Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nhân giống cây khôi nhung tía (ardisia silvestris pitard) trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình cảm ứng hỉnh thành callus ở giống cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi .... Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân nhanh callus của giống cây

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHUNG TÍA (ARDISIA SILVESTRIS PITARD) TRONG

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

HÀ NỘI - 2022

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHUNG TÍA (ARDISIA SILVESTRIS PITARD) TRONG

NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Người thực hiện : NGUYỄN PHẠM LƯU ANH

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài khóa luận này là công trình nghiên cứu thực sự của tôi, được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức chuyên ngành và dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Phạm Phú Long và TS Nguyễn Thị Thúy Hạnh

Các số liệu, kết quả, hình ảnh, bảng biểu đưa ra hoàn toàn trung thực, chưa từng được sử dụng và công bố trong các công trình nghiên cứu khoa học nào trước đây

Tôi xin cam đoan các thông tin, tài liệu tham khảo trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng và học viện

Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022

Người thực hiện

Nguyễn Phạm Lưu Anh

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực tập tốt nghiệp và hoàn thành khóa luận, tôi đã nhận được sự giúp được sự giúp đỡ về nhiều mặt của các cấp lãnh đạo, các tập thể và các cá nhân

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt cho tôi những kiến thức để làm hành trang sau này Đặc biệt là thầy

cô khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, những người thầy, người cô mang trái tim nhiệt huyết và yêu nghề

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến TS Phạm Phú Long và TS Nguyễn Thị Thúy Hạnh, thầy và cô đã luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn thân thương nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã cổ vũ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2022

Sinh viên

Nguyễn Phạm Lưu Anh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii

TÓM TẮT ix

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Tổng quan về cây Khôi nhung tía 4

2.1.1 Phân loại thực vật 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái 4

2.1.3 Khu vực phân bố 6

2.1.4 Thực trạng 7

2.1.5 Thành phần hóa học 7

2.1.6 Công dụng 8

2.1.7 Giá trị kinh tế 9

2.1.8 Điều kiện sinh thái 9

2.2 Những nghiên cứu về Khôi nhung tía ở trong và ngoài nước 9

2.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới 9

2.2.2 Các nghiên cứu trong nước 10

2.3 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 11

2.3.2 Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 12

2.3.3 Các giai đoạn của nuôi cấy mô tế bào thực vật 13

2.3.4 Môi trường nuôi cấy 14

2.3.5 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật 17

2.3.6 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật 18

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 Địa điểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu 20

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu 20

3.1.2 Thời gian nghiên cứu 20

3.1.3 Vật liệu nghiên cứu 20

3.2 Nội dung nghiên cứu 20

3.3 Phương pháp nghiên cứu 21

3.4 Bố trí thí nghiệm 21

3.4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình cảm ứng hình thành callus từ cây bố mẹ 21

3.4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân nhanh callus của giống cây Khôi nhung tía 22

3.4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình tái sinh chồi từ callus của giống cây Khôi nhung tía 23

3.4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của giống cây Khôi nhung tía 24

3.4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ của giống cây Khôi nhung tía 25

3.4.6 Thí nghiệm 6: Đánh giá khả năng thích ứng ngoài vườn ươm 25

3.5 Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu 26

3.5.1 Các chỉ tiêu theo dõi 26

3.5.2 Phương pháp xử lý số liệu 27

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình cảm ứng hình thành callus từ cây bố

mẹ 28

4.2 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân nhanh callus của giống cây Khôi nhung tía 31

4.3 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình tái sinh chồi từ callus của giống cây Khôi nhung tía 35

4.4 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của giống cây Khôi nhung tía 38

4.5 Ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ của giống cây Khôi nhung tía 41

4.6 Đánh giá khả năng thích ứng ngoài vườn ươm của giống cây Khôi nhung tía 46

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

5.1 Kết luận 49

5.2 Kiến nghị 50

PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của TDZ đến quá trình cảm ứng

hình thành callus từ cây bố mẹ 21 Bảng 3.2 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân

nhanh callus của giống cây Khôi nhung tía 22 Bảng 3.3 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của TDZ đến quá trình tái sinh

chồi từ callus của giống cây Khôi nhung tía 23 Bảng 3.4 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của TDZ đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của giống cây Khôi nhung tía 24 Bảng 3.5 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ

của giống cây Khôi nhung tía 25 Bảng 4.1 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình cảm ứng hỉnh thành callus ở

giống cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi 29 Bảng 4.2 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân nhanh callus của giống

cây Khôi nhung tía sau 20 ngày và 30 ngày nuôi cấy và theo dõi 32 Bảng 4.3 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình tái sinh chồi từ callus của

giống cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy theo dõi 35 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

giống cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi 39 Hình 4.4 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của

giống cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi 40 Bảng 4.5 Ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ của giống cây Khôi

nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi 45 Bảng 4.6 Sinh trưởng và phát triển ngoài vườn ươm của Khôi nhung tía 47

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 2.1 Cây Khôi nhung tía (nguồn: Internet) 4

Hình 2.2 Lá cây Khôi nhung tía (nguồn: Internet) 5

Hình 2.3 Hoa cây Khôi nhung tía (nguồn: Internet) 6

Hình 2.4 Quả cây Khôi nhung tía (nguồn: Internet) 6

Hình 4.1 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình cảm ứng hình thành callus từ lá cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi 30

Hình 4.2 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân nhanh callus của giống cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi 33

Hình 4.3 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình tái sinh chồi từ callus của giống cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi 36

Hình 4.5 Ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ của giống cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi 46

