Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch ngựa dạng cọng rạ

Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch ngựa dạng cọng rạ

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH NGỰA

DẠNG CỌNG RẠ

Vũ Đình Ngoan, 1 Đào Đức Thà, Đặng Đình Hanh, Nguyễn Hữu Trà,

Nguyễn Văn Đại, Dương Thị Thư

Trung tâm Nghiên cứu và PTCN miền Núi

1Bộ môn Sinh lý Sinh hoá và Tập tính Vật nuôi

Tóm tắt

Ở Việt Nam thụ tinh nhân tạo cho ngựa là công việc còn rất mới mẻ Trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi đang củng cố, nâng cao chất lượng đàn giống, phổ biến giống mới và làm tươi máu những đàn giống hiện có cũng như bảo tồn phát triển các giống ngựa quý hiếm Nhằm đáp ứng nhu cầu khai thác tiềm năng di truyền của con đực và nguyên liệu cho TTNT ngựa chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu sản xuất tinh đông lạnh cọng rạ ngựa có hoạt lực tinh trùng (A) sau giải đông ≥35%

Tinh dịch ngựa có hoạt lực >70% được đưa vào sử dụng trong nghiên cứu Trong thí nghiệm chúng tôi nghiên cứu chế độ ly tâm, môi trường đông lạnh, phương pháp cân bằng, chế độ cân bằng, thời gian đông lạnh trong hơi nitơ và chế độ giải đông để đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải đông

Tinh dịch ngựa được lọc bỏ keo phèn, pha loãng môi trường ly tâm và được làm lạnh đến 150C trong 1.5 giờ sau đó được ly tâm trong 15 phút ở 50C (1.500v/p) Tinh ngựa đậm đặc sau ly tâm được cân bằng 2 bước: Tinh dịch được pha lần thứ nhất với môi trường A theo tỷ lệ pha loãng là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1), tinh dịch được hạ nhiệt độ từ 150C xuống đến 50C trong thời gian 1.5 giờ Tiếp theo tinh dịch được bổ sung thêm môi trường đông lạnh B vào 3 thời điểm là 1.5h; 2h và 2.5h Sau đó cân bằng trong 1.5 giờ tiếp theo Tinh dịch sau cân bằng được tiến hành nạp tinh vào cọng rạ Tinh dịch sau cân bằng có mật độ tinh trùng khoảng 160 triệu/ml sau đó được nạp tinh vào cọng rạ (0.5ml/cọng) để tiến hành đông lạnh Đông lạnh ở 20 phút trong hơi nitơ sau đó đông lạnh sâu trong nitơ lỏng Giải đông ở 450C trong 5 giây, sau đó chuyển sang 370C trong 30 giây cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông tốt nhất (A 35.60%) Hoạt lực tinh trùng sau giải đông được đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision 3.0

1 Đặt vấn đề

Thụ tinh nhân tạo (TTNT) ngựa đã có từ lâu trên thế giới nhưng ở Việt Nam kỹ thuật này còn rất mới mẻ Hiện nay Trung tâm nghiên cứu và phát triển chăn nuôi miền núi đang củng cố, nâng cao chất lượng đàn giống, phổ biến giống mới và làm tươi máu những đàn giống hiện có cũng như bảo tồn phát triển các giống ngựa quý hiếm Vì vậy nhằm đáp ứng nhu cầu khai thác tiềm

năng di truyền của con đực và nguyên liệu cho TTNT ngựa chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên

cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch ngựa dạng cọng rạ với mục tiêu: Xác định phương pháp tối ưu

trong đông lạnh tinh dịch ngựa và sản xuất được tinh đông lạnh cọng rạ ngựa có hoat lực tinh trùng (A) sau giải đông ≥35%

2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu

Sử dụng tinh dịch giống ngựa Cabardin Ngựa đực giống khỏe mạnh được chăm sóc nuôi dưỡng theo quy trình của Trung tâm nghiên cứu và PTCN miền Núi - Viện Chăn Nuôi

