Nghiên cứu tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn, vi nấm của dẫn chất 5 (5 clorosalicylaldehyd) 3 (4 clorosalicylamido)rhodanin

“NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI KHUẨN, VI NẤM CỦA DẪN CHẤT CLOROSALICYLAMIDO RHODANIN” 5-5-CLOROSALICYLALDEHYD-3-4-Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau: 1.. Ng

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS PHẠM THỊ TỐ LIÊN

Cần Thơ- 2018

ố Liên lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất Cô

đã hết lòng hướng dẫn, chia sẻ những kiến thức, kinh nghiệm giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn thầy Ds Huỳnh Trường Hiệp, cô ThS Võ Thị Mỹ Hương,

cô ThS Lê Thị Cẩm Tú, cô ThS Trần Lê Uyên, thầy Lê Việt Hùng và chị Bùi Thị Ngọc Hân bộ môn Hóa dược, trường Đại học Y Dược Cần Thơ đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho em trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Em xin cảm ơn thầy cô liên bộ môn Dược liệu - Dược cổ truyền - Thực vật dược, bộ môn Hóa Phân tích - Kiểm nghiệm - Độc Chất đã tạo điều kiện, hỗ trợ em các phương tiện, máy móc để thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Cảm ơn chị Ds Nguyễn Ngọc Bảo Hà, anh Ds La Minh Thành đã nhiệt tình trao đổi, chia sẻ kinh nghiệm cho em

Cảm ơn các bạn trong nhóm luận văn Hóa dược, Dược liệu, Bào chế và Kiểm nghiệm K39 đã đồng hành, giúp đỡ cùng mình vượt qua những khó khăn, trở ngại trong suốt thời gian qua

ừng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào

Cần Thơ, ngày 14 tháng 6 năm 2018

Ngô Thị Mộng Tuyền

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC SƠ ĐỒ vii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 5-Clorosalicylaldehyd 3

1.1.1 Công thức và cấu trúc 3

1.1.2 Danh pháp 3

1.1.3 Tính chất vật lý 3

1.1.4 Đặc tính cấu trúc 3

1.1.5 Tính chất hóa học 4

1.1.6 Tổng hợp 5-clorosalicylaldehyd 5

1.1.7 Tác dụng sinh học của 5-clorosalicylaldehyd 6

1.2 3-Aminorhodanin 7

1.2.1 Công thức và cấu trúc 7

1.2.2 Danh pháp 7

1.2.3 Tính chất vật lý 7

1.2.4 Đặc tính cấu trúc 8

1.2.5 Tính chất hóa học 8

1.2.6 Phương pháp tổng hợp 3-aminorhodanin và các dẫn chất 12

1.2.7 Tác dụng sinh học của rhodanin và các dẫn chất 13

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng và trang thiết bị nghiên cứu 17

17

17

18

18 2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.3.1 Tổng hợp và tinh chế dẫn chất 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido)rhodanin 19

2.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết, xác định các thông số lý hóa và cấu trúc hóa học 20

2.3.3 Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn và vi nấm 23

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Tổng hợp khung 3-(4-clorosalicylamido)rhodanin 29

3.2 Tổng hợp dẫn chất 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido) rhodanin 29

3.2.1 Tiến hành phản ứng 29

3.2.2 Tinh chế sản phẩm 30

3.2.3 Tính chất sản phẩm 30

3.2.4 Định tính bằng phản ứng hóa học 31

3.3 Kiểm tra độ tinh khiết, xác định các thông số lý hóa và cấu trúc hóa học 32

3.3.1 Kiểm tra độ tinh khiết và xác định các thông số lý hóa 32

3.3.2 Xác định cấu trúc hóa học 33

3.4 Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn và vi nấm của dẫn chất

5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido)rhodanin 34

3.4.1 Kết quả định tính kháng khuẩn, kháng nấm 34

3.4.2 Kết quả xác định MIC kháng khuẩn, kháng nấm 34

Chương 4 BÀN LUẬN 35

4.1 Tổng hợp dẫn chất 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido) rhodanin 35

4.1.1 Cơ chế phản ứng 35

4.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp 36

37

ịnh các thông số lý hóa và cấu trúc hóa học 37

ịnh các thông số lý hóa 37

ọc 38

4.2.3 Xác định cấu trúc hóa học 38

4.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 44

4.3.1 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn 44

4.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng nấm 45

KẾT LUẬN 46

KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC PHỤ LỤC

PHỤ LỤC

ỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

nguyên Ý nghĩa CFU Colony-forming unit Đơn vị tính số khuẩn lạc

13C-CPD 13C-Composite Pulse Decoupling Phổ 13C xóa ghép đa xung

DMF Dimethylformamide Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxyde Dimethylsulfoxyd

ESI Electrospray ionization Ion hóa phun sương electron

1H-NMR 1H nuclear magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ proton

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50%

IN Intergrase Enzym hợp nhất

IR Infrared Phổ hồng ngoại

MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus

aureus

Vi khuẩn Staphylococcus aureus

kháng Methicillin

MS Mass spectrometry Khối phổ

NMR Nucleus magnetic resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

PDAB Paradimethylaminobenzaldehyde Paradimethylaminobenzaldehyd

PL Phụ lục

UV-Vis Ultra violet & visible Phổ tử ngoại khả kiến

λmax Bước sóng hấp thu cực đại

ỤC BẢNG

và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của

3-(4-clorosalicylamido)rhodanin………….…… 17

Bảng 2.2 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu……… ……… 18

Bảng 2.3 Đỉnh hấp thu IR đặc trưng của sản phẩm ghép 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido) rhodanin……… 23