Hình 4.6 Khôi nhung tía sau 20 ngày ngoài vườn ươm 47

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

STT VIẾT TẮT VIẾT ĐẦY ĐỦ

14 SH Schenk & Hildebrandt Basal Salt Medium

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm xác định được mức độ ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng TDZ và α-NAA đến quá trình nhân giống cây Khôi

nhung tía (Ardisia silvestris Pitard) trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Vật liệu

ban đầu là mẫu lá Khôi nhung tía được cắt nhỏ và cấy vào các công thức môi trường khác nhau Kết quả theo dõi được ghi nhận sau 30 ngày nuôi cấy Đối với thí nghiệm cảm ứng hình thành callus từ cây bố mẹ, môi trường ½ MS + 1.5 ppm TDZ là môi trường tối ưu cho quá trình này với tỉ lệ tạo callus là 88.57% và

số lượng callus hình thành là 34.00 callus Đối với thí nghiệm nhân nhanh callus, môi trường ½ MS + 1.0 ppm TDZ là môi trường tối ưu cho quá trình nhân nhanh callus với hệ số nhân nhanh là 5.31 và số lượng callus mới hình thành là 47.80 callus Đối với thí nghiệm tái sinh chồi từ callus, môi trường MS + 2.5 ppm TDZ là môi trường tối ưu nhất cho quá trình tái sinh chồi với hệ số nhân chồi là 3.82 và số lượng chồi hình thành là 34.40 chồi Đối với thí nghiệm sinh trưởng và phát triển của giống cây Khôi nhung tía thì môi trường MS + 0.8 ppm TDZ là môi trường tối ưu nhất với chiều dài thân là 2.78 cm, đường kính thân là 0.78 cm, trọng lượng là 0.64 g, chiều dài lá là 4.02 cm và chiều rộng lá là 1.26 cm Đối với thí nghiệm tạo rễ cho cây thì môi trường MS + 1.2 ppm α-NAA là môi trường tối ưu nhất cho giai đoạn này với chiều dài thân là 2.88 cm, đường kính thân là 0.74 cm, số lượng chồi ra rễ là 5.40 chồi, số lượng rễ là 5.00

rễ, chiều dài rễ là 5.88 cm, số lá là 6.20 lá và trọng lượng là 1.60 g Đối với giai đoạn vườn ươm thì cây sinh trưởng và phát triển khá tốt trên giá thể Peat Moss

PHẦN I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Với điều kiện thiên nhiên nhiều ưu đãi, Việt Nam có một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc Đây cũng là điều kiện thuận lợi để phát triển nguồn dược liệu, cung cấp nguyên liệu để sản xuất thuốc trong nước Với sự đa dạng về khí hậu và thổ nhưỡng – đất đai, ngay

từ cuối những năm của thập kỷ 60-80 ở Việt Nam đã hình thành những vùng trồng, sản xuất cây dược liệu có tính chuyên canh Hiện nay, ở Việt Nam có

4000 loài cây dược liệu quý được thế giới công nhận như cây hồi, quế, sâm Ngọc Linh,… Số lượng cây thuốc được phát hiện, nghiên cứu và ứng dụng ngày càng nhiều, làm phong phú thêm nguồn dược liệu của nền y học cổ truyền dân tộc Việt Nam Trên khắp mọi miền đất nước, mỗi nơi người dân đều có cách thức sử dụng cây thuốc khác nhau, trong đó tiềm ẩn nhiều cây thuốc quý mà chúng ta chưa biết đến Trong số đó, cây Khôi nhung tía là một loại cây dược liệu được dùng làm thuốc trong dân gian từ lâu

Cây Khôi nhung tía là một loài thực vật họ Đơn nem (Myrsinaceae), phân

bố ở Trung Quốc và Việt Nam Cây mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc và một số tỉnh miền Trung Theo tài liệu y học cổ truyền, trong lá Khôi nhung tía

có thành phần chủ yếu là tannin, glycoside có tác dụng làm trung hòa, làm giảm

sự gia tăng acid của dạ dày, chống viêm giảm đau, đặc biệt các tác dụng làm se vết loét, kích thích lên da non và làm lành vết thương trong đường tiêu hóa Do vậy, theo Quỹ Châu Á năm 2012, Khôi nhung tía được dùng để điều trị bệnh viêm loét dạ dày tá tràng, làm giảm ợ hơi, ợ chua, nóng rát vùng thượng vị Vì vậy, đây là một loại dược liệu cần được bảo tồn và nhân giống rộng rãi (Bùi Văn Thắng, 2016)

Trong tự nhiên, Khôi nhung tía tạo ra hạt thông qua thụ phấn chéo và hạt mất hơn 3 năm để phát triển thành cây trưởng thành bắt đầu ra hoa, việc nhân giống Khôi nhung tía bằng phương pháp thông thường sẽ quá chậm Hiện nay, ở

Việt Nam, trước nạn phá rừng tràn lan, biến đổi khí hậu cùng sự khai thác bừa bãi mà chưa có kế hoạch tái sinh và phát triển nên loài Khôi nhung tía đang bị giảm sút về số lượng, chất lượng một cách đáng báo động và có nguy cơ bị tuyệt chủng ngoài tự nhiên Để bảo tồn và có nguồn cung dược liệu Khôi nhung tía ổn định, lâu dài và đảm bảo hàm lượng, hoạt tính, chúng ta cần phải có biện pháp hữu hiệu trong bảo tồn và phát triển loài dược liệu này Ở nước ta, Bùi Văn Thắng và cộng sự (2016) đã nghiên cứu nhân giống thành công cây Khôi nhung

tía (Ardisia silvestris Pitard) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro Tuy nhiên, dựa trên

cơ sở các chương trình nghiên cứu, các phương pháp nhân giống nuôi cấy mô đã được thực hiện thành công, chúng ta cần đánh giá kĩ hơn về sự ảnh hưởng của các yếu tố tác động đến quá trình nhân giống để có thể đạt được kết quả tối ưu

Căn cứ vào những dẫn chứng nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài: “Ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình nhân

giống cây Khôi nhung tía (Ardisia silvestris Pitard) trong nuôi cấy mô tế bào

thực vật” với mục đích nhằm phát triển loài cây quý này

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục đích

Đánh giá được ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến quá trình

nhân giống cây Khôi nhung tía (Ardisia silvestris Pitard) trong nuôi cấy mô tế

bào thực vật Từ đó có thể nâng cao hệ số nhân giống nhằm góp phần bảo vệ loài dược liệu quý hiếm của Việt Nam tránh khỏi nguy cơ bị tuyệt chủng

- Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đối với sinh trưởng và phát triển chồi

- Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đối với cảm ứng tạo rễ cây

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về cây Khôi nhung tía

Tên khoa học : Ardisia silvestris Pitard

Tên gọi khác : Cơm nguội rừng, Đơn tướng quân, Độc lực,

Khôi đốm, Xăng sê…

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Khôi nhung tía (Ardisia silvestris Pitard) còn được gọi là Cơm nguội rừng, Khôi nhung tía thuộc họ Đơn nem (Myrsinaceae), bộ Anh Thảo (Primulalales) Loài cây này được chuyên gia Charles-Joseph Marie Pitard (1873-1927) mô tả khoa học lần đầu tiên và được công bố trong Flore Générale

de I’Indo-Chine năm 1930 Khôi nhung tía là cây tiểu mộc cao 0.5-2 m, không

lông, có thân rễ bò, rỗng xốp, có vỏ màu xám, ít phân nhánh hay không phân nhánh, gần trên ngọn có nhiều lá (Wikipedia)

Hình 2.1 Cây Khôi nhung tía (nguồn: Internet)

Lá Khôi nhung tía tập trung ở đầu ngọn, mọc so le, phiến lá nguyên, dài đến 15-40 cm, rộng 6-10 cm, đầu nhọn hoặc tù, giảm dần và men xuống gốc, đáy từ từ hẹp thành cuống có cánh Lá cây có màu xanh lục hoặc xanh tím, có khi màu tía, đậm màu ở mặt trên, nhạt màu hơn ở dưới; mép lá có răng cưa nhỏ

và đều nhau Lá mịn như nhung và có nhiều đường gân nổi hình mạng lưới

Hình 2.2 Lá cây Khôi nhung tía (nguồn: Internet)

A Lá tươi, B Lá khô

Hoa Khôi nhung tía mọc thành chùm, dài 10-15cm, hoa rất nhỏ, chùm kép ngoài nách lá; cọng hoa 10-12 mm; lá đài cao 1.5 mm; cách hoa 3 mm Hoa có màu trắng pha hồng tím gồm 5 lá đài 3 cánh hoa Lá đài hình tam giác hoặc thuôn, nhọn, hợp ngắn ở gốc, có lông mi Cánh hoa màu hồng, hình mác, dài 3mm, đầu tù hoặc nhọn, có điểm tuyến Nhị hoa ngắn hơn cánh hoa, bao phấn hình mác nhọn, chỉ nhị rất ngắn Bầu hoa có hình trứng, vòi mảnh và đầu nhụy hình nấm

Hình 2.3 Hoa cây Khôi nhung tía (nguồn: Internet)

Quả của cây Khôi nhung tía thuộc quả mọng, hình cầu, khi non có màu xanh và chuyển màu đỏ khi đã chín, đường kính quả khoảng 7-8 mm Hạt 1, lõm

ở gốc Cây tái sinh bằng hạt và chồi, mùa hoa tháng 5-7 và mùa quả chín vào tháng 10-12 năm sau

Hình 2.4 Quả cây Khôi nhung tía (nguồn: Internet)

2.1.3 Khu vực phân bố

Khôi nhung tía thuộc loài cây ưa ẩm và bóng râm nên cây thường chỉ phân bố và mọc sâu trong những khu rừng rậm

Tại các tỉnh miền Bắc, do có khí hẩu ẩm và lạnh nên loài cây này có thể sinh trưởng và phát triển Do đó, cây Khôi nhung tía thường được trồng tại Hữu Lũng - Lạng Sơn, Sapa - Lào Cai, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Ba Vì – Hà Nội, Cúc Phương – Ninh Bình,…

Ngoài ra còn một số nơi ven biển miền Trung cũng trồng cây Khôi nhung tía như Quỳ Châu – Nghệ An, Phú Lộc - Thừa Thiên Huế, Lanh Chánh – Thanh Hóa, Quảng Nam, Đà Nẵng… (Wikipedia) Ở Trung Quốc, chúng ta cũng có thể tìm thấy Khôi nhung tía ở Hải Nam, Quảng Tây

2.1.4 Thực trạng

Khôi nhung tía là loài cây đang bị khai thác nhiều dẫn đến số lượng bị giảm sút, được đưa vào Sách Đỏ IUCN đề nghị bảo vệ Và theo như Sách Đỏ Việt Nam (Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 2007), Khôi nhung tía được xếp vào nhóm “sẽ nguy cấp” (VU A1a, c, d+2d) chỉ khai thác có mức độ và giữ lại những cây con chưa đến tuổi thu hái, cấm khai thác loài này trong các Vườn quốc gia và Khu bảo tồn thiên nhiên, cũng như cần nghiên cứu nhân giống để gieo trồng tạo hàng hóa xuất khẩu và bảo vệ nguồn gen

Tuy loài có khu phân bố rộng nhưng số lượng cá thể ít do tái sinh hạt kém, lại bị khai thác làm dược liệu với số lượng nhiều nên bị mất nguồn hạt tái sinh Mặt khác, những nơi có cây con mọc lại bị chặt phá rừng nên có thể bị tuyệt chủng vì không còn môi trường sống thích hợp

2.1.5 Thành phần hóa học

Các loài thực vật thuộc chi Ardisia họ Myrsinaceae đã được nghiên cứu từ

rất sớm trên thế giới Ngay từ năm 1968, Ogawa Hideko và các cộng sự đã tìm

thấy các hợp chất ardisiaquinon A, B, C từ loài Ardisia sieboldi của Nhật Bản Trong nghiên cứu về các hợp chất Triterpene Saponins chiết suất từ Ardisia

crispa của Jansakul C (1986) đã phân lập trong rễ Ardisia crispa có 19 hợp chất

tritecpen saponin, trong đó có 2 hợp chất ardisiacrispin A & B còn được tìm

thấy từ loài A crispa, A brevicaulis Năm 1987, từ rễ và thân loài A

cornudentata, lần đầu tiên đã phân lập được 2 hợp chất 1,4-benzoquinon trong

bài nghiên cứu Quinones từ Ardisia Cornudentata của Tian Z Tiếp theo đó,

Chun-Po Chang và cộng sự năm 2010 cũng đã nghiên cứu phân lập gốc rễ

Ardisia Cornudentata Mez và phát hiện 3 hợp chất mới là:

