Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus phù hợp cho lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi

Trong nghiên cứu này sử dụng 14 chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải và bã sắn thu thập tại Công ty cổ phần thực phẩm Minh Dương Hà Nội trong bộ sưu tập chủng giống được lưu trữ tại Trun

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN

BACILLUS PHÙ HỢP CHO LÊN MEN BÃ SẮN

LÀM THỨC ĂN CHĂN NUÔI”

HÀ NỘI - 2022

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

“NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN

BACILLUS PHÙ HỢP CHO LÊN MEN BÃ SẮN

LÀM THỨC ĂN CHĂN NUÔI”

Sinh viên thực hiện : Mai Thùy Linh

Người hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh

HÀ NỘI – 2022

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực và không sao chép kết quả của bất cứ nghiên cứu nào trước đó

Tôi xin cam đoan các tài liệu, thông tin trích dẫn đều đã được ghi rõ nguồn gốc ở phần tài liệu tham khảo

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Sinh viên

Mai Thùy Linh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin chân thành cảm ơn người hướng dẫn, TS Vũ Thị Hạnh Nguyên, cán bộ Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã cho em một

cơ hội tuyệt vời để thực hiện đề tài nghiên này Cảm ơn cô luôn hướng dẫn chỉ bảo tận tình, luôn đưa ra những lời khuyên và chỉ dẫn lúc em gặp khó khăn Nhờ cô mà tôi được tiếp xúc nhiều hơn với những kiến thức thực tế mà trước đó chỉ được học trên sách vở Em cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới PGS TS Phí Quyết Tiến vì đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài này Luận văn được thực hiện nhờ sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài: “Nghiên cứu xử lý bã thải sắn làm thức ăn chăn nuôi bằng chế phẩm sinh học nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường”, Mã số TNMT.2021.553.01, Chủ nhiệm đề tài: TS Vũ Thị Hạnh Nguyên

Em xin chân thành cảm ơn PGS TS Nguyễn Xuân Cảnh thuộc Bộ môn Công nghệ vi sinh, Khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Viêt Nam Thầy đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và viết luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn đến CN Lê Phương Chi, ThS Ngyễn Văn Thế và các cán bộ (Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học) đã giúp đỡ, hỗ trợ kỹ thuật, chia sẻ tài liệu, kinh nghiệm với tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Nông nghiệp Việt Nam và thầy cô trong Học viện đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân và bạn bè

đã ủng hộ và giúp đỡ tôi

Một lần nữa cho phép tôi được cảm ơn về sự giúp đỡ nhiệt tình và quý báu đó

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2022

Sinh viên

Mai Thùy Linh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

TÓM TẮT viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về tình hình sử dụng và chế biến bã sắn trong chăn nuôi 3

1.2 Nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi 5

1.3 Cơ sở khoa học lựa chọn chủng vi khuẩn sử dụng cho lên men bã sắn 7

1.3.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào 7

1.3.3 Khả năng phân giải xyanua 8

1.3.4 Yêu cầu về an toàn đối với vi sinh vật sử dụng trong chăn nuôi 10

1.4 Tình hình sử dụng bã sắn và nghiên cứu lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi 11

1.4.1 Tình hình sử dụng bã sắn và nghiên cứu lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi trên thế giới 11

1.4.2 Tình hình sử dụng bã sắn và nghiên cứu lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam 13

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật 20

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 20

2.1.3 Môi trường nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Giữ giống vi khuẩn 22

2.2.2 Hoạt hóa và nhân giống vi khuẩn 23

2.2.3 Xác định hoạt tính enzyme ngoại bào của vi khuẩn 23

2.2.4 Xác định khả năng phân giải xyanua của vi khuẩn 24

2.2.5 Phương pháp định danh vi khuẩn 25

2.2.6 Phương pháp xử lí số liệu 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Sàng lọc khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn 29

3.1.1 Sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh cellulase 29

3.1.2 Sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh amylase 31

3.1.3 Sàng lọc vi khuẩn có khả năng sinh protease 34

3.2 Khả năng phân giải xyanua của các chủng vi khuẩn 36

3.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của chủng tuyển chọn 39

3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của chủng tuyển chọn 39

3.3.2 Đặc điểm sinh hóa, sinh lí của chủng tuyển chọn 39

3.3.2 Phân loại dựa trên xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng tuyển chọn 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

4.1 Kết luận 46

4.2 Kiến nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHỤ LỤC 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.2: Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.1: Khả năng sinh phân giải CMC của các chủng vi khuẩn 30

Bảng 3.2: Khả năng sinh amylase của các chủng vi khuẩn 32

Bảng 3.3: Khả năng sinh protase của các chủng vi khuẩn 35

Bảng 3.4: Khả năng sử dụng và hiệu suất phân giải xyanua của các chủng vi khuẩn 37

Bảng 3.5: Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nito của chủng vi khuẩn BCH6 40

Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ muối đến sinh trưởng của BCH6 40

Bảng 3.7: So sánh đặc điểm sinh lí, sinh hóa của chủng BCH6 với chủng đối chiếu Bacillus velezensis CBMB205 43

DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ

Hình 2.1: Đồ thị đường chuẩn xyanua 25

Hình 3.1: Đường kính vòng phân giải CMC của một số chủng vi khuẩn 30

Hình 3.2: Khả năng phân giải tinh bột tan của các chủng vi khuẩn 32

Hình 3.3: Hình ảnh vòng phân giải protein của các chủng vi khuẩn 35

Hình 3.4: Sàng lọc sơ cấp các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải xyanua 37

Hình 3.5: Hình ảnh khuẩn lạc và hình ảnh tế bào của chủng BCH6 39

Hình 3.6: Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S Rrna trên gel Agarose 1% 41

Hình 3.7: Cây phát sinh loài dựa theo phương pháp Neighbor-joining về độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA 42

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BOD Biochemical oxygen Demand Nhu cầu oxy sinh hoá

COD Chemical Oxygen Demand Nhu cầu oxy hóa học

CMC Carboxymethyl Cellulosen

FAO Foodand Agriculture Organization

of the United Nations

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc

nông thôn rDNA Deoxyribonucleic acid ribosome

TÓM TẮT

Việt Nam là một trong những nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu lương thực nhưng ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi ở nước ta chưa thực sự phát triển Từ vấn đề đó đã có rất nhiều những nghiên cứu tận dụng phụ phẩm công nông nghiệp làm thức ăn chăn nuôi trong đó có nguồn phụ phẩm từ chế biến lương thực thực phẩm đặc biệt là từ bã sắn Trong nghiên cứu này sử dụng

14 chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải và bã sắn thu thập tại Công ty cổ phần thực phẩm Minh Dương (Hà Nội) trong bộ sưu tập chủng giống được lưu trữ tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, đánh giá khả năng sinh enzyme ngoại bào và phân giải độc tố xyanua Đánh giá khả năng sinh amylase, sàng lọc được 9/14 chủng (chiếm 64,28%), 10/14 chủng (chiếm 71,43%) có khả năng sinh cellulase và 11/14 chủng (chiếm 78,57%) ó khả năng sinh protase Với khả năng phân giải xyanua, sàng lọc được 13/14 chủng (chiếm 92,86%) Trong đó chủng BCH6 có khả năng sinh cả 3 enzyme ngoại bào amylase, cellulase và protase tốt với đường kính vòng phân giải 14,0

