Khảo sát một số đặc điểm của chủng xạ khuẩn tb25 có khả năng kháng nấm sclerotium rolfsii gây bệnh thối gốc lạc

Chủng xạ khuẩn TB25 đã được xác định là có khả năng kháng nấm Sclerotium rolfsii trong nghiên cứu này tiếp tục được đánh giá có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt trên môi trường ISP2

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

SCLEROTIUM ROLFSII GÂY BỆNH THỐI GỐC LẠC

Sinh viên thực hiện

: ThS TRẦN THỊ ĐÀO : PGS.TS NGUYỄN VĂN GIANG : CÔNG NGHỆ VI SINH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khóa luận này là trung thực dưới sự nghiên cứu của bản thân và dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Văn Giang Các số liệu trong nghiên cứu hoàn toàn trung thực và chưa được sử dụng trong bất kì công bố nào trước đó

Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khóa luận tốt nghiệp

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2022

Sinh viên

Vũ Anh Tuấn

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực tập tại bộ môn Công nghệ Vi sinh – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, được sự giúp đỡ tận tình của các Thầy, Cô giáo và các cán bộ tại phòng thí nghiệm của bộ môn, cùng với sự cố gắng của bản thân, tôi đã hoàn thành khoá luận tốt nghiệp của mình

Đầu tiên, tôi xin gửi lời cám ơn đến Ban giám đốc, Ban chủ nhiệm Khoa, cùng các thầy cô giáo đã tận tình hướng dẫn, giảng dạy trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và rèn luyện ở Học viện Nông Nghiệp Việt Nam

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy PGS TS Nguyễn Văn Giang – Trưởng bộ môn Công nghệ Vi sinh đã định hướng đề tài và đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới cô ThS Trần Thị Đào, NCV Tạ Hà Trang và các bạn đang nghiên cứu thực tập tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ vi sinh đã tận tình giúp đỡ, giải đáp thắc mắc trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Phòng, Ban của khoa Công nghệ Sinh học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và môi trường làm việc hết sức chuyên nghiệp để tôi hoàn thành khoá luận tốt nghiệp một cách thuận lợi

Cuối cùng, với tất cả lòng thành kính và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cám ơn đến bố mẹ, người đã sinh thành, nuôi nấng, động viên và tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày 06 tháng 09 năm 2022

Sinh viên

Vũ Anh Tuấn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii

TÓM TẮT ix

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Đối tƣợng 2

1.2.3 Nội dung nghiên cứu 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về cây lạc 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Đặc điểm sinh học 3

2.1.3 Phân loại 4

2.1.4 Tác dụng của lạc 4

2.2 Một số bệnh gây hại ở lạc 5

2.2.1 Bệnh thối gốc mốc trắng 5

2.2.2 Bệnh gỉ sắt 7

2.2.3 Bệnh thối mầm, thối thân ở lạc 8

2.2.4 Bệnh lở cổ rễ 9

2.3 Tổng quan về nấm Sclerotium rolfsii 9

2.3.1 Giới thiệu về nấm 9

2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng của nấm Sclerotium rolfsii 10

2.3.3 Đặc điểm gây bệnh 11

2.4 Tổng quan về xạ khuẩn 12

2.4.1 Giới thiệu về xạ khuẩn 12

2.4.2 Đặc điểm hình thái 12

2.4.3 Đặc điểm sinh hoá 14

2.4.4 Vai trò của xạ khuẩn 14

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 15

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 15

2.5.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 16

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Vật liệu nghiên cứu 18

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 18

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 18

3.1.3 Thiết bị và hoá chất 18

3.1.4 Các loại môi trường sử dụng trong thí nghiệm 19

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn TB25 20

3.2.2 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA của chủng xạ khuẩn TB25 21

3.2.3 Khảo sát khả năng phân giải phosphate khó tan 22

3.2.4 VP Test (Voges-Proskauer test) 24

3.2.5 MR Test (Methyl red test) 24

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Đặc điểm sinh trưởng của chủng xạ khuẩn TB25 25