3-methoxy-2-methyl-5-pentylphenol, 3-methoxy-2-methyl-5-(1’-ketopentyl)phenol và cornudentata cùng với 26 hợp chất khác đã được biết đến

Ngoài ra, Viện đông y và Bộ môn dược lý Trường đại học y dược có thí nghiệm sơ bộ trên loài Khôi nhung tía có tìm thấy 2 chất chính là tannin và glycoside Đây là 2 chất chủ yếu có tác dụng trong việc điều trị các bệnh về dạ dày (Đỗ Tất Lợi, 2005)

2.1.6 Công dụng

Cây Khôi nhung tía được coi là loại cây dược liệu quý hiếm dùng để chữa các bệnh dạ dày, đau bụng, dân gian còn sắc nước ngậm khi bị viêm họng Thành phần chính là tannin và glycoside, giúp trung hòa và giảm tăng tiết acid của dạ dày Khi dịch vị trong dạ dày được ổn định, các chứng ợ nóng, ợ chua cũng giảm dần và hết hẳn, giúp người bệnh có cảm giác dễ chịu, nhẹ bụng

Sau khi giúp trung hòa và giảm tiết acid dạ dày nhờ các glycoside, các thành phần khác trong lá Khôi nhung tía tiếp tục phát huy tác dụng giảm co thắt

cơ trơn, chống viêm, ức chế vi khuẩn HP, làm se vết loét, làm liền sẹo, kích thích lên da non Nhờ cơ chế này, Khôi nhung tía đặc biệt hiệu quả trong điều trị bệnh dạ dày – tá tràng, giúp giảm đau và làm lành dạ dày – tá tràng nhanh chóng Hơn nữa, theo các bác sĩ chuyên khoa, nếu dùng ở dạng nước sắc, lá Khôi nhung tía không chỉ giúp giảm đau, giảm dịch vị xuống mức bình thường

mà còn giúp người bệnh ăn ngon và ngủ tốt hơn

Đặc biệt, lá Khôi nhung tía kết hợp với các dược liệu như nghệ vàng, ô tặc cốt, hồi đầu thảo, phục linh, ý dĩ, cam thảo… có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm loét dạ dày – tá tràng cấp và mãn tính; giúp giảm nhanh các triệu chứng như đầy

bụng hơi, đau vùng thượng vị; giúp bổ tỳ vị, tăng cường chức năng hệ tiêu hóa

2.1.7 Giá trị kinh tế

Với những công dụng của cây Khôi nhung tía, giá bán trên thị trường hiện nay: lá tươi từ 20.000-30.000đ/kg, lá khô 180.000-250.000đ/kg Mỗi cây thu hái đạt tầm 300-500 gram lá tươi, với diện tích 1 ha sẽ thu về lợi nhuận trên 40 triệu đồng/vụ Nếu chăm sóc tốt, mỗi năm cây cho thu hoạch lá 2-3 lần, ước tính tổng

giá trị 80-120 triệu/năm/ha (Chưa tính đến giá trị của việc nhân giống)

2.1.8 Điều kiện sinh thái

Theo Lý Đức Long và Trần Thị Thu Hà (2020), Khôi nhung tía phân bố chủ yếu ở các khu rừng thứ sinh, khe suối, nơi có:

2.2 Những nghiên cứu về Khôi nhung tía ở trong và ngoài nước

Hiện tại chưa có nhiều nghiên cứu về loài Khôi nhung tía trên thế giới cũng như ở Việt Nam Đa phần các nghiên cứu hiện tại chủ yếu tập trung ở nhân giống và nuôi cấy mô cây Khôi nhung tía Ngoài ra, chỉ có một số ít nghiên cứu

về thành phần hóa học của các loài thuộc chi Ardisia, họ Myrsinaceae

2.2.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Các nghiên cứu về cây Khôi nhung tía (Ardisia silvestris Pitard) trên thế

giới chưa có nhiều và chưa có chuyên sâu về đặc điểm, thành phần và tính chất dược lý loài này Hiện tại chỉ ghi nhận một số nghiên cứu về dược học của các

loài cùng chi Ardisia Trong cuốn “Thực vật dược châu Á Thái Bình Dương:

Dược phẩm cho tương lai” của Christophe Wiart (2006) có giới thiệu về dược

phẩm từ cây thuốc ở Châu Á Thái Bình Dương với hơn 400 cây, dược liệu trong

đó có chi Ardisia

Hay các nghiên cứu về thành phần hóa học của hai loài thuộc chi Ardisia

của Nguyen H.A., Ripperger H., Schmidt J (2007) đã phát hiện được trong lá

của Ardisia silvestris có các hợp chất 2-methyl-5-( Z-nonadec-14-enyl) và nonadec-14-enyl), các diphenol cũng thu được từ rễ của Ardisia gigantifolia

5-(Z-Ngoài ra bài nghiên cứu phân lập Antitubercular Resorcinol Analogs và

Benzenoid C-Glucoside từ rễ cây Ardisia cornudentata của Chun-Po Chang và cộng sự (2010) đã phân lập gốc rễ của Ardisia cornudentata Mez thành ba hợp

chất mới và 26 hợp chất khác đã được biết đến, 13 trong số những hợp chất này cho thấy các hoạt động chống vi trùng, 2 hợp chất cho kết quả chống lại tế bào ung thư

2.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Các nghiên cứu về các loài thuộc chi Ardisia nói chung và Khôi nhung tía

nói riêng ở Việt Nam trong thời gian qua đã có nhiều bước phát triển Đặc biệt các nghiên cứu cơ bản về phân bố và cách thức sử dụng Khôi nhung tía trong chăm sóc chữa bệnh Trong đó phải kể đến “Nghiên cứu tác dụng của chế phẩm HPmax trong điều trị loét hoành tá tràng có Helicobacter pylori” của Phạm Bá Tuyến (2014) với việc kết hợp cây Cao khô Chè dây, Dạ cẩm và Khôi nhung tía; kết quả HPmax có tác dụng chống viêm loét dạ dày, tá tràng, giảm đau, liền sẹo, giảm thể tích dịch rỉ viêm, chống viêm mãn tính

