Chỉ số E.coli <20 tế bào/lít

2.1.5 Acid citric

Sử dụng nhằm mục đích tạo pH thích hợp cho quá trình lên men, acid citric hầu như không có ảnh hưởng đến tâm hoạt động của nấm men

2.2 Động lực của quá trình lên men

2.2.1 C ơ chế của quá trình lên men

Để lên men người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định Tuỳ theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được >100 triệu tế bào trọng một ml dịch lên men Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh Đường lên men là các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men sau đó khuếch tán qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành

Rượu etylic tạo thành khuếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men Rượu hoà tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường CO2 cũng hoà tan vào trong môi trường nhưng sự hoà tan không lớn Ở áp suất 800mmHg nhiệt độ 25÷30oC là 0,856÷0,837 lít CO2 trong một lít nước Vì thế

CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bảo hoà Khi bảo hoà CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên

bề mặt Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị

vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men vốn từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái chuyển động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men

Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát lít CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hoà tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men khi lên men đều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng quá trình lên men

2.2.2 Động học của quá trình lên men

Tốc độ của quá trình lên men có thể quan sát được bằng cách theo dõi sự thay đổi của hàm lượng đường trong dịch lên men, quan sát bằng cách theo dõi sự thay đổi lượng rượu và CO2 tạo thành cũng như sự thay đổi trị số của nồng độ dịch lên men

Quá trình lên men chia làm 3 thời kỳ chính:

Thời kỳ đầu: Khoảng 60 giờ kể từ khi cho nấm men tiếp xúc với dịch lên men Sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể

Thời kỳ 2: đây là thời kỳ lên men chính Chiếm khoảng 60-120 giờ sau thời kỳ đầu Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng nhanh đáng kể và đạt đến trị số cực đại

Thời kỳ cuối: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kỳ ổn định tạo mùi cho sản phẩm Tuỳ theo phương pháp lên men loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau không quan sát được

Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men Trong giai đoạn này, trong điều kiện lên men bình thường sau mỗi giờ nồng độ đường trong dịch lên men sẽ giảm đi khoảng 1 độ (Brix, balling, %) tuỳ loại sản phẩm, dây chuyền sản xuất

Sự tồn tại của thời kỳ lên men cuối là đặc trưng đối với quá trình lên men dịch đường hoá từ nguyên liệu chứa tinh bột

Trong dịch lên men nếu biểu thị hàm lượng đường tồn tại trong dịch lên men là 100% thì 4÷6% là dạng chất không tan, 75÷77% được chuyển thành maltose và 19% là dextrin

Trong giai đoạn lên men sự đường hoá cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hoà tan Do đó tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào sự thuỷ phân hàm lượng dextrin không lên men còn lại Tuy vậy, chính những loại đường không lên men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm Như vậy, chu kỳ lên men dịch đường hoá tinh bột phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả năng đường hoá của phức hệ enzyme amylase Rất nhiều thí nghiệm cho thấy càng kéo dài thời gian lên men cuối thì càng gia tăng hiệu suất của quá trình lên men

Tuy vậy, tuỳ theo sản phẩm của sự lên men, nồng độ glucid của dịch đường hoá, phương pháp lên men, nhà sản xuất cũng sẽ tạo ra một qui trình sản xuất riêng biệt với chất lượng và thành phần mong muốn của họ

2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

2.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Để thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động sống của nấm men cụ thể nấm men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu Nấm men chủng VII phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30÷33oC, nhiệt độ tối đa 38oC, tối thiểu là

5oC Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17÷22oC có năng lực lên men rất lớn Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1÷45oC Nếu nhiệt độ quá 50oC thì nấm men sẽ chết

2.3.2 Ảnh hưởng của pH

Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH=2÷8 nhưng thích hợp nhất là 4÷4,5 Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH=4,2 và cao hơn khi pH<4,2 chỉ có nấm men phát triển Vì vậy trong lên men rượu, để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH=3,8÷4,0 Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần (thuần hoá) với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng Khi pH=8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh Ở pH=3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển

Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta

có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh mẽ đến trung tâm hoạt động của nấm men

2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ rượu

Quá trình nuôi cấy nấm men chủ yếu là tạo điều kiện cho nấm men phát triển sinh khối, đạt số lượng theo yêu cầu Song nấm men cũng thực hiện một quá trình lên men rượu đáng kể (còn phụ thuộc vào chế độ thông không khí)

Thường trong dich nấm men có khoảng 4÷6% rượu Nồng độ (rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men Nồng độ rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phụ thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị môi trường nuôi cấy Cùng một môi trường nuôi cấy,

số lượng tế bào nấm men cho vào bằng nhau, điều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4÷6% đã có ảnh hưởng xấu

2.3.4 Ảnh hưởng của chất lượng và số lượng nấm men sử dụng

Số lượng tế bào nấm men cho vào dịch lên men ảnh hưởng rất lớn đến quá trình lên men Nếu số lượng tế bào nấm men cho vào dịch thích hợp thì quá trình lên men diễn ra tốt và hiệu suất thu hồi cao, chất lượng sản phẩm cũng tốt hơn Nếu tế bào nấm men cho vào quá ít thì tốc độ lên men chậm, sinh khối tế bào nấm men thấp, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, số lượng tế bào nấm men quá nhiều thì môi trường dịch lên men không đủ cho nấm men phát triển, tế bào nấm men sẽ chết dần sản phẩm sinh ra mùi lạ, vị lạ đồng thời phí đi một lượng đáng kể men không có ích

2.4 Qui trình sản xuất rượu vang chuối

glucoamylase

2.5 Các dạng hư hỏng trong sản xuất rượu vang chuối

2.5.1 Lên men lactic

Sự lên men lactic cũng gây nhiều tác hại như làm chua và vẩn đục bia, nước ngọt, nước giải khát…

Vi khuẩn lactic thường dễ xâm nhập vào các thiết bị lên men rượu, từ đó nó lên men lactic làm hư hại cả một giai đoạn của sự lên men rượu, làm rượu bị kém phẩm chất do nó tạo ra acid lactic, acetic, manic Lên men này còn gây hư hỏng, làm chua một số thực phẩm có đường khi bảo quản

Thủ phạm gây ra hiện tượng này là do vi khuẩn lactic, đặc biệt là chủng Lactobacterium manitopocrum

2.5.2 Lên men butyric

Vi khẩn butyric khi nhiễm vào thùng ủ sẽ gây lên men butyric, tạo ra nhiều khí hydro, tuy nhiên độ acid không tăng cao

2.5.3 Lên men d ại

Thường gặp là loại nấm men hình oval lớn, lên men rất nhanh, tạo độ acid cao và

độ rượu sớm, làm ức chế hoạt động nấm men cần thiết để thực hiện quá trình lên men

C 6 H 12 O 6 Glucose

2CH 3 CHOHCOOH Acid lactic

C 6 H 12 O 6 Glucose

CH3CH2CH2COOH + 2CO2 + 2H2

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1 Phương tiện

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp và Sinh học Úng dụng - Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Th ời gian thực hiện

Hình 9: Máy quang phổ Hình 10: Bể điều nhiệt

- Máy xay nguyên liệu

- Hàm lượng chất khô hòa tan

- Hàm lượng đường tổng số

- Acid tổng số theo acid malic

3.2.2 Thí nghi ệm 1: Khảo sát động học vô hoạt enzyme glucoamylase

Định nghĩa đơn vị hoạt tính enzyme glucoamylase (đv/mg):

Một đơn vị enzyme là lượng enzyme xác định có khả năng tạo ra 1mg đường khử

ở nhiệt độ thuỷ phân là 60oC, pH 4,5, thời gian thuỷ phân là 1 giờ