VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Các chủng nấm C militaris S1, S2, S3 thương mại đang được sử dụng và lưu giữ tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam để làm nguyên liệu cho các nghiên cứu thí nghiệm.
Hóa chất: Đệm CTAB, đệm TE, marker 1kb, lysozyme, SDS, proteinaise
K, Natri clorua (NaCl), hỗn hợp Clorofrom: isoamylacohol (CI, 24: 1), isopropanol, ethanol, dextro, agar bacteriologial, peptone, Yeast extract (cao nấm men), Magie sulphat (MgSO 4 ), Potassium Phosphate Monobasic (KH 2 PO 4 ), glucose, thiamin B 1 và các hóa chất thông thường khác
Thiết bị tại phòng Công nghệ bao gồm các dụng cụ chuyên dụng như box cấy, cân phân tích, tủ sấy, đĩa petri, lò vi sóng, parafilm, ống fancol, pipet cùng với nhiều thiết bị khác nhằm đảm bảo quy trình nghiên cứu và phân tích chính xác Các thiết bị này đóng vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ công đoạn chuẩn bị mẫu, kiểm tra và phân tích số liệu, góp phần nâng cao hiệu quả công việc nghiên cứu khoa học Việc sử dụng các thiết bị hiện đại và đúng tiêu chuẩn giúp đảm bảo kết quả chính xác, tin cậy và đáp ứng được yêu cầu của quá trình nghiên cứu tại phòng Công nghệ.
Our laboratory is equipped with advanced machinery, including the PCR System 9700 from Applied Biosystem for precise gene amplification, EPS300 electrophoresis system from Sweden for DNA and protein separation, and Clever Scientific gel imaging equipment from the UK for high-quality gel documentation We also utilize Mimishaker Vortex mixers from Germany for sample mixing, Memmert incubators and centrifuges for controlled environment experiments and sample processing, as well as sample grinders and various other specialized laboratory devices to ensure comprehensive research capabilities.
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phân lập và phát triển các dòng bào tử đơn
Các dòng bào tử đơn được phân lập và lưu giữ theo phương pháp Kang và đồng tác giả (Kang & cs., 2017)
Thể sợi được nuôi cấy trong 50 ml môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) trong bình tam giác 250 ml có bổ sung các viên bi thủy tinh để kích thích sự phát triển Quá trình nuôi cấy diễn ra trong 7 ngày ở điều kiện lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 25°C và có chiếu sáng nhằm thúc đẩy sự phân chia của bào tử sinh dưỡng (conidia) Sau đó, dịch nuôi được ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 14.000 vòng/phút để tách các thành phần sinh học một cách hiệu quả.
Dịch nấm sau khi hòa loãng được cấy trải trên mặt môi trường PDA (bột khoai tây, dextrose, agar 2%, pH 5.7) để thu bào tử đơn Bào tử đơn sau khi chọn lọc được nuôi cấy trên môi trường nhân giống cấp 1 SDAY đặc, gồm peptone, cao nấm men, MgSO4, KH2PO4, glucose và agar, và duy trì nuôi cấy trong vòng 7 ngày ở điều kiện thích hợp nhằm phát triển hiệu quả.
Ở nhiệt độ 25℃ trong điều kiện tối, hệ sợi phát triển sau đó được chiếu sáng để quan sát sự thay đổi màu sắc và quá trình phát triển của hệ sợi Các thể sợi hình thành từ các dòng bào tử đơn này được lưu giữ để sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo, giúp nghiên cứu quá trình sinh trưởng và đặc điểm của hệ sợi một cách chính xác.
3.2.2 Kiểm tra thành phần và sự biến đổi gen MAT
Tách chiết DNA tổng số từ hệ sợi nấm
Hệ sợi nấm trong giai đoạn phát triển sinh dưỡng được thu thập trên đĩa môi trường nhân giống cấp 1 để chuẩn bị cho quá trình tách chiết DNA tổng số Phương pháp tách DNA sử dụng kỹ thuật CTAB theo Doyle (1991), đã được cải tiến để nâng cao hiệu quả, bao gồm các bước chính như thu mẫu sợi nấm, xử lý mẫu với dung dịch phản ứng phù hợp và tiến hành tách chiết nhằm tối ưu hóa chất lượng DNA Phương pháp này giúp thu được DNA có độ tinh khiết cao, phù hợp cho các phân tích sinh học phân tử sau này.