Về thành phần hóa học của các loài trong chi Ardisia, Lưu Tuấn Anh (2013) đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học loài Ardisia

balansana thuộc họ Đơn nem (Myrsinaceae) ở Việt Nam”, kết quả đã thành

công trong việc phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập

từ lá, thân, rễ cây Ardisia balansana Mới đây trong nghiên cứu về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học một số loài Ardisia thuộc họ Myrsinaceae ở Việt

Nam của Trịnh Anh Viên (2017) đã phân lập và xác định được cấu trúc của 40 hợp chất trong đó có 2 hợp chất mới, 12 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ

chi Ardisia; ngoài ra trong nghiên cứu còn thăm dò các hoạt tính kháng nấm,

kháng khuẩn, kháng virus và hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được

Các nghiên cứu về nhân giống cây Khôi nhung tía trong thời gian qua đã ghi nhân nhiều kết quả tích cực “Quy trình nhân giống cây Khôi nhung tía bằng

phương pháp nuôi cấy in vitro” của tác giả Bùi Văn Thắng và cộng sự (2016)

được cấp bằng bảo hộ giải pháp hữu ích tại Việt Nam số VN 2-0001914 Trong

đó, vật liệu nuôi cấy là chồi bánh tẻ được thu từ các cây mẹ trồng tại vườn cây thuốc Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp Quy trình bao gồm các bước: xử lý mẫu và nuôi cấy khởi động, nhân nhanh chồi, tạo cây hoàn chỉnh trong môi

trường nuôi cấy in vitro thích nghi với môi trường tự nhiên Cây Khôi nhung tía được sản xuất bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro với hiệu suất đạt hơn 90%, khắc

phụ được những khó khăn trong sản xuất giống cây dược liệu bằng phương pháp truyền thống

2.3 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là một phương pháp nhân

giống vô tính, tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các

tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định

2.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Việc nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh của tế bào thực vật dựa trên tính toàn năng, phân hóa và phản phân hóa của tế bào Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm rằng mỗi tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật

đa bào đều có khả năng phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Sinh học hiện đại đã chứng minh mỗi tế bào đơn lẻ đều mang đầy đủ lượng thông tin di truyền của cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Đó là tính toàn năng của tế bào

Cơ thể thực vật là một chỉnh thể bao gồm nhiều cơ quan, bộ phận khác nhau, được cấu tạo từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuy nhiên các nhà khoa học

đã chứng minh các tế bào này đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử này phân chia hình thành nhiều phôi sinh chưa chuyên hóa thành các mô riêng biệt nhưng chúng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia của mình Trong điều kiện thích hợp, mỗi cơ quan bộ phận của

tế bào thực vật đều có thể trở về dạng phôi sinh và phân chia mạnh mẽ, hình thành một cơ thể hoàn chỉnh Quá trình này được gọi là quá trình phản phân hóa

2.3.2 Các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh

dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng Các kỹ thuật nuôi cấy mô bao gồm:

- Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

- Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh

- Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành

- Nuôi cấy mô sẹo (callus)

- Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào)

- Nuôi cấy Protoplast: nuôi cấy bên trong tế bào thực vật in vitro (trong

ống nghiệm) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy cây trong điều kiện tự nhiên ngoài ống nghiệm

Ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật vào sản xuất giống cây trồng cho những ưu điểm mà các phương pháp khác không thể có được, đó là: có thể nhân giống ở quy mô công nghiệp (kể cả trên đối tượng khó nhân giống bằng phương

pháp thông thường), cho hệ số nhân cao, cho các cá thể đồng nhất về mặt di truyền và chất lượng

2.3.3 Các giai đoạn của nuôi cấy mô tế bào thực vật

Theo Nguyễn Quang Thạch và Nguyễn Thị Lý Anh (2005) sự thành công của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật chỉ đạt được khi trải qua các giai đoạn sau:

a Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ qua trình nhân giống in

vitro Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để

đưa vào nuôi cấy Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên Tuy vậy nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử chắc chắn sẽ đạt kết quả

b Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin, cytokinin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cây Thường mô non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành Người ta còn nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi

c Giai đoạn 3: Nhân nhanh

Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều tiết sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin,…), các chất bổ sung khác như nước dừa, than hoạt tính… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp

Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình thành qua các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích

sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính

d Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường 2-3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này

sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin, là nhóm hoocmon thực vật quan trọng

có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

e Giai đoan 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ bình thủy tinh ra ngoài điều kiện tự

nhiên là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định

khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất

Để đưa cây từ bình thủy tinh ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu sau:

- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số rễ, số lá, chiều cao cây,…)

- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tùy từng loại cây) để thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh,… bằng cách đặt cây ngoài điều kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi,…

- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát

nước Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu ánh sáng của vườn ươm cũng như chế độ dinh dưỡng thích hợp

2.3.4 Môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy mô là thành phần môi trường nuôi cấy Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm thì thành phần môi trường cũng sẽ thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002)

Có rất nhiều loại môi trường khác nhau Trong đó, có một số môi trường

cơ bản được sử dụng phổ biến như: MS, B5, SH có hàm lượng khoáng đa lượng cao Môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau:

b Nguồn cacbon

Phần lớn mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống theo phương thức dị

dưỡng, vì vậy việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt buộc Nguồn cacbon thông dụng hiện nay là sucrose Nồng độ thích hợp là 2-3%, song cũng còn phụ thuộc vào mục đích nuôi cấy mà thay đổi Ngoài ra còn có thể sử dụng một số nguồn cacbon khác như glucose, maltose, fructose… Các loại rượu như glycerin cũng được tế bào sử dụng Manitol hoặc sorbitol còn

có thể sử dụng trong nuôi cấy huyền phù và nuôi cấy protoplast với chức năng là chất ổn định áp suất thẩm thấu

c Vitamin

Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng

tự tổng hợp được hầu hết các loại vitamin, nhưng thường không đủ về lượng Do

đó phải bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B như: B1, B3, B5, B6, meso-inosit… rất cần thiết cho các phản ứng sinh hóa

d Các chất điều tiết sinh trưởng

Trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật thành phần phụ gia quan trọng nhất quyết định kết quả nuôi cấy là các chất điều tiết sinh trưởng, thuộc

các nhóm sau:

