VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Nicotiana tabacum L K326 được sử dụng làm đối tượng chuyển gen nhờ vào khả năng thích hợp để thực hiện các kỹ thuật biến đổi gen Chúng tôi tiến hành chuyển gen GmCYP450, một gene quan trọng trong quá trình cải thiện đặc tính cây trồng, để nghiên cứu và phát triển các giống cây mới GmCYP450 do Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp, đảm bảo chất lượng và độ tin cậy cho các hoạt động nghiên cứu.
Chúng tôi cung cấp các hóa chất quan trọng như đệm CTAB, đệm TE, Thang DNA 1kb và 100bp để phục vụ các nghiên cứu về di truyền và sinh học phân tử Để tiến hành các phương pháp phân tích DNA, chúng tôi có các loại chloroform, isoamyl alcohol (CIA 24:1), isopropanol, ethanol, nước khử ion, Trizol, natri biphosphate, natridiphosphate, đệm PBS, metylen blue, natri hydroxide, TCA, TBA, axit photphoric, dung dịch KI3, dung dịch GB, axit sulfuric, axit sulfuricicylic, cùng các hóa chất thông thường như TAE 1X, agarose Ngoài ra, chúng tôi còn cung cấp hóa chất để nghiên cứu khả năng chống chịu mặn và hạn của cây, bao gồm NaCl 200mM và PEG 8000 10%, cùng các môi trường nuôi cấy mô thực vật như dung dịch MS, kháng sinh và các chất điều tiết sinh trưởng.
Trong quy trình nuôi cấy mô thực vật và chuyển gen, các thiết bị cần thiết bao gồm đèn cồn để tạo môi trường thích hợp, cân phân tích chính xác, bình nuôi cấy để đảm bảo sự phát triển của mô, máy tạo dao động cách thủy kỹ thuật số để kiểm soát nhiệt độ, máy tiệt trùng khô đảm bảo vệ sinh, kẹp và box cấy hỗ trợ thao tác dễ dàng, lò vi sóng dùng để tiệt trùng nhanh, Parafilm bảo vệ mẫu, đĩa Petri để cấy mẫu và quan sát, máy đo pH để duy trì độ pH phù hợp, pipet và cuvet thủy tinh thạch anh dùng trong phân tích mẫu, cùng các dụng cụ như dao mổ, kéo để thao tác chính xác trong quá trình nghiên cứu.
Các thiết bị đã qua sử dụng tại Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học bao gồm máy PCR System 9700 của Applied Biosystem (Mỹ), máy điện di EPS300 của Thụy Điển, máy NanoDrop của Thermo Scientific (Mỹ), máy chụp gel của Clever Scientific (Anh), máy Vortex của Mimishaker (Đức), cùng các thiết bị như máy ly tâm, máy lắc, bể ủ của Memmert (Đức) và máy nghiền mẫu, phục vụ cho các nghiên cứu về công nghệ sinh học và thực vật.
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Chuyển gen GmCYP450 vào cây thuốc lá thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens
Quy trình biến nạp thuốc lá tiến hành theo topping và cs (1998)
Vi khuẩn A tumefaciens mang vector chuyển gen pFGC5941:GmCYP450 được nuôi cấy trên môi trường YEP rắn chứa 50 mg/L rifampicin và 50 mg/L kanamycin trong hai ngày ở nhiệt độ 28ºC Các khuẩn lạc sau đó được chọn lọc và nuôi qua đêm để chuẩn bị cho các bước chuyển gen tiếp theo.
Môi trường YEP lỏng chứa 50 mg/L rifampicin và 50 mg/L kanamycin được chuẩn bị ở 28°C, với mật độ quầy thể 200 vũng/phút để tạo môi trường tiền cảm ứng Sau đó, 200 µL dịch tiền nuôi cấy được thêm vào 50 mL môi trường YEP chứa cùng nồng độ thuốc kháng sinh để nuôi cấy tiếp Dịch cấy được lắc ở tốc độ 250 vòng/phút và nhiệt độ 28°C cho đến khi quang học hấp thụ (OD) tại A600 nm đạt khoảng 0,8-1, đảm bảo sự phát triển đủ của vi sinh vật Tiếp theo, mẫu được ly tâm trong 10 phút ở nhiệt độ phòng với tốc độ 5000 vòng/phút để thu cặn khuẩn, sau đó hòa tan trong môi trường 1/2 MS pH 5,8 chứa 200 µM axetosyringone để tiến hành quá trình cảm ứng meth.
Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy:
Lá vô trùng được cắt thành các “mảnh lá” kích thước 1x1 cm² và đặt trên giấy lọc đã được làm ẩm để tránh hư hỏng Các mảnh lá sau đó được thả vào bình chứa môi trường cảm ứng, ngâm và lắc nhẹ trong 30 phút để đảm bảo nhiễm khuẩn đều Sau quá trình nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy để tiến hành nghiên cứu hoặc nhân giống.