Thời gian nghiên cứu: Tháng 1-12 năm 2009

Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu và PTCN miền Núi

Bộ môn Sinh lý Sinh hoá và TTVNi - Viện Chăn Nuôi

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Khai thác tinh dịch và đánh giá chất lượng tinh nguyên

Tinh ngựa được khai thác bằng âm đạo giả, có sử dụng ngựa cái làm giá

Tinh dịch ngựa: Sau khi khai thác được lọc bỏ keo phèn bằng vải gạc vô trùng

Một số chỉ tiêu chất lượng tinh nguyên được đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision và các phương pháp thường quy trong phòng thí nghiệm thông qua các chỉ tiêu: Thể tích tinh dịch (V), Mầu sắc tinh dịch, Hoạt lực tinh trùng (A), Nồng độ tinh trùng (C), Áp suất thẩm thấu (ASTT), tỷ lệ kỳ hình (K), độ pH và keo phèn

Những lô tinh dịch có hoạt lực ≥70% sẽ được đưa vào xử lý và đông lạnh trong thí nghiệm

Dung dịch ly tâm: Tinh dịch sau khi lọc bỏ keo phèn, được pha loãng với môi trường ly

tâm theo tỷ lệ 1:1 về thể tích, sau đó làm lạnh dần đến 150C trong 2 giờ

Phương pháp ly tâm: Tinh dịch sau khi được làm lạnh đến 150C, tinh pha được ly tâm trong 15 phút ở 50C với 2 chế độ ly tâm 1.500v/p và 2000 v/p Bỏ phần dung dịch trên ống ly tâm, lấy phần đậm đặc lắng ở đáy ống

Tinh dịch sau ly tâm được pha môi trường đông lạnh A, B, mật độ tinh trùng có khoảng

80 triệu tinh trùng/cọng rạ sau đó nạp tinh vào cong rạ và tiến hành đông lạnh Khi pha loãng tinh dịch môi trường A và môi trường B phải bằng nhau về thể tích khi cân bằng Trong 1 một môi trường đông lạnh chúng tôi chia làm 2 loại môi trường: Môi trường A không có thành phần glyceryl Môi trường B có thêm thành phần glyceryl

Cân bằng 1 bước:

Tinh dịch đậm đặc thu được sau ly tâm được pha ngay với môi trường đông lạnh A,B rồi

hạ nhiệt độ từ 150C xuống 50C trong 1.5giờ và tiếp theo để cân bằng trong 2.5giờ ở 50

C sau đó tiến hành nạp tinh vào cọng rạ

Cân bằng 2 bước: (bổ sung MT đông lạnh B vào 1 lần)

Tinh dịch đậm đặc thu được sau ly tâm được bổ sung môi trường A theo tỷ lệ pha loãng

là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1) hạ nhiệt độ từ 150C xuống đến 50

C trong thời gian 1.5 giờ Tiếp theo tinh dịch được bổ sung thêm môi trường B vào 1 lần rồi cân bằng ở

50C trong 2.5 giờ sau đó tiến hành nạp tinh vào cọng rạ

Cân bằng 2 bước: (bổ sung MT đông lạnh B vào 3 lần)

Tinh dịch đậm đặc thu được sau ly tâm được bổ sung môi trường A theo tỷ lệ pha loãng

là ½ thể tích cuối cùng cần đạt được (cân bằng lần 1) hạ nhiệt độ từ 150C xuống đến 50

C trong thời gian 1.5 giờ Tiếp theo tinh dịch được bổ sung thêm môi trường B vào 3 thời điểm là 1.5h; 2h và 2.5h, sau đó cân bằng trong 1.5 giờ tiếp theo Tinh dịch sau cân bằng được tiến hành nạp tinh vào cọng rạ

Phương pháp đông lạnh trong hơi nito Tinh dịch sau khi cân bằng được nạp vào các

cọng rạ và đông lạnh trong hơi nito lỏng (-800C) ở 3 mức thời gian là 10 phút, 20 phút, 30 phút Sau khi đông lạnh trong hơi nito, tinh dịch được đông lạnh sâu ở nitơ lỏng (-1960