4.2 Khả năng đồng hoá nguồn Carbon 27

4.3 Khả năng đồng hoá nguồn nitơ 30

4.4 Khả năng sinh tổng hợp IAA 33

4.6 Phản ứng VP test (Voges – Proskauser test) 37

4.7 Phản ứng MR test (Methy red test) 38

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

5.1 Kết luận 40

5.2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hướng dẫn pha dung dịch chuẩn làm việc IAA 22Bảng 3.2 Xây dựng dãy nồng độ đường chuẩn 24Bảng 4.1 Đặc điểm sinh trưởng của xạ khuẩn TB25 trên môi trường khác

nhau 25Bảng 4.2: Đánh giá khả năng đồng hoá nguồn Carbon 28Bảng 4.3 Khả năng sử dụng nguồn nitơ khác nhau của chủng xạ khuẩn

TB25 sau 7 ngày nuôi cấy 31

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Hình ảnh cây lạc 3

Hình 2.2 Bệnh thối gốc mốc trắng trên cây lạc 6

Hình 2.3 lá lạc bị nhiễm nấm gây bệnh gỉ sắt 7

Hình 2.4 Hình ảnh bào tử nấm Rhizopus arhizus 8

Hình 2.5 Triệu chứng bệnh lở cổ rễ ở lạc do nấm Rhizoctonia solani Kuhn 9

Hình 2.6 Nấm Sclerotium rolfsii nuôi cấy trên PDA 11

Hình 2.7 Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn 13

Hình 2.8 Các dạng bào tử của xạ khuẩn 14

Hình 1 Đường chuẩn IAA 34

Hình 2 Dải màu trong đồ thị đường chuẩn IAA 35

Hình 3 Vòng sáng quanh khuẩn lạc TB25 36

Hình 4 Đường chuẩn phosphate 37

Hình 5 Dải màu trong đường chuẩn phosphate 37

Hình 6 Kết quả phản ứng VP Test 38

Hình 7 Kết quả phản ứng MR test của chủng TB25 39

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

R solani Rhizoctonia solani

S rolfsii Sclerotium rolfsii HRGMT Héo rũ gốc mốc trắng

TÓM TẮT

Sclerotium rolfsii được xem là loại nấm đất gây thiệt hại nghiêm trọng đối

với nhiều loài cây trồng cạn mà chưa có biện pháp xử lý hữu hiệu Hiện nay việc

nghiên cứu tuyển chọn vi sinh vật kháng nấm Sclerotium rolfsii đang được nhiều

nhà khoa học quan tâm bởi tính an toàn với sản xuất nông nghiệp và người tiêu dùng Chủng xạ khuẩn TB25 đã được xác định là có khả năng kháng nấm

Sclerotium rolfsii trong nghiên cứu này tiếp tục được đánh giá có khả năng sinh

trưởng, phát triển tốt trên môi trường ISP2, ISP3, ISP4; có khả năng sử dụng nguồn carbon dextrin là tốt nhất; có khả năng sử dụng cao thịt như là nguồn cung cấp nitơ tốt nhất Chủng xạ khuẩn TB25 vừa có khả năng sinh tổng hợp IAA vừa có khả năng phân giải phosphate khó tan, có tiềm năng ứng dụng tốt trong nông nghiệp

PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh năm nên thuận lợi cho việc gieo trồng nhiều loại cây trồng khác nhau, đặc biệt là các loại cây trồng cạn Điều kiện thời tiết khí hậu của nước ta cũng rất thuận lợi cho các loài vi sinh vật xâm nhiễm gây hại đối với cây trồng Trong đó các loài nấm gây bệnh, nhóm tác nhân chính gây bệnh trên hầu hết các loại cây trồng, đặc biệt

là nhóm nấm đất (Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium sp., Pythium

sp v.v ) Một trong những loài nấm đất điển hình hại vùng rễ cây trồng cạn là

nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh héo rũ gốc mốc trắng (HRGMT) Nguồn bệnh

của nấm tồn tại chủ yếu trong đất, trong tàn dư thực vật, cây ký chủ và trong các vật liệu giống nhiễm bệnh dưới dạng sợi nấm, hạch nấm Hạch nấm tồn tại từ năm này qua năm khác ở tầng đất bề mặt và là nguồn gây bệnh phổ biến cho các cây trồng vụ sau, năm sau