- Nghiền mịn hệ sợi bằng nitơ lỏng
- Bổ sung 600 àl đệm TE vào mỗi ống và trộn đều bằng mỏy vontex
- Bổ sung 15 àl lysozyme 100mg/ml, trộn đều bằng mỏy vontex và đem ủ ở 37℃ trong vòng 30 phút
Lấy mẫu ra khỏi bể ủ, sau đó bổ sung 40 ml SDS 10% và trộn đều bằng máy vontex để đảm bảo hòa tan hoàn toàn Tiếp theo, thêm 8 ml protease K (20 mg/ml) vào mẫu, trộn đều và ủ ở nhiệt độ 56°C trong vòng 20 phút, đảo đều mẫu sau 5 phút để tăng hiệu quả phân giải protein Quá trình này giúp chuẩn bị mẫu tối ưu cho các bước phân tích tiếp theo trong nghiên cứu của bạn.
- Lấy mẫu ra khỏi bể ủ, bỏ sung thờm 100 àl CTAB/NaCl, trộn đều rồi bổ sung thờm 100 àl NaCl 5M, trộn đều; đem ủ ở 65℃ trong vũng 10 phỳt
- Lấy mẫu ra khỏi bể ủ và đặt vào trong tủ hỳt, bổ sung thờm 600 àl hỗn hợp Cloroform/isoamylalcohol (24:1) (đảo nhẹ nhàng), sau đó đem ly tâm
13000 vòng/phút trong 10 phút Hút lấy dịch nổi ở trên sang một ống mới
- Bổ sung 500 àl isopropanol để tủa DNA Đảo nhẹ ống và ủ ở -20℃ trong vòng 1 giờ Sau đó đem ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 15 phút
- Rửa bằng 200 àl ethanol 70% và ly tõm ở 13000 vũng/phỳt trong 15 phút Lặp lại tối đa 3 lần
- Loại bỏ dịch nổi phía trên và để khô
- Hũa tan lại DNA trong 30 àl đệm TE
- Điện di kiểm tra DNA tách được trên gel agarose 1% và bảo quản ở -
20℃ cho các thí nghiệm tiếp theo
Kiểm tra sự có mặt của gen MAT bằng phản ứng PCR
DNA tổng số đã được tách chiết được sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại gen MAT
Bảng 3.1 Thành phần một phản ứng PCR
2X Mồi xuôi Mồi ngược DNA khuôn Tổng thể tớch (àl)
Các cặp mồi cho các gen MAT được thiết kế dựa trên trình tự đã được công bố trong các nghiên cứu trước (Chen & cs., 2017; Kang & cs., 2017; Tan
& cs., 2011) và được tổng hợp nhân tạo tại công ty hóa chất Phù Sa (PHUSABiochem, Việt Nam)
Bảng 3.2 Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
Sản phẩm PCR sau đó được điện di kiểm tra trên gel Agarose 1%
Ngoài ra, sản ph chủng giống bố mẹ cũng
Sanger tại Viện Công ngh tích và so sánh dựa trên các công c
3.2.3 Đánh giá hình thái sinh tr cấp 1
Thí nghiệm sử dụ militaris S 3 thương mại nuôi c
Dùng que cấy lấy h lên mặt thạch trong đĩa petri có ch men + MgSO 4 + KH 2 PO
15 ngày Theo dõi và đánh giá h ngày
Chỉ tiêu theo dõi bao gồm hình thái hệ sợi của PCR gen MAT ở một số dòng đã được tinh sạch và giải trình tự bằng công nghệ sinh học VAST Trình tự gen MAT a được phân tích và xác định chính xác thông qua các công cụ tin sinh học như BioEdit 7.2 và cơ sở dữ liệu NCBI để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả nghiên cứu.
Dưới đây là đoạn văn đã được tóm tắt và tối ưu hóa cho SEO dựa trên nội dung của bạn: "Sơ đồ chu kỳ nhiệt phản ứng chạy PCR phản ánh quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm C militaris S1 trên môi trường nuôi cấy Quá trình nuôi cấy diễn ra trên môi trường nhân giống có dạng sợi phát triển từ bào tử đơn, được đặt trong các đĩa petri chứa môi trường SDAY đặc phù hợp để thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của nấm C militaris, góp phần nâng cao hiệu quả nghiên cứu và ứng dụng trong các lĩnh vực y học và thực phẩm."