Bảng 3.1 Kết quả định tính sản phẩm ghép bằng phản ứng hóa học………31

Bảng 3.2 Kết quả giá trị Rf ……… 32

Bảng 3.3 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm ghép 5-(5-

clorosalicylaldehyd)- 3-(4-clorosalicylamido)rhodanin……….32

Bảng 3.4 Định tính khả năng kháng khuẩn, kháng nấm……… 34

Bảng 3.5 Kết quả MIC của sản phẩm ghép……… 34

ỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.3 Cấu trúc của 3 aminorhodanin……….7

Hình 1.4 Phổ IR của 3-aminorhodanin……… 8

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của dẫn chất ký hiệu 1a và 1b……… 14

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của dẫn chất ký hiệu 3d và 3e……… 15

Hình 1.7 Công thức của hợp chất có ký hiệu 11……… 15

Hình 1.8.Công thức dẫn chất có ký hiệu T21……….………16

Hình 2.1 Phương trình phản ứng để tổng hợp dẫn chất ngưng tụ 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido)rhodanin……… ………19

Hình 2.2 Thứ tự vết chấm trên bản mỏng……….21

Hình 2.3 Phản ứng định tính khung rhodanin……… 22

Hình 2.4 Đĩa thạch định tính khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm 26

Hình 2.5 Đĩa thạch xác định MIC của vi khuẩn, vi nấm……… 28

Hình 3.1 Phương trình phản ứng để tổng hợp dẫn chất ngưng tụ 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido)rhodanin……… ……29

Hình 3.2 Mô hình phản ứng……… …30

Hình 3.3 Hình dạng cảm quan sản phẩm 5-(5-clorosalicylaldehyd)- 3-(4-clorosalicylamido)rhodanin………31

Hình 4.1 Khả năng phản ứng ngưng tụ của các hợp chất mang nhóm carbonyl 36

Hình 4.2 Phổ 1H-NMR của khung rhodanin và sản phẩm ghép……… 40

Hình 4.3 Phổ 1H-NMR của sản phẩm ghép……… 41

Hình 4.4 Phổ 13C-CPD của khung rhodanin……… 42

Hình 4.5 Phổ 13C-CPD của sản phẩm ghép……… 42

Hình 4.6 Phổ 13C-CPD & DEPT của khung rhodanin……… 43

Hình 4.7 Phổ 13C-CPD & DEPT của sản phẩm ghép……… 44

ỤC SƠ ĐỒ

ằng phương pháp dithiocarbamat… 13 Knoevenagel……….35

ẶT VẤN ĐỀ

c tìm ra bởi Alexander Fleming vào năm 1928 đã

ền y học khi có thể cứu sống được rất nhiều

ớc đó gần như chắc chắn tử vong Từ đầu thế kỷ

ết tìm kiếm nhiều loại kháng sinh mới, hơn 8000 chất kháng khuẩn đã được tìm thấy và hơn 100 loại kháng sinh được đưa vào sử dụng trên lâm sàng [1] Kháng sinh đã thực sự trở thành vũ khí mạnh mẽ trong cuộc chiến chống lại bệnh nhiễm trùng Tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh quá mức đã làm gia tăng tỷ lệ kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh Hiện nay đã xuất hiện nhiều chủng vi khuẩn kháng thuốc như MRSA giảm nhạy cảm với vancomycin, trực khuẩn

gram âm ESBL (+), những chủng Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter

baumannii đa đề kháng [2], [6], [14]

Trên thế giới, đặc biệt ở các nước đang phát triển như Việt Nam khi mà bệnh truyền nhiễm còn chiếm tỷ lệ cao trong mô hình bệnh tật thì vấn đề kháng kháng sinh lại

càng trở nên đáng báo động Các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc “ESKAPE” (viết tắt

6 chữ cái đầu tiên của 6 chủng vi khuẩn Enterococcus faecium, Staphylococcus

aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa,

và Enterobacter species) là các tác nhân gây nhiễm trùng nặng, kéo dài thời gian nằm

viện và làm tăng chi phí điều trị do việc thay thế các kháng sinh cũ bằng kháng sinh mới, đắt tiền Gần đây, có sự lây lan nhanh chóng của siêu vi khuẩn gram âm mang

gen New Delhi Metallo Beta lactamase 1 (NDM-1) kháng carbapenem- nhóm kháng

sinh mạnh nhất hiện nay [9], [40]

Trong khi vi khuẩn ngày càng trở nên kháng thuốc mạnh mẽ thì việc nghiên cứu thuốc mới đòi hỏi rất nhiều thời gian nên số lượng kháng sinh mới ra đời chưa theo kịp với mức độ đề kháng thuốc của vi khuẩn Nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị bệnh cho nhân loại, việc đầu tư mạnh mẽ cho nghiên cứu và phát triển kháng sinh mới là hết sức cần thiết Các công trình nghiên cứu công bố gần đây về dẫn chất của rhodanin cho thấy, những chất này có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư, chống oxy hóa

và hạ đường huyết rất đáng quan tâm [18], [20], [29], [30], [34], [42] Đặc biệt là tác

“NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI

KHUẨN, VI NẤM CỦA DẪN CHẤT CLOROSALICYLAMIDO) RHODANIN”

5-(5-CLOROSALICYLALDEHYD)-3-(4-Đề tài được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Tổng hợp dẫn chất 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido) rhodanin

2 Kiểm tra độ tinh khiết, xác định cấu trúc cùng các thông số hóa lý đặc trưng của dẫn chất tổng hợp được

3 Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm của dẫn chất tổng hợp được trên in vitro

ỔNG QUAN TÀI LIỆU

Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Cấu trúc của 5-clorosalicylaldehyd

1.1.2 Danh pháp

Tên thông thường: 5-clorosalicylaldehyd

Tên theo IUPAC: 5-cloro-2-hydroxylbenzaldehyd; 2-hydroxy-5-clorobenzaldehyd; Benzaldehyd, 2-hydroxy, 5-cloro; 4-cloro-2-formylphenol [47], [48]