± 1,0, 20,33 ± 0,58 và 19,33 ± 1,15, cùng khả năng phân giải xyanua vượt trội được đánh giá thông qua kết quả phân giải 100% NaCN 1,5 mM trong 5 ngày nuôi cấy Sử dụng phương pháp phân loại truyền thống kết hợp với phân tích

trình tự gene 16S rRNA, chủng BCH6 được định danh là chủng Bacillus

velezensis BCH6 Do vậy chủng B velezensis BCH6 có nhiều tiềm năng trong

việc lên men bã sắn ứng dụng sản xuất chế phẩm thức ăn chăn nuôi

MỞ ĐẦU

Việt Nam là một trong những nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu lương thực Tuy nhiên ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi ở nước ta chưa thực sự phát triển Năm 2017, Việt Nam nhập khẩu 1,5 triệu tấn thức ăn chăn nuôi thành phẩm từ nước ngoài, và nhập khẩu 16,3 triệu tấn nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi trong khi nguồn nguyên liệu nội địa chỉ đáp ứng 16,3 triệu tấn, khiến giá thành sản xuất tăng cao và sức cạnh tranh giảm đáng kể (Nguyễn Văn Thế, 2019) Từ vấn đề đó đã có rất nhiều những nghiên cứu tận dụng phụ phẩm công nông nghiệp làm thức ăn chăn nuôi trong đó có nguồn phụ phẩm từ chế biến lương thực thực phẩm đặc biệt là từ bã sắn Vì nhu cầu sử sụng sắn một cách tối đa, dẫn đến lượng bã sắn thải ra trong quá trình chế biến là vô cùng lớn, trung bình khoảng 45% so với tổng khối lượng nguyên củ

Theo ước tính, khoảng 250-300 tấn củ tươi qua chế biến sẽ tạo ra 1,6 tấn bột và thải ra 280 tấn bã có độ ẩm cao (Pandey và cs, 2000) Phần lớn lượng bã sắn này được thải ra ngoài môi trường gây lãng phí và ô nhiễm nghiêm trọng Chỉ một số ít được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, cũng như nhiều phụ phẩm nông nghiệp khác, bã sắn thường có một số hạn chế như hàm lượng protein thấp, hàm lượng carbohydrate như polysaccharide không phải tinh bột (cellulose, hemicellulose, pectin và lignin) không tiêu hóa được và các chất kháng dinh dưỡng như xyanua, tannin và phytate lại tương đối cao (Aro và cs, 2008) Do đó, khi bã sắn được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi sẽ khiến khả năng tiêu hóa của động vật giảm sút dẫn đến giảm năng xuất trong chăn nuôi Theo một số nghiên cứu, trong các mẻ lên men thì hỗn hợp thức ăn có thành phần dinh dưỡng cân đối kết hợp với nước sẽ tạo ra hỗn hợp thức ăn lỏng (Liquid Feed, LF) cho gia súc và không cần sử dụng thêm các loại thức ăn bổ sung (Scholten và cs, 2002) Ưu điểm của quá trình lên men thức ăn này là dễ dàng kiểm soát và giúp cho thức ăn không bị hỏng nhờ quá trình lên men lactic, thời gian lên men không dài và tạo ra loại LF có chất lượng tốt

Nhóm vi sinh vật (VSV) chủ yếu sử dụng trong công nghệ trên gồm nấm

men Saccharomyces cerevisiae, Bacillus spp., Lactobacillus spp Chất lượng của

thức ăn được lên men tự nhiên có thể được cải thiện bằng cách bổ sung các loại

vi khuẩn lactic (Lactobacillus plantarum và Pediococcus spp.), nấm men và vi

sinh vật khác vào môi trường lên men đồng thời giúp giảm pH của thức ăn, tăng lượng axit lactic giúp bảo quản thức ăn (Scholten và cs, 2002)

Chính vì vậy việc chế biến bằng công nghệ lên men có thể chuyển bã sắn thành nguồn thức ăn chăn nuôi có giá trị dinh dưỡng cao, có khả năng cạnh tranh được với các nguyên liệu nhập khẩu là rất cần thiết Xuất phát từ thực tế

đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn phù hợp cho lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi” tại Trung tâm Giống và

Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu

Tuyển chọn được chủng vi khuẩn bacillus có đặc tính sinh học phù hợp

cho lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi

Nội dung nghiên cứu

- Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào (cellulase, amylase, protease)

- Đánh giá khả năng phân giải xyanua của các chủng vi khuẩn tuyển chọn

- Nghiên cứu đặc điểm sinh hóa và phân loại chủng vi khuẩn tuyển chọn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về tình hình sử dụng và chế biến bã sắn trong chăn nuôi

Bã sắn là một trong những chất thải nông nghiệp lớn nhất được tạo ra thông qua quá trình chế biến củ sắn để sử dụng cho con người và công nghiệp

Bã sắn chiếm 20 - 35% trọng lượng của củ (Olanbiwoninu và cs, 2012) Xử lý khoảng 300 tấn củ sắn cho 1,16 tấn bã sắn với độ ẩm 85% (EuisHermiati và cs, 2012) Theo Wongskeo và cs (2012), vỏ sắn là chất thải khô dạng sợi rắn bao gồm 56 - 60% tinh bột, 15 - 18% hemixenlulo, 2 - 3% lignin, 1,5 - 2% protein, 2% pentosan và 0,4 - đường khử 5% là nguồn nguyên liệu sản xuất cồn sinh học hiệu quả Bã sắn có thể dễ dàng bị phân hủy bởi vi sinh vật vì nó rất giàu các chất hữu cơ và hàm lượng tinh bột đóng vai trò là nguồn cacbon trong bã sắn

Bã sắn thường bị loại bỏ và để thối rữa trong môi trường vì hàm lượng xyanua cao và xảy ra phản ứng lên men giữa bã sắn và đất không có tác dụng với cây cối mà còn gây mùi khó chịu Thay vì gây ô nhiễm môi trường, bã sắn có thể được chuyển đổi thành các sản phẩm hữu ích hoặc được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi sau khi xử lý sinh học (Ajao và cs, 2009)

Trong quá trình sản xuất tinh bột sắn, chất thải rắn bao gồm:

vỏ gỗ và vỏ củ, chiếm khoảng 2 - 3% lượng sắn củ tươi, được loại bỏ ngay từ khâu bóc vỏ Loại này có thể được sử dụng làm thức ăn gia súc ở dạng khô hoặc ướt Xơ và bã sắn sau khi đã lọc hết tinh bột Loại chất thải này thường chiếm 15

- 20% lượng sắn tươi, rất dễ gây ô nhiễm môi trường nếu không được xử lý kịp thời Bã sắn có độ ẩm khoảng 75 - 85% và lượng tinh bột trong bã sắn chiếm khoảng 50 - 60% theo khối lượng khô Xơ và bã sắn sau khi trích ly được tách bớt một phần nước trước khi làm thức ăn gia súc Mủ: lượng mủ khô chiếm khoảng 3,5 - 5% khối lượng sắn tươi Bã thải rắn từ ngành sản xuất tinh bột sắn thường được các doanh nghiệp tận dụng làm sản phẩm phụ dưới dạng thức ăn gia súc Tuy nhiên, nguồn thu từ sản phẩm này không đáng kể, cần có các biện pháp sử dụng và quản lý bã thải rắn hiệu quả hơn (Ezekiel và cs, 2012)

Hiện tại bã sắn thải ra do quá trình sản xuất tinh bột được xử lí làm thức

ăn cho động vật Bã sắn sau khi phơi nắng hoặc xấy khô thường được làm thức

ăn cho gia súc, có thể ăn trực tiếp hoặc trộn lẫn với các chất dinh dưỡng khác Phương án này có ít hiệu quả kinh tế vì giá bã sắn phơi khô trên thị trường rất thấp Ngoài ra, phơi khô còn phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, gây mùi hôi và ở chừng mực nào đó có thể bị hư hỏng Hơn thế phơi bã sắn không thể áp dụng cho các cơ sở sản xuất lớn vì lượng bã sắn thải ra hàng ngày là quá lớn

Phương pháp xử lý nước thải tinh bột sắn bằng phương pháp sinh học là

sử dụng các vi sinh vật để phân giải các chất ô nhiễm hữu cơ có trong nước thải Nhờ hoạt động của các vi sinh vật, các chất ô nhiễm được chuyển hóa, nước thải được làm sạch, đảm bảo vệ sinh môi trường Ưu điểm của phương pháp là đơn giản, rẻ tiền dựa trên các nguồn vi sinh vật sẵn có được tuyển chọn và lưu giữ trong nước Hiệu quả xử lý các chất gây ô nhiễm như BOD, COD cao, an toàn với môi trường và sức khỏe cộng đồng Ngoài ra, có thể thu được khí biogas để sản xuất năng lượng tái tạo

