Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp gamma aminobutyric axit từ thực phẩm lên men và ứng dụng trong lên men trên cám gạo

vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..... Giới thiệu chung về Gamma-Aminobutyric Acid Gamma- ế GA A cid 4 carbon, Haynes and William M, 2016... VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PH P TH NGHIỆM 3.1...  Bảo

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

"PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC

CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GAMMA -

AMINOBUTYRIC AXIT TỪ TH C PHẨM L N MEN VÀ ỨNG D NG TRONG L N MEN TR N C M G O"

HÀ NỘI - 2022

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

"PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC

CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GAMMA -

AMINOBUTYRIC AXIT TỪ TH C PHẨM L N MEN VÀ ỨNG D NG TRONG L N MEN TR N C M G O"

Sinh viên thực hiện : Chu Hồ Lan Anh

Kh : K63 MSV : 637103 Giảng viên hướng dẫn : 1 TS Lê Th Minh Th nh : 2 TS Ngu n Th nh Hảo

HÀ NỘI - 2022

LỜI CAM ĐOAN

T ế

ế ủ

T

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2022

Sinh viên thực hiện

Chu Hồ Lan Anh

LỜI CẢM ƠN

ế

ế TS L T ị M T P T G

V – V C ọ

ế ọ

T h TS N T H n Sinh học C ọ Họ N V N

sinh học

T Họ N V N

Họ

T

ủ

M

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2022

Sinh viên thực hiện

Chu Hồ Lan Anh

M C L C

LỜI CAM OAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC ẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC Ồ THỊ vii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

T M TẮT KH A LU N ix

Ph n MỞ Đ U 1

1 1 ặ 1

1 2 Mụ 2

1.3 Y 2

Ph n 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2 1 Tổ G -Aminobutyric Acid 3

2.1.1 G G -Aminobutyric Acid 3

2 1 2 C ủ GA A 4

2 1 3 C ổ GA A 5

2.2 Tổ ẩ L 6

2 2 1 Lị 6

2 2 2 ặ 6

2 2 3 K ủ ẩ 8

2 3 Tổ 10

2 3 1 G ị ủ 10

2 3 2 G ị ọ ủ 11

2 3 3 M GA A 13

Ph n VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PH P TH NGHIỆM 15

3 1 V 15

3 1 1 15

3 1 2 V 15

3.1.3 H ế ị 16

3.1.4 M 16

3 2 N 17

3 2 1 N 1: X ị ặ ọ ủ ủ ẩ

ẩ 17

3 2 2 N 2: N ủ ủ ẩ ế

GA A MSG 17

3 2 3 N 3: N

ị ủ 4 ủ ẩ 17

3 2 4 N 4: ổ GA A

ủ ẩ ọ 18

3 2 5 N 5: ị ủ ẩ ọ 18

3 3 P 18

3 3 1 P ẩ ẩ 18

3 3 2 ủ 19

3 3 3 X ị ặ ủ ủ ẩ lactic 19

3 3 4 P ẩ ị

GABA 21

3 3 5 P 21

3 3 6 P ị ị GA A 22

3 3 7 X ị ị ủ ủ ẩ lactic 24

3 3 8 P ị ẩ 25

3 3 9 P 26

Ph n K T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4 1 P ị ặ ọ ủ ủ ẩ 27