C)

Phương pháp giải đông: Cọng rạ được giải đông ở nhiệt độ 370C, 390C trong thời gian là 30 giây, 50 giây và 450C trong 5 giây sau đó chuyển sang 370

C trong 30 giây

Đánh giá hoạt lực tinh trùng sau giải đông: Dùng micropipet hút 0.23l tinh dịch sau giải đông (đã được pha loãng bằng môi trường MTS) nhỏ lên phiến kính chuyên dụng (dùng riêng cho phần mềm Sperm Vision) có nhiệt độ ổn định 370C và đánh giá bằng phần mềm Sperm Vision 3.0 (hãng Minitub , Đức)

Phương pháp xử lý số liệu: Một số chỉ tiêu tinh dịch được đánh giá bằng phương pháp

thường quy và phần mền Sperm Vision 3.0 Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê

miêu tả (Display Descriptive Statistics) qua phương pháp kiểm tra ANOVA của phần mềm

Minitab 13 Số liệu được hiển thị dạng MeanSE, với P<0.05 có sai khác về ý nghĩa thống kê

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Chất lượng tinh nguyên

Tinh nguyên sau khi khai thác được đánh giá các chỉ tiêu sinh học: Thể tích tinh dịch (V, ml), mầu sắc tinh dịch, hoạt lực tinh trùng (A, %), nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml), tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC, tỷ/lần), pH tinh dịch, áp suất thẩm thấu (ASTT), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình Kết quả được đánh giá ở bảng 1

Bảng 1 Một số chỉ tiêu tinh dịch ngựa

(n là số mẫu tinh nguyên khai thác ở các lần trên cùng một cá thể ngựa)

Qua bảng 1 cho thấy: Thể tích tinh dịch mỗi lần khai thác với ngựa 62ml, Hoạt lực đều

>70%, tổng số tinh trùng là 132 triệu/ml Keo phèn tinh ngựa là ~16ml/lần khai thác (20%) Kết quả nghiên cứu về tinh dịch ngựa của một số tác giả :

Theo Mann (1981) tinh dịch ngựa có nồng độ: 100-150 trệu/ml

Theo kết quả bảng 1 cho thấy, tinh ngựa đủ tiểu chuẩn trước khi tiến hành các bước đông lạnh tinh dịch

3.2 Ảnh hưởng của chế độ ly tâm đến một số chỉ tiêu sinh lý của tinh trùng

Theo Vidament (1997) tinh dịch ngựa sau khi khai thác được lọc bỏ keo phèn và đánh giá hoạt lực phải được pha loãng ngay sau 2-15 phút với nồng độ tinh trùng đạt khoảng 60triệu/ml rồi hạ nhiệt độ để ly tâm

Ly tâm là một khâu rất quan trọng trong quy trình đông lạnh tinh dịch ngựa Chế độ ly tâm tốt sẽ loại bỏ được nhiều nhất tinh thanh, thu được lượng tinh trùng tối đa trong tinh dịch, đồng thời không gây những tổn thương đến cấu trúc của tinh trùng Tinh ngựa sau khi khai thác lọc bỏ keo phèn và để ở nhiệt độ 50C trong 1.5h đến 2h sau đó ly tâm Kết quả cho thấy ảnh hưởng của

chế độ ly tâm đến một số chỉ tiêu của tinh trùng được thể hiện ở bảng 2 như sau:

Bảng 2 Một số chỉ tiêu tinh dịch ngựa trước và sau ly tâm ở 2 tốc độ ly tâm

trường ly tâm

Sau ly tâm R1 (n=10) 1500 v/p,

C

R2 (n=10) 2000 v/p,

C

C triệu/ml 66,30 2,41 2297,5a 80,30 2384,5b 76,60

Ghi chú: Các chữ số có số mũ a,b, trong cùng một hàng có sự sai khác nhau về ý nghĩa thống kê P<0,05