Để xử lý nước thải tinh bột sắn, cần tiến hành xử lý kỵ khí để phân giải các chất hữu cơ có trong nước thải Nước thải chế biến tinh bột sắn được chuyển

về bể biogas qua hệ thống ống khép kín Bể biogas có tác dụng phân hủy các chất trong nước thải nhờ các vi sinh vật trong điều kiện không có ôxy Thời gian nước thải lưu trong bể từ 50 - 60 ngày Nước thải sau khi xử lý trong bể bigogas

sẽ được chuyển sang hệ thống xử lý hiếu khí, có lắp đặt hệ thống sục khí, nhằm cung cấp ôxy để sinh vật ôxy hóa các chất hữu cơ còn lại sau quá trình xử lý hiếu khí Sau đó, tiến hành bổ sung chế phẩm vi sinh vật, có thể sử dụng chế phẩm vi sinh vật BIOADB do Viện Môi trường Nông nghiệp đã đăng ký lưu hành với Bộ TN&MT Trộn đều chế phẩm với nước và rỉ đường, với tỷ lệ 500 g chế phẩm, rỉ đường 5 kg, nước sạch 40 - 50 lít xử lý cho 100 m3 nước thải Sử dụng máy bơm trộn đều dịch vi sinh vật và nước thải trong bể biogas, xử lý hiếu khí bằng cách dùng hệ thống khuấy và sục khí để cấp ôxy vào nước Nước thải sau khi xử lý hiếu khí được bơm sang bể lắng nhằm loại bỏ các chất lơ lửng,

sinh khối do vi sinh vật tạo ra và thu hồi bùn Có thể sử dụng vôi bột trong quá trình kết lắng Sau khi lắng bùn, nước thải được dẫn đến hồ sinh học để xử lý nitơ, phốt pho, BOD5, COD, SS Sau khi kiểm tra các thông số đều đạt QCVN 40:2011/BTNMT thì có thể thải ra môi trường (Trần Thu Trang, 2016)

Tái sử dụng nước thải sau chế biến tinh bột sắn: Các cơ sở nên áp dụng cơ chế tái tuần hoàn nước để giảm chi phí sản xuất và nâng cao hiệu quả kinh tế Nước thải thu được trong quá trình rửa sắn chủ yếu là đất, cát Lượng nước này

có độ ô nhiễm không cao nên sẽ được xử lý bằng biện pháp cơ học như để lắng, lọc, tách đất, cát và vỏ sắn Nước sau xử lý được tái sử dụng để rửa sắn nguyên liệu cho các đợt tiếp theo Phần tạp chất loại bỏ có thể thu gom vào về nơi tập trung Đặc biệt, để làm công đoạn này, các cơ sở chế biến tinh bột sắn cần ưu tiên bố trí tách hệ thống luồng nước, bể tích trữ nước sau khi rửa củ sắn

1.2 Nhóm vi sinh vật sử dụng trong lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi

➢ Nhóm vi khuẩn Bacillus

Bacillus là vi khuẩn Gram (+), hình que (rod shape), hiếu khí hoặc kỵ khí

tuỳ tiện, và là vi khuẩn sinh bào tử Rất nhiều chủng Bacillus sp đang được sử

dụng làm chế phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Tính đến thời điểm

hiện tại (2018) có đến hơn 100 loài và dưới loài của chi Bacillus đã được báo cáo Tuy nhiên chỉ có một vài chủng Bacillus sp là được sử dụng phổ biến như

B coagulans, B clausii, B cereus, B velezensis, B subtilis và B Licheniformis

Để có thể phát huy các tác dụng có lợi trên động vật chủ, chủng Bacillus

sp phải sống sót, phát triển và tồn tại trong điều kiện đường ruột Thông thường,

Bacillus sp tồn tại ở cả hai dạng: tế bào sinh dưỡng và bào tử Các tế bào sinh

dưỡng được báo cáo là nhạy cảm với điều kiện axit dạ dày và muối mật, trong khi đó các bào tử tồn tại tốt với cả hai điều kiện trên (Barbosa, 2005) Bernadeau

và cộng sự (2017) so sánh khả năng sống sót của tế bào sinh dưỡng và bào tử

Bacillus chống lại các điều kiện bất lợi của môi trường và điều kiện đường tiêu

hoá Cụ thể, các tế bào sinh dưỡng bị bất hoạt trong điều kiện axit thấp, trong khi đó pH 1 - 5 trong môi trường dạ dày không ảnh hưởng đến bào tử Thêm vào

đó, khi có mặt muối mật ở nồng độ <1 mM, các tế bào sinh dưỡng được báo cáo

là rất nhạy cảm Bào tử không bị ảnh hưởng ở điều kiện này (Bernardeau và cs,

2017) Một số nghiên cứu chỉ ra rằng bào tử Bacillus có thể nảy mầm trong ruột

non và có thể phát huy tác dụng có lợi trên vật chủ thông qua các hoạt động trao đổi chất như tiết ra các chất kháng khuẩn và/hoặc cạnh tranh dinh dưỡng với các

vi khuẩn gây bệnh

Đồng thời Bacillus có khả năng sản sinh ra nhiều enzyme có tác dụng giúp cải thiện tiêu hóa và tăng cường hấp thụ chất dinh dưỡng Các chủng B

subtilis, B licheniformis, B velezensis, B cereus, B thurigiensis … có khả năng

sinh nhiều enzyme như protease, amylase, cellulose, pectinase, glucoamylase, lipase, nuclease, phosphatases, phytase và lynase … trong đó quan trọng nhất là hai enzyme amylase và protease trong hệ thống men tiêu hoá (Elshaghabee,

2017; Latorre, 2016) Một vài chủng Bacillus còn có khả năng đồng hoá một vài

vitamin (riboflavin, cobalamin, inositol) có vai trò quan trọng trong cơ thể sống động thực vật (Elshaghabee, 2017)

Các chế phẩm sinh học hiện nay đều sử dụng rất nhiều chủng Bacillus như Bacillus subtilis, B velezensis, B amyloliquefaciens, B licheniformis, B

megaterium, các chủng khuẩn này đều đạt chuẩn theo Qualified Presumpion of

Safety (QPS) của Tổ chức An toàn Thực phẩm Châu Âu (EFSA) Chế phẩm sinh học làm từ các chủng này hoàn toàn không có độc tính và an toàn khi sử dụng

Đối với vi sinh vật phân giải chất xơ, vi khuẩn thuộc chi Bacillus có hoạt

tính phân giải chất xơ, giàu enzyme thủy phân và có hoạt tính probiotic (Gori và

cs, 2011) Bacullus có vai trò quan trọng trong lên men nhờ khả năng tổng hợp

nhiều sản phẩm thứ cấp đặc biệt như kháng sinh và enzyme Nhờ hệ enzyme

ngoại bào đa dạng như amylase, protase, celulase , nhóm vi khuẩn Bacillus có

thể chuyển hóa các chất như cellulose, tinh bột, protein thành các axit amin và glucose dễ hấp thụ, góp phần cải thiện dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa thức ăn

và giúp vật nuôi tăng trọng nhanh Do vậy, có thể nói khả năng sinh enzyme

thủy phân các hợp chất hữu cơ là một đặc tính rất cần thiết trong việc nghiên

cứu sử dụng Bacillus để tạo chế phẩm tiềm năng trong chăn nuôi

1.3 Cơ sở khoa học lựa chọn chủng vi khuẩn sử dụng cho lên men bã sắn

1.3.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Trong quá trình sinh trưởng, các nhóm vi sinh vật thường sản sinh những

chất có hoạt tính sinh học cần thiết để thích ứng với nhiều hoàn cảnh và điều kiện môi trường sống Ngoài cellulase chúng còn có khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào như protease, amylase, galactosidase, chitinase, glucose,

isomerase, glucanase, lipase, đây một đặc tính nổi bật của các loài Bacillus Trong đó, Bacillus là một trong số các VSV có khả năng sinh protease nhiều nhất, đặc biệt là protease kiềm tính Một số loài Bacillus liên quan đến sản xuất protease như B cereus, B sterothermophilus, B velezensis, B mojavensis, B

megaterium và B subtilis (Shumiet và cs, 2004) So với amylase lấy từ động vật

và vi nấm thì amylase từ Bacillus bền hơn trong môi trường axit của dạ dày

(Gupta và cs, 2003)

