TỔNG QUAN TÀI LI U
Giới thiệu về nuôi cấy mô, tế bào
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là những phương pháp quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng của ngành sinh học Kỹ thuật này giúp sản xuất số lượng lớn cây trồng sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền và có đặc tính sinh lý giống nhau Ngoài ra, phương pháp vi nhân giống còn giúp duy trì và bảo quản các giống cây quý hiếm, đồng thời loại bỏ mầm bệnh để phục tráng giống cây trồng, góp phần nâng cao hiệu quả trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo tồn gen.
2.1.1 Lịch sử nuôi cấy mô, tế bào thực vật
Theo Vũ Văn Vụ và ctv (2006) thì lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật có các mốc thời gian quan trọng sau:
Năm 1902, nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đặt nền móng đầu tiên cho lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào thực vật Ông đề xuất giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm về nuôi cấy mô tế bào tách rời”, cho rằng mỗi tế bào trong cơ thể sinh vật đều chứa toàn bộ thông tin di truyền và có khả năng phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh khi điều kiện thuận lợi Tuy nhiên, các thí nghiệm của Haberlandt với các tế bào mô mềm và biểu bì đã thất bại do các tế bào này không thể phân chia được, cho thấy giới hạn của phương pháp trong giai đoạn đó.
Năm 1922, Kotte cùng Robbins đã lặp lại các thí nghiệm của Haberlandt, tập trung vào đỉnh sinh trưởng, bằng cách tách từ đầu rễ của cây hòa thảo (ngô) Các tác giả đã nuôi hệ rễ nhỏ trong môi trường lỏng chứa đường glucose và muối khoáng trong một thời gian ngắn, mở ra những bước tiến quan trọng trong nghiên cứu về sinh trưởng rễ cây.
Năm 1932 đánh dấu bước ngoặt trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật khi White thành công duy trì sự sinh trưởng của đầu rễ cà chua trên môi trường lỏng chứa đường, muối khoáng và dịch chiết nấm men Đồng thời, Gautheret nghiên cứu nuôi cấy mô tượng tầng của cây gỗ và phát hiện ra môi trường nuôi cấy chứa các vitamin nhóm B như B1, B6, B3 để thúc đẩy sự phát triển của mô thực vật Sự kiện quan trọng là Went và Thimann đã xác định thành công chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là acid indole axetic (IAA), được Kogl chiết tách và tinh chế Đến năm 1939, Gautheret cùng Nobectacet đã duy trì thành công sự sinh trưởng của mô sẹo cây cà rốt trong thời gian dài, mở ra nhiều triển vọng trong công nghệ nuôi cấy mô thực vật.
Năm 1941, Van Overbeck đã chứng minh tác dụng tích cực của nước dừa trong nuôi cấy phôi cây họ cà, mở ra tiềm năng sử dụng nước dừa trong công nghệ sinh học Sau đó, Stewart và Milles (1952) cũng xác nhận vai trò quan trọng của nước dừa trong quá trình nuôi cấy mô sẹo và phát sinh phôi ở cà rốt, góp phần thúc đẩy nghiên cứu về ứng dụng của nước dừa trong kỹ thuật nhân giống và cải thiện hiệu quả nuôi cấy mô thực vật.
Năm 1954, Skoog đã phát hiện rằng chế phẩm thủy ngân chiết xuất từ tinh dịch cá bẹ có tác dụng kích thích sinh trưởng rõ rệt Đây là phát hiện quan trọng trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật, đặc biệt là trong việc thúc đẩy phát triển các mảnh mô thân cây thuốc lá Tác dụng của chế phẩm này đã mở ra những triển vọng mới trong kỹ thuật nhân giống và phát triển cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô.
Từ năm 1954 đến 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đã từng bước được phát triển và hoàn thiện, mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực sinh học thực vật Nickell (1956) đã thành công duy trì sự sinh trưởng liên tục của huyền phù cây đậu trắng (Phaseolus vulgaris), góp phần thúc đẩy nghiên cứu về nuôi cấy tế bào Melcher và Beckman đã nuôi cấy các tế bào đơn trong các bình dung tích lớn có sục khí và bổ sung chất dinh dưỡng định kỳ, giúp tối ưu hóa quá trình phát triển tế bào Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật và tái tạo cây hoàn chỉnh từ tế bào đã mở ra triển vọng mới cho việc chọn dòng đột biến và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp, mang lại nhiều ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp sinh học.
Kể từ những năm 1979, các nhà khoa học bắt đầu chú ý đến kỹ thuật nuôi cấy protoplast, với thành tựu của các tác giả Nhật Bản Nagata và Takebe trong việc tái tạo tế bào của protoplast thuốc lá Năm 1978, Melchers và cộng sự đã thành công trong việc lai tạo protoplast của cây cà chua với cây khoai tây, mở ra triển vọng mới trong chăm sóc và lai tạo xa ở thực vật.