Qua bảng 2 cho thấy, lượng tinh trùng được cô đặc theo phương pháp R1 chỉ còn 2,17ml, trong khi đã phương pháp R2 còn 2,07ml, tức là lượng dịch còn chứa trong phần đậm đặc sau ly tâm ở R1 nhiều hơn Hoạt lực (A) của tinh trùng sau ly tâm ở 2 phương pháp R1 và R2 khác nhau (P < 0.05)

Như vậy việc loại bỏ triệt để tinh thanh ra khỏi mẫu khi đưa vào đông lạnh không chỉ đảm bảo việc loại bỏ hiện tượng thể tinh hoá tốt hơn mà còn tập trung một lượng tinh trùng lớn trong một thể tích nhỏ Điều này rất cần thiết trong phân liều đông lạnh và thụ tinh nhân tạo Phương pháp ly tâm 1 cho kết quả ưu việt hơn vì hoạt lực tinh trùng sau ly tâm cao hơn

phương pháp ly tâm 2 mặc dù thể tích tinh dịch sau ly tâm thu được không được đậm đặc hơn

so với phương pháp 1 là không đáng kể

Theo Cochran (1984) Tinh dịch ngựa pha loãng ở mật độ 50 triệu tinh trùng/ml và ly tâm

ở 20OC là tốt nhất Lực ly tâm 400g cho 15 phút

3.3 Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh tới hoạt lực của tinh trùng

Môi trường đông lạnh có tác dụng điều chỉnh mật độ tinh trùng, cung cấp năng lượng và bảo vệ tinh trùng trước sự tấn công của vi sinh vật, bảo vệ cấu trúc của tinh trùng trong suốt quá trình đông lạnh Sử dụng phương pháp ly tâm 1 để nghiên cứu so sánh ảnh hưởng của môi trường đông lạnh tới hoạt lực tinh trùng Kết quả thể hiện

bảng 3

Bảng 3 Ảnh hưởng của môi trường đông lạnh tới hoạt lục của tinh trùng

Với tinh ngựa trong thí nghiệm này, sau ly tâm chúng tôi pha với môi trường đông lạnh

để đạt nồng độ cuối cùng là ≥160 triệu tinh trùng/ml

Qua bảng 3 cho thấy: Hoạt lực tinh trùng của tinh dịch ngựa ở môi trường đông lạnh 2 cho kết quả tốt nhất (68,8%) Tỷ lệ kỳ hình tinh trùng ở 3 môi trường đông lạnh không khác biệt nhiều (17,6-18,2%)

3.4 Ảnh hưởng của chế độ cân bằng đến hoạt lực của tinh trùng trước, và sau giải đông

Sử dụng phương pháp ly tâm 1 và môi trường đông lạnh 2 để nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ cân bằng đến hoạt lực tinh trùng Kết quả thể hiện bảng 4

Bảng 4 Hoạt lực tinh trùng trước và sau giải đông

Chế độ cân bằng n Hoạt lực, A (%)

CB 2 bước: bổ sung MT

CB 2 bước: bổ sung MT

Ghi chú: Hoạt lực tinh trùng giai đoạn trước đông lạnh ( sau giai đoạn cân bằng )

Kết quả cho thấy: Hoạt lực tinh trùng sau giải đông sử dụng phương pháp cân bằng 2

bước (bổ sung MT đông lạnh B vào 3 lần) cho kết quả tốt nhất (35,60%) Có sự sai khác rõ rệt về

hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở 3 phương pháp cân bằng nói trên

Vidament (1997) Với tinh dịch ngựa trước khi ly tâm, tốc độ làm lạnh vừa phải từ 370C đến 40C trong 1h cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông (45%) so với khi sử dụng làm mát chậm 370C đến 40C trong 4 giờ cho A sau giải đông là 39%; (P <0,05)

3.5 Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ hình sau giải đông

Giai đoạn đông lạnh trong hơi nito là bước đông lạnh trung gian giữa 50C với đông lạnh sâu (-1960C) Trong hơi nitơ nhiệt độ khoảng -800