4 2 K MSG GA A ủ ủ 31

4 3 K ị ủ ủ ẩ

ọ 34

4 4 Ả ủ ế GA A 36

4.4 1 H GA A 45oC 36

4 4 2 H GA A 37o C 37

4.5 ị ủ ọ 16S RNA 39

Ph n K T LUẬN VÀ KI N NGH 43

5 1 Kế 43

5 2 K ế ị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 50

DANH M C BẢNG

4 1: ặ ọ ủ ủ ẩ 27

4 2: K ổ GA A ủ ủ ẩ 31

4 3: K ế ị ủ DCI3 5 KC 35

DANH M C HÌNH

H 2 1: C ủ GA A 3

H 2 2: K G GA A G ate decarboxylase 5

H 3 1: ẩ GA A 24

H 4 1: H ẩ ế ủ ủ ẩ DCI3 5 KC4 5 (A- H ẩ ; - Tế G ) 30

H 4 2: P ặ ủ GA A TLC 33

H 4 3: Kế 1 ẩ PCR 16S rRNA 40

H 4 4: C ủ ủ DCI3 5 Neighbor

- Joining 41

H 4 5: C ủ ủ KC4 5 Neighbor - Joining 42

NCBI National center for

biotechnology information

T T

C ọ

Q H K PCR Polymerase Chain Reaction P

Polymerase MRS De Man, Rogosa and Sharpe M MRS

TLC Thin layer chromatography S

) PLP P 5‟- photphat

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

V ẩ ế ế

GA A ụ

ẩ T

25 ủ ẩ 6 ẩ

ị ị ị T Q H G L H N T 25 ủ ẩ ọ

21 25 ủ ổ GA A T ủ DCI3 5

ủ KC4 5 K

ổ GA A GA A 4 474 L

4 4 7 L MRS ổ 2 MSG

ị ủ 2 ủ ẩ

ọ ủ DCI3 5 ủ KC4 5 4 7 ủ VSV ị ẩ 4 – 21 5 K ế 45oC

37oC 24 48 72 45oC ủ KC4 5

GA A 48 ị 3 965 1

T ế 37oC GA A

ủ DCI3 5 24 (3 197 1 ) ế

Ph n MỞ Đ U 1.1 Đặt vấn đề

H p ch t Gamma-aminobutyric acid (GABA) t amino acid

ph c t e b i glutamate ng v t, th c v t

(Ueno et al., 2000) GABA s h ọ i nổi tiế

d n truy n th ế ụng an th n (Pearl et al.,2006)

Ph n 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng qu n về G mm -Aminobutyric Acid

2.1.1 Giới thiệu chung về Gamma-Aminobutyric Acid

Gamma- ế GA A cid 4

carbon,

(Haynes and William M, 2016) N ( 2 1) H

ủ GA A ụ T pha kh GA A ẽ

T ọ

5 K Ở

GA A ẳ

ế

Ở GA A

ẳ

C c

GA A ọ ọ (Majumdar D & Guha S, 1988)

Hình 2 : Cấu trúc phân tử củ GABA

(Nguồn: Internet)

Acid gamma-aminobutyric l t ch t d n truy n th c gi i

ế chuy n tiế ến m t tế N

u t ủa s i trục gọ C GABA trong m C p nh t v i ế n kinh

chế ến m ổ c n thế n

m kh n của tế n kinh GABA

c gi ết v i thụ th , bị ủy b z khe h synap hoặ l u t i trụ c synap b

v n chuy c th t v n chuy n hoặ N

GA A c s n xu t m ế n xu t insulin của tuyến tụ C GA A c s n xu t b ế

GA A ết v ụ th củ o nh c n v ế của tuyến tụ c chế ết glucagon S n t i của tế

GA A ổi tế

N ến m u trị m i cho b nh ti ng

2.1.2 Chức năng của GABA

GA A y chủ yế t ch t

d n truy n th n kinh c chế quan trọ GA A ụ th củ c

n trong h th ng ngo i vi, n i tiế t s i th n kinh, (H R and Schmit

JC, 1993)

N ế u v GA A ụ th của

u ch ng minh r GA A ụng quan trọ i v i s c kh GA A ẩ ổi ch t của tế

b c chế ết

hoocmon vasopressin b n m ch của tủy s ng

N ụng l i ti u, ch ng tr m c ết

ng, gi m huyế r (Leventhal AG et al., 2003; Ueda Y et al 2 7) N t lo i thu c gi u qu c

u trị t quỵ GABA c biế u qu trong vi u chỉnh m t s

r i lo n th nh Parkinson, co gi t Huntington (Manyam BV et

al 1981) A z H GA A ế ủa tế ụng c chế s của tế T c phẩ c phẩ c s dụ n ho ọc (Kim JY et al.,2009)