Bacillus spp tạo ra một số enzyme ngoại bào có ích, đã được sử dụng

thương mại cho các ngành công nghiệp chất tẩy rửa, dệt may, thực phẩm, thức

ăn chăn nuôi và nước giải khát Các chủng Bacillus spp., có vai trò quan trọng

nhờ khả năng tổng hợp nhiều sản phẩm thứ cấp như kháng sinh, thuốc trừ sâu

sinh học, hóa chất và đặc biệt là enzyme, (Smith và cs, 2000) Bacillus có thể

tiết ra hoạt tính cao của nhiều loại enzyme như protease, lipase, amylase và

cellulase Ví dụ, B amyloliquefaciens là chủng vi khuẩn có lợi, tiềm năng quan

trọng đã được thấy tiết ra cellulase và được áp dụng cho nhiều loại thức ăn của động vật có vú để cải thiện môi trường vi khuẩn đường ruột của chúng Trong số

các VSV sinh α-amylase, Bacillus gần như có số loài lớn nhất Hầu như các loài thuộc chi này đều có thể tìm thấy các chủng sinh α-amylase, ví dụ như B

subtilis, B stearothermophilus, B velezensis, B licheniformis, B amyloliquefaciens, B circulans, B coagulan, B caldoliticus, B acidocodaricus,

B megaterium…, trong đó B subtilis, B stearothermophilus, B licheniformis

và B amyloliquefaciens, được biết đến là những loài sản xuất amylase tốt và

được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thương mại cho các ứng dụng khác nhau (Sundarram và cs, 2014)

Nhiều nghiên cứu khoa học đã khẳng định rằng, nhờ khả năng sinh

enzyme ngoại bào mà các chủng Bacillus spp có thể kiểm soát một số bệnh đường ruột trên động vật Bacillus có khả năng cạnh tranh với các vi khuẩn gây

bệnh qua cơ chế ngăn cản miễn dịch, vị trí bám dính và sản sinh ra chất kháng khuẩn (bacteriocins) hoặc các chất kháng khuẩn giống bacteriocin như lipopeptides có thể tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh (Kivanc và cs, 2014)

Nhờ hệ enzyme ngoại bào đa dạng, nhóm vi khuẩn Bacillus có thể chuyển

hóa các chất như cellulose, tinh bột, protein thành các axit amin và glucose dễ hấp thụ, góp phần cải thiện dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa thức ăn và giúp vật

nuôi tăng trọng nhanh Do vậy khả năng sinh enzyme ngooại bào của Bacillus là

rất cần thiết trong lên men bã sắn để sản xuất thức ăn chăn nuôi

1.3.3 Khả năng phân giải xyanua

Xyanua xuất hiện tự nhiên trong củ sắn, khoai tây giống như củ được trồng ở các nước nhiệt đới dưới dạng xyanogenic glucoside (tiền chất của HCN)

ở các nồng độ khác nhau tùy thuộc vào giống và điều kiện sinh trưởng Xyanua liên kết được chuyển thành xyanua tự do trong quá trình xay xát như gọt vỏ, cắt lát, ép và nghiền Khoảng 70% tổng lượng xyanua có trong nước thải được tạo

ra và 30% nằm trong cặn dạng sợi Ở nồng độ cao, xyanua trở thành chất độc đối với vi sinh vật trong đất và có thể đi qua đất vào các dòng nước ngầm Ngoài bản chất độc hại, xyanua còn được biết đến với tác dụng ức chế trao đổi chất Do

đó, không thể thải các chất thải nhiễm độc xyanua mà không có bất kỳ biện pháp

xử lý thích hợp nào Mức cho phép của xyanua là 0,1 mg/l Về việc loại bỏ xyanua, các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn có khả năng phân hủy và

sử dụng xyanua để phát triển như nguồn cacbon hoặc nitơ Vì xyanua là hợp chất một cacbon, và việc sử dụng các hợp chất của vi sinh vật đã được nghiên cứu rộng rãi vì tầm quan trọng về mặt khoa học và công nghiệp của chúng

(Kosaric và cs, 1974) Sự phân hủy của vi sinh vật đối với xyanua, xyanate và thiocyanat ở quy mô phòng thí nghiệm và việc sử dụng xyanua được cải thiện bằng cách bổ sung dextrose vào đầu vào (Ludzack và cs, 1960) Có tới 60 mg xyanua trên một lít nước thải đầu ra đã bị phân hủy hoàn toàn, với sự thu hồi nitơ xyanua dưới dạng amoniac và nitrat cộng với nitrit

Quá trình xử lý sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật cần thiết cho quá trình xử lý (Akcil, 2003) Người ta đã phát hiện ra rằng xyanua xuất hiện tự nhiên trong môi trường thông qua sự phân hủy glycoside cyanogenic thực vật Rất nhiều vi sinh vật có thể giải độc các dạng

đơn giản của xyanua (Gadd, 2001) Pseudomonas fluorescens NCIMB 11764 đã

được báo cáo là có thể sử dụng kali xyanua (KCN) trong nuôi cấy theo mẻ

(Kunzet và cs, 1998) Pseudomonas huỳnh quang cũng đã được báo cáo là làm phân hủy ferrocyanide (Arzu và cs, 2000) Sự phát triển của Pseudomonas

fluorescens NCIMB 11764 trên môi trường chứa kali xyanua (KCN) cũng đã

được báo cáo (Kunzet, 1998) Sự phân hủy xyanua bởi các loài E coli, A

lcaligenes, A cinetobacter và Bacillus cũng đã được báo cáo trong một số

nghiên cứu

Người ta đã báo cáo rằng các chủng vi khuẩn từ chi Klebsiella rất hiệu quả trong việc xử lý sinh học xyanua và thiocyanat K oxytoca được phân lập từ

chất thải công nghiệp có chứa hàm lượng xyanua cao sinh sôi tốt với xyanua là

nguồn nitơ duy nhất (Kao, 2003), cụ thể là chủng K oxytoca có hiệu quả trong

việc phân hủy sinh học ngay cả ở nồng độ xyanua cao hơn 1 mM (Chenaet, 1999) Vi sinh vật phân hủy sinh học xyanua thành các sản phẩm không độc hại bằng cách sử dụng xyanua làm nguồn nitơ duy nhất theo phương pháp hiếu khí hoặc kỵ khí (Kaoet, 2003; Stephen, 2004) Bảy chủng vi khuẩn được phân lập từ môi trường mỏ vàng ở Hàn Quốc đã được phát hiện là có hiệu quả trong quá trình phân hủy sinh học của thiocyanat với nồng độ ban đầu là 150 mg/L trong

vòng 16 ngày sau khi ủ (Lee, 2003) Bốn chủng từ chi Bacillus, hai chủng

Corynebacterium nitrophilus và Brevi bacterium đã được tìm thấy để khử

xyanua một cách hiệu quả

Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 là một dòng vi khuẩn

alkaliphilic được báo cáo là có khả năng phân hủy sinh học xyanua Sinh vật được phân lập từ bùn của Guadalquivir (Cordoba, Tây Ban Nha) Nó sinh sôi nảy nở ở độ pH tối ưu là 9,5 và sử dụng 2 mM xyanua làm nguồn hydro duy nhất (Luque-Almagroet, 2005; Huertaset, 2010) Sinh vật cũng có thể sử dụng phức hợp xyano-kim loại, xyanate và cặn từ đồ kim hoàn như nguồn nitơ duy nhất (Luque-Almagroet, 2005)