Hiện nay việc phòng trừ Việc phòng trừ nấm Sclerotium rolfsii chủ yếu

bằng các phương pháp hoá học, việc dùng thuốc hoá học có thể gây ảnh hưởng đến môi trường và sức khoẻ con người còn ảnh hưởng đến chất lượng nông sản phẩm do tồn tại dư lượng thuốc hóa học trong nông sản Vì vậy, ứng dụng các nguồn vi sinh vật đối kháng trong sản xuất các chế phẩm sinh học nông nghiệp thân thiện với môi trường ngày càng được quan tâm và phát triển Nghiên cứu ứng dụng các vi sinh vật có khả năng kháng nấm bệnh trong việc phòng trừ bệnh hại trên cây trồng có nhiều triển vọng, đáp ứng với yêu cầu sản xuất an toàn và hướng đến một nền nông nghiêp phát triển bền vững

Xuất phát từ những lý do trên đề tài: “Khảo sát một số đặc điểm của

chủng xạ khuẩn TB25 có khả năng kháng nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh thối gốc lạc” được thực hiện

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

1.2.3 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn TB25 trên các môi trường khác nhau

- Đánh giá khả năng sinh IAA

- Đánh giá khả năng phân giải phosphate khó tan

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về cây lạc

2.1.2 Đặc điểm sinh học

Cây lạc là cây hai lá mầm, có hệ rễ cọc, thân được chia ra làm nhiều đốt,

lá và hoa của lạc được mọc ra từ những mắt của đốt Rễ cái do rễ mầm của hạt lớn lên và tạo thành, rễ cái có thể đâm sâu xuống đất đến 2m Còn rễ nhánh và rễ con tập trung phần lớn ở gần mặt đất Cũng như rễ của các cây họ đậu khác, rễ cây lạc có nhiều nốt sần Các nốt sần trên rễ cây họ đậu được tạo nên do sự cộng

sinh của vi khuẩn cố định đạm Rhizobium Thân cây lạc lúc còn non có hình

tròn, đến lúc già thì có cạnh và rỗng ruột Trên thân có nhiều lông ngắn và lông

tơ Chiều cao của thân thay đổi trong khoảng 19-80cm do khí hậu, nơi trồng Lá cây lạc có dạng lá kép hình lông chim, mỗi lá kép thường có 4 lá chét, một số trường hợp có 3 hoặc 5 lá chét

Hình 2.1 Hình ảnh cây lạc

Cây lạc có thể cao đến 30 - 60 cm, thân có lông, góc ốc với các nhánh xòe ra, các lá mọc xen kẽ Cây lạc có hệ thống rễ dùng được bao phủ bởi các nốt sần ở rễ do sự cộng sinh của vi khuẩn cố định đạm Cây lạc thích hợp trồng trên những loại đất có thành phần cơ giới nhẹ và thoát nước tốt như đất cát pha, đất thịt nhẹ như đồng bằng Bắc Bộ, Trung bộ, Tây Nguyên và Nam Bộ Các giống lạc được gieo trồng nhiều ở Việt Nam chủ yếu là các giống chín sớm, có thời gian sinh trưởng là 100-125 ngày Các giống lạc chín muộn với thời gian sinh trưởng trên 160 ngày, phần lớn là thuộc loại hình phân nhánh nhiều, thường được dùng để trồng xen trong các vườn trồng cây lâu năm, với mục đích chủ yếu

để làm cây phủ đất

2.1.3 Phân loại

Cây lạc có tên khoa học là Arachis hypogaea

Giới (regnum): Plantae

Kết quả thử nghiệm cho thấy ăn lạc còn giúp tăng cường khả năng kháng viêm, chống ung thư, chống oxi hóa, làm giảm mỡ máu, đồng thời cải thiện và làm tăng mức độ HDL Cholesterol – loại chất béo tốt giúp giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não

+ Công dụng của lá, thân và vỏ quả lạc

Nghiên cứu chiết xuất từ lá và thân cây lạc cho thấy tác dụng an thần nhẹ giúp cải thiện tình trạng mất ngủ Bên cạnh đó, chiết xuất methanol từ lá lạc còn giúp ngăn chặn sự phát triển của chứng phù chân và ức chế kết tập tiểu cầu