- Auxin: Có 4 loại auxin thường được sử dụng là Indole acetic acid (IAA), α-Naphtanyl acetic acid (α-NAA), 2.4-dichlorphenoxyacetic (2.4D), Indol butyric (IBA) Chúng chủ yếu có tác dụng kích thích sinh trưởng của tế bào nhưng cũng làm phân bào (Nguyễn Như Khanh, 2011)

- Cytokinin: Là nhóm các phytohormone dẫn xuất của Adenin Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hóa của các cơ quan, làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy Các loại cytokinin thường dùng trong môi trường nuôi cấy là Kinetin, 6-Benzylaminopurin (BAP) Ngoài ra còn có Zeatin nhưng nó ít được sử dụng trong nuôi cấy mô vì giá thành quá đắt (Nguyễn Như Khanh, 2011)

- Gibberellin acid: Tới nay đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm gibberellin acid Loại thông dụng nhất trong nuôi cấy mô là GA3 Trong cơ thể thực vật, gibberellin đóng vai trò quan trọng đối với nhiều quá trình sinh lý như sinh lý ngủ nghỉ của hạt và chồi, phát triển của hoa, làm tăng sinh trưởng chiều dài của thực vật (Nguyễn Như Khanh, 2011)

- Abscisic acid: Abscisic acid (ABA) thuộc nhóm các chất ức chế sinh trưởng ABA có tác dụng tăng cường khả năng chống chịu của tế bào thực vật đối với điều kiện ngoại cảnh bất lợi, vì vậy ABA được đưa vào môi trường tái sinh cây và mang lại hiệu quả nhất định (Nguyễn Như Khanh, 2011)

e Các hỗn hợp chất tự nhiên

Sự bổ sung thêm một số các hỗn hợp dinh dưỡng tự nhiên như: nước dừa, than hoạt tính… vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy

f Chất độn – thạch agar

Agar là thành phần quyết định trạng thái vật lí của môi trường Hàm lượng agar dùng trong nuôi cấy dao động 0.5-1.0% theo khối lượng Tuy nhiên còn tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy mà sử dụng cho phù hợp

g Nước

Nước là thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy Nước để pha môi trường là loại nước cất 2 lần (hoặc nước RO)

2.3.5 Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

a Điều kiện vô trùng

Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng

- Vô trùng thiết bị và dụng cụ: Dụng cụ được hấp ướt ở 121°C trong 30 phút, sấy khô ở nhiệt độ 90°C trong 2 giờ, sấy tiệt trùng 180°C trong 1 giờ Thiết bị sử dụng gồm nồi hấp, tủ sấy, box cấy chuyên dụng

- Vô trùng mẫu: Sử dụng hóa chất cồn tuyệt đối, thủy ngân HgCl2 0.1%

b Điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ pH của môi trường

Ánh sáng: Ánh sáng có ảnh hưởng mạnh tới quá trình phát sinh hình thái

mô nuôi cấy, bao gồm cường độ, chu kì và thành phần quang phổ ánh sáng Cường độ ánh sáng được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô là từ 1000-

4000 lux Với cường độ ánh sáng lớn hơn thì sinh trưởng của chồi chậm lại

nhưng sẽ thúc đẩy quá trình tạo rễ Sự thu nhận ánh sáng của chồi in vitro phụ

thuộc vào bước sóng ánh sáng và chất lượng bình nuôi cấy (Lê Văn Hoàng, 2008)

Nhiệt độ: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan

trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộc vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng ở nhiều loài cây là 25°C (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

Độ pH của môi trường: Độ pH của môi trường dinh dưỡng ảnh hưởng

trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ môi trường và tế bào Độ

pH môi trường thường được điều chỉnh từ 5.5-6.0 trước khi hấp khử trùng Nhìn chung nếu độ pH cao hơn 6.0 sẽ làm môi trường bị cứng và nếu thấp hơn 5.5 thì

agar khó đông (Ngô Xuân Bình, 2010)

2.3.6 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

a Ưu điểm

So với các kiểu nhân giống vô tính thông thường (chiết cành, giâm

cành…) thì nhân giống in vitro khắc phục nhiều trở ngại mà các phương pháp

nhân giống khác thường gặp Có thể tạo ra cây con đồng nhất về mặt di truyền, sạch bệnh cũng như bảo tồn được các tính trạng tốt được di truyền từ cây mẹ

sang cây con 100% Nhân giống in vitro không chiếm nhiều diện tích, không bị

ảnh hưởng bởi thời tiết cũng như các điều kiện ngoại cảnh khác Một giống cây quý được sản xuất quanh năm, quá trình sản xuất được vận hành bất cứ thời gian

nào trong ngày, mùa nào trong năm Hệ số nhân của phương pháp nhân giống in

vitro là cái mà các phương pháp khác không thể sánh kịp, từ một bộ phận nhỏ

của cây có thể nhân ra hàng trăm, hàng nghìn cây, kể cả phương pháp nhân giống từ hạt trong vòng 1-2 năm có thể cho hàng triệu cây cũng không thể so