Quy trình khử độc xyanua, chẳng hạn như phơi nắng và ủ chua, đã được

sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi Lên men sử dụng vi sinh vật như

Saccharomyces cerevisiae và Aspergillus niger để cải thiện hàm lượng protein

trong thức ăn chăn nuôi

1.3.4 Yêu cầu về an toàn đối với vi sinh vật sử dụng trong chăn nuôi

Theo hướng dẫn số 90/679/EWG của Cộng đồng Châu Âu về an toàn sinh học, nhóm tác nhân sinh học vi sinh vật được phân làm 4 cấp độ an toàn, trong

đó chỉ các VSV ở cấp độ 1 và 2 được ứng dụng trong sản xuất Các loài thuộc

Bacillus bài tiết các enzyme thủy phân có khả năng phá vỡ vách tế bào, sinh

tổng hợp một loạt các loại thuốc kháng sinh như iturin, surfactin (Akiyama và

cs, 2001), fengycin (Phister và cs, 2004), bacillomycin và mycosubtilin (Ramarathnam và cs, 2007) Về tính an toàn đối với vi sinh vật sử dụng trong chăn nôi: Các chủng probiotic sử dụng cho động vật thủy sản được sử dụng hiện

nay chủ yếu là các chủng L acidophilus, B subtilis, S cerevisiae, dùng bổ sung

vào thức ăn Mingmongkolchai và cộng sự (2017) đánh giá tính an toàn của

chủng Bacillus CM40 (B subtilis) có khả năng sinh bào tử ứng dụng làm thức

ăn chăn nuôi Các kết qủa thu được cho thấy, chủng CM40 không gây độc trên hai dòng tế bào HT-29 và Caco-2 (các dòng tế bào đường ruột ở con người); không có hoạt tính làm tan huyết, không mang gen enterotoxin hoặc độc tố di truyền và nhạy cảm với mười loại kháng sinh, bao gồm sáu loại kháng sinh

chính (chloramphenicol, erythrom gentamicin, tetracycline, streptomycin và kanamycin) Đồng thời, chủng CM40 còn có tác dụng giảm 30-48% sự phát

triển của các vi khuẩn gây bệnh đường ruột (Salmonella typhi, Salmonella

enteritidis 1781 và Escherichia coli)

1.4 Tình hình sử dụng bã sắn và nghiên cứu lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi

1.4.1 Tình hình sử dụng bã sắn và nghiên cứu lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi trên thế giới

Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp (FAO) , thế giới sản xuất khoảng 303,6 triệu tấn sắn củ vào năm 2019, trong đó châu Phi là nhà sản xuất lớn nhất (~ 192 triệu tấn), tiếp theo là châu Á (~ 85 triệu tấn) và Latinh Mỹ (~

26 triệu tấn), trong đó Brazil sản xuất khoảng 17 triệu tấn Cây trồng này cũng được xếp hạng thứ năm trên toàn cầu, là nguồn cung cấp tinh bột được sử dụng rộng rãi nhất và thứ ba trong số các loại cây lương thực được tiêu thụ ở các vùng nhiệt đới (Garcia và cs, 2020) Chế biến sắn tiêu tốn nhiều năng lượng cũng như tiêu tốn nhiều nước (Garcia và cs, 2020) và đòi hỏi nhiều công đoạn, gọt vỏ, bào, ép, rửa tạo ra một lượng lớn chất thải (cặn rắn và nước thải lỏng) Trong

số các chất rắn còn lại chính là vỏ bã, thân và lá, thân cây có thể được để lại với mục đích nhân giống cây trồng, bã vở và lá được dùng trực tiếp hoặc ủ chua làm thức ăn cho gia súc (Sánchez và cs, 2017) Nước thải từ sắn (CW), còn được gọi

là “sportsueira” Ở Brazil, sắn được sản xuất với số lượng lớn, ít nhất 600 L CW

được tạo ra trên mỗi tấn củ đã qua xử lý (Carvalho và cs, 2017), và nó có hại

cho môi trường khi chứa một lượng chất hữu cơ đáng kể (Peres và cs, 2019)

Ngoài các chất ô nhiễm hữu cơ, CW cũng có độc tính do một glycoside tên là linamarin tồn tại trong tất cả các bộ phận của cây (Sánchez và cs, 2017) Linamarin phản ứng khi các tế bào sắn bị phân hủy cơ học trong quá trình thu hoạch, chế biến và giải phóng xyanua có thể gây ra nhiều vấn đề sức

khỏe cho những người tiếp xúc (Fukushima và cs, 2016) Tuy nhiên, các tài liệu cho

thấy hàm lượng độc tính của bã sắn thay đổi tùy thuộc vào độ cao, vị trí địa lý, thời gian thu hoạch, giống cây trồng và điều kiện theo mùa (Ndam và cs, 2019)

Ở đông bắc Brazil, chế biến sắn thường được thực hiện trong các cơ sở nhỏ, những cơ sở này thường thải ra nước thải gần đó mà không qua bất kỳ xử

lý nào Tuy nhiên, khi một lượng lớn các chất ô nhiễm này được thải ra ngoài,

nó sẽ gây ra các vấn đề môi trường nghiêm trọng như ô nhiễm đất, mùi khó chịu, vật trung gian truyền bệnh và ô nhiễm nước khi trôi ra đường nước, dẫn đến ngộ độc và chết cá và các động vật thủy sinh khác (Peres và cs, 2019) Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng những bã sắn này có thể được chuyển hóa sinh học thành nhiều sản phẩm có giá trị cao hơn, nhằm mục đích tối đa hóa việc sử dụng nguồn sinh học (Zhang và cs, 2016)

Chẳng hạn theo Versino và cộng sự (2019) đã phát triển một loại phân bón thải ra có kiểm soát sử dụng nguyên liệu hỗn hợp tinh bột sắn và bã mía cho các ứng dụng nông nghiệp

Hơn nữa bã sắn còn là nguồn thức ăn lí tưởng trong chăn nuôi

Theo Limon, 1992; Kayouli và cộng sự (2000) ủ chua là phương pháp thích hợp để bảo quản lá sắn làm thức ăn chăn nuôi trong mùa khô

Marjuki và cộng sự (2008), Malawi IITA (2004) đã báo cáo việc đưa bã sắn vào ủ chua cho nông dân nhỏ ở Indonesia nhưng việc sử dụng bã sắn làm thức ăn cho gia súc chưa phổ biến ở Nigeria

Oboh (2006) đã báo cáo sự giảm hàm lượng phytate trong vỏ sắn lên men (705,1 - 789,7 mg/100 g) và sự giảm này nhiều hơn ở vỏ sắn được lên men bằng nước thải từ bã sắn lên men tự nhiên (705,13 mg/100 g), trong khi vỏ sắn chưa lên men có hàm lượng phytate là 1043,56 mg/100 g Sự giảm sút như vậy có thể

là kết quả của việc các vi sinh vật trong nước thải có thể tiết ra enzyme phytase Enzyme này có khả năng thủy phân phytate do đó làm giảm hàm lượng phytate trong vỏ sắn lên men (Oboh và cs, 2003)

Từ kết quả của tất cả các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cho đến nay

đã báo cáo về việc ứng dụng vỏ sắn làm chất nền hoặc đơn lẻ hoặc khi trộn với

các chất thải nông nghiệp khác trong sản xuất khí sinh học, có thể thấy rõ ràng rằng sản xuất khí sinh học từ vỏ sắn không phải là khả thi về mặt thương mại, và không thể đóng góp vào sự bền vững môi trường Tuy nhiên, ứng dụng vỏ sắn truyền thống làm chất bổ sung cho động vật có thể đóng góp theo cách riêng của

nó đối với việc quản lý hiệu quả chất thải này (Smah và cs., 2020) Một đóng góp khác, tuy nhiên, không phải ở quy mô lớn cũng cho thấy nhiều hứa hẹn là quá trình lên men vỏ sắn trong điều kiện yếm khí để sản xuất phân bón sinh học (Ogbo, 2010; Okolie và cs., 2018)