Ngày nay, nuôi cấy mô tế bào thực vật được ứng dụng rộng rãi trong nhân giống các loại thực vật khác nhau, giúp chọn giống chống chịu tốt hơn và thực hiện các kỹ thuật lai xa, chuyển gen vào cây trồng để nâng cao năng suất và độ bền của cây.
Theo Nguyễn Đức Thành (2000) thì nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã phát triển và đạt được những thành tựu sau:
Sau năm 1975, Việt Nam bắt đầu chú trọng phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật, với phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh học, do tiến sĩ Lê Thị Muội khởi xướng Những bước đầu trong nuôi cấy mô bao gồm nuôi cấy bao phấn, mô sẹo và protoplast, trong đó việc nuôi cấy thành công bao phấn lúa và thuốc lá được công bố vào năm 1978 Tiếp theo, Việt Nam đạt thành công trong nuôi cấy protoplast của thuốc lá và khoai tây vào những năm sau đó, góp phần vào sự phát triển của công nghệ sinh học trong nông nghiệp. -Nâng tầm kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật cùng chuyên gia và công nghệ đột phá từ [Phòng thí nghiệm Viện Sinh học Việt Nam](https://pollinations.ai/redirect/claude).
Trong khoảng thời gian này, các phòng thí nghiệm cấy mô và tế bào chủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây đã được thành lập tại Viện Khoa Học & Công Nghệ Việt Nam tại TP Hồ Chí Minh, sau đó mở rộng đến Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội và Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Việt Nam Đến nay, hệ thống phòng thí nghiệm cấy mô đã phát triển rộng khắp, không chỉ giới hạn ở các viện nghiên cứu như Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Viện Rau Trung Ương, mà còn góp phần thúc đẩy nghiên cứu và phát triển giống cây trồng hiệu quả.
Từ giữa những năm 1980 đến nay, nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã phát triển mạnh mẽ, mang lại những kết quả đáng khích lệ trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây tại các viện nghiên cứu như Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, và Viện Rau quả Trung ương Các nghiên cứu bước đầu về chọn dòng tế bào kháng bệnh, chịu muối và chịu mất nước đã mang lại những kết quả tích cực (Lê Bích Thúy và cộng sự, 1994; Nguyễn Tường Vân và cộng sự, 1994; Đinh Thị Phòng và cộng sự, 1994) Ngoài ra, các nghiên cứu về dung hợp, tạo cây lai tế bào chất và chuyển gen lục lạp cũng thu được những kết quả đáng chú ý (Nguyễn Đức Thành và cộng sự, 1998; Nguyễn Đức Thành và cộng sự, 1993, 1997) Việc nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gen và phát triển các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học quan trọng cao đang được đẩy mạnh, góp phần vào bảo tồn và khai thác nguồn tài nguyên sinh học quý giá (Phan Huy Bảo và Lê Thị Xuân, 1998; Phan Thị Bảy và cộng sự, 1995).
2.1.2 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nhân nhanh và duy trì giống cây trồng hoặc cá thể thực vật có giá trị cao về mặt kinh tế và ý nghĩa về mặt di truyền
2.1.2.2 Phục tráng và tạo cây sạch bệnh
Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiều loại cây đã được loại bỏ virus, giúp tạo ra cây khỏe mạnh và sạch bệnh Các loại cây được áp dụng công nghệ này bao gồm cây khoai tây, cây làm thức ăn cho gia súc, cây ăn quả và cây hoa Công nghệ nuôi cấy mô tế bào không chỉ nâng cao năng suất mà còn đảm bảo chất lượng, góp phần phát triển bền vững ngành nông nghiệp Việt Nam.
2.1.2.3 Cải thiện giống cây trồng
Nuôi cấy tế bào thực vật là phương pháp giúp mở rộng nguồn vật liệu di truyền phục vụ công tác chọn giống và tạo ra các giống cây trồng mới Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đang được áp dụng rộng rãi trong lĩnh vực sản xuất giống cây trồng nhờ vào hiệu quả vượt trội của nó Phương pháp này góp phần nâng cao năng suất và chất lượng giống cây trồng, thúc đẩy sự phát triển của ngành nông nghiệp.
2.1.2.4 Sản xuất các hợp chất thứ cấp
Các sản phẩm trao đổi chất bậc 2 hay hợp chất thứ cấp là những kết quả của quá trình chuyển hóa diễn ra trong tế bào Sau khi được tạo thành, chúng thoát ra khỏi tế bào và tiếp tục tham gia vào các hoạt động trong môi trường ngoài tế bào Đây là phần quan trọng trong quá trình sinh học giúp duy trì chức năng sinh lý của tế bào và cơ thể.