Đối với vỏ quả lạc, kết quả nghiên cứu cho thấy chiết xuất của nó có khả

năng chống lại các vi khuẩn như Acinetobacter baumannii, Staphylococcus

aureus (gây các bệnh về nhiễm trùng), Klebsiella pneumonia (gây viêm phổi), Escherichia coli (gây ngộ độc thực phẩm và bệnh đường ruột)… và làm giảm sự

hấp thu chất béo của cơ thể

+ Công dụng của mầm và rễ cây lạc

Kết quả nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ mầm của hạt lạc có tiềm năng trong phòng ngừa các bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer và bệnh Parkinson Đồng thời, nghiên cứu chiết xuất từ rễ cây lạc cũng cho thấy khả năng chống oxy hóa mạnh (do có chứa một hợp chất polyphenolic tự nhiên là resveratrol)

+ Công dụng của dầu lạc

Dầu lạc được làm từ hạt lạc được sử dụng để làm giảm sự thèm ăn, ngăn ngừa ung thư hoặc được bôi trực tiếp lên da giúp giảm tình trạng da khô, chàm hoặc vảy trên da đầu… Bên cạnh đó, dầu lạc còn được ứng dụng trong thuốc mỡ

và dầu thuốc để điều trị táo bón

Ngoài ra, nó cũng được sử dụng nhằm làm giảm cholesterol và ngăn ngừa bệnh tim Tuy nhiên, khi nghiên cứu trên động vật, dầu lạc lại gây tắc nghẽn động mạch và tăng nguy cơ mắc bệnh tim

2.2 Một số bệnh gây hại ở lạc

2.2.1 Bệnh thối gốc mốc trắng

a Đặc điểm nhận biết

Cây bệnh héo rũ, xanh hoặc hơi vàng Cổ rễ và đoạnh thân ngầm bị bệnh

có vết màu nâu, thối mục, khô xác Nhổ cây rễ bị đứt gốc, trên gốc thân cây bệnh mọc lớp nấm trắng đậm, tia lan rộng ra mặt đất, hình thành nhiều hạch nấm hình tròn hình tròn như hạt cải màu trắng, về sau có màu nâu hạt chè

Hình 2.2 Bệnh thối gốc mốc trắng trên cây lạc

b Tác nhân gây bệnh

Do nấm Sclerotium rolfsii gây ra

c Đặc điểm phát sinh, gây hại

Bệnh phát sinh phát triển mạnh trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao, ẩm ướt, cây sinh trưởng kém Trên đất trồng độc canh, đất cát thô bệnh nặng hơn Trên đất có nhiều chất hữu cơ, tàn dư cây chưa hoai mục bệnh hại nặng hơn, vụ xuân bệnh hại nặng hơn vụ thu

Bệnh xuất hiện trong suốt quá trình sinh trưởng của cây Nấm phá hại tia

củ lạc trong đất làm tóp, thối củ, hạt mốc, mất sức nảy mầm hoặc khi gieo mầm mọc yếu, cây sẽ bị bệnh Ở Giai đoạn ra hoa và quả non bệnh hại nặng hơn; vụ xuân bệnh hại nặng hơn vụ thu

d Biện pháp phòng, trừ

- Luân canh với lúa nước, các cây trồng khác để hạn chế nguồn bệnh ở đất Bón phân hợp lý và cân đối Đặc biệt ở vùng đất bạc màu cần bón nhiều vôi, dùng phân chuồng hoai mục để bón

- Dùng hạt giống tốt, xử lý khô bằng TMTD 2kg/1 tấn hạt; Rovral 50 WP 2kg/1 tấn hạ

- Dùng thuốc phun vào gốc cây để chống bệnh héo rũ lạc do nấm như: Kasumin 2L (1,5-2l/ha); Topsin M-70WP (0,4-0,6kg/ha)

Nhổ bỏ cây bệnh khi mới chớm phát sinh, rắc vôi bột vào gốc trên mặt luống hoặc tưới nước vôi loãng 4% vào gốc để hạn chế các loại nấm gây bệnh