1.4.2 Tình hình sử dụng bã sắn và nghiên cứu lên men bã sắn làm thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam

Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực, thức ăn gia súc quan trọng sau lúa và ngô Theo số liệu thống kê năm 2010, tổng diện tích sắn trên cả nước là 496.200 hecta, sản lượng đạt hơn 8,5 triệu tấn Sắn dễ trồng, phù hợp với nhiều loại đất, vốn đầu tư thấp, phù hợp với khả năng kinh tế của nhiều hộ gia đình nông dân nghèo, thiếu lao động Các sản phẩm từ cây sắn bao gồm củ, thân, lá đều được

có thể sử dụng được, củ sắn dùng để chế biến tinh bột sắn, sắn lát phơi khô, bột sắn nghiền hoặc dùng để ăn tươi Từ sắn củ tươi hoặc từ các sản phẩm sắn sơ chế tạo thành hàng loạt các sản phẩm công nghiệp như bột ngọt, rượu cồn, mì ăn liền, Một loại phụ phẩm từ củ sắn sau khi chế biến là bã sắn, đây là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất tinh bột của các nhà máy chế biến tinh bột sắn, chiếm khoảng 45% so với khối lượng sắn nguyên củ Theo Bùi Quang Tuấn (2005), trong bã sắn chứa khoảng 8% tinh bột, 15-20% là xơ thô

Ở Việt Nam hiện nay bã sắn chủ yếu được sử dụng để sản xuất thức ăn cho động vật nhai lại và sản xuất thức ăn chăn nuôi có giá trị cao từ bã sắn Theo

bộ NN&PTNT, hiện nay ở Việt nam có trên 60 nhà máy tinh bột sắn với tổng công suất khoảng 38 triệu tấn củ tươi/năm Theo ước tính, một nhà máy chế biến tinh bột sắn có công suất 30-100 tấn/ngày sẽ sản xuất được 7,5-25 tấn tinh bột, kèm theo đó là 12-48 tấn bã gồm hai loại: Loại thứ nhất là bã thải do quá trình rửa và bóc vỏ gỗ chiếm tỉ trọng ít và thành phần chủ yếu là cellulose,

hemicellulose và cát, sạn Loại này thường được chôn lấp hợp vệ sinh hoặc dùng làm phân bón Loại thứ hai là phần bã còn lại sau khi tách tinh bột sắn được gọi

là bã sắn Điều này tương đương với khoảng 3,8-5,4 triệu tấn chất thải rắn mỗi năm Điều đó đã khiến cho rất nhiều người dân sống quanh khu vực các nhà máy sản xuất chế biến tinh bột sắn cảm thấy bức xúc vì vấn đề ô nhiễm môi trường Đứng đầu cả nước về số lượng nhà máy chế biến sắn và tinh bột sắn là Tây Ninh, với 74 nhà máy chế biến bột sắn (có 50 công ty, doanh nghiệp và 24

cơ sở nhỏ) Hiện các nhà quản lý đang đau đầu giải quyết nạn ô nhiễm môi trường do các nhà máy này gây ra Đáng lo nhất, có nhà máy, cơ sở xen lẫn trong khu dân cư, đô thị, gần sông suối không có hệ thống xử lý nước thải đạt chuẩn ảnh hưởng rất lớn đến nguồn nước và môi trường

Theo thống kê tỉnh Quảng Bình năm 2017, hai nhà máy chế biến tinh bột sắn đang hoạt động ngoài việc tiêu thụ nguyên liệu trong tỉnh nhập thêm từ các tỉnh khác dẫn đến lượng bã sắn tươi tạo ra khoảng 50.000 – 60.000 tấn/năm Tại Lào Cai, nhà máy chế biến tinh bột sắn Tân An có công suất 250 tấn sản phẩm/ngày, ngay từ khi bắt đầu hoạt động (tháng 1-2006) đã gây ô nhiễm không khí nghiêm trọng Hệ thống bể chứa của nhà máy chứa hàng chục m3 bã thải, bốc mùi khó chịu cho toàn vùng với bán kính ảnh hưởng 2-4 km, ngay cả lúc nhà máy không hoạt động Tại tỉnh Yên Bái, nhà máy chế biến sắn Vũ Linh tại huyện Yên Bình hoạt động từ năm 2004, và 3 nhà máy sản xuất tinh bột sắn tư nhân khác có tổng công suất lên đến hàng trăm tấn mỗi ngày gây tình trạng ô nhiễm nặng và bốc mùi hôi nồng nặc Ở xã Thanh Hà (Thanh Ba, Phú Thọ), nơi

có nhà máy chế biến sắn của Công ty TNHH Toàn Năng, từ khi nhà máy chế biến sắn hoạt động, hàng nghìn hộ dân xung quanh phải chịu mùi hôi nồng nặc bốc ra từ nhà máy, đặc biệt là ruồi và muỗi xuất hiện dầy đặc Mùi hôi bốc ra từ nhà máy không chỉ ảnh hưởng riêng xã Thanh Hà, mà còn lan sang các xã lân cận như Xuân Cang (cách nhà máy 3-4 km) hay vùng ven thị xã Phú Thọ

Hiện nay, bã sắn sấy khô có thể được bán cho các công ty sản xuất thức

ăn gia súc với giá rất thấp và không ổn định (Hiệp hội Sắn Việt Nam) Giá bã

sắn tươi và bã sắn khô lần lượt vào khoảng 50-200 đồng/kg và 2.000-3.000 đồng/kg Bã sắn tươi thường được sấy khô bằng ánh nắng mặt trời hoặc máy sấy đến độ ẩm 10-13% Sau khi sấy, bã sắn được sử dụng để sản xuất thức ăn chăn

nuôi (Từ Việt Phú và cs, 2016) Sấy nắng truyền thống rất chậm và không hiệu

quả, thông thường sẽ mất từ 3 đến 5 ngày để làm khô một mẻ tùy theo điều kiện thời tiết; hơn nữa việc phơi khô ngoài trời sẽ tốn diện tích lớn đồng thời gây ô nhiễm không khí nghiêm trọng Ngoài ra, việc vận chuyển bã sắn khô là bất tiện

do khối lượng cao và ô nhiễm không khí nghiêm trọng do phát sinh bụi trong quá trình tải và dỡ bã sắn Nhằm giải quyết tình trạng ô nhiễm nói trên, từ cuối năm 2000, các nhà khoa học thuộc Phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới, đã quyết định sản xuất acid citric bằng cách nuôi một số chủng nấm mốc có lợi trên bã khoai mì Acid citric được cho vào nước giải khát và thực phẩm chế biến Tuy nhiên là giá thành sản xuất quá cao, không thể cạnh tranh với sản phẩm cùng loại của Trung Quốc Do chứa hàm lượng chất hữu cơ cao nên bã thải sắn thường được sử dụng làm phân bón hữu cơ cho cây trồng Tuy nhiên, nếu bón trực tiếp thì không mang lại hiệu quả cao, lại gây mùi hôi khó chịu nên một số nghiên cứu hiện đang tìm cách tái chế nguồn bã thải sau chế biến tinh bột sắn thành phân bón hữu cơ bằng cách sử dụng vi sinh vật Tuy nhiên, do chứa tinh bột hàm lựơng nước cao, quá trình xay bã sắn rất không hiệu quả và không kinh tế Ép hoặc gia nhiệt khổ bã này khó do tinh bột và nước tương tác ở nhiệt độ cao bã sắn ướt hoặc sảy không triệt để, trong điều kiên thuận lợi về nhiệt độ, vi sinh vật phát triển rất nhanh, gây hỏng bã sản, ảnh hưởng đến môi trường và chất lượng nước khu vực lân cận Quá trình ủ có thể thực hiện trong 35-40 ngày, do thời gian ủ dài và chi phí vận chuyển cao nên việc dùng bã sắn làm phân bón hữu cơ chi giới hạn ở khu vực gần nhà máy chế biến Các nghiên cứu về xử lý bà sẵn cho mục tiêu thức ăn gia súc, bao gồm sấy khô, ủ chua lên men lactic, làm phân bón