PO 4 + Glucose + agar) được hấp khử trùng y, đĩa petri được ủ trong điều kiện tối 7 ngày và chi đánh giá hình thái sinh trưởng của hệ sợ tiêu theo dõi: Đường kính hệ sợi (cm); tốc độ phát tri dòng đặc trưng và các thông qua phương pháp
MAT sẽ được phân c như BioEdit 7.2, NCBI Blast và y PCR rên môi trường nhân giống
C militaris S 2 , C ng cấp 1 (SDAY đặc) i kích thước 0,5cm cấy c (peptone + cao nấm trùng ở 121℃ kéo dài i 7 ngày và chiếu sáng ợi sau 7 ngày và 15 phát triển và đặc điểm
3.2.4 Đánh giá hình thái sinh trưởng phát triển trên môi trường nhân giống cấp 2
Thí nghiệm sử dụng các chủng nấm C militaris S 1 , C militaris S 2 , C militaris S 3 thương mại được thực hiện nuôi cấy trong môi trường nhân giống cấp 2 (SDAY lỏng)
Đầu tiên, dùng dao cắt mảnh môi trường nhân giống cấp 1 chứa hệ sợi đang sinh trưởng mạnh tại rìa của các cụm nấm trên môi trường SDAY đặc với kích thước khoảng 0,5cm x 0,5cm Sau đó, các mảnh sinh học này được chuyển vào bình tam giác chứa 100 ml môi trường nhân giống cấp 2 (SDAY lỏng gồm peptone, cao nấm men, MgSO4, KH2PO4 và glucose đã qua khử trùng ở 121°C trong 20 phút) Bình mẫu được nuôi lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong điều kiện tối, ở nhiệt độ 25°C, trong khoảng 5-7 ngày để tạo thành dung dịch nấm Cuối cùng, dung dịch nấm này sẽ được sử dụng để cấy chuyển lên môi trường giá thể nhằm thúc đẩy quá trình hình thành và phát triển quả thể.
Chỉ tiêu theo dõi: Tốc độ phát triển của các chủng nấm, màu sắc, hình thái của pilet, đếm số lượng pilet khi pha loãng tỷ lệ 1/20X
3.2.5 Đánh giá hình thái sinh trưởng phát triển trên môi trường cơ chất tạo quả thể
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Wen et al (2012), nhằm nghiên cứu sự phát triển của các chủng nấm C militaris S1, S2, S3 Các chủng nấm này được nuôi cấy trong các hộp có kích thước 9x9x9cm, sử dụng cơ chất gồm 50% gạo, 25% nhộng, 15% khoai tây, 10% bột đậu, cùng với các khoáng chất như nước dừa, MgSO₄ và KH₂PO₄ để tối ưu hóa quá trình phát triển nấm.
+Thiamin B 1 + đường glucose), hấp ở 121℃ kéo dài 20 phút
Cấy chủng được thực hiện bằng cách pha loãng dịch nuôi cấy giống cấp 2 với nước cất khử theo tỷ lệ 1:20, sau đó lắc đều và phun 5ml dung dịch đã pha vào mỗi hộp cơ chất Hộp nuôi được ủ tối trong điều kiện không có ánh sáng, duy trì nhiệt độ 22°C trong vòng 7-13 ngày để phát triển sợi nấm Sau đó, quá trình ươm mầm và theo dõi quả thể diễn ra bằng cách đặt hộp lên kệ trong phòng có lắp đèn với chu kỳ chiếu sáng/tối là 14/10 giờ, cường độ ánh sáng 900 lux, nhiệt độ phòng 22°C, độ ẩm 80%, và thời gian nuôi kéo dài khoảng 8-9 tuần để đạt hiệu quả tối ưu.
Chỉ tiêu theo dõi bao gồm tốc độ phát triển của hệ sợi theo từng ngày và thời gian hệ sợi mọc kín cơ chất, giúp đánh giá quá trình sinh trưởng của thể Số lượng mầm, đặc điểm hình thái của mầm quả thể hoặc quả thể cũng được ghi nhận để theo dõi sự phát triển chính xác Chiều dài quả thể trưởng thành, cùng với các đặc điểm về sinh trưởng, hình thái, năng suất và chất lượng quả thể nhộng trùng thảo đều được kiểm tra kỹ lưỡng Quá trình này diễn ra qua các thế hệ nhân nuôi, giúp thu thập dữ liệu có hệ thống để phân tích và nâng cao hiệu quả sản xuất.
3.2.6 Xử lý số liệu và phân tích
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại Số liệu xử lý, tính toán thống kê trên phần mềm excel 2016
Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường tối hoặc trên giàn đèn với cường độ chiếu sáng từ 700 đến 900 lux, phù hợp với nghiên cứu về ảnh hưởng của ánh sáng Chu kỳ chiếu sáng thay đổi từ 14 giờ sáng và 10 giờ tối tùy thuộc vào từng giai đoạn thử nghiệm, đảm bảo điều kiện tối ưu cho kết quả chính xác Nhiệt độ phòng nuôi duy trì trong khoảng 20-22℃ để giữ môi trường ổn định cho các đối tượng thí nghiệm Quá trình thu thập dữ liệu, hình ảnh và ghi nhận kết quả được thực hiện cẩn thận sau mỗi giai đoạn để đảm bảo độ chính xác và khả năng phân tích.