2.2.2 Bệnh gỉ sắt

a Triệu chứng

Bệnh gỉ sắt hại lạc xuất hiện dưới dạng các nốt li ti hình tròn màu nâu cam (gỉ sắt), thường được tìm thấy ở mặt dưới của lá Các đốm này thường được bao quanh bởi một quầng màu vàng úa Tình trạng này làm suy giảm đáng kể sự phát triển của lá và cây Khi bệnh tiến triển, lá bị nhiễm bệnh nặng bị phủ đầy các nốt mụn màu rỉ sét ở cả hai mặt, lá chuyển sang màu vàng và trông giống như bị “gỉ sét”, cuối cùng lá cong quăn lại Các nốt mụn thon dài màu nâu đỏ (sau đó chuyển sang màu đen) cũng có thể xuất hiện trên quả lạc, thân và cuống

lá Bệnh này có thể làm giảm đáng kể năng suất quả và chất lượng dầu của hạt

Hình 2.3 lá lạc bị nhiễm nấm gây bệnh gỉ sắt

và trên 35oC bệnh phát triển chậm và gây gia tăng thời gian ủ bệnh

2.2.3 Bệnh thối mầm, thối thân ở lạc

a Triệu chứng

Bệnh thường xâm nhiễm và gây hại chính ở vị trí gần sát mặt đất Tại vị trí bệnh xuất hiện vết màu nâu đen, mặt đất quanh vị trí bệnh cũng xuất hiện các sợi nấm màng màu trắng Cách cành lạc nhiễm bệnh gần mặt đất thường héo rũ

Ngoài ra bệnh gây hại cho mầm và tia củ làm cho các bộ phận này kém phát triển thậm chí dẫn tới thối hỏng

b Tác nhân gây bệnh: Nấm Rhizopus arrhizus

Nguồn: Hoda Khesali (2015)

Hình 2.4 Hình ảnh bào tử nấm Rhizopus arhizus

2.2.4 Bệnh lở cổ rễ

a Triệu chứng

Cây lạc bị thối gốc, héo rũ, héo khô, héo cây con Bệnh có thể tấn công suốt giai đoạn sinh trưởng của cây, thường gây thiệt hại nặng cho cây con, thường xảy ra trong khu đất cũ đã phát bệnh và có độ ẩm cao Bệnh được nhận diện dễ dàng nhờ vào dấu hiệu của bệnh, đó là các sợi nấm, hạch nấm của nấm gây bệnh, chúng phát triển ngay trên vết bệnh ở gốc thân, phát triển lan lên thân

và vùng đất quanh gốc cây Rễ bị thối và thường có màu nâu đỏ

Hình 2.5 Triệu chứng bệnh lở cổ rễ ở lạc do nấm Rhizoctonia solani Kuhn

b Tác nhân gây bệnh: Do nấm Rhizoctonia solani Kuhn

2.3 Tổng quan về nấm Sclerotium rolfsii

2.3.1 Giới thiệu về nấm

Nấm Sclerotium rolfsii là một trong những nấm có nguồn gốc từ đất với

số lượng ký chủ lớn, hơn 500 loài Nơi phân bố đa dạng và rộng, thường được tìm thấy ở các vùng khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới và các vùng ôn đới khác trên thế giới (Aycock, 1966)

Nấm Sclerotium thuộc:

Giới (Kingdom) : Fungi

Nghành (Phylun) : Basidiomycota

Lớp (Class) : Agaricomycotina

Họ (Family) : Atheliales

Chi (Genus) : Atheliaceae

Loài : Athelia

Tên nhị thức : Athelia rolfsii (Sclerotium rolfsii sacc.)

(Tu & Kimbrough, 1978)

2.3.2 Đặc điểm sinh trưởng của nấm Sclerotium rolfsii

Nhiệt độ và độ ẩm là những yếu tố rất quan trọng trong sự lây lan và phát

triển của mầm bệnh nấm Sclerotium rolfsii Theo Kator & cs (2015), sợi nấm phát triển trong phạm vi nhiệt độ 10o

C – 40oC, trong đó tối ưu nhất trong khoảng

27oC – 30oC và cũng là nhiệt độ thích hợp cho việc sản sinh hạch nấm Hạch nấm có thể tồn tại nhiều tháng trong đất ngay cả khi ở trong điều kiện khắc nghiệt (Ristaino & cs 1985), sợi nấm tồn tại trong đất kém hơn hạch nấm khi bị tiêu diệt ở nhiệt độ dưới 0o