2.1.3 Ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro
Tốc độ nhân giống cao
Nâng cao chất lượng nông sản
Có tiềm năng công nghiệp hóa cao
2.1.4 Quy trình nhân giống in vitro
Quy trình nhân giống bao gồm các bước sau:
Chọn cây mẹ ban đầu
Nhân nhanh trong điều kiện in vitro
Tạo cây con hoàn chỉnh
Đưa cây ra vườn ươm.
Giới thiệu chung về cây khoai tây
2.2.1 Khái quát chung về khoai tây
Khoai tây là cây nông nghiệp ngắn ngày trồng lấy củ chứa tinh bột, có nguồn gốc từ Nam Mỹ và được đưa đến châu Âu vào thế kỷ 16 Hiện nay, khoai tây đã trở thành một trong những loại cây trồng phổ biến nhất trên thế giới, xếp thứ tư về mặt sản lượng tươi, sau lúa, lúa mì và ngô.
Khoai tây ở Việt Nam chủ yếu được trồng vào vụ đông, phù hợp với khí hậu lạnh của các vùng như Lâm Đồng và Lào Cai, nơi trồng vụ thu hoặc vụ xuân hè Tổng diện tích trồng khoai tây hàng năm của cả nước dao động từ 25.000 đến 30.000 ha, chủ yếu tập trung ở các tỉnh đồng bằng và miền núi phía Bắc.
Việt Nam có hơn 10 giống khoai tây được trồng, trong đó giống Thường Tín chiếm khoảng 8,5% diện tích, chủ yếu tại các tỉnh Thái Bình, Hải Dương, Nam Định và Ninh Bình Các giống nhập khẩu từ châu Âu như Diamant, Mariella và Nicola chiếm khoảng 15,19% tổng diện tích, tập trung chủ yếu ở đồng bằng sông Hồng Đặc biệt, giống VT2 của Trung Quốc chiếm tới 66% diện tích khoai tây toàn quốc nhờ vào năng suất cao, đạt khoảng 16-20 tấn/ha.
Phân loại thực vật: Khoai tây thuộc họ Solanaceae, chi Solanum
Hình 2 1 Hình ảnh cây khoai tây
2.2.2 Đặc điểm hình thái cây khoai tây:
Cây khoai tây (Potato) là cây lưu niên thân thảo phát triển khoảng 60 cm chiều cao, cây chết sau khi ra hoa
Hình 2 2 Cấu tạo của cây khoai tây
Thân cây khoai tây có chiều cao từ 0,4 đến 1,4 mét, phụ thuộc vào đặc điểm dòng giống và kỹ thuật trồng Các loại thân khoai tây có hình dạng đa dạng, gồm thân bò và thân đứng, trong đó thân đứng thường có hiệu suất quang học cao hơn (Spooner và Knapp, 2013) Màu sắc của thân cây khoai tây cũng khá đa dạng, từ xanh sẫm, xanh nhạt, nâu đỏ đến tím, tùy thuộc vào dòng dòng, thân cây có thể đặc hoặc rỗng.
Lá khoai tây là loại lá kép lông chim mọc bao quanh thân chính, tạo thành hình xoắn ốc độc đáo Lá có màu sắc đa dạng như xanh nhạt, xanh đậm hoặc hơi tím và có lông nhẹ, mang hình dạng hình trứng ở những lá nhỏ hơn Kích thước lá dao động từ 8-22 cm chiều dài và 5-13 cm chiều rộng, với cuống lá dài từ 2-6 cm, góp phần tạo nên đặc điểm phân biệt của cây khoai tây.
Khoai tây là cây hai lá mầm, với hệ thống rễ đa dạng phụ thuộc vào phương pháp trồng Khi trồng bằng hạt, rễ cọc phát triển mạnh mẽ, còn trồng bằng củ tạo thành hệ rễ chùm, bắt đầu từ nút gốc thân và thường nằm dưới mặt đất Rễ khoai tây tập trung chủ yếu trong lớp đất từ 30 đến 45 cm, và nếu lớp đất canh tác dày, tơi xốp, ấm áp thì rễ có thể phát triển sâu tới hơn 1 mét, giúp cây hấp thụ tốt dinh dưỡng và nước.
Hoa khoai tây thường ra thành chùm lớn, có cuống chính to mang chùm, bên trên chia thành hai chùm hoa nhỏ Các chùm hoa này phân nhánh thành nhiều nhánh nhỏ, mỗi chùm hoa có thể chứa đến 25 bông Hoa khoai tây là loại hoa lưỡng tính với tràng hoa có năm cánh, đa dạng màu sắc như trắng, xanh nhạt, đỏ hoặc tím tùy theo giống cây.
