ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng
- Mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn: Azithromycin, Clarithromycin,
Erythromycin, Roxithromycin, Gentamicin, Kanamycin, Streptomycin, Tobramycin
- Mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn thêm nội chuẩn Amikacin
- Mẫu trắng giả lập (mẫu trắng): mẫu nước thải không chứa các kháng sinh đang nghiên cứu
- Mẫu thử giả lập: mẫu hỗn hợp chuẩn thêm vào mẫu trắng
Mẫu thử được thu thập từ các vùng nuôi trồng thủy hải sản tại đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm 6 mẫu nước tại Trà Vinh, 5 mẫu tại Cà Mau, 10 mẫu nước thải tại Bạc Liêu và 3 mẫu nước thải công nghiệp Thời gian lấy mẫu diễn ra một tuần trước khi nghiên cứu bắt đầu, tại các ao nuôi thủy hải sản và khu vực nước thải công nghiệp.
Theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6663-1: 2011: Chất lượng nước - lấy mẫu
Chương trình lấy mẫu và kỹ thuật lấy mẫu được quy định trong tiêu chuẩn này, bao gồm các chi tiết quan trọng về việc lấy mẫu cho tất cả các loại nước thải, từ nước thải công nghiệp đến nước thải sinh hoạt.
2.1.3 Nguyên vật liệu - hóa chất, dung môi - trang thiết bị
STT Mô tả Hãng cung cấp Độ tinh khiết
MeOH, ACN, acid formic đạt tiêu chẩn HPLC gradient của JT Baker,
Mỹ Nước cất đạt tiêu chuẩn MS của Merck, Đức
Tên dụng cụ, thiết bị Nước sản xuất
Máy sắc ký lỏng ACQUITY LC H-CLASS SYSTEM Waters, Xevo
TQD ghép detector khối phổ 3 lần tứ cực Mỹ Cân phân tích ABT 220-5DM, d = 0,1 mg/0,01 mg, max 220 g Đức Cân phân tích OHAUS Explorer Pro, d = 0,1 mg, max 210 g Mỹ
Bể siêu âm Wisd WUC – D22H Hàn Quốc
Tủ lạnh sâu (–80 o C), Sanyo MDF – 236 Nhật
Micropipet Eppendorf có các dung tích 1 – 10 μl, 10 – 100 μl và 100 – 1000 μl, được sản xuất tại Đức Bình định mức và dụng cụ thủy tinh được sử dụng trong phân tích cũng đến từ Đức Máy đo pH WTW-INOLAB pH720 với điện cực kép Ag/AgCl và thủy tinh, số hiệu HI 1131, là một sản phẩm chất lượng cao từ Đức.
Máy khuấy từ IKA C-MAG HS10 Đức
Vial loại 1,8 ml Isolab Đức Đầu lọc santorius 0,22 àm Đức Đầu lọc santorius 0,45 àm Đức
2.1.4 Địa điểm nghiên cứu và thời gian nghiên cứu
Phòng nghiên cứu liên bộ môn Hóa phân tích - Kiểm nghiệm - Độc chất, khoa Dược trường Đại Học Y Dược Cần Thơ
Phương pháp nghiên cứu
- Mẫu dung dịch chuẩn và nội chuẩn gốc: pha riêng biệt các chất chuẩn AZI, CLAR, ERY, ROXI, GENT, KANA, STREP, TOB và nội chuẩn
AMI có nồng độ 200 ppm trong MeOH : nước acid formic 0,1% (30:70)
- Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các dung dịch chuẩn làm việc của chất phân tích có nồng độ từ 1 ppb đến 200 ppb
- Từ dung dịch nội chuẩn gốc pha loãng thành dung dịch nội chuẩn làm việc có nồng độ 50-100 ppb
2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng Azithromycin, Clarithromycin,
Erythromycin, Roxithromycin, Amikacin, Gentamicin, Kanamycin,
Streptomycin, Tobramycin trong mẫu thử giả lập bằng phương pháp LC-
2.2.2.1 Lựa chọn chất nội chuẩn
Nhằm giảm sai số và đạt độ lặp lại cao trong phương pháp định lượng bằng
LC-MS/MS, người ta thường sử dụng chất nội chuẩn với các yêu cầu:
Cấu trúc hóa học của chất khảo sát phải tương ứng nhưng không được chuyển đổi thành chất cần phân tích trong quá trình định lượng và không có sẵn trong hỗn hợp cần phân tích.
- Bền vững, không phản ứng với các thành phần trong mẫu, pha tĩnh hay pha động
- Phải tách hoàn toàn khỏi các chất cần phân tích và cho một đỉnh riêng biệt trên sắc ký đồ
- Có thời gian lưu gần với thời gian lưu chất cần phân tích trong cùng điều kiện
- Tạo được phân mảnh phù hợp và ổn định khi bắn phá bằng khối phổ
- Nên có sẵn dưới dạng tinh khiết trên thị trường
- Chất cấm sử dụng trong nuôi trồng thủy hải sản do độc tính cao
Dựa trên tính chất hóa lý của AZI, CLAR, ERY, ROXI, GENT, KANA,
STREP, TOB và tài liệu tham khảo [29], [31], [32], [36] đã được sử dụng để khảo sát nội chuẩn cho hai nhóm kháng sinh aminoglycosid và macrolid, có cấu trúc vòng tương tự AMI và KANA được chọn làm nội chuẩn, với dung dịch pha loãng khoảng 500 ng/mL được bơm vào hệ thống khối phổ để xác định ion mẹ và ion phân mảnh Quá trình này diễn ra với tốc độ 20 μL/phút, sử dụng chế độ phun điện tử ion dương (ES +) hoặc âm (ES -) nhằm lựa chọn chất nội chuẩn có tín hiệu cao và ổn định nhất.
2.2.2.2 Khảo sát điều kiện khối phổ
Sử dụng chế độ Auto-tune trong phần mềm Masslynx 4.1 của hệ thống khối phổ Xevo-TQD giúp khảo sát các thông số khối phổ để thu được tín hiệu tối ưu cho AZI, CLAR, ERY, ROXI, GENT, KANA, STREP, TOB Chất phân tích và nội chuẩn được hòa tan trong dung môi MeOH: nước acid formic 0,1% (30:70, tt/tt) với nồng độ khoảng 500 ng/mL, sau đó được bơm trực tiếp vào máy khối phổ để tối ưu hóa điều kiện khối phổ.
- Xác định ion mẹ cho AZI, CLAR, ERY, ROXI, GENT, KANA, STREP,
- Xác định phân mảnh ion con của của chất phân tích và nội chuẩn có cường độ tín hiệu cao và ổn định
Các thông số khối phổ dự kiến khảo sát:
- Kiểu ion hóa ESI: dương (ES + ) hay âm (ES - )
- Thế mao quản (capillary voltage): 2-4 kV
- Thế cone (cone voltage): 10-80 eV
- Thời gian chờ ghi nhận tín hiệu (dwell time): 0,025-0,2 giây
- Tốc độ dòng khí phun (nebulizer gas flow)
- Nhiệt độ khí bay hơi (desolvation temp): 250-500 0 C
- Tốc độ dòng khí bay hơi (desolvation gas flow): 800-1000 L/giờ.
2.2.2.3 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp
Sắc ký pha đảo sẽ được áp dụng cho các hợp chất AZI, CLAR, ERY, ROXI, GENT, KANA, STREP, TOB với độ phân cực từ trung bình đến cao Hệ dung môi phân cực bao gồm ACN, MeOH và nước, có thể điều chỉnh pH bằng các chất như acid acetic băng, acid formic (nồng độ
