Nghiên cứu xây dựng qui trình định lượng đồng thời dư lượng một số kháng sinh nhóm phenicol, quinolon có trong nước bằng phương pháp lc ms

Áp dụng quy trình đã thẩm định để phân tích dư lượng kháng sinh nhóm phenicol và quinolon trong mẫu nước thải vùng nuôi trồng thủy sản thu thập tại các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh ..

NGUYỄN NGỌC KHÁNH THƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH

LƯỢNG ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG MỘT SỐ

KHÁNG SINH NHÓM PHENICOL, QUINOLON CÓ TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC

CẦN THƠ - 2018

NGUYỄN NGỌC KHÁNH THƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH

LƯỢNG ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG MỘT SỐ

KHÁNG SINH NHÓM PHENICOL, QUINOLON CÓ TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ

ThS DƯƠNG THỊ TRÚC LY

Cần Thơ - 2018

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian nghiên cứu thực hiện luận văn dưới sự hướng dẫn khoa học của

Thầy TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ và cô ThS Dương Thị Trúc Ly em xin gửi

lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến:

TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ và cô ThS Dương Thị Trúc Ly đã luôn tận

tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ và cho em những ý kiến bổ ích trong suốt quá

trình thực hiện luận văn

Các thầy cô trong Liên bộ môn Hóa phân tích - Kiểm nghiệm - Độc chất, thầy

Nguyễn Mạnh Quân đã cho những lời khuyên hữu ích và giúp đỡ, tạo điều kiện cho

em có đầy đủ dụng cụ, trang thiết bị, máy móc để thực hiện đề tài này

Xin gởi lời cám ơn chân thành đến Ths Huỳnh Thị Ngọc Liên và Ths Nguyễn

Văn Luy (Trung tâm chất lượng nông lâm thủy sản vùng 6, NAFI 6) đã giúp đỡ

hỗ trợ về chất chuẩn, hóa chất, kinh nghiệm phân tích mẫu để em hoàn thành tốt

luận văn

Cảm ơn các anh chị Dược K38, anh Huỳnh Huỳnh Anh Thi và các bạn bè

Dược K39 đã giúp đỡ, động viên em trong suốt quãng thời gian vừa qua

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân đã luôn

ủng hộ, đồng hành cùng con

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ và ThS Dương Thị Trúc Ly

Các số liệu, kết quả thực nghiệm nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào khác

Nguyễn Ngọc Khánh Thư

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC HÌNH ii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về nhóm kháng sinh phenicol 3

1.1.1 Tổng quan cloramphenicol 3

1.1.2 Tổng quan florfenicol 4

1.1.3 Tổng quan thiamphenicol 5

1.2 Tổng quan về nhóm quinolon 6

1.2.1 Tổng quan ofloxacin 6

1.2.2 Tổng quan ciprofloxacin 7

1.2.3 Tổng quan enrofloxacin 8

1.3 Các nghiên cứu liên quan đến đến phương pháp định lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải bằng phương pháp sắc ký lỏng 9

1.3.1 Nghiên cứu trong nước 9

1.3.2 Nghiên cứu trên thế giới: 10

1.3.3 Nhận xét các công trình nghiên cứu 11

1.4 Tổng quan về phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu nước thải 11

1.4.1 Phương pháp lấy mẫu nước thải 11

1.4.2 Xử lí mẫu 12

1.5 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ 16

1.5.1 Sắc ký lỏng 16

1.5.2 Đầu dò khối phổ ba lần tứ cực 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu 19

2.3 Phương tiện nghiên cứu 19

2.3.1 Hóa chất, thuốc thử 19

2.3.2 Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn 20

2.3.3 Thiết bị, dụng cụ 20

2.4 Phương pháp nghiên cứu: 21

2.4.1 Chuẩn bị mẫu 21

2.4.2 Xây dựng quy trình định lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải bằng phương pháp LC-MS/MS 22

2.4.3 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải bằng phương pháp LC-MS/MS 27

2.4.4 Ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định phân tích dư lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin có trong mẫu nước thải thu thập ở vùng nuôi trồng thủy sản các tỉnh Bạc liêu, Sóc trăng, Trà Vinh 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 31

3.1 Khảo sát xây dựng quy trình định lượng 31

3.1.1 Khảo sát sự lựa chọn nội chuẩn 31

3.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ 32

3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp 35

3.1.4 Quy trình xử lý mẫu thích hợp 36

3.1.5 Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích 37

3.1.6 Đánh giá ảnh hưởng nhiễu nền lên chất phân tích 38

3.2 Thẩm định quy trình phân tích 38

3.2.1 Tính tương thích hệ thống 38

3.2.2 Tính đặc hiệu- chọn lọc 40

3.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 43

3.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 44

3.2.5 Độ đúng và độ chính xác 46

3.3 Áp dụng quy trình đã thẩm định để phân tích dư lượng kháng sinh nhóm phenicol và quinolon trong mẫu nước thải vùng nuôi trồng thủy sản thu thập tại các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh 49

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 50

4.1 Xây dựng quy trình định lượng 50

4.1.1 Khảo sát nội chuẩn 50

4.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu 50

4.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp 54

4.1.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu thích hợp 56

4.1.5 Khảo sát sự ổn định mẫu phân tích 58

4.1.6 Khảo sát ảnh hưởng của nhiễu nền lên chất phân tích 58

4.2 Thẩm định quy trình định lượng 58

4.2.1 Tính tương thích hệ thống 58

4.2.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 60

4.2.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 60

4.2.5 Độ đúng và độ chính xác 60

4.3 Ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định 61

KẾT LUẬN 62

KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Chữ tắt, ký hiệu Chữ nguyên Ý nghĩa

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của cloramphenicol 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của florfenicol 4

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của thiamphenicol 5

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của ofloxacin 6

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của ciprofloxacin 7

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của enrofloxacin 8

Hình 1.7 Tóm tắt quy trình chiết pha rắn (SPE) 15

Hình 1.8 Cấu tạo bộ phận khối phổ 3 lần tứ cực 18

Hình 2.1 Hệ thống UPLC-MS/MS Xevo-TQD của Waters 21

Hình 2.2 Quy trình xử lý mẫu 1 24

Hình 2.3 Quy trình xử lý mẫu 2 25

Hình 2.4 Quy trình xử lý mẫu 3 25

Hình 3.1 Kết quả năng lượng phân mảnh tối ưu tín hiệu cho nội chuẩn 31

Hình 3.2 Kết quả autotune và manual-tune của chất chuẩn OFL 33

Hình 3.3 Kết quả autotune và manual-tune của chất chuẩn CLOR 34

Hình 3.4 SKĐ phân tích đồng thời CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF 36