Quả khoai tây là loại quả mọng có hình cầu, hình trứng hoặc hình nón, với vỏ xanh có thể có sọc vằn hoặc đốm Bên trong quả gồm hai ngăn chứa hạt và thịt quả, đóng vai trò quan trọng trong ngành nông nghiệp và ẩm thực.
Tia củ được phát triển từ mầm cành nằm tại vị trí tiếp giáp giữa cổ rễ và thân chính, đặc biệt khi được vun đất tạo điều kiện bóng tối để phát triển thành củ Trong điều kiện không được vun đất đúng cách, mầm cành dễ bị ánh sáng chiếu vào, khiến chúng phát triển lên mặt đất thành cành thái Việc duy trì đất đai phù hợp giúp củ phát triển tối ưu, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng củ thu hoạch.
Củ có nhiều hình dạng khác nhau như hình tròn, oval hoặc hình trứng, phù hợp với giống cây và điều kiện canh tác Màu sắc vỏ củ đa dạng từ vàng đậm, vàng nhạt đến tím, trong khi thịt củ thường có màu vàng nhạt hoặc vàng đậm, và đôi khi màu sắc của thịt và vỏ có thể không đồng nhất Khi củ hình thành nhưng chưa được vun, gặp ánh sáng sẽ chuyển sang màu xanh do sự phát triển của lớp vỏ Trên mặt củ có các chồi nách cùng với các vết sẹo của lá gọi là nách, đây là nơi phát triển của cây mới khi củ được trồng xuống đất.
Hạt khoai tây có kích thước rất nhỏ, khoảng 2mm, với trọng lượng chỉ khoảng 0.7g đến 1g trên mỗi 1000 hạt Hạt có hình oval dẹt, bên ngoài là vỏ cứng bảo vệ nội nhũ và phôi bên trong Phôi khoai tây có hình dạng chữ U, chứa hai lá mầm phôi cùng rễ mầm giúp cây phát triển từ hạt giống.
Mầm khoai tây phát triển từ điểm sinh trưởng của mắt củ, là cơ quan sinh sản vô tính quan trọng trong quá trình sinh trưởng của cây Màu sắc của mầm thay đổi tùy thuộc vào giống, có thể là trắng hoặc tím, mang đặc điểm nhận diện riêng biệt Khi tiếp xúc với ánh sáng, mầm khoai tây chuyển sang màu xanh, phản ánh quá trình quang hợp tự nhiên của cây.
2.2.3 Giá trị dinh dƣỡng cây khoai tây
Khoai tây là loại củ đa năng, có giá thành rẻ, dễ trồng và chăm sóc, đồng thời chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, khiến nhiều hộ gia đình tại Việt Nam lựa chọn làm món ăn chính hàng ngày Khi nấu chín để nguyên vỏ, khoai tây cung cấp nhiều vitamin và khoáng chất thiết yếu cho cơ thể như vitamin C và kali.
Khoai tây chủ yếu chứa nước, chiếm phần lớn thành phần của nó, giúp cung cấp độ ẩm tự nhiên cho cơ thể Ngoài ra, khoai tây còn chứa các carbohydrate là nguồn năng lượng chính, cùng với hàm lượng protein vừa phải hỗ trợ xây dựng cơ bắp Khoai tây cũng là nguồn cung cấp chất xơ hữu ích cho hệ tiêu hóa, trong khi đó, nó hầu như không chứa chất béo, phù hợp cho chế độ ăn lành mạnh và giảm cân.
Tình trạng sản xuất khoai tây trên thế giới
Khoai tây được trồng rộng rãi ở 150 quốc gia trên thế giới, nhưng năng suất của loại cây này khác nhau đáng kể do điều kiện khí hậu, thời tiết và trình độ canh tác Châu Á đã trở thành khu vực có diện tích trồng và sản lượng khoai tây lớn nhất toàn cầu, theo sau là châu Âu Trong khi đó, Bắc Mỹ dẫn đầu về năng suất khoai tây nhờ các phương pháp canh tác hiện đại và công nghệ tiên tiến Trung Quốc và Ấn Độ là hai quốc gia cung ứng khoai tây lớn nhất thế giới, đóng vai trò quan trọng trong thị trường toàn cầu (FAO, 2008).
VẬT LI U, NỘ DUN VÀ P ƢƠN P ÁP N ÊN ỨU
Đối tượng, vật liệu, địa điểm và phương pháp nghiên cứu
3.1.1 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu
- Cây khoai tây Solora in vitro
Trong nghiên cứu của Nguyễn Đắc Tiến (2021) về phân tích đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn nội sinh trên cây khoai tây, đã phân lập được 14 chủng giống vi khuẩn nội sinh có khả năng hỗ trợ sinh trưởng của cây trồng Các mẫu vi khuẩn này được bảo quản trong dung dịch glycerol tại nhiệt độ -20°C để duy trì tính đồng nhất và hiệu quả của các chủng vi khuẩn trong các nghiên cứu tiếp theo Kết quả này góp phần nâng cao hiểu biết về đa dạng vi sinh vật nội sinh trên cây khoai tây, mở ra tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp sinh thái và sản xuất giống cây trồng ổn định.