C, trong khi đó hạch nấm có thể tồn tại ở nhiệt độ

-10oC

Phạm vi pH tối ưu cho sự phát triển của sợi nấm ở khoảng từ pH 2 đến 5 Hạch nấm cũng có khả năng nảy mầm trong khoảng pH này và bị ức chế trên môi trường kiềm (pH > 7)

Ngoài ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, sự phát triển của sợi nấm và sự nảy mầm của hạch nấm cũng chịu sự tác động của độ ẩm Hạch nấm có thể tồn tại ở

độ ẩm tới 80%, tối ưu 60 – 70%, không tồn tại lâu ở độ ẩm bão hoà

Ở điều kiện in vitro: 27oC, môi trường PDA (Potato Dextrose Agar), tốc

độ phát triển của sợ nấm S.rolfsii đã được quan sát là 0.8 – 0.9 nm mỗi giời,

hạch nấm hình thành sau 5 – 7 ngày (Tu & Kimbr, 1978) Do đó, cây kí chủ dễ

bị xâm nhiễm ở nhiệt độ tối ưu là 27 – 30oC, điều kiện nhiệt độ và độ ẩm cao

Hình 2.6 Nấm Sclerotium rolfsii nuôi cấy trên PDA

2.3.3 Đặc điểm gây bệnh

Hạch nấm tồn tại trong đất qua thời gian dài vẫn có thể gây bệnh Sợi nấm phát triển từ các hạch nấm tồn tại trong đất, xâm nhiễm vào cây qua gốc thân

Sự lây nhiễm thường xảy ra ở các bộ phận của cây khi tiếp xúc với đất Trên cây

lạc nấm S rolfsii xâm nhiễm tại thân, rễ, lá, đốt và vỏ quả Các triệu chứng ban

đầu của bệnh bao gồm các vết bệnh nhỏ, vỏ ngậm nước trên thân dưới hoặc gần

bề mặt đất, sau đó là vàng và héo ở các cành bên, thân chính và cuối cùng là toàn bộ cây Triệu chứng để chẩn đoán của nấm bệnh bao gồm hệ sợi màu trắng đặc trưng và hạch nấm màu nâu kéo dài từ các mô bị bệnh Nấm lây nhiễm vào đốt và vỏ quả gây thối Quá trình xâm nhiễm sẽ diễn ra nhanh và mạnh hơn ở những nơi có tàn dư cây bệnh còn sót lại trên bề mặt đất Các sợi nấm có thể mọc lan đến vài cm trên mặt đất từ cây hoặc mô bị bệnh để xâm nhiễm những cây gần đó Trong điều kiện thuận lợi, hạch nấm nảy mầm và sợi nấm phát triển tấn công phần dưới của gốc thân Trên các mô bị bệnh, một lớp sợi nấm và hạch nấm tạo ra các báo tử nấm Hạch nấm thường mọc sợi khi chúng ở trên đất (độ sâu

ít nhất 5cm) Hạch nấm có thể dễ lây lan qua cây con, nguồn nước, gió hoặc bất kỳ con đường nào trên đất bị nhiễm bệnh hoặc tàn tích thực vật (Punja, 1985)

Nhiều nghiên cứu về nấm S.rolfsii cho thấy nấm này có khả năng sinh ra

một lượng lớn acid oxalic Độc tố này làm biến đổi màu trên hạt và gây nên những vết đốm chết hoại trên lá ở giai đoạn đầu phát triển bệnh (Koklis, 1984)

2.4 Tổng quan về xạ khuẩn

2.4.1 Giới thiệu về xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt Chúng có khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nấm (myces) Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU – Colony – Forming Unit) xạ khuẩn trong 1gram đất thường đạt tới hàng triệu (Giáo trình Vi sinh vật học) Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương, thường có tỉ lệ GC trong AND cao hơn 55%

Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10

dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc

chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn và được xếp vào nhóm

xạ khuẩn hiếm

Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự rADN 16S, lai AND, hình thái, sinh lý sinh hoá và phân loại Hiện nay đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai AND Theo Keswani & cs, đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rADN 16S là 98,6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự rADN 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%