Hình 3.5 Độ thu hồi các chất phân tích qua các quy trình xử lý mẫu 37

Hình 3.6 Sắc ký đồ overlay 6 lần tiêm liên tiếp của Cloramphenicol 40

Hình 3.7 Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn lần 2 của chất cloramphenicol 41

Hình 3.8 Phổ đồ MS fullscan ES+ của mẫu trắng thêm chuẩn 421

Hình 3.9 Phổ đồ Phổ đồ Daughter Scan của Ciprofloxacin 422

Hình 3.10 Đường tuyến tính của CIP và CLOR được truy xuất từ phần mềm Masslynx 4.1 44

Hình 3.11 S/N xác định LOD của CIP và CLO 46

Hình 3.12 Độ thu hồi trong ngày và liên ngày của CIP, OFL, ERF, CLOR, THI, FLOR ở nồng độ 10 ppb 48

Hình 3.13 Độ chính xác trong ngày và liên ngày của CIP, OFL, ERF, CLOR, THI, FLOR ở nồng độ 10 ppb 48

Hình 4.1 Phân mảnh con trong đặc trưng cho phân tích định lượng CLOR,

THIAM, FLOR, CIP, OFL, ERF và nội chuẩn NOR bằng kỹ thuật LC-MS/MS so với Thư viện Phổ chuẩn (European Massbank) 53

Hình 4.2 Sắc ký đồ minh họa hệ pha động ACN-nước acid formic pH 2,99 55 Hình 4.3 Sắc ký đồ các mẫu nước có dư lượng kháng sinh 61

Bảng 1.1 Nghiên cứu trong nước 9

Bảng 1.2 Nghiên cứu trên thế giới 10

Bảng 2.1 Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn được dùng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.2 Thông tin về các chất chuẩn đối chiếu sử dụng trong nghiên cứu 20

Bảng 2.3 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỉ lệ ion 28

Bảng 3.1 Thông tin khảo sát nội chuẩn 31

Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ tối ưu các kháng sinh phân tích 32

Bảng 3.3 Chương trình gradient pha động thích hợp phân tích đồng thời CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF 35

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu 37

Bảng 3.5 Độ ổn định sau 24 giờ 38

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu lên chất phân tích 38

Bảng 3.7 Kết quả tính tương thích hệ thống 39

Bảng 3.8 Tỉ lệ ion định tính và định lượng các kháng sinh phân tích 42

Bảng 3.9 Độ lệch chuẩn thời gian lưu cho các chất phân tích 43

Bảng 3.10 Khoảng tuyến tính, phương trình hồi quy và hệ số tương quan 44

Bảng 3.11 LOD, LOQ của các chất cần phân tích 46

Bảng 3.12 Độ đúng, độ chính xác trong ngày và liên ngày của các chất 47

Bảng 3.13 Kết quả phân tích 15 mẫu nước thải vùng nuôi trồng thủy sản 49

Bảng 4.1 So sánh kết quả khảo sát pha tĩnh tìm điều kiện sắc ký tối ưu 54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kháng sinh đóng vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khỏe nhân dân, phòng và điều trị bệnh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản Tuy nhiên, việc sử

dụng kháng sinh không hợp lý trong khám chữa bệnh, phòng bệnh đã gây hiện

tượng đề kháng và tồn dư các kháng sinh trong nước thải, trong vật nuôi, ảnh hưởng

xấu đến hiệu quả điều trị bệnh, sức khỏe cộng đồng và môi trường nghiêm trọng

[1], [4] Trong khi các cơ sở khám chữa bệnh, đặc biệt khu vực nuôi trồng thủ sản

và chăn nuôi hầu như chưa có hệ thống xử lý nước thải chứa dư lượng các kháng

sinh, chất sát khuẩn

Hiện nay, trên thị trường các loại thuốc kháng sinh phòng và trị bệnh nuôi

trồng thủy sản, chăn nuôi rất phong phú và đa dạng về số lượng và chủng loại với tên

thương mại rất khác nhau Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ra

Quyết định ban hành danh mục hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng trong nuôi trồng

thủy sản và các quy định về việc cấm mua bán và sử dụng thuốc, hoá chất

không rõ nguồn gốc cho nuôi trồng thủy sản [10] Nhưng trong thực tế tình

trạng mua bán và sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng hoặc không

rõ nguồn gốc vẫn diễn ra thường xuyên và phổ biến

Qua phân tích tình hình phân phối và sử dụng thuốc trong nuôi trồng

thuỷ sản tại các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau (Nguyễn Thị Phương

Nga, 2014) thì có đến 136 loại kháng sinh đang được sử dụng trong nuôi

trồng thủy sản, trong đó có 40 loại thuốc có chứa kháng sinh thuộc danh mục hạn

chế sử dụng Kháng sinh được sử dụng nhiều nhất thuộc nhóm

Fluoroquinolone (enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin và oxolinic

acid) và nhóm Phenicol (cloramphenicol, flofencicol) Do có phổ kháng khuẩn rộng

và khả năng phân bố tốt vào các mô trong cơ thể nên kháng sinh nhóm phenicol và

nhóm quinolon được dùng phổ biến [15]

Khi vấn đề sử dụng thuốc có tính chất lạm dụng thuốc, dùng không

đúng liều lượng, dùng một cách tràn lan, sử dụng tăng lên dẫn đến dư lượng kháng

sinh còn tồn dư trong các sản phẩm thủy sản, nước thải với hàm lượng đáng kể, đây

là một vấn đề hết sức báo động vì dẫn đến tình trạng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trên diện rộng ở nước ta, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc chăm sóc sức khỏe con người, vật nuôi và bảo vệ môi trường sống Do đó,việc phát triển phương pháp phân tích với độ đặc hiệu, nhạy và chính xác caonhằm xác định dư lượng các kháng sinh có trong nước thải từ các cơ sở khám chữa bệnh, cơ sở nuôi trồng thủy hải sản, chăn nuôi một vấn đề cấp thiết

Hiện nay, đã có một vài công trình nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh nhóm quinolon trong nước thải bệnh viện bằng phương pháp LC-FD, hay phương pháp LC-MS/MS phân tích quinolon [13] hoặc beta-lactam [21] trong mẫu nước thải của nhà máy sản xuất Dược phẩm, trong mẫu nước bề mặt [24] Hầu như chưa

có công trình nghiên cứu phân tích đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm quinolon

và cloramphenicol có trong trong mẫu nước thải nuôi trồng thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình định

lượng đồng thời dư lượng một số kháng sinh nhóm phenicol, quinolon có trong nước bằng phương pháp LC-MS/MS”được thực hiện với các mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng đồng thời dư lượng chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol; ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin,

có trong mẫu nước thải nuôi trồng thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS theo hướng dẫn của EC/657-2002