Diệt khuẩn và tạo đa chồi:
Sau thời gian đồng nuôi cấy, các mảnh lá được rửa trong nước cất khử trùng có chứa 500 mg/L cefotaxime để loại bỏ các tác nhân gây nhiễm Tiếp theo, mảnh lá được thấm trên giấy thấm khử trùng và đặt trên môi trường chọn lọc chồi chứa 100 mg/L kanamycin để kiểm soát sự phát triển của vi khuẩn và tăng cường khả năng kháng thuốc Các mảnh lá trên môi trường chọn lọc được ủ ở 25°C trong chu kỳ quang gồm 16 giờ sáng và 8 giờ tối, tạo điều kiện tối ưu cho quá trình phát triển trước khi tiến hành nuôi cấy trên bình chứa với môi trường chọn lọc phù hợp.
Sau 3 - 4 tuần, các chồi khỏe mạnh được chọn và đặt trên môi trường chọn lọc rễ có chứa 50 mg/L kanamycin và 500 mg/L cefotaxime để cảm ứng rễ
Bảng 3.1 Thành phần các môi trường dùng trong nghiên cứu
Tên môi trường Mục đích Thành phần
Nuôi phục hồi khuẩn và chuẩn bị cho biến nạp
10 g yeast extract + 10 g bactopeptone +5 g NaCl (+ 15 g/L bactoagar); pH 7,0
IM Hũa tan cặn khuẩn ẵ MS + 200 àM axetosyringone
CCM Đồng nuôi cấy MS + 1 mg/L BAP + 30 g/L sucrose + 2,5 g/L agar; pH 5,8
Diệt khuẩn và tạo đa chồi
MS + 1mg/L BAP + 30g/L sucrose + 2,5 g/L agar + 100 mg/L kanamycin + 500 mg/L cefotaxime; pH 5,8
3.2.2 Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu lá thuốc lá
Tách chiết DNA được tiến hành bằng phương pháp CTAB (Doyle & Doyle, 1987) bao gồm các bước dưới đây:
- Nghiền mẫu látrong nitơ lỏng bằng máy nghiền mẫu
- Bổ sung 650 àl đệm CTAB vào mỗi ống và trộn đều, sau đú ủ ở 60-65 °C trong 1 giờ và đảo mẫu mỗi 20 phút một lần
- Lấy mẫu ra khỏi bể ủ và đặt trong tủ hỳt, thờm 650 àl cloroform: isoamyl alcohol (CIA, 24: 1, v/v) và trộn đều
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 °C
- Chuyển dịch nổi (lớp trên cùng) vào ống Eppendorf 1,5 ml mới
- Thờm 650 àl isopropanol lạnh (-20 °C) và trộn nhẹ bằng cỏch lật ngược ống cho đến khi DNA kết tủa
- Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút
- Loại bỏ phần nổi phớa trờn và rửa DNA bằng 700 àl etanol 80%
- Làm khô trong 20 phút ở nhiệt độ phòng và hòa tan DNA trong dung dịch đệm 100 àl TE
- Đo nồng độ DNA, kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose 0.8% và bảo quản ở -20 °C cho các thí nghiệm tiếp theo
3.2.3 Phương pháp kiểm tra sự có mặt có gen GmCYP450 bằng phản ứng PCR
DNA tổng số đã tách chiết được sử dụng để làm template cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen GmCYP450 (Bảng 3.4)
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR
STT Cỏc thành phần Thể tớch (àl)
Bảng 3.3 Chu trình phản ứng PCR
Bước Giai đoạn Nhiệt độ (˚C) Thời gian Giai đoạn Stage
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%
Bảng 3.4 Danh sách các mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên mồi Mục đích Trình tự (5’-3’)
CYP-R TGAAGGAAAGGCCAAATGTC qRT-CYP-F Kiểm tra mức độ biểu hiện gen
3.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
Chuẩn bị khay đổ gel và lược tạo các giếng điện di
Để chuẩn bị gel agarose 0,8%, cân 0,8g agarose rồi bổ sung 100ml dung dịch TAE 1X, đun trong lò vi sóng đến khi tạo thành dung dịch đồng nhất, sau đó để nguội khoảng 50-60°C Trong khi đó, kiểm tra chất lượng DNA tổng số 1,5% bằng cách chuẩn bị dung dịch phù hợp và tiến hành phản ứng PCR để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển Cuối cùng, đổ dung dịch agarose vào khay gel một cách cẩn thận để tránh tạo bọt khí, đảm bảo quá trình gel hóa diễn ra thuận lợi.
Sau 20 phút rút lược và đưa gel vào bể chạy điện di
Cho đệm TAE 1X ngập gel 2mm
Tra mẫu vào giếng Điện di ở điện áp 120V trong khoảng 20 phút
Sau khi hoàn tất quá trình chạy điện di, bản gel sẽ được nhuộm để phát hiện DNA Gel được lấy ra khỏi khuôn, ngâm trong dung dịch EtBr 0,5 µg/ml trong 10-15 phút để khắc thể DNA Sau đó, rửa lại gel bằng nước cất để loại bỏ dư lượng thuốc nhuộm, rồi quan sát dưới tia UV (254nm) trên máy soi DNA để kiểm tra kết quả, đồng thời chụp lại hình ảnh đảm bảo rõ nét.
3.2.5 Tách chiết RNA tổng số từ thực vật
- Nghiền 0,2 g lá trong nitơ lỏng
- Bổ sung 800 àl Trizol, trộn đều ngay lập tức
- Giữ mẫu trên đá trong 5 phút
- Thờm 200 àl CI, trộn đều
- Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C
- Chuyển phần dịch nổi phía trên thu được vào một ống 1,5 ml mới có chứa một thể tích isopropanol lạnh tương đương
- Đậy nắp ống, trộn bằng cách lật ngược ống nhiều lần
- Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C
- Loại bỏ hoàn toàn phần nổi phía trên
- Rửa tủa bằng 1ml ethanol 75%, đảo ngược ống trong thời gian ngắn
- Ly tâm ở tốc độ 13000 vòng/phút trong 5 phút ở 4°C
- Loại bỏ hoàn toàn phần dịch rửa
- Làm khô RNA trong không khí trong 5-10 phút
- Hũa tan RNA trong 50 àl nước DEPC lạnh
- Toàn bộ quá trình phải được thực hiện trên đá Điện di
Chuẩn bị gel agarose 1% Điện di: tra 1àg RNA vào giếng, chạy trong 25 phút ở điện áp 100V
Quy trình tổng hợp cDNA được thực hiện bằng RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất, trong đó:
Dung dịch tổng hợp được ủ ở 65°C trong 5 phút sau đó đặt lại ngay vào đá lạnh
Tiếp theo bổ sung 8 àl dung dịch tổng hợp 2 cú thành phần gồm:
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều bằng pipet và ủ trong máy PCR theo quy trình như sau: 25°C, 5 phút; 42°C, 60 phút, 70°C, 5 phút
3.2.6 Thí nghiệm gây stress hạn và stress mặn ở cây thuốc lá chuyển gen
Thuốc lá không chuyển gen (WT) và các dòng chuyển gen được nuôi cấy trong phòng có nhiệt độ duy trì ở mức 27°C và độ ẩm 80% Quá trình nuôi cấy diễn ra theo chu kỳ sáng và tối với thời gian 16 giờ sáng và 8 giờ tối, đảm bảo điều kiện tối ưu cho sự phát triển của cây trồng.
Chuyển chồi của các dòng chuyển gen và không chuyển gen (WT) vào các bình công thức môi trường nuôi cấy khác nhau:
- Đối chứng: MS + 0.1 mg/l NAA + 200 mg/l cefotaxime + 50 mg/l timetin
- Stress hạn: 2X MS + 0.1 mg/l NAA + 200 mg/l cefotaxime + 50 mg/l timetin + PEG 8000 15%
- Stress mặn: MS + 0.1 mg/l NAA + 200 mg/l cefotaxime + 50 mg/l timetin + NaCl 200mM
Các cây thí nghiệm đã trải qua giai đoạn gây stress nhân tạo trong khoảng 2 tuần, sau đó được đưa trở lại môi trường bình thường để quan sát quá trình hồi phục Vào ngày cuối cùng của quá trình thí nghiệm, các mẫu lá được thu thập để phân tích biểu hiện gen, giúp hiểu rõ tác động của stress và khả năng phục hồi của cây.
3.2.7 Định lượng proline tự do
- Dung dịch gốc: 100 mg/ml L-proline
- Dung dịch 1 mg/mL L-proline: 20 àl 100 mg/mL betaine + 1980 àl dH 2 O
- Dãy pha loãng chất chuẩn:
Bảng 3 5 Chuẩn bị dãy đường chuẩn của L-proline Nồng độ
1mg/ml Proline (àl) 0 10 20 30 40 50 60 dH 2 O (àl) 100 90 80 70 60 50 40
Tổng (àl) 100 100 100 100 100 100 100 Đường chuẩn được thực hiện đồng thời cùng với quá trình định lượng proline tự do trong mẫu
Tách chiết protein tổng số
- Nghiền khoảng 20 mg lá trong nitơ lỏng, sau đó bổ sung 1 ml dung dịch đệm PBS 100 mM lạnh (pH = 7,8), sau đó lắc ở 4 °C trong 5 phút
- Ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 20 phút ở 4°C
- Thu dung dịch protein và đo nồng độ bằng phương pháp Bradford Định lượng proline tự do
- Chuẩn bị dung dịch sau phản ứng (Rec.Sol) gồm: 10 ml axit sulphosalicylic 3%, 10 ml axit axetic và 20 ml 2,5% axit-ninhydrin
- Thờm 50 àl dung dịch protein tổng số/đường chuẩn L-proline vào ống chứa 1 ml Rec.Sol và trộn đều
- Đun sôi trong nồi cách thủy trong 15 phút
- Làm lạnh trên đá trong 5 phút Đo độ hấp thụ của dung dịch sau phản ứng ở bước sóng A520 nm.