được với tốc độ và hệ số nhân của nhân giống in vitro Thời gian đưa cây vào sản xuất đại trà của nhân giống in vitro cũng nhanh hơn những phương pháp

khác

Trong công tác chọn giống, sản xuất giống người ta quan tâm nhất là chất lượng và số lượng giống Bằng phương pháp nhân giống từ đỉnh sinh trưởng, người ta ngoài đảm bảo số lượng giống mà về chất lượng tạo ra cũng là những cây hoàn toàn sạch virus

b Nhược điểm

- Nhược điểm chính của phương pháp nhân giống in vitro là đòi hỏi trang

thiết bị đắt tiền và kĩ thuật cao hơn so với các phương pháp khác nên giá thành

không cạnh tranh

- Không phải bất kì loại cây nào cũng có thể nhân giống in vitro

- Khả năng tạo đột biến tăng và cây có thể bị nhiễm bệnh hàng loạt

- Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích thước

nhỏ và đôi khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn

- Khả năng tự tổng hợp các chất hữu cơ của cây kém vì cây giống in vitro

được cung cấp nguồn cacbonhydrat nhân tạo

- Cây giống in vitro thường được nuôi trong bình thủy tinh hoặc bình

nhựa nên độ ẩm không khí thường bão hòa, do đó khi chuyển cây ra môi trường

tự dưỡng cây thường bị mất cân bằng độ ẩm gây héo và chết

- Những vấn đề có thể sẽ gặp trong quá trình nuôi cấy:

+ Tính bất định về mặt di truyền

+ Sự nhiễm mẫu

+ Việc sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy

+ Hiện tượng thủy tinh hóa

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm, thời gian và vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm nghiên cứu

- Phòng nghiên cứu và chọn tạo giống cây dược liệu, Viện nghiên cứu và

Phát triển cây dược liệu, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.1.2 Thời gian nghiên cứu

- Từ tháng 03/2022 đến tháng 09/2022

3.1.3 Vật liệu nghiên cứu

- Giống cây Khôi nhung tía (Ardisia silvestris Pitard) được chọn lọc và

thu mẫu giống tại huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang

- Hóa chất: Môi trường nuôi cấy MS (Murashige & Skoog medium) và các chất điều tiết sinh trưởng TDZ, α-NAA

- Hệ thống máy móc và dụng cụ thí nghiệm hiện có tại Viện nghiên cứu

và Phát triển cây dược liệu, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến sự hình thành callus trong giai đoạn đầu nhân giống

- Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh tạo callus mới

- Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ callus

- Đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng sinh trưởng và phát triển của chồi

- Đánh giá ảnh hưởng cúa các chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tạo

rễ của giống cây Khôi nhung tía

3.3 Phương pháp nghiên cứu

Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật đang hiện hành, trong điều kiện:

- Mẫu được cấy trên môi trường ½ MS, MS được khử trùng trước khi đưa vào nuôi cấy

- Vật liệu: Các lá được lấy từ bình mẫu, chia thành từng mảnh nhỏ

- Quang chu kỳ: Để trong bóng tối (không chiếu sáng) 10 ngày, 10 ngày tiếp theo đưa ra ánh sáng đèn led, chế độ chiếu sáng là 10 giờ sáng/14 giờ tối

- Điều kiện phòng nuôi: Nhiệt độ phòng ổn định 25±1°C, độ ẩm 60-70%

- Mỗi công thức (CT) 5 bình, mỗi bình 7 mẫu và lặp lại 3 lần ngẫu nhiên độc lập

- Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu sống, tỉ lệ tạo callus, tỉ lệ mẫu nấm, số lượng callus hình thành

3.4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân nhanh callus của giống cây Khôi nhung tía

Bảng 3.2 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của TDZ đến quá trình nhân

nhanh callus của giống cây Khôi nhung tía STT Công thức TDZ (ppm)

- Mỗi công thức (CT) 5 bình, mỗi bình 9 mẫu và lặp lại 3 lần ngẫu nhiên độc lập

- Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ mẫu sống, hệ số nhân nhanh callus, số lượng callus hình thành

3.4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình tái sinh chồi từ callus của giống cây Khôi nhung tía

Bảng 3.3 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của TDZ đến quá trình tái sinh

chồi từ callus của giống cây Khôi nhung tía STT Công thức TDZ (ppm)

- Quang chu kỳ: Chiếu sáng 10 giờ sáng/14 giờ tối

- Điều kiện phòng nuôi: Nhiệt độ phòng ổn định 25±1°C, độ ẩm 60-70%

- Mỗi công thức (CT) 5 bình, mỗi bình 9 mẫu và lặp lại 3 lần ngẫu nhiên độc lập

- Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng chồi hình thành, hệ số nhân chồi

3.4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của giống cây Khôi nhung tía

Bảng 3.4 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của TDZ đến quá trình sinh

trưởng và phát triển của giống cây Khôi nhung tía STT Công thức TDZ (ppm)

- Quang chu kỳ: Chiếu sáng 10 giờ sáng/14 giờ tối

- Điều kiện phòng nuôi: Nhiệt độ phòng ổn định 25±1°C, độ ẩm 60-70%

- Mỗi công thức (CT) 5 bình, mỗi bình 6 mẫu và lặp lại 3 lần ngẫu nhiên độc lập

- Chỉ tiêu theo dõi: Chiều cao chồi, trọng lượng, chiều dài lá, chiều rộng

lá

3.4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ của giống cây Khôi nhung tía

Bảng 3.5 Công thức thí nghiệm ảnh hưởng của α-NAA đến quá trình tạo rễ

của giống cây Khôi nhung tía STT Công thức α-NAA (ppm)

- Quang chu kỳ: Chiếu sáng 10 giờ sáng/14 giờ tối

- Điều kiện phòng nuôi: Nhiệt độ phòng ổn định 25±1°C, độ ẩm 60-70%

- Mỗi công thức (CT) 5 bình, mỗi bình 8 mẫu và lặp lại 3 lần ngẫu nhiên độc lập

- Chỉ tiêu theo dõi: Số lượng chồi ra rễ, số lượng rễ, số lá, chiều dài thân, đường kính thân, chiều dài rễ, trọng lượng

3.4.6 Thí nghiệm 6: Đánh giá khả năng thích ứng ngoài vườn ươm

- Môi trường: Giá thể Peat Moss và giá thể vụn thông + xơ dừa (Tỉ lệ 1:1)

- Vật liệu: Cây lấy từ giai đoạn tạo rễ, rửa sạch với nước, để trong bóng râm 4-5 giờ rồi trồng ra ngoài giá thể