2.4.2 Đặc điểm hình thái

Xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi Hệ sợi của xạ khuẩn chia ra thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản, còn khuẩn ty khí sinh phát triển mạnh hay yếu thậm chí không phát triển tùy từng chi, từng loài

Tập hợp của một nhóm xạ khuẩn riêng rẽ tạo thành khuẩn lạc Khuẩn lạc của xạ khuẩn khá đặc biệt so với khuẩn lạc của vi khuẩn, vi nấm thông thường,

đó là không trơn ướt như vi khuẩn, nấm men mà có dạng thô ráp, dạng phấn không trong suốt, có các nếp gấp tỏa ra hình phóng xạ

Nguồn: Lưu Anh (2017)

Hình 2.7 Hình ảnh khuẩn lạc xạ khuẩn

Đường kính của khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi trong khoảng từ 0,3-1,0 m đến 2-3 Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn đa dạng

Khuẩn ty xạ khuẩn có thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có loại phụ thuộc vào pH môi trường, có loại chỉ tan trong dung môi hữu cơ Trong môi trương đặc hiệu có thể tạo ra sắc tố melanoid màu đen

Đối với một số loài xạ khuẩn, sau một thời gian phát triển, trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử, chuỗi này có thể mọc đơn hoặc vòng Bào tử trần có các hình dạng phong phú

Nguồn: Nguyễn Lân Dũng & cs (1998)

Hình 2.8 Các dạng bào tử của xạ khuẩn 2.4.3 Đặc điểm sinh hoá

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipit, protein và một số hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn C, muối nitrat, muối amon, ure, amino axit, pepton để làm nguồn N Tuy nhiên khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài, các chủng khác nhau

Phần lớn xạ khuẩn thuộc nhóm ôn hoà, là nhóm vi sinh vật hiếu khí, ưa

ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25o

C – 30oC, một số ít ưa nhiệt, có nhiệt độ phát triển tối ưu ở 45o

C – 55oC Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường từ 18o

C – 28oC Độ ẩm thích hợp khoảng 49 – 50%, giới hạn pH từ 6,8 – 7,5, một số loài ưa acid có thể phát triển owr khoảng pH 3,5 đến pH 6,5

2.4.4 Vai trò của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có khả năng sản sinh các chất có hoạt tính sinh học như kháng

vi sinh vật, kháng ohaan bào, ức chế enzyme, ức chế miễn dịch, kháng côn trùng, diệt cỏ và các đặc tính sinh học quý khác (Anandan & cs 2016) Trong số

đó khả năng hình thành chất kháng sinh là quan trọng nhất Đa số các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn đều có phổ kháng sinh rộng, kìm hãm hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau,

đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces được coi là nguồn sản xuất chất

kháng sinh nhiều nhất (Qin & cs 1994) Đến nay, trong khoảng hơn 8000 chất kháng sinh được biết trên thế giới, 80% là do xạ khuẩn sinh ra chủ yếu thuộc các

chi Streptomyces và Micromonospora (Dhanasekaran & cs 2012)

Xạ khuẩn còn được dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, một số vitamin

và axit hữu cơ, các chất sinh học như vitamin nhóm B (B2, B6, B12) Trong nuôi trồng thuỷ sản xạ khuẩn có thể được sử dụng như một loại thuốc để xử lý nước thải Trong môi trường nước, xạ khuẩn tiết ra các loại kháng sinh làm ức chế sự tăng cường của vi khuẩn gây bệnh trong ao nuôi (Nguyễn Lân Dũng &

cs 1998) Trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi, xạ khuẩn được dùng làm chất lên men vật liệu thức ăn thô Các sản phẩm lên men được kỳ vọng sẽ ngăn ngừa nhiễm trùng do vi khuẩn gây bệnh và thay thế việc sử dụng kháng sinh (Hepiyanti & cs 2017) Ngoài ra, xạ khuẩn có hàm lượng protein cao ( > 60%), vitamin nhóm B và các enzyme tiêu hoá, có thể được sử dụng làm thực phẩm hoặc phụ gia trong sản xuất thức ăn cho tôm, đặc biệt là trong giai đoạn ấu trùng, để cải thiện tỷ lệ sống

Trong bảo vệ thực vật, sự đối kháng giữ các vi sinh vật đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây nhằm tạo ra một phương pháp phòng trừ, tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh một cách hiệu quả và thân thiện với môi trường