C

Sử dụng phương pháp ly tâm 1, môi trường đông lạnh 2, CB 2 bước bổ sung môi trường

B vào 3 lần để nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng Kết quả nghiên cứu thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ hình sau giải đông được thể hiện trong bảng 5 như sau:

Bảng 5 Ảnh hưởng của thời gian đông lạnh trong hơi nitơ đến hoạt lực tinh trùng và tỷ lệ kỳ

hình sau giải đông

Kết quả bảng 5 cho thấy: Thời gian đông lạnh trong hơi nito ở 3 mức: 10 phút, 20p và 30p có sự khác nhau về A sau giải đông Hoạt lực của tinh trùng sau giải đông với thời gian đông lạnh trong hơi nito 20 phút cho kết quả cao nhất, cao hơn so với đông lạnh trong hơi nito 10 phút

và 30 phút Không có sự sai khác về hoạt lực của tinh trùng sau giải đông khi sử dụng thời gian đông lạnh trong hơi nito 20 phút và 30 phút (P>0.05) Có sự sai khác rõ rệt về hoạt lực tinh trùng sau giải đông khi đông lạnh trong hơi nito ở 20 phút, 30 phút so với đông lạnh trong hơi nito ở

10 phút (P<0.05)

Theo Boyle (1996) tinh ngựa có hoạt lực sau giải đông >35% là đạt, 30-35% có thể chấp nhận được, hoạt lực <30% là kém

Theo Vidament (1997) Có một mối quan hệ mạnh mẽ về hoạt lực tinh trùng giữa chất lượng tinh dịch trước đông lạnh và sau đông lạnh (P <0,001)

Theo Davies (1999) tốc độ hạ nhiệt được tổng kết cho quy trình đông lạnh tinh ngựa đạt kết quả tốt nhưa sau:

Giai đoạn nhiệt độ (0

trong nitơ lỏng (-1960C) Tốc độ hạ nhiệt (0

3.6 Ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng

Chế độ giải đông là khâu quan trọng làm ″thức tỉnh″ khả năng hoạt động của tinh trùng Một chế độ giải đông tốt sẽ đánh thức được nhiều tinh trùng hoạt động trở lại với khả năng hoạt động với chức năng cao nhất

Sử dụng phương pháp ly tâm 1, môi trường đông lạnh 2, CB 2 bước bổ sung môi trường

B vào 3 lần, đông lạnh trong hơi ni tơ 20 phút để nghiên cứu ảnh hưởng chế độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng Kết quả nghiên cứu nhiệt độ và thời gian giải đông được thể hiện bảng 6

Bảng 6 Ảnh hưởng của chế độ giải đông đến hoạt lực tinh trùng

450C ở 5 giây, tiếp 370

Kết quả bảng 6 cho thấy: Ở phương pháp giải đông 450C ở 5 giây, tiếp 370

C trong 30 giây cho kết quả cao nhất Không có sự sai khác về hoạt lực tinh trùng sau giải đông ở nhiệt độ

370C trong 50 giây, 390C trong 30 giây và 50 giây Ngược lại có sự sai khác về hoạt lực của tinh trủng ở chế độ giải đông 370C trong 30 giây so với các phương pháp khác trên

Đào Đức Thà (2007) Hoạt lực tinh trùng ngựa trước khi đông lạnh là 69,14% và sau khi tan băng trung bình đạt 33,78%

Theo Kuisma (2006), nên giải đông cọng rạ 0.5ml/cọng nhiệt độ giải đông 370C ít nhất

30 giây, cọng rạ 2.5ml/cọng ứng với 500C cho 40 giây, tốc độ giải đông phải đạt ≥350

C/giây Theo Loomis (1984) khuyến cáo cọng rạ 0.5ml/con nên giải đông ở nhiệt độ 380