- Quang chu kỳ: Ánh sáng tự nhiên

- Điều kiện vườn ươm: Thoáng mát, đủ độ ẩm 60-70%

- Chế độ tưới nước: 3 lần/ngày

- Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ sống, chiều cao cây, số lá trên cây, chiều dài rễ, chiều rộng rễ

3.5 Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu

3.5.1 Các chỉ tiêu theo dõi

- Chiều cao chồi (cm): Đo từ phần gốc đến phần đỉnh ngọn

- Chiều dài lá (cm): Đo từ gốc cuống lá đến chóp lá

- Chiều rộng lá (cm): Đo phần rộng nhất của phiến lá

- Số lượng chồi ra rễ: Đếm số lượng chồi ra rễ trong giai đoạn thí nghiệm

- Số lượng rễ hình thành: Đếm số lượng rễ thật được hình thành trong giai đoạn thí nghiệm

- Chiều dài rễ (cm): Đo từ gốc rễ đến chóp rễ

- Chiều dài thân (cm): Đo từ phần gốc đến phần đỉnh chồi

- Đường kính thân (cm)

3.5.2 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý bằng phần mềm MICROSOFT EXCEL và được đánh giá bởi chương trình thống kê SPSS 22.0 (Tập đoàn IBM, Somers, NY) So sánh giữa các phương tiện phân tích đã được kiểm tra bằng việc thử nghiệm phạm vi rộng với Duncan (DMRT) và mức ý nghĩa là 5%

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình cảm ứng hình thành callus từ cây

bố mẹ

TDZ (Thidiazuron) là một hoocmon sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin giúp kích thích phân chia tế bào mạnh mẽ, tạo và nhân callus, ảnh hưởng rõ rệt

đến sự phân hóa chồi trong nuôi cấy mô in vitro Ngoài ra còn có khả năng kìm

hãm sự hóa già của cơ quan và của cây nguyên vẹn

Mẫu lá ban đầu được lấy từ trong bình thí nghiệm, được cắt ra thành các mảnh nhỏ và nuôi cấy trên môi trường tạo callus ½ MS + 30 g/l đường sucrose +

6 g/l agar + 0.1 Inositol, pH=5.8 kết hợp với TDZ cho ra 6 loại môi trường, ký hiệu từ ĐC đến CT5 Trong đó có sử dụng môi trường để làm công thức thí nghiệm đối chứng (ĐC) (không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng) để so sánh với các công thức còn lại

Ở thí nghiệm 1 này TDZ được sử dụng ở những nồng độ từ 0-2 ppm (bảng 3.1) để khảo sát cảm ứng hình thành callus từ lá của Khôi nhung tía Theo dõi và thu được kết quả thống kê sau 30 ngày cho thấy sự khác nhau về các chỉ tiêu theo dõi, được thể hiện lần lượt ở bảng 4.1 và hình 4.1

Từ bảng 4.1 và hình 4.1 cho ta thấy sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi, tỉ lệ sống của mẫu ở tất cả các công thức đều cao từ khoảng 74.28% đến 97.14% và

có sự sai khác có ý nghĩa về mặt thống kê Cụ thể, tỉ lệ sống cao nhất là ở CT2 với giá trị tương ứng là 97.14% CT4 và CT1 cũng có tỉ lệ sống cao với giá trị lần lượt là 94.28% và 91.43% Các công thức có tỉ lệ sống thấp hơn là CT5 và

ĐC với tỉ lệ tương ứng là 88.57% và 85.71% CT3 có tỉ lệ sống là 74.28% và là công thức có tỉ lệ sống thấp nhất trong 6 công thức thí nghiệm

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của TDZ đến quá trình cảm ứng hỉnh thành callus ở

giống cây Khôi nhung tía sau 30 ngày nuôi cấy và theo dõi

Công

thức

TDZ (ppm)

Tỉ lệ sống (%)

Tỉ lệ tạo callus (%)

Số lượng callus hình thành (callus)

Tỉ lệ nhiễm nấm (%)

ĐC 0 85.71±6.39ab 42.86±4.52c 16.40±1.21c 0bCT1 0.1 91.43±3.50a 57.14±7.82bc 19.60±1.33c 0bCT2 0.5 97.14±2.86a 68.57±8.33ab 23.80±1.16b 0bCT3 1.0 74.28±8.33b 71.43±9.03ab 31.00±0.71a 0.35±0.10aCT4 1.5 94.28±3.50 a 88.57±7.00a 34.00±1.30a 0bCT5 2.0 88.57±5.34 ab 62.85±5.71bc 25.20±1.16b 0b

Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt đáng kể ở mức 0.05 theo Duncan’s Multiple Range (DMRT)

Đối với chỉ tiêu tỉ lệ tạo callus của các mẫu thí nghiệm có sự khác nhau có

ý nghĩa CT4 là công thức cho tỉ lệ tạo callus cao nhất với giá trị là 88.57%, có thể thấy khi bổ sung TDZ nồng độ 1.5 ppm sẽ tạo được callus từ lá Khôi nhung tía nhiều nhất ở thí nghiệm 1 Thấp hơn 17.15% và 20% so với CT4 lần lượt là CT3 và CT2 với tỉ lệ tạo callus tương ứng là 71.42% và 68.57% Công thức cho

tỉ lệ tạo callus thấp hơn một chút nữa là CT5 và CT1 với giá trị tương ứng là 62.85% và 57.14% Công thức ĐC với nồng độ TDZ là 0 ppm là công thức cho

tỉ lệ tạo callus thấp nhất là 42.46%

Ta có thể thấy, số lượng callus hình thành ở các công thức cũng có sự sai khác có ý nghĩa Tương tự như tỉ lệ tạo callus thì CT4 là công thức cho số lượng callus hình thành cao nhất là 34.00 callus CT3 cũng có số lượng callus hình thành khá cao là 31.00 callus CT5 và CT2 là 2 công thức cho số lượng callus hình thành thấp hơn với giá trị tương ứng là 25.20 callus và 23.80 callus Hai công thức còn lại là CT1 và ĐC thì cho số lượng callus hình thành thấp hơn các