2 Ứng dụng qui trình đã thẩm định để xác định dư lượng các kháng sinh nhóm phenicol và quinolon có trong mẫu nước thải vùng nuôi trồng thủy sản, sông, rạch thu thập tại các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về nhóm kháng sinh phenicol

1.1.1 Tổng quan cloramphenicol [2], [3], [36]

1.1.1.1 Cấu trúc, tên hóa học

Tên khoa học:

2,2-dicloro-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-2-(4-nitrophenyl) ethyl] acetamid

Công thức phân tử: C11H12Cl2N2O5

Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của cloramphenicol

Phân tử lượng: 323,132 g/mol

1.1.1.2 Tính chất

Bột kết tinh màu trắng, trắng xám hoặc trắng vàng hay tinh thể hình kim hoặc phiến dài, khó tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96% và trong propylen glycol Dung dịch trong ethanol thì hữu tuyền, trong ethyl acetat thì tả tuyền

D Hoà tan khoảng 10 mg chế phẩm trong 1 mL ethanol 50% (TT), thêm 3 mL dung dịch calci clorid 1% (TT) và 50 mg bột kẽm (TT), đun nóng trên cách thủy 10

phút Lọc dung dịch nóng và để nguội Thêm 0,1 mL benzoyl clorid (TT) và lắc 1 phút Thêm 0,5 mL dung dịch sắt (III) clorid 10,5% (TT) và 2 mL cloroform (TT), lắc Lớp nước có màu đỏ tím nhạt đến đỏ tía

E Lấy 50 mg chế phẩm vào chén sứ, thêm 0,5 g natri carbonat khan (TT), đốt trên ngọn lửa trong 10 phút, để nguội Hoà tan cắn bằng 5 mL dung dịch acid nitric

2 M (TT) và lọc Lấy 1 mL dịch lọc, thêm 1 mL nước, dung dịch này phải cho phản ứng A của ion clorid

1.1.1.4 Định lượng

Hòa loãng một thể tích chế phẩm có chứa 20 mg cloramphenicol với nước thành 200 mL Lấy 10 mL dung dịch này cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước vừa đủ đến vạch Lắc kỹ và đo độ hấp thu của dung dịch thu được ở bước sóng cực đại 278 nm, cốc đo dày 1 cm, dùng nước làm mẫu trắng Tính hàm lượng của cloramphenicol, C11H12Cl2N2O5, theo A (1%, 1 cm) Lấy 297 là giá trị A (1%, 1 cm) ở cực đại 278 nm

Công thức phân tử: C12H14Cl2FNO4S

Công thức cấu tạo:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của florfenicol

Phân tử lượng: 358,21 g/mol

1.1.2.2 Tính chất

Chất rắn, dạng bột, màu trắng, không mùi, vị đắng, khó tan trong nước, tan nhiều trong lipid và dung môi hữu cơ

1.1.3.1 Cấu trúc, tên hóa học

Tên khoa học:

2,2-dicloro-N-{(1R,2R)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-2-[4-(methylsulfonyl) phenyl] ethyl} acetamid

Tên khác: Thiophenicol, dextrosulphenidol

Công thức phân tử:C12H15Cl2NO5S

Công thức cấu tạo:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của thiamphenicol

Phân tử lượng: 356,223 g/mol

Chưa có qui trình định lượng thiamphenicol trong Dược điển Việt Nam IV,

BP 2016, USP 31

1.2 Tổng quan về nhóm quinolon

1.2.1 Tổng quan ofloxacin [2], [3], [36]

1.2.1.1 Cấu trúc, tên hóa học

Tên khoa học: acid oxo-2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de]-1,4-benzoxazin-6-carboxylic [1],[19],[44]

(RS)-9-fluoro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-7-Công thức phân tử: C18H20FN3O4

Công thức cấu tạo:

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của ofloxacin

Phân tử lượng: 361,368 g/mol

1.2.2 Tổng quan ciprofloxacin [2],[36], [38]

1.2.2.1 Cấu trúc, tên hóa học

Tên khoa học: Acid dihydroquinolin-3-carboxylic

1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-yl)-1,4-Công thức phân tử: C17H18FN3O3.HCl

Công thức cấu tạo:

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của ciprofloxacin

Phân tử lượng: 331,346 g/mol

1.2.2.2 Tính chất

Bột kết tinh màu vàng nhạt, hút ẩm nhẹ, tan trong nước, khó tan trong methanol, rất khó tan trong ethanol, thực tế không tan trong aceton, ethyl acetat và methylen clorid

Dung dịch thử: hòa tan 25,0 mg chế phẩm trong pha động và pha loãng thành 50,0 mL với cùng dung môi

Dung dịch đối chiếu: hòa tan 25,0 mg ciprofloxacin hydroclorid chuẩn (ĐC) trong pha động và pha loãng thành 50,0 mL với cùng dung môi

Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch đối chiếu Tính hàm lượng

C17H18FN3O3.HCl dựa vào diện tích pic

1.2.3 Tổng quan enrofloxacin [13], [16], [38]

1.2.3.1 Cấu trúc, tên hóa học

Tên khoa học: dihydroquinolin-3-carboxylic acid

1-cyclopropyl-7-(4-ethylpiperazin-1-yl)-6-floro-4-oxo-1,4-Công thức phân tử: C19H22FN3O3

Công thức cấu tạo:

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của enrofloxacin

Phân tử lượng: 359,4 g/mol

1.3 Các nghiên cứu liên quan đến đến phương pháp định lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải bằng phương pháp sắc ký lỏng

1.3.1 Nghiên cứu trong nước

Bảng 1.1 Nghiên cứu trong nước

(ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin) trong nước thải bệnh viện

Chiết tách và làm giàu bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE)

sử dụng cột chiết cation hỗn hợp

Định tính, định lượng bằng HPLC với detectơ huỳnh quang

Quy trình có hiệu suất thu hồi cao (trung bình

84 - 101%), LOQ từ 0,5 - 1 μg/L

Nguyễn Thị

Hạnh (2015)

[13]

moxifloxacin, ofloxacin, ciprofloxacin, norfloxacin trong nước thải công nghiệp Dược