1.1.3 Tính chất vật lý

5-Clorosalicylaldehyd có dạng bột kết tinh, màu trắng đến vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy 102°C, pKa = 8,37 (ở 250) Kém tan trong nước; dễ tan trong ethanol, methanol, n-hexan,… [47], [48], [49]

1.1.4 Đặc tính cấu trúc

Phổ IR

Hình 1.2 Phổ IR của 5-clorosalicylaldehyd

p thu của dao động co giãn của liên kết -OH ở ảng 3100-3000 cm-1 cũng quan sát được vân hấp

-C=O aldehyd có vân hấp thu

ở khoảng 1780-1750 cm-1[22], [47]

no và phân cực đã trở thành trung tâm tấn công của những tác nhân ái nhân [3]

1.1.5.1 Phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl

Phản ứng cộng hợp với natrihydrosulfit (NaHSO3)

5-Clorosalicylaldehyd tác dụng với dung dịch đậm đặc natrihydrosulfit tạo thành sản phẩm cộng ở trạng thái tinh thể gọi là hợp chất sulfonic Nguyên tử lưu huỳnh có tính

ái nhân mạnh tác dụng với nguyên tử carbon của nhóm carbonyl theo cơ chế:

Hợp chất sulfonic dễ bị thủy phân trong môi trường acid tạo thành hợp chất carbonyl ban đầu và SO2 [3]

Phản ứng cộng hợp với các hợp chất có nhóm methylen linh động

Phân tử 5-clorosalicylaldehyd trong môi trường base loãng sẽ ngưng tụ với hợp chất

có nhóm methylen linh động tạo hợp chất aldol sau đó loại đi một phân tử nước tạo thành sản phẩm chưa no Phản ứng này được gọi là phản ứng Knoevenagel (hay phản ứng ngưng tụ aldol) [3]

Phản ứng Perkin

Là phản ứng của aldehyd thơm với anhydrid acetic và natri acetat

Natri acetat đóng vai trò xúc tác base để tạo carbanion- tác nhân ái nhân cộng hợp

vào nhóm carbonyl của phân tử aldehyd thơm [3]

a nhóm chức amin

NH2 và nhóm carbonyl linh động trên phân tử 5-clorosalicylaldehyd tạo thành hợp chất có cấu trúc RC=NR’ gọi là base Schiff [3]

Đun hồi lưu 5-clorosalicylaldehyd với anilin trong ethanol ở nhiệt độ 303-318 oK tạo

thành base Schiff Phản ứng trải qua 2 giai đoạn: đầu tiên là phản ứng cộng tạo thành

carbinolamin và giai đoạn thứ hai là sự tách nước tạo hợp chất chứa chức -C=N [32],

[39]

1.1.5.2 Phản ứng oxy hóa

Tác nhân oxy hóa là Ag2O, H2O2, KMnO4, CrO3, Cu(OH)2,…

Phản ứng của aldehyd với dung dịch AgNO3 trong amoniac tạo Ag kim loại và acid

hữu cơ (phản ứng Tollens) và phản ứng với thuốc thử Fehling tạo oxyd đồng Cu2O

có màu đỏ gạch là những phản ứng đặc trưng để định tính nhóm chức aldehyd [3]

1.1.6 Tổng hợp 5-clorosalicylaldehyd

5-Clorosalicylaldehyd được tổng hợp bằng phản ứng monoclor hóa Quá trình tổng

hợp trải qua các bước sau:

Bước 1: Salicylaldehyd phản ứng đồng lượng với clor tạo thành hỗn hợp phản ứng

thô gồm có 5-clorosalicylaldehyd, salicylaldehyd chưa phản ứng hết và một lượng

nhỏ tạp hữu cơ

được chưng cất chân không từng phần để tách

ệt độ chưng cất chân không nên duy trì ở mức dưới 1400C để tránh sự polyme hóa Hỗn hợp còn lại sau chưng cất chân không là 5-clorosalicylaldehyd và tạp hữu cơ

Bước 3: Kết tinh lại

Isopropanol-H2O tỉ lệ 50:50 thích hợp để kết tinh lại 5-clorosalicylaldehyd vì trong hỗn hợp này độ tan của 5-clorosalicylaldehyd thay đổi theo nhiệt độ còn tạp hữu cơ thì không [27]

1.1.7 Tác dụng sinh học của 5-clorosalicylaldehyd

5-Clorosalicyaldehyd là một chất trung gian tổng hợp hữu ích và là tiền chất của các tác nhân tạo nối chelat 5-Clorosalicyaldehyd được sử dụng để tổng hợp các dẫn chất imin resveratrol - những chất điều trị bệnh Alzheimer

5-Clorosalicyaldehyd có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm rất tốt Năm 2007 Lei Shi và cộng sự đã tổng hợp base Schiff từ 5-clorosalicyaldehyd và 26 amin bậc một Những hợp chất tạo thành được khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn (trên các chủng vi

khuẩn Bacillus subtilis, Escherichia Coli, Pseudomonas fluorescence và

Staphylococcus aureus) và vi nấm (trên các chủng Aspergillus niger, Candida albicans và Trichophyton rubrum) Kết quả cho thấy các chất thu được có hoạt tính

kháng khuẩn, kháng nấm tiềm năng trong đó (E)- 4-cloro-2-((4-fluorobenzylimino) -methyl) phenol có khả năng kháng vi khuẩn tốt nhất với MIC lần lượt là 45,2; 1,6; 2,8; 3,4; 47,5𝜇𝑔/mL trên các chủng B.subtilis, E.coli, P.fluorescence, S.aureus và

A.niger [39]

5-Clorosalicyaldehyd cũng được sử dụng làm nguyên liệu tổng hợp các phối tử để tạo phức kim loại chuyển tiếp Năm 2012 Matangi và cộng sự đã tổng hợp, xác định cấu trúc và thử hoạt tính kháng vi khuẩn của phức kim loại chuyển tiếp Phức kim loại tạo thành do Ni(II), Co(II), Cu(II) liên kết với phối tử là base Schiff Phối tử base