C trong

30 giây Cochran (1984) cho rằng: cọng rạ 0.5ml/cọng giải đông ở nhiệt độ 750

C cho 7 giây sau

đó chuyển 370C cho ít nhất 5 giây cho kết quả tốt hơn 370C cho 30 giây có hoạt lực tương ứng là 34% và 29%

4 Kết luận và đề nghị

4.1 Kết luận

- Chất lượng tinh nguyên của tinh dịch ngựa nuôi tại Thái Nguyên đủ điều kiện làm tinh cọng rạ

- Sử dụng chế độ ly tâm 1500 v/p, trong 15phút ở 50C cho kết quả tốt hơn chế độ ly tâm

2000 v/p, trong 15phút ở 50

C

- Sử dụng môi trường đông lạnh 2 và cân bằng 2 bước bổ sung MT B có Glyceryl vào 3 lần ở thời điểm cho kết quả hoạt lực tinh trùng sau giải đông tốt

- Đông lạnh trong hơi nitơ 20 phút và giải đông ở 450C ở 5 giây, tiếp 370

C trong 30 giây (với cọng rạ 0.5ml/cọng) cho kết quả cao nhất (A=35,60%)

4.2 Đề nghị

Đề nghị công nhận đông lạnh tinh dịch ngựa dạng cọng rạ là tiến bộ kỹ thuật

Tiến hành thụ tinh nhân tạo bằng tinh đông lạnh ngựa để đánh giá tỷ lệ thụ thai

Tài liệu tham khảo

1 Đào Đức Thà, Vũ Đình Ngoan, Đặng Đình Hanh, Nguyễn Hữu Trà, Trịnh Văn Thân, Vũ Ngọc Hiệu, Phan

Văn Kiểm và Trần Văn Đường, 2007 Kết quả bước đầu nghiên cứu đông lạnh tinh dịch ngựa ở Việt Nam,

Tạp chí khoa học kỹ thuật chăn nuôi số 9 - Hội chăn nuôi Việt Nam

2 Boyle, M S, 1996 Essessing the potential fertility of frozen stallion semen Stallion reproduction services

143 Huntingdon Road, Cambridge CB3 ODH, UK

3 Loomis, P R., Amann, R P., Sqires, E L and Pickett, B W, 1983 Fertility of unfrozen and frozen stallion

spermatozoa extended in EDTA-lactose-egg and packaged in straw Journal of Animal Science 56,

687-693

4 Kuisma, P., Andersson, M., Koskinen E and Katila T, 2006 Fertility of frozen-thawed stallion semen

cannot be predicted by the currently used laboratory methods Acta Veterinaria Scandinavica

5 Mann, T & Lutwak-Mann, C., 1981 Male reproductive funtion and semen New York, 193pp 1981

6 Vidament, M., Dupere, A.M., Julienne, P., Evain, A, Noue, P, Palmer, E, 1997 Equine frozen semen

freezability and fertility field results Theriogenology 1997 Oct 15 Horse Institute, National Studs and I.N.R.A 37380 Nouzilly, France

7 Davies Morel M C G, 1999 Equine artificial insemination, New York N.Y, 10016 USA

8 Cochran, J D., Amann, R P., Froman, D P and Pickett, B W, 1984 Effects of centrifugation, glycerol

level, cooling to 50C, freezing rate and thawing rate on the post thaw motility of equine spermatozoa Theriogenology: 1984 July: 22(1):25-38 Animal Reproduction Laboratory Colorado State University Fort Collins, CO 80523 USA

Phụ lục Môi trường ly tâm và môi trường đông lạnh tinh dịch ngựa

* Môi trường ly tâm tinh dịch ngựa trong thí nghiệm

Glucose và bổ sung thêm 95ml nước cất, đồng thời đun sôi cách thuỷ 10 phút sau đó làm nguội

Lòng đỏ trứng gà ml 5 đến 37 0 C và bổ xung thêm 5ml lòng đỏ trứng gà

cho vừa đủ 100ml, đánh tan đều và để tủ ấm ở

370C

* Một số môi trường đông lạnh tinh dịch ngựa trong thí nghiệm