Sử dụng SPE để xử lý mẫu giúp loại bỏ được nhiều tạp chất xác định dư

l ư ợ n g bằng LC- MS/MS

Phương pháp có độ đúng, độ chính xác

từ 72,08% - 114,78%, LOD từ 0,03 - 0,2 ppb và LOQ từ 0,1-0,66 ppb,

hiệu suất thu hồi của các kháng sinh cao (77,75-114,93%), Nguyễn Văn

Thuận (2015)

[20]

cephalexin, cefuroxim, cefixim trong nước thải nhà máy dược phẩm

Tiến hành xử lý mẫu bằng phương pháp SPE, phát hiện và định lượng bằng phương pháp LC/MS-MS

Độ lặp lại cao RSD < 8% với n = 6,độ nhạy cao với giá trị LOD và LOQ thấp (LOD từ 0,58 ng/mL- 1,22 ng/mL), Độ thu hồi của các kháng sinh nằm trong khoảng 40 – 80% (RSD < 8%)

1.3.2 Nghiên cứu trên thế giới:

Bảng 1.2 Nghiên cứu trên thế giới

tetracycline (TET)

và trimethoprim

Xử lý mẫu bằng SPE trao đổi anion, đinh tính định lượng bằng sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (LC-MS / MS)

Giới hạn phát hiện (LOD) thay đổi từ 0.13 ng/L cho CIP và NOR đến 0,76 ng/ L cho TET

Qiang Xue &

Yanjie Qi &

Fei Liu, (2015)

[37]

35 chất kháng sinh bao gồm sulfonamid (SAs), quinolone (QLs) , tetracyclines (TCs), macrolides (MALs), lincomycin (LIN), và cloramphenicol (CAP)

SPE kết hợp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC-MS / MS) Pha động được bổ sung 0,1% axit formic giúp hình thành [M + H] + và tăng cường tín hiệu phát hiện

Khoảng pH tối ưu cho SPE là 4,5 ~5.0 với 6

mL dung dịch amoniac/methanol (5/95, v / v)

Độ thu hồi chất trong mẫu nước siêu sâu và nước ngầm lần lượt

là 67,13%- 93,00%

và 68,91% -92,67%

Ưu điểm thời gian phát hiện ngắn (< 10 phút), lượng mẫu nhỏ, hiệu suất thu hồi

và độ nhạy cao LOD phương pháp (MDL) là 0,29-4,03 ng/L

Ocsana Opris

và cộng sự

(2013) [34]

ba penicillin (amoxicillin,

ampicillin, penicillin G),hai cephalosporin (ceftazidim,

ceftriaxone) và hai tetracycline

(tetracycline, doxycycline)

Xử lý mẫu bằng SPE, định tính, định lượng bằng HPLC đầu dò, diode quang và phổ khối trong chế độ ion dương Kháng sinh được chiết xuất bằng cột

hydrophilic-lipophilic

Sự thu hồi tốt nhất thu được ở pH 3 và 7 tương ứng

LOD và LOQ khoảng 0,07-0,92 μg mL-1 và 0,21-2,77

μg mL-1 tương ứng

1.3.3 Nhận xét các công trình nghiên cứu

Qua các công trình nghiên cứu đã công bố, nhận thấy:

- Mẫu nghiên cứu thường là mẫu nước thải sinh hoạt, nước bề mặt sông, rất ít nghiên cứu trên mẫu nước nuôi trồng thủy, hải sản

- Kháng sinh nghiên cứu thường là nhóm quinolon, nhóm phenicol chỉ tập trung vào cloramphenicol; florfenicol, thiamphenicol rất ít được quan tâm trong các nghiên cứu về nước thải

- Kỹ thuật sắc ký thường dùng là LC-MS/MS

- Phương pháp xử lý mẫu thường dùng là phương pháp chiết pha rắn SPE

- Giới hạn phát hiện (LOD) trong khoảng 0,02-0,92 ppb, giới hạn định lượng (LOQ) từ 0,2-2,77 ppb

Như vậy, các nghiên cứu trên đã chỉ ra nhiều phương pháp phân tích kháng sinh trong nước Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu nào xác định đồng thời dư lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải, nước nuôi trroong thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS

Phương pháp nghiên cứu thành công sẽ rút ngắn thời gian và chi phí xử lý mẫu, đồng thời mở rộng nền mẫu có thể áp dụng phương pháp

1.4 Tổng quan về phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu nước thải

1.4.1 Phương pháp lấy mẫu nước thải

1.4.1.1 Địa điểm lấy mẫu

Trước tiên phải nghiên cứu kỹ hệ thống cống trên bản vẽ Sau đó kiểm tra thực địa, chọn các địa điểm lấy mẫu đại diện [6]

Cần quan tâm đến cả lưu lượng dòng chảy tại vị trí then chốt, lấy ở nơi có xoáy cuộn, vì chất lỏng được trộn đều [6]

1.4.1.2 Thời gian lấy mẫu và phân tích mẫu

Dựa trên các mẫu lấy ở những khoảng thời gian đều đặn trong một chu kỳ Nếu bản chất và độ lớn của tải lượng cực đại là quan trọng, cần lấy mẫu ở thời điểm tải lượng cực đại xuất hiện [7]

1.4.1.3 Thể tích lấy mẫu

Khi lấy mẫu tổ hợp, thể tích mỗi mẫu đơn phải lớn hơn 50 mL Nên lấy mẫu đơn từ 200 mL đến 300 mL để có được các mẫu đại diện [6]

1.4.1.4 Phương pháp lấy mẫu

Thông thường cần phân biệt hai loại mẫu: mẫu đơn và mẫu tổ hợp Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp lấy mẫu đơn [6]

Mẫu đơn: Trong một mẫu đơn, toàn bộ thể tích mẫu được lấy ở một thời điểm Các mẫu đơn thường được dùng để xác định thành phần nước thải ở một thời điểm nhất định Trong những trường hợp dòng nước thải ít thay đổi về thể tích và thành phần, một mẫu đơn có thể đại diện cho thành phần dòng nước thải trong thời gian dài

Cách lấy mẫu: Việc lấy mẫu được thực hiện bằng cách sử dụng chai thủy tinh màu vàng 1 lít đã được làm sạch trong phòng thí nghiệm và rửa bằng nước mẫu tại chỗ Chai được gói bằng giấy nhôm, đặt trong thùng đá và được vận chuyển tới phòng thí nghiệm Tất cả các mẫu được chuyển ngay đến giai đoạn chiết và làm sạch [24]

Bảo quản, vận chuyển và lưu giữ mẫu:

Bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2- 8oC nếu phân tích ngay trong 24 giờ hoặc bảo quản ở tủ lạnh sâu –30oC trong vòng 1 tháng