-2yl)phenyl]imino} methyl]-4-cloro phenol

n ứng giữa 2-(2-aminophenyl) 1H-benzimidazol

ức kim loại tạo thành được khảo sát hoạt tính

ẩn gram âm là E.coli, Pseudomonas fluorescence

là Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus Kết

khả năng kháng khuẩn mạnh hơn phối tử tự do

[44]

1.2 3-Aminorhodanin

1.2.1 Công thức và cấu trúc

Công thức phân tử: C3H4N2OS2 [46]

Trọng lượng phân tử: 148,198g/mol [46]

Công thức cấu tạo

Tên theo IUPAC: 3-amino-2-sulfanyliden-1,3-thiazolidin-4-on;

3-amino-2-thioxo-4-thiazolidinon; 3-amino-2-thioxo-1,3-thiazolidin-4-on; 3-amino-2-thioxothiazolidin

-4-on; 3-amino-4-thiazolidinon-2-thion [46], [47], [48], [49]

1.2.3 Tính chất vật lý

3-Aminorhodanin có dạng tinh thể hình kim, màu vàng nhạt, nhiệt độ nóng chảy là

100-103o C Tan trong nước, methanol, ethanol, acid acetic băng,… không tan trong

benzen, ether, cloroform,…[22]

ố 3 và các dẫn chất 5-alkyl có cực đại hấp thu ở

ất rhodanin mà vị trí số 5 chưa no gây ra hiệu ứng

ụ như nhóm vinyl liên kết giữa rhodanin và

ự chuyển dịch cực đại hấp thu lên 376 nm [23]

1.2.4.2 Phổ IR

Trên phổ đồ IR vân hấp thu nhọn ở khoảng 1760- 1745 cm-1 có cường độ mạnh nhất đặc trưng cho dao động co giãn 𝜈C=O Dao động của 𝜈C=S là các dải hấp thu ở vùng 1155-1092 cm-1 có cường độ yếu và vùng 1250 cm-1 với cường độ mạnh hơn Dao động co giãn của liên kết N-H có vân hấp thu nhọn ở vùng 3400-3100 cm-1 [22], [23], [47]

n là dạng thion và dạng thiol Khi ở dạng thion,

thơm và tạo thành dẫn chất 3-aryliden amoniac phản ứng xảy ra với dạng thiol và tạo

Sự hỗ biến đã chuyển nhóm thion thành nhóm

ử có tính acid yếu [35]

Phản ứng alkyl hóa

Trong phản ứng alkyl hóa 3-aminorhodanin và các dẫn chất thế ở vị trí số 5, gốc alkyl gắn vào nguyên tử lưu huỳnh của nhóm thion Phản ứng alkyl hóa giữa rhodanin với 𝛽–propiolacton ở nhiệt độ phòng tạo dẫn chất S-(𝛽-carboxyethyl) [23]

Đun hồi lưu rhodanin với 2,4-dinitroclorobenzen với xúc tác natri acetat tạo thành các dẫn chất O,S- diaryl của thiazol 2,4 thiazolidindion tương ứng cũng được tạo thành khi đun hồi lưu rhodanin hoặc dẫn chất 5-alkyliden rhodanin với acid cloroacetic trong cồn [23]

Phản ứng thế ái nhân với các dẫn chất amin tạo thành 2-iminorhodanin

1.2.5.2 Phản ứng hóa học ở vị trí số 3

Sự cộng hưởng của nhóm thion -C=S làm N trên nhân rhodanin mang điện tích dương, ảnh hưởng đến cặp điện tử của nhóm -NH2 Vì vậy -NH2 có tính kiềm rất yếu, trong môi trường HCl vẫn tồn tại dạng base mà không tạo thành muối Tuy nhiên nếu thay nhóm -C=S bằng nhóm -C=O thì dẫn chất 3-amino-2,4- thiazolidindion vẫn có thể tạo muối với HCl [23]

N-aminorhodanin tham gia phản ứng acetyl hóa với anhydrid acetic xúc tác kẽm oxid

hoặc anhydrid acetic trong acid acetic băng tạo thành N-acetylaminorhodanin Nếu chỉ dùng anhydrid acetic, phản ứng sẽ tạo ra N,N-diacetylaminorhodanin [33]

cồn tạo sản phẩm là dẫn chất thế ở vị

ố 4

ở vị trí số 4 có tính ái nhân yếu

ằng cách chuyển -C=O thành -C=S khi cho

5 trong môi trường dioxan [23]

1.2.5.4 Phản ứng hóa học ở vị trí số 5

Tính ái nhân tăng lên trong môi trường kiềm vì phân tử rhodanin sẽ tồn tại ở dạng

aninon Các nhóm rút điện tử khác nhau tính ái nhân sẽ khác nhau Nhóm -C=S rút

điện tử mạnh hơn -C=O nên khả năng tham gia phản ứng ái nhân của thiorhodanin

cao hơn rhodanin và thiazolidindion [23], [41]

Phản ứng ngưng tụ với aldehyd và ceton

Là phản ứng ngưng tụ giữa nhóm methylen của rhodanin và nhóm carbonyl của

aldehyd hoặc ceton và loại đi một phân tử nước [23], [35]

Dẫn chất thế ở vị trí số 5 tạo thành trong môi trường amoniac khi mà 3-aminorhodanin

chuyển hoàn toàn thành dạng mercaptan (-SH) [36]

Nhóm methylen (vị trí số 5) của 3-aminorhodanin phản ứng với aldehyd trong ethanol

đun nóng, trong khi đó nếu thực hiện phản ứng trong acid acetic băng ở nhiệt độ

phòng thì aldehyd sẽ tấn công vào nhóm amino (vị trí số 3) trên phân tử

ợng thừa aldehyd (trừ salicylaldehyd) sản phẩm

ế ở cả hai vị trí 3 và 5 [36]

Tác nhân ngưng tụ có thể là acid sulfuric, glycin, diethylamin, pyridin, NH4OH trong ethanol, NH4Cl trong NH4OH, amoni acetat, NaOH trong ethanol, natri acetat khan trong acid acetic, natri acetat khan,… Đôi khi phản ứng ngưng tụ diễn ra rất nhanh trong dung dịch đun hồi lưu mà không cần sử dụng chất ngưng tụ [23], [25]

Phản ứng tạo thuốc nhuộm hoàn nguyên

Rhodanin và các dẫn chất phản ứng với isatin hoặc thianaphthenon trong anhydrid acetic tạo thành sản phẩm là thuốc nhuộm hoàn nguyên [23]

Phản ứng với acid nitrơ và các dẫn chất nitroso

Rhodanin phản ứng với acid nitrơ, amyl nitrit và isopropyl nitrit thu được sản phẩm

là 5-oximinorhodanin [23]

Phản ứng trùng hợp rhodanin

Sự oxy hóa và trùng hợp 3-aminorhodanin xảy ra với tác nhân selenium dioxid trong cồn nóng xúc tác amin bậc bốn tạo thành dạng dimer [23]

ặc natri

1.2.6 Phương pháp tổng hợp 3-aminorhodanin và các dẫn chất

1.2.6.1 Tổng hợp 3-aminorhodanin

Phản ứng của amoni dithiocarbamat và diethyl cloromalonat

Sản phẩm tạo thành của phản ứng giữa amoni dithiocarbamat và diethyl cloromalonat phụ thuộc nhiệt độ Ở nhiệt độ phòng thu được 5-carbethoxyrhodanin trong khi nếu đun hồi lưu sẽ xảy ra sự xà phòng hóa và decarboxy hóa tạo thành 3-aminorhodanin

[23]

Phương pháp dithiocarbamat

Phương pháp này thông dụng hơn phương pháp đóng vòng rhodanin từ amoni dithiocarbamat và diethyl cloromalonat Chất trung gian dithiocarbamat để đóng vòng rhodanin được tổng hợp từ nguyên liệu ban đầu là hydrazin phản ứng với CS2 trong môi trường kiềm (NH4OH) ở nhiệt độ 0-5oC Dithiocarbamat sau đó được cho phản ứng với muối Natri (hoặc Kali) của acid monocloroacetic Cuối cùng hỗn hợp được đóng vòng tạo 3-aminorhodanin khi đun nóng trong HCl đậm đặc Nếu dùng lượng thừa amoniac sản phẩm tạo thành là amoni trithiocarbonat Trong dung môi alcol, amoni trithiocarbonat mất -SH tạo thành dithiocarbamat [23]

Sơ đồ 1 Quy trình tổng hợp 3-aminorhodanin bằng phương pháp dithiocarbamat

1.2.6.2 Tổng hợp dẫn chất 5-aryliden của 3-aminorhodanin

Các dẫn chất 5-aryliden của 3-aminorhodanin được tạo thành bằng phản ứng

Knoevenagel, là phản ứng ngưng tụ giữa nhóm methylen linh động của 3-aminorhodanin và nhóm chức carbonyl của aldehyd [11], [23]

1.2.7 Tác dụng sinh học của rhodanin và các dẫn chất

Từ lâu rhodanin và các dẫn chất của rhodanin đã được nghiên cứu và cho thấy nhiều

hoạt tính sinh học đáng kể như hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, kháng ký sinh

trùng, kháng ung thư, kháng virus, cũng như những tác dụng dược lý bao gồm hạ

đường huyết, chống loạn nhịp, chống co giật, chống đông, chống oxy hóa [16], [20],

[28], [30], [34], [45] Những hợp chất có khung rhodanin cũng được phát hiện có khả

năng ức chế HIV-1 intergrase, HCV NS3 protease, aldose reductase, β-lactamase,

histidin decarboxylase, acetylcholinesterase và 15- lipooxygenase ,…[17], [37], [38],

1.2.7.1 Tác dụng kháng khuẩn

Hầu hết các nghiên cứu về rhodanin tập trung khảo sát tác dụng kháng vi khuẩn đặc

biệt là tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất thế ở vị trí số 5 trên khung rhodanin

[31], [42], [45]

Trong những năm gần đây đã có nhiều báo cáo về tác dụng kháng khuẩn tiềm năng

của dẫn chất N-carboxymethyl rhodanin trên vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng

Methicillin (MRSA) MRSA đã thực sự trở thành mối đe dọa đến sức khỏe của toàn

cầu bởi theo ước tính có đến hơn 50% các nhiễm trùng tụ cầu vàng gây ra bởi MRSA

Hơn nữa MRSA đã trở nên đề kháng với hầu hết kháng sinh như β-lactam và

macrolid Năm 2010, Hardej và cộng sự đã báo cáo quá trình tổng hợp và sàng lọc

của các dẫn chất N-carboxymethyl-5-aryl

ố những hợp chất thu được ký

ại MRSA với MIC lần lượt là 1,95 và 3,9 𝜇g/mL

𝜇g/mL [42]

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của dẫn chất ký hiệu 1a và 1b

Năm 2017, Martin và cộng sự đã tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất 5-arylalkyliden của rhodanin-3 acid acetic Các dẫn chất tổng hợp được đều

có tác dụng kháng vi khuẩn mycobacteria trong đó

N-(4-clorophenyl)-2-[5-(2-hydroxybenzenzyliden)-4-oxo-2-thioxothiazolidin-3-yl] acetamid biểu hiện hoạt tính

kháng khuẩn mạnh nhất trên vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis với MIC

8-16𝜇𝑀 [31]

1.2.7.2 Tác dụng kháng nấm

Theo Yoshihiko, 3-aminorhodanin có hoạt tính kháng nấm trên Aspergillus niger,

Trichophyton mentagrophytes, Candida albicans, Hansenula anomala và Penicillium expansum, với MIC trên Aspergillus niger chỉ 6,25𝜇g/mL; tác dụng kháng nấm của 3-aminorhodanin mạnh hơn rhodanin chứng tỏ nhóm amino gắn vào N-3 đóng vai trò quan trọng làm tăng hoạt tính kháng nấm của hợp chất [26] Theo Brown (1961), rhodanin và các dẫn chất của rhodanin chứa nhóm thiocarbamat được

sử dụng phổ biến làm hóa chất diệt nấm nhất là nấm mốc Vì vậy các sản phẩm ngưng

tụ aldol giữa rhodanin và aldehyd cũng biểu hiện hoạt tính kháng nấm tiềm năng đặc biệt những dẫn chất ngưng tụ có gắn nhóm methoxy, cloro, bromo và acetyl ở vị trí para trên vòng benzen [23]

Năm 2006, Maximiliano và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất 5-arylidenrhodanin nhờ

sự hỗ trợ của vi sóng sau đó đánh giá hoạt tính kháng nấm trên các chủng Candida

albicans, Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus spp,

Kết quả cho thấy hợp chất có ký hiệu 3d và 3e

ất trên nấm Candida và C.neoformans Nghiên

tác dụng của những hợp chất kháng nấm tốt tác -4-on và liên kết enon là không thể thiếu [43]

các dẫn chất rhodanin và tác dụng ức chế IN Kết quả hợp chất có ký hiệu 11 với

nhóm thế rút điện tử mạnh ở vị trí số 5 trên nhân rhodanin có ảnh hưởng lớn nhất đến hoạt lực ức chế IN [37]

Hình 1.7 Công thức của hợp chất có ký hiệu 11 1.2.7.4 Tác dụng kháng ung thư

Những nghiên cứu gần đây cho thấy dẫn chất của rhodanin có tiềm năng kháng ung thư cao Cigdem và cộng sự (2017) đã tổng hợp những dẫn chất rhodanin bằng phản ứng Knoevenagel và khảo sát hoạt tính kháng ung thư trên năm dòng tế bào ung thư

biểu mô gan là Huh 7, Plc, Snu449, HepG2, Hep3B và một dòng tế bào ung thư vú

ụng kháng ung thư cao nhất trên 6 dòng

𝜇𝑀 [34]

Hình 1.8 Công thức dẫn chất có ký hiệu T21 1.2.7.5 Tác dụng hạ đường huyết

Nhiều dẫn chất của rhodanin cho thấy tác dụng hạ đường huyết đáng kế [18], [29] Murugana và cộng sự đã tổng hợp các hợp chất vòng dispiropyrrolidin bằng phản ứng cộng đóng vòng giữa azomethine ylide và 5-aryliden rhodanin Sau đó tiến hành nghiên cứu docking trên protein 1FM9 và sàng lọc hoạt tính hạ đường huyết trên chuột Wistar Những dẫn chất tổng hợp được có tác dụng hạ đường huyết hiệu quả hơn cả rosiglitazon [21]

ỨU

ứu

-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido)

2.1.2 Nguyên liệu nghiên cứu

Hai nguyên liệu cần thiết cho phản ứng tổng hợp là khung 3-(4-clorosalicylamido) rhodanin và 5-clorosalicylaldehyd

Bảng 2.1 Nguyên liệu để tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của dẫn chất 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido) rhodanin

1 5-clorosalicylaldehyd Acros-Bỉ ≥ 98%

2 Acid 4-clorosalicylic Acros-Bỉ ≥ 98%

3 Acid monocloroacetic Acros-Bỉ ≥ 99%

4 Acid hydroclorid đậm đặc Xilong-Trung Quốc 35-38%

5 Acid sulfurid đậm đặc Xilong-Trung Quốc 95-98%

6 Natri bicarbonat Xilong-Trung Quốc ≥ 99,5%

7 Dung dịch amoniac Xilong-Trung Quốc 25-28%

8 Carbon disulfit Xilong-Trung Quốc ≥ 97%

9 Hydrazin hydrat Xilong-Trung Quốc 80%

10 Methanol Xilong-Trung Quốc ≥ 99,5%

11 Acid acetic băng Xilong-Trung Quốc ≥ 99,85%

12 Dimethylamin Xilong-Trung Quốc 40%

13 Dimethylsulfoxid Merck

14 Môi trường Tryptic Soy Agar Merck

15 Môi trường Tryptic Soy Broth Merck

16 Môi trường Mueller Hinton Agar Merck

17 Glucose

trưng phân tích của hãng Merck, bản nhôm tráng sẵn

sản phẩm: n-hexan, cồn tuyệt đối, nước cất một

Bảng 2.2 Trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Dùng để tổng hợp và tinh chế

1 Bếp cách thủy Memmert Đức

3 Bộ dụng cụ đun hồi lưu Đức

4 Bộ lọc áp suất giảm Đức

5 Bếp khuấy từ có bộ phận gia nhiệt Trung Quốc

6 Cân phân tích 4 số Kern AES 220-4 Đức

7 Tủ hood Esco Frontier- Junior Singapore

Dùng để kiểm tra độ tinh khiết và xác định thông số lý hóa

9 Đèn UV Camag 254nm và 365nm Thụy Sĩ

10 Máy đo điểm chảy Stuart SPM3 Mỹ

11 Máy đo phổ hồng ngoại Bruker Alpha-T Đức

12 Máy đo quang phổ tử ngoại Jasco V730 Nhật Bản

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Thực hiện tổng hợp dẫn chất ngưng tụ clorosalicylamido)rhodanin tại phòng thí nghiệm của bộ môn Hóa Dược, trường Đại học Y Dược Cần Thơ bằng phương pháp hóa học Sản phẩm sau khi tổng hợp được tinh chế, xác định độ tinh khiết, các thông số hóa lý đặc trưng và xác định cấu trúc hóa học Sau đó các dẫn chất đã tổng hợp được tiến hành khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn và vi nấm