đã được rất nhiều tác giả nghiên cứu và công bố Bùi Quang Tuấn (2005) đã nghiên cửu ủ chua bã sắn làm thức ăn gia súc như một hình thức bảo quản Tuy nhiên, bã sẵn dùng làm thức ăn gia súc được đánh giá là không có chất lương

cao, do vậy ti lệ thu hồi giá tri của bã sản rất thấp, việc ủ chua phụ thuộc nhiều vào thời tiết, mùa thu hoạch mà chế biến sắn thường vào mùa mưa nên gặp nhiều khó khăn (Đặng Thị Thu, 1995; Nguyễn Hữu Văn và cs, 2008) Để cải thiện giá trị dinh dưỡng của bã sắn, nhiều nhóm nghiên cứu đã nuôi các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp hệ enzyme trên bã, đồng thời thu nhận chế phẩm bao gồm

cả sinh khối vi sinh vật, nâng hàm lượng protin của chế phẩm đồng thời nâng cao khá năng hấp thụ cho sản phẩm

Năm 2002, Lê Thị Bích Phượng và các cộng sự đã sản xuất thành công hai loại sản phẩm lên men từ bã khoai mì sống: ProBio-S và Bio-E Do cả hai chế phẩm trên đều có mùi thơm thơm, đặc trưng cho quá trình lên men, nên rất hấp dẫn vật nuôi Kết quả thử nghiệm sơ bộ trên 15-20 con lợn 1 tháng tuổi cho thấy sau ba tháng, lợn tăng trọng nhanh hơn 1,1-1,3kg so với những con đối chứng (chỉ

ăn thức ăn bình thường)

Năm 2018, việc sản xuất thử nghiệm thức ăn chăn nuôi được thực hiện trong khuôn viên của Nhà máy chế biến tinh bột Long Giang Thịnh, trên cơ sở nhà xưởng, máy móc thiết bị, nguồn nguyên liệu sẵn có của Công ty và quy trình công nghệ được Viện Công nghệ sinh học chuyển giao Sau 15 tháng triển khai thực hiện, Đề tài đã sản xuất được 150 tấn thức ăn dạng ướt với 78 lần lên men; thời gian ủ lên men mỗi khối ủ từ 05 - 07 ngày để đảm bảo quá trình lên men và độ pH

ổn định Thức ăn bã sắn sau khi lên men có chất lượng cao hơn hẳn so với bã sắn tươi; tỷ lệ protein thô, mật độ các lợi khuẩn và nồng độ acid hữu cơ tăng mạnh;

hàm lượng xơ giảm mạnh, không phát hiện các độc tố HCN, vi khuẩn E coli,

Samonella, Aflatoxine Kết quả bước đầu khi cho bò, lợn thịt ăn bã sắn lên men

cho thấy các đối tượng này thích ăn, giảm triệu chứng bệnh về đường ruột, giảm mùi hôi của phân, tăng khả năng tăng trọng

Gần đây, một số nghiên cứu đã thành công trong việc sản xuất viên bột sắn bằng cách thêm một lượng nhỏ tinh bột sắn khô vào bã sắn tươi sau đó ép viên và sấy khô để làm thức ăn chăn nuôi (Bùi Tuấn Anh và cs, 2018) Về cơ bản, quy trình này giải quyết vấn đề xử lý và sử dụng bã sắn dễ dàng hơn cho

quá trình sấy, vận chuyển và nó giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm không khí Tuy nhiên, độ bền của các viên thấp, tỷ lệ vỡ của viên khô được ước tính khoảng 50% Do đó, các viên không đáp ứng các yêu cầu của ngành công nghiệp thức

ăn chăn nuôi Các nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng ứng dụng công nghệ lên men để sản xuất thức ăn chăn nuôi từ bã sắn có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển ngành chăn nuôi, đồng thời góp phần khắc phục tình trạng ô nhiễm môi trường do bã thải từ quá trình chế biến tinh bột sắn Hiện nay, bã sắn sấy khô có thể được bán cho các công ty sản xuất thức ăn gia súc với giá rất thấp và không

ổn định (Hiệp hội Sắn Việt Nam) Giá bã sắn tươi và bã sắn khô lần lượt vào khoảng 50-200 đồng/kg và 2.000-3.000 đồng/kg Bã sắn tươi thường được sấy khô bằng ánh nắng mặt trời hoặc máy sấy đến độ ẩm 10-13% Sau khi sấy, bã

sắn được sử dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi (Tu và cs, 2016) Sấy nắng

truyền thống rất chậm và không hiệu quả, thông thường sẽ mất từ 3 đến 5 ngày

để làm khô một mẻ tùy theo điều kiện thời tiết; hơn nữa việc phơi khô ngoài trời

sẽ tốn diện tích lớn đồng thời gây ô nhiễm không khí nghiêm trọng Ngoài ra, việc vận chuyển bã sắn khô là bất tiện do khối lượng cao và ô nhiễm không khí nghiêm trọng do phát sinh bụi trong quá trình tải và dỡ bã sắn

Theo nhóm tác giả Bùi Văn Chính, Lê Viết Ly, (2000) khi chế biến sắn bằng phương pháp ủ chua đã làm giảm rõ rệt hàm lượng độc tố Nếu lá sắn tươi hàm lượng HCN là 862,5 mg/kg vật chất khô thì ủ chua chỉ còn 32,5 mg/kg vật chất khô; bột khô chỉ còn có 90,2 mg/kg vật chất khô Theo quy định của Cộng đồng Châu Âu (EC) thì hỗn hợp cho gia súc chỉ được phép chứa thấp hơn 60 mg HCN Như vậy, chứng tỏ phương pháp ủ chua đã làm lượng HCN giảm mạnh

Theo các tác giả Mai Thị Thơm và Bùi Quang Tuấn (2006) khi sử dụng khẩu phần có 10kg bã sắn ủ chua và 0,75 kg cám đỗ xanh để vỗ béo bò thịt đã cho tăng trọng tương đối cao 656,0 - 682,2 g/con/ngày so với lô đối chứng là 728,9g/con/ngày với khẩu phần thí nghiệm có thức ăn tinh

Theo Nguyễn Hữu Văn và cs (2008) khi nghiên cứu ủ chua bã sắn để làm thức ăn cho gia súc nhai lại thì ủ với công thức 0,5% muối + 3% rỉ mật, hoặc

0,5% muối + 3% cám gạo có thể bảo quản bã sắn và làm giảm đáng kể hàm lượng HCN sau 21 ngày ủ nên có thể sử dụng một lượng lớn bã sắn ủ trong khẩu phần mà không gây độc Tuy nhiên, theo các tác giả do bã sắn tươi có hàm lượng protein thô rất thấp nhưng có giá trị năng lượng tương đối cao, vì vậy khi

sử dụng làm thức ăn cho gia súc nhai lại cần thiết phải bổ sung nguồn thức ăn giàu protein để cân đối năng lượng và protein cho nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật dạ cỏ và cho sản xuất

Theo các tác giả Nguyễn Hải Quân, Nguyễn Xuân Bả (2008) khi nghiên cứu về mức bổ sung bã sắn ủ chua với khẩu phần giàu xơ, nghèo dinh dưỡng là rơm lúa thì mức bổ sung không nên vượt quá 40% so với tổng chất khô khẩu phần, và việc bổ sung các loại thức ăn giàu protein thực trong khẩu phần là rất cần thiết để đảm bảo khả năng tiêu hóa thức ăn và môi trường trong dạ cỏ

Theo các tác giả Phạm Sỹ Tiệp, 1999, Bùi Văn Chính và Lê Viết Ly,

2001, phương pháp băm nhỏ, phơi khô hoặc sấy khô rồi nghiền thành bột là một biện pháp chế biến để có thể bảo quản, dự trữ và làm giảm hàm lượng độc tố trong lá sắn rất tốt, hơn nữa có thế thực hiện với một khối lượng lá sắn khá lớn