1.4.2.2 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký

Các mẫu sinh học, mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên không tương thích cho việc phân tích

trực tiếp trên hệ sắc ký Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách, làm giàu các thành phần của mẫu cần phân tích Có rất nhiều phương pháp xử lý mẫu như : lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng- lỏng, sắc ký cột, chiết Soxhlet, chiết pha rắn (Solid Phase Extraction– SPE) nhưng tất cả các phương pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí:

- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc

- Cô đặc mẫu

- Lượng mẫu không cần nhiều

- Lượng dung môi tiêu thụ ít

- Độ thu hồi cao, không gây nhiễu

- Đơn giản, nhanh

Dựa trên các mối liên hệ giữa đặc tính chất phân tích, nồng độ, nền mẫu mà chúng tôi chọn phương pháp SPE để xử lý mẫu

Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn: [13]

Bước 1 Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được với chất hấp phụ Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho vào cột SPE để tránh làm tắc cột

Bước 2 Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo môi trường thích hợp cho việc hấp thu chất phân tích Thể tích dung môi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp phụ Nếu thể tích dung môi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng nguy cơ pha rắn không được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp Bước 3 Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung môi có điều kiện tương đương dung môi chứa mẫu

Bước 4 Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE Tốc độ dòng chảy của mẫu qua cột khoảng 0,5 – 1 mL/phút

Bước 5 Rửa pha rắn: dùng dung môi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích

Bước 6 Rửa giải: sử dụng dung môi thích hợp để tách chất cần phân tích ra khỏi cột, tốc độ dòng chảy khi rửa giải không được quá nhanh Tốc độ này phụ thuộc vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ khoảng 1mL/phút

1.4.2.3 Một số quy trình chiết pha rắn đã được sử dụng để tách chiết kháng sinh trong nước thải trong các nghiên cứu

Chiết pha rắn trao đổi ion [24]

Sự chiết kháng sinh được thực hiện bằng cách sử dụng hai cột chứa pha tĩnh SPE, trong một hệ thống chiết xuất do phòng thí nghiệm thực hiện

Cột pha tĩnh trao đổi anion chứa 500 mg Strata SAX (Phenomenex, Torrance, CA) dùng để loại bỏ các chất humic Cột polyme 500mg Oasis HLB (Waters, Milford, CT) dùng để giữ các hợp chất đích

Các cột được thiết lập theo chuỗi và được hoạt hóa với 6 mL methanol, 6mL nước cất và dung dịch HCl 6 mL ở pH 2,4 Các mẫu được nạp ở tốc độ dòng chảy 5 mL/min

Sau khi nạp, gỡ bỏ cột SAX, và cột HLB được rửa sạch bằng 6mL nước khử ion Cột này được làm khô bằng dòng Nitơ liên tục trong 20 phút

Bước tẩy rửa được thực hiện bằng cách sử dụng một ống thủy tinh Prep Sepet

12 cổng (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) với ống thủy tinh đã làm sạch trước đó Kháng sinh đã được rửa bằng 6 mL methanol

Cô cạn bằng khí trơ N2, và các chất đích đạt thể tích cuối cùng là 1.0 mL trong dung dịch axit formic 0.1% trong tỉ lệ nước : methanol (90:10) (v / v).được nạp ở tốc độ dòng chảy 5 mL/phút

Hình 1.7 Tóm tắt quy trình chiết pha rắn (SPE)

Chuẩn bị mẫu dung dịch (chiết hoặc ly tâm)

dịch Na2EDTA

2.5 ~ 3.0, 4.5 ~ 5.0, 7.0 ~ 7.5, và 9.5 ~10,0

Rửa cột:pha rắn được rửa sạch với ít nhất 10 mL nước và làm khô bằng dòng

nitơ trong khoảng 30 phút

Rửa giải : kháng sinh được rửa giải bằng 6 mL một trong 3 loại dung môi

(methanol hoặc dung dịch amoniac / methanol (5/95, v / v) hoặc 0.2% formic acid trong methanol), để xác định loại tỷ lệ tối ưu hóa quyết

định cho từng nhóm);

Các chất chiết methanol được làm khô đến cắnbằng luồng nitơ nhẹ ở30oC, hòa tan lại tạo hỗn hợp trong 1mL methanol-nước (1: 1, v: v) và cuối cùng là thêm vào chuẩn nội

Cột chứa pha tĩnh Oasis HLB Waters (6 mL, 500 mg)

1.5 Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ là phương pháp phân tích được sử dụng rộng rãi hiện nay để nghiên cứu các chất với khả năng xác định hàm lượng vết chất phân tích và ứng dụng trong quá trình nhận biết, phân tích cấu trúc phân tử của các chất hữu cơ [13]

1.5.1 Sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn được nhồi trên cột và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được đưa lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân

tử và tính chất lí hóa của các chất khác nhau nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau [13], [21]

đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, bộ phận tích khối và detector Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lý và lưu trữ [13], [20]

1.5.2.1 Nguồn ion hóa

Nguồn ion hóa trong LC-MS thường được cấu tạo để thực hiện nhiệm vụ hóa hơi, loại dung môi và ion hóa mẫu Chất phân tích sau khi ra khỏi cột tách sẽ được dẫn tới nguồn ion để chuyển thành dạng hơi và được ion hóa nguyên tử Một số kỹ thuật ion hóa được sử dụng trong sắc ký lỏng khối phổ như: ion hóa phun điện tử

(electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển pressure chemical ionization – APCI), Ion hóa bằng cách giải hấp hợp chất ra khỏi chất mang bằng tia laser (MALDI)

(atmospheric-Ion hóa phun điện tử (ESI): Dòng chảy từ LC ra đi qua một ống mao quản có

đường kính khoảng 0,1 mm và với một điện trường cao (Từ 3-4 kV) sẽ tạo thành các hạt mang điện Dòng khí nitơ thổi vào mẫu làm bay hơi nhanh dung môi biến các hạt đã rất nhỏ trở thành cực nhỏ trước khi mẫu được đưa vào buồng ion hóa Các giọt phun ra có kích thước rất nhỏ chứa ion phân tử là (M+H)+ nếu ở chế độ ion dương hay (M-H)- nếu ở chế độ ion âm (Có 2 chế độ là bắn phá với ion dương và bắn phá với ion âm) Ngoài ra, quá trình ion hóa có thể tạo ra một số ion khác do sự

có mặt của các chất trong môi trường như (M+Na)+, (M+CH3OH)+ hay các ion đa điện tích như (M+2H)2+, (M+3H)3+, (M+4H)4+