ế dẫn chất

5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4 (5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido)

được tổng hợp bằng phương pháp dithiocarbamat (đã đề cập trong phần tổng quan) Quy trình tổng hợp được thực hiện

theo luận văn của tác giả La Minh Thành [15]

Dẫn chất 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido)rhodanin được tổng hợp

bằng phản ứng ngưng tụ giữa khung 3-(4-clorosalicylamido)rhodanin và 5-clorosalicylaldehyd Dung môi sử dụng có thể là methanol hoặc acid acetic băng

Xúc tác phản ứng thường là natri acetat khan hoặc các amin bậc 1, bậc 2 Trong

nghiên cứu này, acid acetic băng được chọn làm dung môi hòa tan và dimethylamin

làm xúc tác phản ứng [11], [25] Khảo sát các thông số của quá trình phản ứng để tìm

ra điều kiện phản ứng thích hợp gồm: nhiệt độ 60-1000C, thời gian 4-6 giờ kèm sự

Sản phẩm sau khi tổng hợp được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại nhiều lần

trong dung môi thích hợp

ịnh các thông số lý hóa và cấu trúc hóa học

ịnh các thông số lý hóa

đối chiếu với nguyên liệu và triển khai với 3 hệ

Chuẩn bị bản mỏng

Pha tĩnh: bản mỏng tráng sẵn Silica gel 60 F254 của Merck, kích thước 3,0x10cm

Chuẩn bị hệ dung môi khai triển

Dựa vào độ phân cực của chất phân tích để lựa chọn 3 hệ dung môi khai triển phù hợp và có độ phân cực tăng dần

Các hệ dung môi khai triển:

Hệ dung môi A: cloroform – aceton – acid acetic (60: 40: 0,5)

Hệ dung môi B: cloroform – ethyl acetat – acid acetic (60: 40: 0,5)

Hệ dung môi C: n-hexan – ethyl acetat – acid acetic (50: 50: 0,5)

Pha dung môi theo tỷ lệ thích hợp và bão hòa bình trong 15-20 phút

Chuẩn bị mẫu thử và chấm mẫu thử

Mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp, chấm điểm, lượng chấm khoảng 5μl [4]

Khai triển

Khai triển trong bình sắc ký đã bão hòa dung môi, ở nhiệt độ phòng

Phát hiện vết

Quan sát các vết dưới ánh sáng thường, soi đèn UV 254nm và 365nm

Tính toán Rf của vết nguyên liệu và sản phẩm

Sản phẩm được đánh giá sơ bộ là tinh khiết khi nhiệt độ nóng chảy giữa hai lần tinh chế chênh lệch không quá 0,5oC Sử dụng máy STUART® SMP3 để đo nhiệt độ nóng chảy Mẫu được đo 3 lần sau đó lấy kết quả trung bình

Xác định độ tan

Độ tan: là lượng dung môi tối thiểu cần thiết để hòa tan hoàn toàn một đơn vị chất

đó ở điều kiện chuẩn (20oC, 1atm) [5]

Sản phẩm sau khi tinh chế sẽ được xác định độ tan trong một số dung môi thông dụng như nước, cồn tuyệt đối, methanol, cloroform, ethyl acetat,…

vùng 600-200nm [10]

Phổ hồng ngoại IR

Mẫu được đo bằng kỹ thuật dập viên với KBr và đo trên máy Brucker Alpha – T Cách tiến hành (PL 4.2 Dược điển Việt Nam IV): với mẫu rắn, nghiền mịn 1-2mg mẫu trong 300-400mg bột KBr trong cối mã não, dập viên dưới áp lực khoảng 500MPa, viên có đường kính 13 mm Quét phổ trong vùng hồng ngoại cơ bản từ 4000-400cm-1 [3], [5], [10]

sản phẩm ghép -(4-clorosalicylamido) rhodanin [3]

5-(5-Khối phổ

Được thực hiện trên máy LC-MSD-Trap-SL Agilent Mẫu pha trong dung môi methanol Nguồn tạo ion theo phương pháp ion hóa phun sương (ESI) Phổ được biện giải theo tài liệu của tác giả Nguyễn Kim Phi Phụng [12]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ 1H-NMR, phổ 13C-CPD, phổ 13C-CPD & DEPT được đo trên máy Brucker AC 500MHz Mẫu pha trong dung môi dimethylsulfoxyd (DMSO) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân được biện giải theo tài liệu của tác giả Nguyễn Kim Phi Phụng [13]

2.3.3 Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn và vi nấm

2.3.3.1 Vật liệu

Môi trường

Môi trường tăng sinh

Vi khuẩn: Nutrient Broth (NB), Tryptic Soy Broth (TSB), Trypticase soy agar (TSA)

Vi nấm: Sabouraud dextrose agar (SDA)

Môi trường thử nghiệm kháng sinh

Vi khuẩn: Thạch Mueller-Hinton (MHA)

Kiểu dao động

ν–OH

νN–H

ν=C–H C=O rhodanin νC=O C=O amid bậc hai νC=O

C=C nhân thơm νC=C C-N rhodanin ν C–N C=S rhodanin νC=S C-H nhân thơm νC–H

+ 2% Glucose

ới dạng bột khô, khi sử dụng hòa tan vào nước

ờng thạch phải đun nóng cho thạch tan

ng đã hấp tiệt trùng nhưng chưa sử dụng được bảo

kháng vi nấm: nước muối sinh lý 0,85%

Chất thử: 5-(5-clorosalicylaldehyd)-3-(4-clorosalicylamido)rhodanin

Chủng thử nghiệm

Vi khuẩn:

1 Escherichia coli ATCC 25922

2 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

3 Streptococcus faecalis ATCC 29212

4 Staphylococcus aureus ATCC 29213

5 Staphylococcus aureus đề kháng methycilin (MRSA) ATCC 43300

Vi nấm:

1 Candida albican ATCC 10231

2 Aspergilus niger ATCC 16404

2.3.3.2 Định tính khả năng kháng khuẩn và kháng nấm của các chất thử nghiệm

Sử dụng phương pháp khuếch tán trong thạch [7], [19]

Môi trường

Môi trường thử nghiệm MHA với thử kháng khuẩn và môi trường MHA + 0,5% glucose đối với thử kháng nấm được nấu chảy và đổ hộp sao cho có được lớp thạch dày khoảng 3-4mm Nếu bề mặt thạch bị đọng nước cần ủ khô mặt thạch bằng cách

ối sinh lý hoặc TSB, sao cho mật độ thu được ảng 1,5 x 108 CFU/mL

Nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

Chất thử: Chất thử được hòa tan trong DMSO để đạt nồng độ cuối cùng là 1024

μg/mL

Tiến hành

Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền trọc vi khuẩn (vào dịch nấm đối với thử kháng nấm) đã chuẩn bị, ép que trên thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60o

Để hộp mở nắp trong tủ ấm 3-5 phút cho ráo mặt

Đục lỗ đường kính 6mm đối với thử kháng khuẩn và 3 mm đối với thử kháng nấm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng

Chất thử được nhỏ vào trong lỗ khoảng 60μl đối với thử kháng khuẩn và 10μl đối với thử kháng nấm Tiến hành song song với một lỗ chứng chỉ nhỏ DMSO, không có chất thử

Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch

Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35-37oC trong 16-18 giờ Nếu vi khuẩn là MRSA thì ủ trong

24 giờ Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35-37oC đối với C.albican và ủ ở 30oC đối với A.niger

trong 24-48 giờ

Đọc kết quả

Lỗ chứng chứa DMSO không ức chế sự phát triển của vi khuẩn và vi nấm Chất thử

có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm khi xung quanh lỗ có vòng kháng khuẩn, kháng nấm

Vòng kháng khuẩn hoặc kháng nấm

Hình 2.4 Đĩa thạch định tính khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm

2.3.3.3 Xác định MIC đối với vi khuẩn và vi nấm của chất thử

Sử dụng phương pháp pha loãng hay phương pháp pha loãng bán định lượng quantitative dilution test) Những thử nghiệm này nói chung được gọi là thử nghiệm MIC Kết quả được thể hiện bằng nồng độ chất thử tối thiểu (µg/mL) có khả năng ức chế sự mọc của vi khuẩn, vi nấm [24]

(Semi-Nguyên tắc, chuẩn bị môi trường và chất thử giống nhau giữa thử nghiệm trên vi khuẩn và vi nấm

Nguyên tắc: chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ từ thấp tới cao theo cấp

số nhân trong môi trường nuôi cấy Mỗi nồng độ chất thử được cấy một lượng vi khuẩn nhất định và được nuôi cấy trong vòng 18-24 giờ Nồng độ chất thử thấp nhất

mà ức chế được sự phát triển của vi khuẩn (môi trường không đục hoặc vi khuẩn

không mọc trên mặt thạch) được gọi là giá trị MIC

Môi trường

Môi trường MHA đối với thử nghiệm vi khuẩn hoặc MHA + 2% glucose đối với vi nấm được phân chia vào các ống nghiệm với một thể tích chính xác, để đảm bảo các đĩa thạch có độ dày đồng đều; hấp tiệt trùng ở 121oC, 15 phút

Chất thử nghiệm được cân chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO Khi

sử dụng pha loãng bằng môi trường thử nghiệm hoặc pha trực tiếp với môi trường thử nghiệm sao cho tạo thành giai nồng độ trong môi trường thử nghiệm (có nồng độ sau bằng ½ nồng độ trước) như sau: 1024µg/mL, 512µg/mL, 256µg/mL, 128µg/mL, 64µg/mL, 32µg/mL, 16µg/mL, 8µg/mL, 4µg/mL Khi pha chất thử vào môi trường phải đảm bảo nồng độ DMSO nằm trong khoảng từ 2-5% nhằm tránh việc nồng độ DMSO cao sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm

nguội về 45-50oC, lắc đều để đạt được nồng độ

ng 3-4 mm

nghiệm kháng vi khuẩn và vi nấm

Các bước chuẩn bị giống như thử nghiệm định tính vi khuẩn nhưng phải pha loãng dịch vi khuẩn 10 lần để đạt mật độ khoảng 107CFU/mL Vi khuẩn đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

Tiến hành

Đĩa thạch được đánh số cho vị trí các chủng vi khuẩn

Làm khô mặt đĩa thạch có chất thử và đĩa chứng không có chất thử

Cho 1-2μl huyền phù dịch vi khuẩn lên đĩa để đạt được mật độ vi khuẩn trên thạch là

104CFU/mL

Để yên khoảng 15 phút để vết chấm khô

Lật ngược đĩa thạch đã cấy và ủ trong tủ ấm ở 37oC trong 16-18 giờ Đối với MRSA

phải ủ trong 24 giờ

Hình 2.5 Đĩa thạch xác định MIC của vi khuẩn, vi nấm

vi khuẩn (vi nấm) thử nghiệm Các khóm đơn lẻ hoặc vết mờ do đầu cấy để lại không được tính Nếu có vi khuẩn (vi nấm) mọc ở nồng độ cao hơn và bị ức chế ở nồng độ thấp, mẫu cấy có thể đã bị nhiễm và thử nghiệm phải được thực hiện lại