Tiềm năng của xạ khuẩn trong đa dạng sản xuất các chất chuyển hoá thứ cấp được công nhận rộng rãi bao gồm thuốc kháng sinh (Lee & cs 2014), thuốc chống ung thư, thuốc chống ký sinh trùng, thuốc ức chế miễn dịch và enzyme (Manivasagan & cs 2013)

2.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Sclerotium rolfsii là là một trong những loài nấm có nguồn gốc từ đất, gây

lên thiệt hại nặng nề trong nền sản xuất nông nghiệp Trước những tác hại do

nấm Sclerotium rolfsii gây ra, đã có nhiều nghiên cứu sử dụng nguồn vi sinh vật

có khả năng đối kháng để ức chế sinh trưởng của nấm này Tuy nhiên, các công trình nghiên cứu chủ yếu tập trung vào vi khuẩn và vi nấm

Theo kết quả sàng lọc khả năng đối kháng của 23 chủng xạ khuẩn phân lập với 5 loài nấm khác nhau của Suthindhiran & cs (2014) cho thấy tỷ lệ kháng nấm lần lượt là: Alternaria brassicicola 26.09%, Colletotrichum

gloeosporioides 39.13%, Fusarium oxysporum 43.48%, Penicillium digitatum

56.52%, thấp nhất là Sclerotium rolfsii với 8.70% Điều này cho thấy tỷ lệ xạ khuẩn trong tự nhiên có khả năng kháng nấm Sclerotium rolfsii là khá thấp, điều

này cũng lí giải cho sự hoành hành của dịch bệnh do loài nấm này gây nên

2.5.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Tình hình bệnh rũ gốc mốc trắng hại một số cây trồng vùng Hà Nội và phụ cận (2005-2006): Bệnh rũ gốc mốc trắng là một trong những loại bệnh hại phổ biến, phát sinh gây hại trên nhiều loại cây trồng cạn khác nhau, ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây Tác hại chủ yếu của bệnh là gây nên hiện tượng héo rũ, chết cây và làm ảnh hưởng không nhỏ đến sinh trưởng phát triển của cây và đến năng suất Bệnh rũ gốc mốc trắng phát sinh gây hại trên nhiều loại cây trồng cạn khác nhau ở vùng Hà Nội và phụ cận Nhìn chung bệnh thường xuất hiện trên đồng ruộng từ sau trồng 16-23 ngày trở đi, bệnh có xu hướng tăng dần vào giai đoạn cây bắt đầu ra hoa – hình thành quả Tỷ lệ bệnh rũ gốc mốc trắng trên các loại cây trồng điều tra thường đạt cao nhất vào thời điểm sau trồng 58-72 ngày Kết quả điều tra mức độ nhiễm bệnh trên các cây cà chua, lạc, đậu tương, đậu xanh, đậu trạch, dưa chuột có tỷ lệ bệnh cao nhất tương ứng là: 6,9%; 11,6%; 14,8%; 7,2%; 8,4% và 3,9% (bảng 1) Bệnh hé rũ gốc mốc trắng gây hại nặng nhất trên cây đậu tương (TLB = 14,8%) và nhẹ nhất trên cây dưa chuột (TLB = 3,9%)

Theo nghiên cứu của Le Nhu Cuong & cs (2012) cho thấy tỷ lệ mắc bệnh

cao do nấm Sclerotium rolfsii ở 8 khu vực trồng lạc tại miền trung Việt Nam

trong tổng số 240 ô thực địa quan sát Kết quả cho thấy rằng 5 – 25% số cây

trồng trên ruộng nhiễm nấm S rolfsii Như vậy, tỷ lệ nhiễm nấm bệnh trên cây

lạc tại các khu vực khảo sát có thể lên tới ¼

Ngoài việc ứng dụng nguồn vi sinh vật để ức chế sự phát triển của nấm bệnh, một số loài đồng thời còn có khả năng kích thích sinh trưởng cây trồng như khả năng sinh IAA, GA3 Trong nghiên cứu của Phan Thị Hồng Thảo & cs (2016), các chủng xạ khuẩn nội sinh không những không gây ảnh hưởng đến cây trồng mà còn có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA