VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian tiến hành Khoá luận bắt đ u từ tháng 01/2022 đến tháng 07/2022
- ịa điểm nghiên cứu: Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Vật liệu nghiên cứu
40 mẫu bệnh phẩm mảnh sinh thiết dạ dày đƣợc lấy từ bệnh nhân nội soi dạ dày tại Bệnh viện 19 – 8.
Hoá chất và thiết bị
- Bộ DNeasy Blood and Tissue Kits (QIAGEN – Mỹ) dùng trong tách chiết DNA
- Bộ kit DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Scientific – Mỹ) s dụng trong chạy phản ứng PCR
- Bộ GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific – Mỹ) s dụng trong tinh sạch sản phẩm PCR
- Bộ mồi đặc hiệu dùng trong phản ứng PCR
Bảng 3.1 Thông tin về mồi sử dụng trong kỹ thuật PCR
Gen Tên mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Kích thước (bp)
- Hoá chất dùng trong chạy điện di
Bảng 3.2 Hoá chất dùng trong chất điện di
STT Hoá chất Hãng sản xuất
3 6X Loading Dye (6XLD) Thermo Scientific (Mỹ)
- Một số hoá chất đi kèm trong các thí nghiệm như: Cồn 70 o C, nước deion
3.3.2 Dụng cụ và thiết bị
Bảng 3.3 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên Hãng sản xuất
3 u tip các loại Watson (Mỹ)
6 Kẹp, phanh, kéo Việt Nam
7 Cối, chày sứ Việt Nam
8 Túi zip các loại Việt Nam
10 Khuôn, lƣợc đổ gel Bio – rad (Mỹ)
Bảng 3.4 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên Hãng sản xuất
1 Nồi hấp tiệt trùng Trung Quốc
2 Bể ổn nhiệt Bio – rad (Mỹ)
3 Cân điện t Shimadzu (Nhật Bản)
4 Máy ly tâm Eppendorf ( ức)
5 Máy Vortex Wisteg (Hàn Quốc)
6 Máy PCR 32 giếng model 322 Astec (Nhật Bản)
7 Lò vi sóng Samsung (Hàn Quốc)
8 Bể điện di Bio – rad (Mỹ)
9 Máy soi gel Dolphin − DOC Wealtec (Mỹ)
10 Tủ lạnh -20 o C Sanyo (Nhật Bản)
11 Tủ lạnh -80 o C Sanyo (Nhật Bản)
Nội dung nghiên cứu
Trong bài viết này, chúng tôi xác định rằng việc tách chiết DNA tổng số từ các mẫu vi khuẩn H pylori trong mảnh sinh thiết dạ dày của bệnh nhân được thực hiện sau khi họ được chỉ định nội soi dạ dày tại Bệnh viện 19-8 Quá trình này giúp đảm bảo việc phân tích chính xác và hiệu quả các mẫu bệnh phẩm, từ đó hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh tốt hơn Việc tách chiết DNA là bước quan trọng để nghiên cứu gen và kháng thuốc của vi khuẩn H pylori trong các mẫu sinh thiết dạ dày, góp phần nâng cao hiệu quả khám chữa bệnh cho bệnh nhân.
Nghiên cứu tập trung vào thông tin gen CagA trên gen ank, bao gồm thiết kế mồi và khuếch đại các phân đoạn gen CagA bằng phản ứng PCR để phát hiện và phân tích đặc điểm của gen này Quá trình giải trình tự nucleotide của vùng gen CagA giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và biến thể gen, góp phần cải thiện chẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ học các chủng vi khuẩn liên quan Các bước này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định vai trò của gen CagA trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn Helicobacter pylori, nâng cao các chiến lược phòng chống và kiểm soát.
Phân tích đặc điểm của phân tử DNA của gen CagA giúp hiểu rõ về tính variability và đặc điểm sinh học của H pylori Việc so sánh trình tự gen CagA của các chủng H pylori Việt Nam và quốc tế đã công bố trên GenBank cho thấy sự đa dạng di truyền trong các chủng vi khuẩn này Dựa trên dữ liệu trình tự nucleotide của vùng gen CagA, chúng tôi đã xây dựng cây phát sinh chủng loại (phylogenetic tree) nhằm xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các chủng H pylori, từ đó hỗ trợ các nghiên cứu về nguồn gốc, lây truyền và đặc điểm sinh học của vi khuẩn này.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Thu thập và xử lý mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm được bảo quản lạnh tại Bệnh viện 19 – 8 rồi vận chuyển đến phòng thí nghiệm của Phòng Miễn dịch học – Viện Công nghệ sinh học để tiến hành phân tích Để đảm bảo chính xác, mẫu đi kèm các thông tin quan trọng như thông tin bệnh nhân, chẩn đoán lâm sàng, thời gian lấy mẫu và kết quả xét nghiệm Urea Việc bảo quản và vận chuyển đúng quy trình giúp duy trì chất lượng mẫu và nâng cao hiệu quả chẩn đoán y học.
Sau khi tiếp nhận mẫu bệnh phẩm, phòng sẽ tiến hành xử lý mẫu bằng cách làm bất hoạt ở nhiệt độ cao 100°C trong 20 phút để đảm bảo an toàn Sau đó, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ –80°C để duy trì chất lượng và chuẩn bị cho các bước thí nghiệm tiếp theo Quá trình xử lý và bảo quản mẫu bệnh phẩm đúng quy trình là yếu tố quan trọng trong xét nghiệm y học chính xác.
3.5.2 Tách chiết DNA tổng số từ mảnh sinh thiết dạ dày
Tách chiết acid nucleic là quá trình phân lập và tinh sạch DNA hoặc RNA từ mẫu nghiên cứu, sử dụng kết hợp các kỹ thuật vật lý, hoá học và sinh học để đảm bảo độ tinh khiết và chất lượng cao Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu sinh học phân tử, giúp phân tích cấu trúc và chức năng của acid nucleic một cách chính xác Việc tách chiết acid nucleic hiệu quả hỗ trợ các ứng dụng trong xét nghiệm y học, nghiên cứu di truyền và phát triển công nghệ sinh học mới.
Bảng 3.5 Quy trình tách chiết DNA từ mảnh sinh thiết dạ dày sử dụng Bộ Dneasy
Cắt nhỏ, nghiền nhỏ mảnh sinh thiết dạ dày và cho vào ống Eppendorf 1,5 ml
Bổ sung 180 àl Buffer ATL
2 Thờm 20 àl Proteinase K, sau đú vortex và ủ ở 56 o C cho đến khi mụ đƣợc ly giải hoàn toàn
3 Vortex trong 15 giõy, bổ sung 200 àl uffer AL vào mẫu, sau đú vortex Ủ mẫu ở 56 o C trong 10 phút
4 Thờm 200 àl Etanol (96 – 100%), sau đú đảo nhẹ mẫu
5 Chuyển cột ly tâm 12000 vòng/phút, trong 2 phút
Bỏ dịch phía dưới ống hứng
6 Thờm 500 àl uffer AW1 và ly tõm trong 2 phỳt với tốc độ 12000 vũng/phỳt
Bỏ dịch dưới ống hứng
7 Thờm 500 àl uffer AW2 và ly tõm trong 3 phỳt ở tốc độ 12000 vũng/phỳt)
Bỏ dịch dưới ống hứng
8 Ly tâm làm khô 2 l n với tốc độ 12000 vòng/phút, mỗi l n 2 phút
Bổ sung 40 àl uffer AE vào giữa cột Ủ trong 2 phút ở nhiệt độ phòng
Ly tâm ở 12000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA tổng số
Bảo quản DNA tổng số ở -20 o C
3.5.3 Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR thu nhận trình tự nucleotide vùng 3’ gen Cag A của H pylori
Cơ sở lý thuyết của đoạn mồi (primer) là một oligonucleotide dùng để khởi đầu quá trình nhân đôi DNA Hầu hết các DNA polymerase không thể bắt đầu tổng hợp DNA mới thiếu primer Primer chỉ gắn các nucleotide vào sợi DNA có sẵn theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn, do đó, thiết kế mồi đóng vai trò quyết định đến mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng PCR.
Tiến hành thiết kế mồi
Quá trình thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR nhằm thu nhận trình tự nucleotide vùng gen Cag A của H pylori bắt đầu bằng việc so sánh tương đồng các chuỗi gen đã thu nhận từ Ngân hàng gen để xác định các vùng trình tự bảo thủ Tiếp theo, tính toán nhiệt độ nóng chảy của mồi phù hợp để tối ưu hóa phản ứng PCR Sau khi xác định được trình tự mồi, quá trình tổng hợp được thực hiện tại The First Base (Singapore) Thông tin về cặp mồi do The First Base tổng hợp đã được trình bày trong Bảng 3.1.
Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) cho phép tạo ra số lượng lớn các đoạn DNA mục tiêu bằng cách nhân nhanh in vitro qua chu trình nhiệt gồm ba giai đoạn cơ bản Theo TS Trường Sơn (2020), nguyên lý của kỹ thuật này dựa trên phản ứng xúc tác của enzyme DNA polymerase với hai đoạn mồi oligonucleotide (primer xuôi – ngược) để nhân bản một đoạn DNA mục tiêu Ban đầu, kỹ thuật này sử dụng enzyme Klenow fragment của E coli thay cho DNA polymerase, nhưng bị bất hoạt Sau đó, nhà khoa học Thomas Brock phát hiện enzyme Taq polymerase của vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng Yellowstone, giúp quá trình PCR phát triển vượt bậc nhờ khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao.
Thành ph n của phản ứng PCR thông thường c n có: DNA khuôn, môi xuôi, mồi ngược, dNTPs, polymerase chịu nhiệt, Mg 2+ , và dụng dịch đệm làm môi trường phản ứng
Chẩn đoán mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật PCR
Các mẫu bệnh phẩm dương tính với H pylori qua xét nghiệm urease đã được xác nhận lại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu, nhằm khuyếch đại vùng gen 16S rDNA của vi khuẩn H pylori (xem Thông tin tại Bảng 3.1).
Thu nhận vùng 3’ gen Cag A bằng kỹ thuật PCR
Sau khi thẩm định chính xác các mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu khuyếch đại vùng gen 16S rDNA của vi khuẩn H pylori, các mẫu đã được xác nhận sẽ tiếp tục thực hiện xét nghiệm PCR với cặp mồi tự thiết kế (xem Bảng 3.1) nhằm thu nhận vùng 3’ của gen CagA, góp phần xác định chính xác chủng vi khuẩn H pylori trong mẫu bệnh phẩm.
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tích
Bảng 3.7 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Bước phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian (phút) Số chu kỳ
Tinh sạch sản phẩm PCR
Tinh sạch sản phẩm PCR là quá trình thu DNA mục tiêu bằng cách loại bỏ các tạp chất như đệm, enzyme, mồi, giúp đảm bảo độ sạch của DNA và thuận tiện cho việc bảo quản, sử dụng sau này Quá trình này đảm bảo DNA đạt tiêu chuẩn cao, không bị nhiễm các tạp chất gây ảnh hưởng đến kết quả phân tích hoặc phản ứng sau đó Việc tinh sạch DNA PCR góp phần nâng cao độ chính xác, tin cậy của các nghiên cứu và ứng dụng trong xét nghiệm sinh học, y học Do đó, quá trình tinh sạch DNA PCR đóng vai trò quan trọng trong quy trình xử lý mẫu và đảm bảo chất lượng dữ liệu khoa học.
Bảng 3.8 Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng Bộ GeneJET PCR Purification
Bổ sung inding uffer vào ống chứa sản phẩm PCR với tỉ lệ 1:1 theo thể tích, trộn đều bằng pipet
2 Chuyển dịch lên cột, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch dưới ống hứng
3 Bổ sung 700 àl Wash uffer, ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 1 phỳt, loại bỏ dịch dưới ống hứng
4 Ly tâm làm khô 13000 vòng/phút trong 2 phút
Chuyển cột lọc sang ống thu, bổ sung 30 àl Elution uffer, ủ nhiệt độ phũng
2 phút, ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ cột lọc, thu nhận DNA tinh sạch
3.5.5 Kỹ thuật điện di để kiểm tra sản phẩm PCR
Di chuyển của acid nucleic trong điện di là quá trình DNA hoặc RNA di chuyển từ cực âm (catot) sang cực dương (anot) trên gel dưới tác dụng của điện trường Độ di chuyển của acid nucleic phụ thuộc chủ yếu vào kích thước, khối lượng và cấu trúc của phân tử, giúp phân tích và xác định chính xác các loại acid nucleic trong nghiên cứu sinh học.
Quá trình điện di sản phẩm PCR được tiến hành theo các bước sau:
- ƣớc 1: Chuẩn bị gel Agarose
Chuẩn bị gel agarose 1% bắt đầu bằng cách cân 1g agarose và pha vào 100ml dung dịch đệm TAE 1X Đun sôi dung dịch agarose trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn, sau đó để gel nguội trước khi sử dụng.
Đổ 30 – 40°C dung dịch agarose vào khay điện di đã chuẩn bị sẵn lưới Để nguội trong khoảng 20 – 30 phút, sau đó rút lưới ra và đổ dung dịch TAE 1X vào bể điện di Tiếp theo, đặt khay điện di vào bể điện di sao cho ngập khay để tiến hành quá trình điện di hiệu quả.
- ƣớc 2: Tra mẫu điện di
Trộn đều sản phẩm PCR với 6X Loading Dye (6XLD) theo tỷ lệ 5 µL sản phẩm PCR với 1 µL 6XLD để tránh tạo bọt Sau đó, chuyển các mẫu đã trộn vào các giếng trên bản gel để chuẩn bị chạy điện di Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 110V trong khoảng 25-30 phút để phân tách mẫu DNA hiệu quả.
Chú ý thực hiện các thao tác cẩn thận để tránh làm thủng giếng, trào mẫu hoặc nhiễm mẫu giữa các giếng Quy trình điện di được thực hiện theo thứ tự rõ ràng gồm: Thang chuẩn, Chứng âm, Mẫu 1, Mẫu 2, và các mẫu tiếp theo, cuối cùng là Chứng dương.
- ƣớc 3: Nhuộm bản gel điện di bằng Ethidium bromide
Sau khi chạy xong, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium Bromide 0,1% trong 10 phút rôi lấy bản gel ra và r a lại bằng nước
Để kiểm tra kết quả, bạn cần quan sát và chụp ảnh bản gel đã được nhuộm Ethidium Bromide 0,1% bằng máy chụp ảnh gel Dolphin – DOC trong buồng chụp UV Sau khi bật nguồn máy, tiến hành chụp ảnh và lưu lại hình ảnh vào ổ nhớ của máy tính đã kết nối sẵn với thiết bị.
3.5.6 Phương pháp giải trình tự
Phương pháp Sanger là một trong những phương pháp xác định trình tự DNA phổ biến do Frederick Sanger nghiên cứu và phát triển năm 1977