Ủ chua lá sắn để dự trữ và bảo quản cũng cho kết quả tốt, theo tác giả Bùi Văn Chính, 1995 khi thí nghiệm ủ chua lá sắn thì hàm lượng HCN chỉ còn 32,5 ppm trong vật chất khô

Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Trịnh Văn Trung và cs, 2007 khi nghiên cứu bổ sung mức 0,5, 1,0 và 1,5 kg/con/ngày bột lá sắn trong khẩu phần

ăn của trâu tơ là cỏ xanh và rơm ủ urê nuôi trong vụ đông xuân đã cho kết quả là mức tăng trọng của trâu tăng dần theo khối lượng bột sắn bổ sung trong khẩu phần, tương ứng là 594 g/con/ngày, 589 g/con/ngày, 444 g/con/ngày và thấp nhất là lô đối chứng 389 g/con/ngày Và để đạt hiệu quả kinh tế cao nhất các tác giả cũng khuyến cáo nên bổ sung bột lá sắn ở mức 1kg/con/ngày tương ứng với 17% vật chất khô trong khẩu phần là phù hợp Theo tác giả Vũ Văn Tý, 2002 khi sử dụng lá sắn ủ chua để vỗ béo trâu tơ với mức bổ sung là 1,4; 2,8; 4,2 kg/con/ngày trong khẩu phần ăn là rơm khô và cỏ hỗn hợp thì có mức tăng trọng

tương ứng sau 90 ngày là 34,42 kg/con; 42,58 kg/con và 45,75 kg/con còn ở lô đối chứng là 27,33 kg/con Kết quả vỗ béo trên đàn trâu già với mức bổ sung là

3 và 5,5 kg/con/ngày cho khối lượng tăng là 36,5 kg/con và 39,0kg/con, ở lô đối chứng là 29,0 kg/con

Như vậy, việc sử dụng phụ phẩm từ sắn trong chăn nuôi gia súc sẽ tận dụng được nguồn thức ăn sẵn có, rẻ tiền ở địa phương, góp phần giải quyết vấn

đề cạnh tranh nguồn thức ăn giàu protein để cung cấp cho gia súc, nâng cao hiệu

quả kinh tế cho người chăn nuôi nhất là các hộ nông dân

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật

Tổng số 14 chủng vi khuẩn phân lập từ nước thải và bã sắn thu thập tại Công ty cổ phần thực phẩm Minh Dương (Hà Nội) và 03 chủng vi sinh vật kiểm định được lưu giữ trong bộ sưu tập chủng giống vi sinh vật tại Trung tâm Giống

và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, gồm:

- Gram âm (2): Escherichia coli ATCC 11105; Salmonella enterica

Bảng 2.1: Các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị Nguồn gốc STT Tên thiết bị Nguồn gốc

1 Máy li tâm Biofuge Fresco,

Kendro, Đức 12 Máy điện di Nhật bản

2 Máy vontel Đức 13 Máy PCR BIO-RAD, Mỹ

3 Máy lắc ổn nhiệt BSI-25R CPT, Mỹ 14 Máy đo OD Hitachi, Nhật Bản

4 Nồi khử trùng

sạch

ALP MC-40DP, Nhật Bản

15 Đĩa petri Việt Nam

5 Lò vi sóng Sharp, Nhật Bản 16 Bình thủy tinh Việt Nam

6 Kính hiển vi Carson, Mỹ 17 Pipette Gilson, Pháp

7 Tủ nuôi Esco, Singapore 18 ống nghiệm Việt Nam

8 Box vô trùng Esco, Autralia 19 Dụng cụ đong Việt Nam

9 Máy đo pH Trung Quốc 20 Lam kính Việt Nam

10 Máy điện di Nhật bản 21 Lam men Việt Nam

11 Máy PCR BIO-RAD, Mỹ 22 Eppendorf Biologix, Mỹ

Và một số thiết bị, dụng cụ khác sử dụng trong phòng thí nghiệm

Bảng 2.2: Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên hóa chất Xuất xứ STT Tên hóa chất Xuất xứ

1 Casein Sigma Aldrich, Mỹ 19 D-mannitol Sigma Aldrich, Mỹ

2 Carboxymethyl

Cellulosen (CMC) Sigma Aldrich, Mỹ 20 Myo-inositol Sigma Aldrich, Mỹ

3 Cao nấm men Ấn độ 21 D-saccarose Sigma Aldrich, Mỹ

4 Cao thịt Ấn độ 22 D-fructose Sigma Aldrich, Mỹ

5 Tinh bột tan Việt Nam 23 D-galactose Sigma Aldrich, Mỹ

6 Thạch Việt Nam 24 α-lactose Sigma Aldrich, Mỹ

7 NaCl Trung Quốc 25 D-sorbitol Sigma Aldrich, Mỹ

8 MgSO 4 Trung Quốc 26 D-trehalose Sigma Aldrich, Mỹ

9 KH 2 PO 4 Sigma Aldrich, Mỹ 27 L-arginine Sigma Aldrich, Mỹ

10 K 2 HPO 4 Trung Quốc 28 L-lysine Sigma Aldrich, Mỹ

11 Na2HPO4 Trung Quốc 29 L-methionine Sigma Aldrich, Mỹ

12 NH4Cl Sigma Aldrich, Mỹ 30 L-leucine Sigma Aldrich, Mỹ

13 CaCl2 Trung Quốc 31 L-tryptophan Sigma Aldrich, Mỹ

14 NaCN Trung Quốc 32 L-asparagine Sigma Aldrich, Mỹ

15 Peptone Ấn độ 33 L-isoleucin Sigma Aldrich, Mỹ

16 Glycerol Merck, Đức 34 L-valin Sigma Aldrich, Mỹ

17 D-glucose Sigma Aldrich, Mỹ 35 L-threonine Sigma Aldrich, Mỹ

18 D-maltose Sigma Aldrich, Mỹ 36 L-cystein Sigma Aldrich, Mỹ

2.1.3 Môi trường nghiên cứu

❖ Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường MPA (g/l) đối với vi khuẩn Bacillus: cao thịt 3 g; NaCl 10 g;

- Protase: cao thịt 3 g; NaCl 10 g; peptone 5 g; thạch 20 g; casein 20 g

- Cellulose: cao thịt 3 g; NaCl 10 g; peptone 5 g; thạch 20 g; CMC 20 g

❖ Môi trường sàng lọc xyanua: Môi trường M9M (Luque-Almagro và

cs, 2015)

Thành phần trong môi trường M9M (g/l): Na2HPO4 12,8; KH2PO4 3,0; NaCl 0,5; CaCl2 110,98; MgSO4 120; natri axetat 4,10; glucose tiệt trùng 20%

❖ Môi trường nghiên cứu đặc điểm sinh học : Môi trường MK

Thành phần môi trường MK (g/l): (NH4) 2 SO 4 2,0; MgSO 4 7H 2 O 0,2; NaH 2 PO 4 H 2 O 0,5; CaCl 2 2H 2 O 1,0; KH 2 PO 4 0,5; thạch 20,0; nước cất 1000 ml; pH 7,0

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Giữ giống vi khuẩn

VK sau khi phân lập được giữ giống bằng hai cách: Bảo quản trên môi trường thạch nghiêng ở 4°C và bảo quản lạnh sinh khối vi khuẩn có bổ sung glycerol 40% ở -80°C (Linde, Luciani và cs, 2018)

❖ Bảo quản trên thạch nghiêng

Chuẩn bị môi trường MPA thạch trong ống peni khử trùng 121℃ trong

30 phút

Vi khuẩn sau khi được làm thuần, sẽ được giữ giống trong môi trường MPA Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn đã làm thuần cấy vào ống thạch nghiêng, đậy nút bông Sau đó nuôi trong 1-2 ngày ở nhiệt độ 30℃ để vi khuẩn phát triển, thay nút bông bằng nút cao su trong tủ box vô trùng, sau đó bảo quản trong tủ 4°C

❖ Bảo quản trong dung dịch glycerol 40%

Bước 1: Chuẩn bị môi trường MPA lỏng trong ống nghiệm khử trùng ở