1.5.2.2 Bộ phân tích khối

Sau khi đã được ion hoá, các ion được đưa đến bộ phân tích khối nhằm lựa chọn các ion cần thiết Đặc trưng cho các ion là thông số m/z (tỷ số khối lượng trên điện tích) Thông thường, giá trị của z là 1 nên m/z cũng chính là khối lượng của ion Các kỹ thuật phân tích khối được sử dụng phổ biến là bộ phân tích tứ cực, ba tứ cực, bộ phân tích bẫy ion, bộ phân tích thời gian bay

Tứ cực: Tứ cực được cấu tạo bởi 4 thanh điện cực song song tạo thành một

khoảng trống để các ion bay qua Một trường điện từ được tạo ra bằng sự kết hợp giữa dòng một chiều (DC) và điện thế tần số radio (RF) Các tứ cực được đóng vai trò như một bộ lọc khối Khi một trường điện từ được áp vào, các ion chuyển động trong nó sẽ dao động phụ thuộc vào tỉ số giữa m/z và trường RF Chỉ những ion có

tỉ số m/z phù hợp mới có thể đi qua được bộ lọc này

Ba tứ cực: Gồm ba tứ cực ghép nối với nhau Trong đó, tứ cực thứ nhất (Q1)

có nhiệm vụ tách các ion, lựa chọn ion phân tử với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến tứ cực thứ 2 (Q2, còn gọi là buồng va chạm) Ở Q2, các ion phân tử chạm với khí trơ có mặt (N2, Ar, He) cùng với năng lượng thích hợp phân ly tạo ra tạo ra các ion sản phẩm Sau đó, tất cả các ion sản phẩm được chuyển

đến tứ cực thứ 3 (Q3) Q3 có cấu tạo giống Q1, tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới bộ phận phát hiện Bộ phân tích khối ba tứ cực có thể thực hiện MS/MS [19],[20].

Hình 1.8 Cấu tạo bộ phận khối phổ 3 lần tứ cực

1.5.2.3 Bộ phận khuếch đại và phát hiện

Thường có hai loại nhân electron và nhân quang, với chức năng chuyển các ion đã đến thành tín hiệu điện và khuếch đại để đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

Nhân electron (electronmultiplier): Tác động của một ion lên bề mặt của dinot

sẽ tạo ra electron Nó được tăng tốc, va chạm tiếp với bề mặt của các dinot khác để tạo ra các electron khác Các electron được thu nhận và chuyển thành tín hiệu điện

Nhân quang (photomultiplier): cũng giống như thiết bị nhân electron, các ion

ban đầu đập vào một dinot tạo ra dòng các electron, các electron sau đó sẽ va đập vào một màn chắn phốt pho và giải phóng ra các photon Các photon này được phát hiện bởi một bộ nhân quang hoạt động như thiết bị nhân electron

Ưu điểm của phương pháp này là các ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được các khả năng nhiễm bẩn [13],[19]

Đầu dò

Nguồn API

Ion (+/-) và trung tính được xác định ở nguồn API

Đường dẫn ion đến Q1

Q1 bắt mảnh mẹ dựa vào thế mao quản

Q2 phân tách mảnh mẹ dựa vào khí Ảr và N 2

Q3 bắt mảnh con

và đưa đến đầu dò

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn: cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol; ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin

- Mẫu dung dịch hỗn hợp chuẩn thêm nội chuẩn norfloxacin (IS-1) cho nhóm quinolone và nội chuẩn cloramphenicol-d5 (IS-2) cho nhóm phenicol

- Mẫu trắng giả lập: mẫu nước thải không chứa các kháng sinh cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol; ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin

- Mẫu thử giả lập: mẫu hỗn hợp chuẩn thêm vào mẫu trắng giả lập

- Mẫu thử :15 mẫu nước thải nuôi trồng thủy sản ở các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh

+ Thời gian lấy mẫu nước thải: 05/2018-06/2018

+ Địa điểm lấy mẫu nước thải: Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh

2.2 Địa điểm, thời gian nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu: Phòng nghiên cứu liên bộ môn Hóa phân tích- Kiểm nghiệm - Độc chất, khoa Dược, trường Đại Học Y Dược Cần Thơ

2.3.2 Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn

Các chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn dự kiến được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn được dùng trong nghiên cứu

(nội chuẩn CLOR-d5) 329756147 – 100 mg 99, 45% Sigma-Aldrich Ofloxacin (OFL) QT079 090617-120 mg 99,2% VKN TP Hồ Chí

Minh Ciprofloxacin (CIP) QT012 111116- 120 mg 94,3% VKN TP Hồ Chí

Minh Enrofloxacin (ERF) 93106-60-6 – 100 mg 99,1% Sigma-Aldrich Norfloxacin (nội chuẩn

NOR) QT068 050316-120 mg 99,54%

VKN TP Hồ Chí Minh

2.3.3 Thiết bị, dụng cụ

Bảng 2.2 Thông tin về các chất chuẩn đối chiếu sử dụng trong nghiên cứu

Tủ sấy Memmert Đức Máy khuấy từ IKA C-MAG HS10 Đức Vial loại 1,8mL Isolab Đức Máy lọc hút chân không

Màng lọc 0,45μmvà 0,2μm Cellulose acetat, Sartorius Đức Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 ( 4,6 x 150 mm, 3,5 µm) Mỹ

Hình 2.1 Hệ thống UPLC-MS/MS Xevo-TQD của Waters

2.4 Phương pháp nghiên cứu:

2.4.1 Chuẩn bị mẫu

- Mẫu dung dịch chuẩn gốc của các chất phân tích CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF và nội chuẩn NOR (IS-1) và CLOR-d5 (IS-2) có nồng độ 1000 µg/mL được pha trong MeOH: nước acid formic 0,1% (50:50)

- Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành các dung dịch chuẩn làm việc của chất phân tích có nồng độ từ 10 ng/mL đến 200 ng/mL

- Từ dung dịch nội chuẩn gốc pha loãng thành các dung dịch nội chuẩn làm việc của nội chuẩn NOR và CLOR-d5 tương ứng có nồng độ 10 ng/mL đến

200 ng/mL

- Mẫu thử giả lập: mẫu hỗn hợp chuẩn của chất phân tích và nội chuẩn được thêm vào mẫu trắng giả lập với nồng độ (ng/mL) thích hợp để xây dựng và thẩm định phương pháp