Hình 2.2: Khử c cbox l h Glut m te th nh GABA bởi Glut m te

GA A

ủ ẩ men,

GA A ổ ủ ế Glutamate Enzyme Glutamate

Decarboxylase (GAD) Pyridoxal phosphate ( ủ

6) ế Q ổ Glutamate ( ) GA A (

ế ) (Petroll OA, 2002; S A 2 7) N GA A

ổ Putrescine (Krantis and Anthony, 2000; Sequerra et al.,

2 7) Diamine oxidease Aldehyd Dehydrogenase

2.2 Tổng qu n về vi khuẩn L ctic

2.2.1 Lịch sử phát hiện

Vi khuẩ L n trong t i

s ng th c ti n củ i Th c phẩ L ( i, s a chua…) c s dụng r c s ến 178

ọ i Thụy i n Scheele m i l c Lactic acid ( c phẩm) t s G n m t thế

kỷ 1857 a chua m c Pasteur ch

do m ẩn ặc bi t gọ ẩ L V 1873

Joseph Lister l n m t lo i vi khuẩ ặ Bacterium Lactic

hi Lactococcus Lactic) ẩn Lactic T nh

m chung v vi khuẩn L : ng vi khuẩn

Vi khuẩ L z

Flavoprotein Enz

ụ ủ H2O2 N ẩ L

ế ặ

ẩ L ẩ C

ặ N n

dinh ủ ẩ L ặ

D ẩ l

( ị ) ị ế ặ

(K H Ả 2 1 ) T ủ ẩ L

:

- V ẩ L ( ):

1 -350 C - Vi ẩ L ( ) ị 450C 2.2.3 Khả năng sinh kháng sinh của vi khuẩn lactic V ẩ L ụ ặ

: ế ế

L ế ế ủ

T ế ế ẩ L

ọ ị ẩ C ủ ẩ

L : Streptococcus, S.cremoris S

ủ ẩ Streptococcus lactic, S.cremoris, Lactococcus casei M ẩ ị ẩ :

Streptococcus citrococcus, S.parcitrovorus V ẩ l ụ

ị

N

ẩ L ế

ẩ G (+) ặ ẩ L ụ

ẩ ụ

C ẩ l ọ

ặ ổ p GABA 2 2 M t s nghiên cứu về khả n ng sinh GABA củ vi khuẩn l ctic H ế ủ ẩ GA A ặ LA

ẩ ẳ

(D 2 12; D 2 14) C ủ GAD

GA A C ế

GA A ụ ế LA ủ Lactobacillus Lactococcus (Li and C 2 1 ) T

GA A ủ LA C ủ L brevis NCL 912 ủ T Q

1 3 7 L GA A ẻ (L

al 2010) M L buchneri WPZ 1

ủ T Q 129 L GA A

ủ ẩ GA A (Z

et al., 2 15) N Y GA A

ụ C glutamicum G 1 L plantarum GB01-21

GA A ế 8 5 L

(Yang et al., 2 15) T GA A

ế L-glutamate M LA

Ý 15 ~ 1 GA A

ụ Kế ủ N H (2 2 )

1 ủ ẩ 1 ẩ 1

ế ặ V c bổ o

i th c th o lu C t th a thu n khoa học r i c kh ến vi ụ ch t

T củ i v i th c phẩm t t cho s c kh nhi u tri n vọ m vi của th c phẩm ch thị ng thế gi i

2 Giá trị dinh d ng của cám gạo

G o ch a 80% carbohydrate, 7-8% protein, 3% ch 3 (Juliano et al 1985) t g o ch 5 12-18 5 u (Saikia

D 2 11) C n h p củ ( ) c t o ra

t s n phẩm phụ g o l t sang g o tr N

m t ngu n cung c t (Mccaskill and

Z 1999) C o chiếm 5-8% tổ c ch t bao g m s t, ph 13 ng 11,5% ch

ng d u t ch a 20% trọ ng trong d u (Oliveira et al.,

z (G W 1994) C a 18–22%

d u bao g m m t lo t ch t sinh họ oryzanols, phytosterol, tocotrienols, squalene, polycosanols, axit phytic, axit

f (A et al 2 6) T z

ng ch t ch o v z

ch 1 n so v i tocopherol, trong khi tocotrienol

4 -60 l n so v i tocopherols (Abdel-Aal and Hucl, 1999) N ỷ l ổ i gi ng (I et al 2 5) i m t s i l n nh c i thi n s c kh i (Gul et al 2 15) ế phẩm t ch t l p th c phẩ ặc bi n th c phẩm ch