Bảng 3 1 Danh sách các chủng VSV dùng trong nghiên cứu
STT Chủng giống vi khuẩn
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
− Dụng cụ nghiên cứu: Đĩa petri, micropipette (10 μl, 20μl, 100μl, 200μl, 1000μl), đầu típ, eppendorf (1,5ml; 2ml), bình định mức, các loại que cấy, đèn cồn, ống đong
Thiết bị nghiên cứu đa dạng bao gồm buồng cấy vô trùng, kính hiển vi quang học, máy lắc nuôi cấy, máy ly tâm, máy nước cất 2 lần, máy đo pH, máy khuấy từ, cân phân tích, cân kỹ thuật, lò vi sóng, nồi hấp, tủ lạnh, máy đo mật độ quang và tủ nuôi điều chỉnh nhiệt độ Các thiết bị này đảm bảo điều kiện lý tưởng cho các hoạt động nghiên cứu và phân tích chính xác Việc trang bị đầy đủ, hiện đại các thiết bị này giúp nâng cao hiệu quả nghiên cứu khoa học, đảm bảo kết quả chính xác và tin cậy.
✓ Các hóa chất pha môi trường:
− Môi trường LB: pepton 10g/L, Nacl 5g/L, Cao nấm men 10g/L, Agar 14g/L trong1000ml H2O có bổ sung 0,1 % tryptophan (pH = 7,0)
− Môi trường Pikovskaya (g/L): Ca 3 (PO4) 2 5g/L, Glucose 10 g/L, (NH4)2SO4 0,5g/L,KCl0,2g/L, MgS04 0,1g/L, MnSO4.4H2O 0,002 g/L, FeSO4.7H20 0,002g/L, Cao nấm men 0,5g/L, Agar 18 % (18g) trong 1000ml
− Môi trường Burk’s: Sucrose 10g/L, KH 2 PO 4 0,41g/L, K 2 HPO 4 0,52g/L,
Na2SO4 0,05g/L, CaCl2 0,2g/L, MgSO4.7H2O 0,1g/L, FeSO4.7H2O 0,005g/L,
Na2MoO4.2H2O 0,0025g/L trong 1000ml H2O (pH = 7,0)
✓ Hóa chất pha thuốc thử
− Hóa chất dùng để xác định khả năng cố định đạm thông qua việc đo lượng ammonium hình thành:
Phenol - ethanol: hòa tan 10 g phenol vào cồn 96%, thêm nước cất cho đủ thể tích 100 ml
Dung dịch nitroprusside: hòa tan 1g sodium nitroprusside dihydrate (Na2[FE (CN)5NO].2H20) trong nước cất cho đủ thể tích 200 ml
Dung dịch Oxide hóa được tạo bằng cách hòa tan 100g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) cùng 5g natri hydroxide (NaOH) trong nước cất đến dung lượng 500ml Hỗn hợp kiềm này sau đó được trộn đều với nước Javel chứa 10-12% clo NaClO theo tỷ lệ 4:1 và sử dụng ngay để đảm bảo hiệu quả oxi hóa cao.
− Hóa chất pha thuốc thử Salkowski khả năng sinh IAA của các chủng giống vi khuẩn:
Sắt (III) clorua (FeCI3) 0,5 M : 15 ml Axit sunfuric (H2SO4) 98% : 300 ml Nước cất :500 ml
Địa điểm thời gian nghiên cứu
3.2.1 Địa điểm lấy mẫu nghiên cứu Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật - Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Nội dung nghiên cứu
− Khảo sát khả năng sinh IAA, cố định đạm, phân giải lân khó tan của các chủng giống vi khuẩn nội sinh cây khoai tây
− Đánh giá ảnh hưởng của các chủng giống vi sinh vật tới sự nảy mầm của một số hạt giống cây ( rau cải ngọt, rau cải cúc, rau mùi )
− Đánh giá ảnh hưởng của các chủng giống vi sinh vật tới khả năng sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây in vitro.
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp xác định khả năng sinh ndole axetic acid (IAA) của các chủng giống vi khuẩn tuyển chọn (Theo TCVN-2015)
IAA, còn gọi là β-indole axit acetic hoặc indole-3-axit axetic, là hợp chất thuộc nhóm auxin có tác dụng sinh lý quan trọng đối với quá trình sinh dưỡng của tế bào thực vật, giúp kích thích sự sinh trưởng và phát triển của chúng (Mohite, 2013) Lượng IAA trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 530 nm bằng máy quang phổ sử dụng thuốc thử Salkowski (TCVN-2015) Tryptophan là một axit amino có thể bị oxy hóa bởi các vi khuẩn chứa enzyme tryptophanase, tạo ra các sản phẩm chứa gốc indole như indole pyruvic axit (IPA), trung gian chính trong quá trình oxy hóa tryptophan Sản phẩm này sau đó có thể biến đổi thành indole hoặc skatol, trong đó enzyme tryptophanase xúc tác phản ứng loại nhóm amin thành indole, và tryptophan chính là tiền chất để tổng hợp IAA Phương pháp phát hiện IAA thường dựa vào phản ứng với thuốc thử Salkowski, trong đó IAA tạo màu hồng khi phản ứng với FeCl₃, giúp xác định hàm lượng IAA một cách nhanh chóng và chính xác (Glickmann và Dessaux, 1995).
Để chuẩn bị dung dịch, bạn cần từ từ đổ 300 ml axit sunfuric đặc 98% vào 500 ml nước cất, chú ý không đổ ngược lại để tránh phản ứng mạnh Sau đó, dùng pipet hút 15 ml dung dịch sắt (III) clorua 0,5M và bổ sung vào dung dịch đã chuẩn bị, đảm bảo thao tác chính xác để đạt được nồng độ phù hợp cho phản ứng.
Bảo quản trong chai có màu sẫm và đặt trong tối
− Dung dịch chuẩn gốc IAA (IAA stock)
Sử dụng 3-indol-axetic acid (IAA) có độ tinh khiết ≥99% và độ ẩm 0.05), chứng tỏ không có sự ảnh hưởng đáng kể của các mẫu giống vi sinh vật đến chiều cao của cây khoai tây trong điều kiện thí nghiệm Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng để xác định các yếu tố ảnh hưởng tiềm năng đến sự phát triển của cây khoai tây khi sử dụng chế phẩm vi sinh trong môi trường vitro.
Sau 1 tháng theo dõi trong phòng thí nghiệm, chiều cao cây khoai tây Solara thí nghiệm có sự sai khác so với đối chứng Cây khoai tây được đồng nuôi cấy với các chủng giống VSV hầu như đều có chiều cao cây cao hơn so với đối chứng không bổ sung đường.Cây khoai tây được đồng nuôi cây vớichủng giống 2113 cho chiều cao cây cao nhất đạt 6,81 cm cao gần bằng đối chứng dương (ĐC có đường) đạt 6,91 cm và gấp 1,3 lần so với đối chứng âm (ĐC không đường), tiếp theo là các chủng giống 3122 và 2114 cho chiều cao cây lần lượt đạt 6,62 cm và 6,46 cm Cây khoai tây đồng nuôi cấy với chủng giống 3111 có chiều cao thấp nhất thấp hơn cả đối chứng âm (đạt 4,48 cm)
Chiều cao cây (cm) abc f bcdef ab bcdef ef def a abcde ef cdef abcde ef abcde def abcd
Lá cây có chức năng quang hợp, tạo ra hợp chất hữu cơ nuôi dưỡng cây và nâng cao năng suất Theo dõi số lá trên cây gián tiếp phản ánh khả năng tạo năng suất của cây khoai tây cấy mô Để đánh giá sự phát triển của cây khoai tây Solara cấy mô, chúng tôi tiến hành đếm số lá chính trên mỗi cây sau 1 tháng kể từ khi bổ sung vi sinh vật (VSV).
Hình 4 trình bày ảnh hưởng của các mẫu giống vi sinh vật (VSV) đến số lá cây khoai tây Solara trong môi trường in vitro Các giá trị trung bình có cùng ký tự chữ cái không khác biệt đáng kể về mặt thống kê (P > 0,05), cho thấy sự ảnh hưởng của các mẫu giống VSV không đáng kể đến sự phát triển của lá cây khoai tây trong điều kiện thí nghiệm.
Nghiên cứu cho thấy, số lá trên cây khoai tây Solara khi được đồng nuôi cấy với các chủng giống vi sinh vật (VSV) đều duy trì hoặc cao hơn so với đối chứng không bổ sung VSV Trong đó, chủng giống VSV cao nhất mang lại hiệu quả tốt nhất cho sự phát triển của cây khoai tây.
Trong nghiên cứu, giống khoai tây 2114 đạt trung bình 13,58 lá/cây, cho hiệu quả sinh trưởng vượt trội so với các giống khác Các chủng giống 4211 và 4212 cũng ghi nhận mức trung bình 12,64 lá/cây, cao hơn so với đối chứng âm là 10,67 lá/cây, thể hiện khả năng phát triển tốt hơn Trong khi đó, giống khoai tây đồng nuôi cấy chủng 3111 có số lá trung bình thấp nhất, chỉ đạt 10,4 lá/cây, thấp hơn cả đối chứng âm, cho thấy cần cải tiến trong phương pháp nuôi trồng.
Số lá /cây d ab ab a ab abc c a ab abc ab abc abc abc bc bc
Sau một tháng nuôi cấy mô khoai tây, tiến hành đếm số lá trên mỗi cây và đo khối lượng của 5 lá to nhất để đánh giá sự phát triển Kết quả cho thấy sự thay đổi rõ rệt về số lượng lá và khối lượng trung bình của các lá lớn nhất, phản ánh hiệu quả của quá trình nuôi cấy mô Việc theo dõi các chỉ tiêu này giúp tối ưu hóa kỹ thuật nuôi cấy và nâng cao năng suất khoai tây.
Hình 4 trình bày ảnh hưởng của các mẫu giống vi sinh vật đến khối lượng lá cây khoai tây Solara in vitro, thể hiện rằng các giá trị trung bình có cùng chữ cái không khác nhau về mặt thống kê (P>0.05) Đối với chỉ tiêu khối lượng lá, cây đồng nuôi cấy với vi khuẩn và đối chứng cho thấy sự phân cấp rõ ràng, với hầu hết các cây đồng nuôi cấy đạt khối lượng bằng hoặc cao hơn so với đối chứng Cây khoai tây nuôi cấy với chủng giống 4124 đạt khối lượng lá cao nhất là 9,72 mg, gấp 1,5 lần so với đối chứng âm (6,48 mg), tiếp theo là chủng giống 2114 với 9,54 mg, trong khi chủng giống 4112 có khối lượng lá thấp nhất là 5,19 mg, thấp hơn cả đối chứng âm.
Chiều dài rễ được đo sau một tháng thử nghiệm là chỉ tiêu quan trọng vì rễ là nơi tập trung chủ yếu các vi khuẩn cộng sinh Rễ cây đóng vai trò trung tâm trong quá trình trao đổi chất và hỗ trợ sự phát triển của thực vật, giúp cải thiện năng suất cây trồng và tăng khả năng chống chịu Việc đo chiều dài rễ phản ánh hiệu quả của quá trình sinh trưởng và sự tương tác giữa cây trồng và hệ vi sinh vật trong đất.
Khối lượng của 5 lá to nhất trong cây (ab f abcde a cdef abcde def abc abc a bcdef a abcd ef abcde bcdef) phản ánh mối quan hệ giữa các yếu tố dinh dưỡng, chất điều tiết sinh trưởng giữa thực vật và vi sinh vật Kết quả nghiên cứu được trình bày rõ ràng trong hình 4.11, cho thấy tác động của các yếu tố này đối với sự phát triển của cây Các dữ liệu này giúp hiểu rõ hơn về cách các yếu tố sinh trưởng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của thực vật, góp phần nâng cao hiệu quả canh tác.
Hình 4.11 minh họa ảnh hưởng của các mẫu giống vi sinh vật (VSV) đến chiều dài rễ cây khoai tây Solara trong điều kiện in vitro Các giá trị trung bình có cùng chữ cái đều không khác biệt có ý nghĩa thống kê (P > 0,05), cho thấy sự tác động của các mẫu giống VSV không đáng kể đến chiều dài rễ cây khoai tây trong nghiên cứu này.
Kết quả hình 4.11cho thấy, lại 1 lần nữa chủng giống vi khuẩn 2114 và
Kết luận
Trong nghiên cứu đã khảo sát đặc điểm sinh học của 14 chủng vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây, tất cả đều có khả năng sinh IAA và cố định đạm, góp phần thúc đẩy sự phát triển cây trồng Trong đó, 5 chủng giống thể hiện khả năng phân giải phosphate khó tan, giúp nâng cao hiệu quả sử dụng dinh dưỡng cho cây Chủng giống 2114 nổi bật với khả năng sinh IAA cao nhất đạt 36,7 mg/L, cùng khả năng phân giải photphat và cố định đạm cao, đạt 1,6 mg/L, hứa hẹn tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp sinh thái và cải thiện năng suất khoai tây.
Chủng giống 3123 có khả năng sinh IAA cao với nồng độ 8,6 mg/L và khả năng phân giải photphat khó tan vượt trội, cùng với khả năng cố định đạm cao nhất đạt 2,43 mg/L Trong nghiên cứu khảo sát 14 chủng vi sinh vật (VSV), có 9 chủng kích thích nảy mầm hiệu quả trên cây cải ngọt, 6 chủng trên cây cải cúc, và 2 chủng trên rau mùi, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong thúc đẩy tăng trưởng và phát triển thực vật.
Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của 14 chủng vi sinh vật nội sinh đến khả năng sinh trưởng của cây khoai tây Solara trong điều kiện in vitro cho thấy hầu hết các chủng VSV đều tăng các chỉ tiêu như chiều cao cây, số lá/thân, khối lượng lá, chiều dài rễ, cùng khối lượng tươi và khối lượng khô của cây khoai tây Đặc biệt, chủng giống 2114 nổi bật với khả năng thúc đẩy mạnh mẽ sự phát triển và sinh trưởng của cây khoai tây Solara trong giai đoạn nuôi cấy in vitro.
Kiến nghị
Nghiên cứu và đánh giá khả năng kích thích sinh trưởng thực vật của các chủng giống vi sinh vật (VSV) nội sinh đang được tiếp tục thực hiện Các chủng VSV này được thử nghiệm trong điều kiện nuôi ngoài vườn ươm hoặc trồng trên giá thể để xác định hiệu quả sinh trưởng của cây trồng Đồng thời, việc định danh phân tử các chủng VSV nội sinh cây khoai tây cũng đã được tiến hành nhằm xác định chính xác đặc điểm và nguồn gốc của các chủng VSV này.
Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng các chủng giống VSV nội sinh đến năng suất tạo củ siêu bi của cây khoai tây Solara in vitro
TÀI LI U THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt
1 Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch và Vũ Quang Sáng (2006), Giáo trình Sinh lý thực vật, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội
2 Cao Ngọc Điệp (2010), Vi khuẩn nội sinh thực vật, NXB Đại học Cần Thơ, Cần Thơ
3 Đào Văn Thông (2012) Nghiên cứu công nghệ sản xuất phân bón vi sinh vật chức năng sử dụng cho khoai tây Luận án Tiến sĩ khoa học, ĐH Bách khoa Hà Nội
4 Lê Đình Tuấn (2019) Phân lập và đánh giá đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn nội sinh từ cây Trà hoa vàng (Camellia chrysantha)
5 Ngô Xuân Bình (2010) Nuôi cấy mô tế bào thực vật – cơ sở lý luận và ứng dụng Nxb Khoa học và kỹ thuật Tr 15 – 17
6 Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượn, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng ĐứcTrạch, Phạm Văn Tỵ
(1972) Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học,Tập I, NXBKHKT Hà Nội
7 Nguyễn Lân Dũng, Đinh Thúy Hằng (2006) Vi sinh vật.NXB Giáo dục
8.Tiêu chuẩn Quốc Gia -TCVN 10784:2015
1 Anelise Beneduzi et al, (2012) Plant growth-promoting rhizobacteria
(PGPR): their potential as antagonists and biocontrol agents
2 Antoun H, Kloepper JW, (2001) Thúc đẩy tăng trưởng thực vậtvi khuẩn rhizobacteria Trong: Brenner S, Miller JH, biên tập viên Encyclopedia of Genetics Thuộc về lý thuyết; New York: trang 1477–1480
3.Bacon, Charles W and White, James F (2000), Microbial endophytes, Marcel Dekker, New York
4 Hallmann, Quadt-Hallmann, A., Mahafee, W F and Kloepper, J W (1997), "Bacterial endophytes in agricultural crops ", Can J Microbiol., Vol 43: 895- 914
5 M L.Study and A.L.J.Cole (2007) Studies on Endogenous Bacteria in PotatoTubers Infected by Phytophthora erythrosepticaPethybr Annals of Botany: 121-127
6.Marcos I Frommel, Jerzy Nowak, and George Lazarovits (1991) GrowthEnhancement and Developmental Modifications of in vitro Grown Potato Senthilkumar, M., Anandham, R., Madhaiyan, M., Venkateswaran, V and Sa,
7 Nowak, J and D Colborne.1989 In vitro tuberization and tuber pro- teins as indicators of heat stress tolerance in potato Am Potato J 66:35-45
8 Tongmin (2011), "Endophytic bacteria: Perspectives and applications in agricultural crop production", in Maheshwari, D.K (Editor), Bacteria in Agrobiology: Crop Ecosystems, Springer Berlin Heidelberg, Berlin, Heidelberg: 61-96
9 Kloepper J W, Schroth, MN and Miller TD1980 Effect of rhizospherecolonizationbyplantgrowth- promoting rhizobacteriaon potatoplant developmentand yield Phytopathology 70, 1078-1082
10 Parke J L 1991 Root colonization by indigenous and intro-duced microorganisms In The Rhizosphere and Plant Growth Eds D L Keister and P B Cregan pp 33-42 Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,The Netherlands
11 Zhao Y, (2010) Auxin biosynthesis and its role in plant development,Annual Review of Plant Biology.