2.4.2 Xây dựng quy trình định lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải bằng phương pháp LC- MS/MS

2.4.2.1 Khảo sát sự lựa chọn nội chuẩn

Dựa trên tính chất hóa lý của CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF và tham khảo tài liệu, CLOR-d5 được khảo sát làm nội chuẩn cho nhóm phenicol; NOR và lomefloxacin được lựa chọn để khảo sát nội chuẩn cho nhóm quinolon Nhằm giảm sai số và đạt độ lặp lại cao trong phương pháp định lượng Các kháng sinh phân tích

và các chất dự kiến làm nội chuẩn được pha thành dung dịch có nồng độ khoảng

500 ng/mL và bơm trực tiếp vào hệ thống khối phổ để xác định ion mẹ và ion phân mảnh với tốc độ 20μL/phút, chế độ phun điện tử ion dương (ES+) hay âm (ES-) tối

ưu hóa cùng điều kiện khối phổ cùng các kháng sinh phân tích

2.4.2.2 Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu

Sử dụng chế độ Auto-tune để khảo sát các thông số khối phổ nhằm thu được tín hiệu tốt nhất của CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF và IS-1, IS-2 Chất phân tích và nội chuẩn được hòa tan trong hỗn hợp dung môi MeOH: nước acid formic 0,1% (50:50, tt/tt) ở nồng độ khoảng 500 ng/mL và được bơm trực tiếp vào máy khối phổ để tối ưu hóa điều kiện khối phổ bao gồm:

- Xác định ion mẹ cho CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF và IS-1, IS-2;

- Xác định phân mảnh ion con của của chất phân tích và nội chuẩn có cường

độ tín hiệu cao và ổn định

Các thông số khối phổ dự kiến khảo sát:

- Kiểu ion hóa ESI: dương (ES+) hay âm (ES-)

- Thế mao quản (capillary voltage): 2-4 kV

- Thế cone (cone voltage): 10-80 V

- Thời gian chờ ghi nhận tín hiệu (dwell time): 0,025-0,2 giây

- Năng lượng buồng va chạm (collision cell energy): 10-80eV

- Tốc độ dòng khí phun (nebulizer gas flow)

- Nhiệt độ khí bay hơi (desolvation temp): 250-500 0C

- Tốc độ dòng khí bay hơi (desolvation gas flow): 800-1000 L/giờ

2.4.2.3 Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp

Do tính chất lý hóa của CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF và nội chuẩn là những chất có độ phân cực trung bình đến phân cực nên phương pháp sắc ký lỏng pha đảo được áp dụng cùng với hệ dung môi phân cực bao gồm ACN, MeOH, nước

có hoặc không có chất điều chỉnh pH như: acid acetic băng, acid formic (0,1%), triethylamin (<0,1%)

Điều kiện sắc ký dự kiến khảo sát:

- Pha tĩnh: cột Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 ( 4,6 x 150 mm, 3,5 µm), cột Synergi Hydro-RP 80A (4,6mmx250mmx4µm), cột UPLC Kinetex phenyl-

(4,6mmx250mmx4µm), cột Synergi 4u MAX-RP 80A (4,6 mmx250mmx4µm)

- Pha động: thay đổi loại dung môi, tỉ lệ dung môi, pH thay đổi

- Chương trình chạy mẫu gradient

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl

- Tốc độ dòng: 0,4-1mL/phút

- Nhiệt độ cột: 20-40o C

- Nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 25oC

2.4.2.4 Khảo sát phương pháp xử lý mẫu

Yêu cầu: qui trình chiết loại được tối đa tạp chất nhưng ít làm ảnh hưởng đến nồng độ chất cần phân tích cũng như quá trình chiết này phải đảm bảo tính đồng nhất và nguyên vẹn của các chất phân tích có trong mẫu Thêm vào đó, phương pháp chiết phải đơn giản, dễ thực hiện, tiết kiệm chi phí, thời gian

Tiến hành chiết CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF và nội chuẩn trong mẫu thử giả lập với các phương pháp khác nhau Định lượng đồng thời 06 kháng sinh cần phân tích để so sánh các kết quả

Qua tham khảo nhiều tài liệu nghiên cứu, các qui trình xử lý mẫu sau đây dự kiến được tiến hành:

Hình 2.2 Quy trình xử lý mẫu 1

Đong 25 mL nước mẫu thử cho vào Becher Thêm vào 2 mL hỗn hợp 6 chuẩn, 2 IS (100 ppb)

Lọc qua giấy lọc thường 2 lần và màng lọc 0,45µm

Thêm vào 10 mL n-hexan, khuấy từ trong 5 phút, lắc chiết phân bố

Thêm vào 10 mL etyl acetat, khuấy từ trong 5 phút, lắc chiết phân bố

Thêm vào 10 mL chloroform, khuấy từ trong 5 phút, lắc chiết phân

bốCho dịch vào bình quả lê, cô quay đến cắn với nhiệt độ

vòng/phút vòng/phút

Phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS

vòng/phút vòng/phút

Hình 2.3 Quy trình xử lý mẫu 2

Hình 2.4 Quy trình xử lý mẫu 3

Pha loãng mẫu nước 10 lần bằng dung môi pha mẫu, được (1)

Cho 2 mL hỗn hợp 6 chuẩn và 2 IS vào BĐM 10mL,

bổ sung dung dịch (1) vừa đủ Thêm vào 2mL hỗn hợp 6 chuẩn, 2 IS (100 ppb) Lọc qua giấy lọc thường 2 lần và màng lọc 0,45µm

Hút 2 mL dịch, lọc qua màng lọc 0,22 µm vào vial

vòng/phút vòng/phút

Phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS

vòng/phút vòng/phút

Đong 25mL nước mẫu thử cho vào Becher Thêm vào 2 mL hỗn hợp 6 chuẩn, 2 IS (100 ppb)

Lọc qua giấy lọc thường 2 lần và màng lọc 0,45µm

Thêm vào 10 mL n-hexan, khuấy từ trong 5 phút, lắc chiết phân bố

Cho dịch vào bình quả lê, cô quay đến cắn với nhiệt độ

vòng/phút vòng/phút

Phân tích bằng hệ thống LC-MS/MS

vòng/phút vòng/phút

2.4.2.5 Khảo sát sự ổn định mẫu [27],[30]

Nhằm mục đích xác định độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc trong khi

bảo quản và sử dụng đúng trong khi phân tích mẫu

Chuẩn bị 3 lô mẫu ở nồng độ MQC chứa hỗn hợp chuẩn và IS trong mẫu

pha động và mẫu trắng Phân tích ngay 1 lô theo phương pháp đã xây dựng (nồng độ ban đầu)

Xác định độ ổn định ngắn hạn ở nhiệt độ phòng: để ở nhiệt độ phòng trong

khoảng 6, 12, 24 giờ rồi tiến hành phân tích theo phương pháp trên, phân tích so

sánh kết quả sự giảm hàm lượng các chất phân tích so ban đầu

2.4.2.6 Khảo sát sự ảnh hưởng nhiễu nền lên chất phân tích

Trong phương pháp khối phổ, các nền mẫu phức tạp có ảnh hưởng nhiều đến

kết quả phân tích đặc biệt là khi mẫu không được xử lý tốt Để đánh giá ảnh hưởng

nhiễu nền lên chất phân tích tiến hành phân tích thực nghiệm xây dựng 01 đường

chuẩn được pha trong dung môi pha mẫu và 01 đường được xây dựng trên nền mẫu trắng

Đánh giá độ sai lệch giữa đường chuẩn được pha trong

dung môi và trên nền mẫu, chấp nhận tại mức nhỏ hơn 20% [25]

Hoặc có thể so sánh hệ số góc của hai đường chuẩn xây dựng trên nền dung

môi và trên nền mẫu trắng Đường chuẩn sử dụng gồm 5 điểm chuẩn có nồng độ là

5, 10, 50, 100 và 200 ppb, nồng độ nội chuẩn cố định 20ppb Ảnh hưởng nền được

tính theo công thức:

𝑀𝐸 =𝑎𝑚− 𝑎𝑠

Trong đó: ME (matrix effect): ảnh hưởng nền

am: hệ số góc đường chuẩn trên nền mẫu (matrix)

as: hệ số góc đường chuẩn trên nền dung môi (solvent)

Kết quả đánh giả ảnh hưởng nhiễu nền lên chất phân tích để quyết định

việc xây dựng đường chuẩn trong dung môi hay trên nền mẫu thực

2.4.3 Thẩm định quy trình định lượng đồng thời cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải bằng phương pháp LC-MS/MS

Việc thẩm định quy trình phân tích được thực hiện theo sự hướng dẫn của EC-657/2002, AOAC [23] và Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia [22]

2.4.3.1 Tính tương thích hệ thống

Sau khi đã khảo sát được các điều kiện sắc ký lỏng và khối phổ để phân tích đồng thời 06 kháng sinh cần phân tích, tính tương thích của hệ thống được đánh giá bằng cách tiêm ít nhất 6 lần liên tiếp mẫu hỗn hợp chuẩn và IS pha trong dung môivà mẫu trắng

Đánh giá: Thời gian lưu và diện tích đỉnh của các chất phải có RSD ≤ 15% và

tỉ lệ diện tích chất/ diện tích nội chuẩn phải có RSD <6% [20], [23]

Yêu cầu mẫu trắng phải không được cho tín hiệu chất phân tích, trong khi mẫu trắng thêm chuẩn phải cho tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu trùng với thời gian lưu trên mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn lần 2 có diện tích píc và tín hiệu các chất tăng lên rõ rệt so với mẫu trắng thêm chuẩn Đối với mũi tiêm của chế độ MS fullscan, phải chứng minh được trong nền mẫu phức tạp như rau củ, ta vẫn thu được các mảnh mẹ và mảnh con của 5 chất phân tích

Ngoài ra tính chọn lọc càng được củng cố thêm bằng số điểm xác nhận (IP) và

tỉ lệ các ion được tính theo quy định EC/657/2002 của Châu Âu [26] Số điểm xác nhận là tổng điểm ion phân tử và ion sản phẩm, trong đó đối với kỹ thuật

LC - MS/MS mỗi ion phân tử được tính 1 điểm và mỗi ion sản phẩm được tính 1,5

điểm Số điểm xác nhận tối thiểu phải đạt đối với kháng sinh phân tích là 4 điểm

Như vậy, mỗi chất phân tích cần tối thiểu 1 ion phân tử và 2 ion sản phẩm

Tỷ lệ ion là tỷ lệ phần trăm của ion sản phẩm có tính hiệu thấp hơn chia cho

ion sản phẩm có tính hiệu cao hơn của cùng một kháng sinh Tỷ lệ ion của mỗi

kháng sinhphát hiện trên mẫu thử so với tỷ lệ tương ứng trên mẫu chuẩn cần phải

đáp ứng yêu cầu được cho trong bảng 2.4

Bảng 2.3 Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỉ lệ ion

Tỉ lệ ion (%) Sai lệch cho phép (%)

2.4.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn ít nhất 6

nồng độ khác nhau và xác định sự tương quan giữa diện tích píc thu được trên diện

tích píc nội chuẩn vào nồng độ Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm

mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Các bước xây dựng

đường chuẩn trên nền mẫu:

Pha dãy hỗn hợp 7 mức nồng độ của mỗi chất phân tích từ 1 ppb đến 200ppb

và nồng độ chuẩn nội cố định là 50ppb trên nền mẫu trắng và dung môi pha mẫu Tiến hành sắc ký theo điều kiện tối ưu đã chọn

Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích píc của từng chất phân tích trên

diện tích píc nội chuẩn tương ứng Các đường chuẩn được đánh giá dựa trên ba tiêu

chí:

+ Hệ số tương quan tuyến tính, R2 ≥ 0,99

+ Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn, ∆i không quá ± 15%

(∆i không quá ±20% tại LOQ) Độ chệch được tính theo công thức sau:

∆𝑖 = 𝐶𝑡 − Cc

Trong đó: ∆𝑖 : Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc: Nồng độ các điểm chuẩn

+Đánh giá ảnh hưởng nhiễu nền (matrix effect)

2.4.3.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Trong nghiên cứu này, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) được xác định dựa trên tỉ lệ tín hiệu chất phân tích chia cho đường nhiễu nền (S/N = signal to noise ratio): Pha loãng hỗn hợp chuẩn rồi tiến hành phân tích đến khi tỉ số S/N đạt yêu cầu

Việc xác định tỉ số S/N được thực hiện bằng phần mềm của thiết bị

LOD là nồng độ mà tại đó tỉ số tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N ≥ 3)

LOQ là nồng độ mà tại đó tỉ số tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N ≥ 10)

2.4.3.5 Độ đúng và độ chính xác

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi, tiến hành phân tích hỗn hợp mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao) trong khoảng tuyến tính, mỗi nồng độ được phân tích lặp lại ít nhất 6 lần Tính độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) và độ thu hồi (Recovery) theo các công thức sau:

Si: Tỉ lệ diện tích píc (Schất/Sis) của lần đo thứ “i”

S̅: Tỉ lệ diện tích píc (Schất/Sis) trung bình RSD%: độ lệch chuẩn tương đối

CV%: Hệ số biến thiên