2 .2 Giá trị sinh học của m t s hợp ch t thứ c p trong cám gạo

C o ch a 15-22% d ọ ng (Patel and Walker, 2004)

D a 90-96% ch ng 4% ch t

C m 68-71% triglycerid, 2-3% diglycerid, 5-6% monoglycerid, 2-3 do, 2-3% 5-7 3-4% phospholipid (McCaskill and Zhang, 1999) trong

ủa ph γ-oryzanol (Raghuram

R 1995) T γ-oryzanol của d g o l c

n duy nh N ị t ph n

ch (4-hydroxy-3-metoxy cinnamic acid) củ sterol th c v L 24- men c ế 8 γ-oryzanol

T γ-oryzanol của d ị ng

th i b ng s ng hi u su N O z t h p

ch t ch ến vi c gi m cholesterol trong huyế

gi m cholesterol huyết thanh, gi m h p thụ m kết t p ti u c u

O z c s dụ u trị ch i lo

(Y G et al., 1989)

g t v N (38 4 ) (34 4 ) (2 2 ) (21 5 ) (2 9 ) i d (R and R 1991) ếm 90% tổng s ủa d o (Amarasinghe and Gangodavilage, 2004) D u

o (RBO) theo truy n th ụ c s n xu t g C Á

i d u th c v ω-3 ω-6 ặc bi oryzanol

m t s r i lo ( , 2009; Srinivasan et al., 2007) N

f ặn s c t do; ki

s t p h p củ u c u; gi m cholesterol (Kayahara, 2004; Nystrom et al.,

2 7) T u của Uraji et al (2013) b ết h p v i m t enzyme i, FA esterase cho th y kh ng v i m t s

enzyme thủ ủa Streptomyces ng s n xu t

ủ L (2 12) ụ (GAD) ổ ụ MSG

Ph n 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PH P TH NGHIỆM

3.1 Vật liệu nghiên cứu

STT Kí hiệu mẫu Lo i mẫu

- ủ 7 ị (G : Escheria coli ATCC

11105, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; Salmonella typhi ATCC14028;

G : Staphylococcus aureus ATCC 33591; Enterococcus hirae ATCC 10541; Micrococcus Luteus ATCC9341; : Candida albicans ATCC

1 321) ủ T G

V C ọ V H K ọ C

V N

3.1.3 óa ch t và thi t ị nghiên cứu

N P T G

V V C ọ

C ụ : ; N C (T Q ); ; ị ; ( ) A (V N ); KH2PO4; K2HO4; MgSO4; (M );

2 M ọ uẩ sinh

GA A: MRS ến (g/l): P 1 ị 1 5 2

Tween80 1, K2HPO4 2, Sodium acetate 5, Diamonium citrat 2, MgSO4.7H2O 0,2, MnSO4.H2O 0,05, MSG 20, pH 6-6,5

3 M ẩ

+ M H (N ) ( ): ucose 20, peptone 10, KH2PO4, MgSO4 2 A 2 ủ 1 H 6

+ L ( ẩ ) ( ): P 1 5 N C 1

3.2 N i dung nghiên cứu

3.2.1 N i dung : ác định đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic

đ ợc phân lập từ các sản phẩm lên men

- C ỉ :

+ S ặ ủ GA A ị

+ H GA A ị ẩ sung 2% MSG

2 N i dung : Nghiên cứu khả năng kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của chủng vi khuẩn lactic

- X ị ị ủ 2 ủ ẩ

GA A

3.3 Phương ph p nghiên cứu

3.3 Ph ơng pháp phân lập vi khuẩn lactic từ các m u thực phẩm lên men

 Ph ơng pháp thu thập m u và đồng hóa m u:

 Ph ơng pháp phân lập vi khuẩn lactic:

P ẩ ủ Oyetay (2 4) ổ

M ẽ ế ụ

ế 1 -5 T 1

1 -4

, 10-5 MRS A ổ 1 C CO3

 Bảo quản trên môi tr ờng thạch

 ác định đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn

X ị ặ ủ ủ ẩ

ặ : ẩ ế G ( „ f )

Đặc điểm hình th i khuẩn l c v t b o vi khuẩn: C ủ

ẽ ế X1

Đặc điểm hình th i sinh l v sinh h : K ặ ặ

7: S ị F csh 1-2