ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Giá trị sử dụng của KIT ELISA định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-
Hãng Testline cung cấp hai sản phẩm trên máy ELISA bán tự động tại Trường Đại học Y tế công cộng Để đánh giá độ chụm, độ đúng, khoảng tuyến tính và khoảng tham chiếu, cần chuẩn bị các yếu tố cần thiết.
+ Mẫu QC kèm theo kit (Bao gồm chứng + và chứng -)
+ Mẫu chuẩn có nồng độ biết trước (kèm theo kit của nhà sản xuất):
+ 20 mẫu máu huyết thanh người có kháng thể chống SARS-CoV-2
Nghiên cứu được thực hiện trên 20 mẫu huyết thanh của người từ 18 đến 25 tuổi, những người đã tiêm đủ 3 mũi vaccine kháng SARS-CoV-2 và có tiền sử mắc SARS-CoV-2, hiện đang sinh sống và làm việc tại Hà Nội.
- Mẫu máu của bệnh nhân khám đủ tiêu chuẩn sẽ được lưu trữ tách huyêt thanh và thực hiện xét nghiệm bằng phương pháp ELISA
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2021 đến 6/2022
- Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm xét nghiệm Trường Đại học Y tế công cộng
Cỡ mẫu
Nhóm nghiên cứu đã chuẩn bị bộ KIT ELISA để định lượng kháng thể chống SARS-CoV-2, thực hiện 5 lần/ngày với 2 mẫu chuẩn trong 5 ngày và 2 lần Cal ở 6 mức theo hướng dẫn CLSI Để đạt được mục tiêu thứ hai, nhóm cũng đã chuẩn bị 20 mẫu huyết thanh người có kháng thể chống SARS-CoV-2 theo thiết kế CLSI.
Trình bày phương pháp chọn mẫu
Phương pháp chọn mẫu theo hướng dẫn CLSI (phần Tổng quan nghiên cứu)
Mẫu chuẩn và mẫu Cal kèm theo KIT xét nghiệm ELISA định lượng kháng thể chống SARS-CoV-2
Tiêu chuẩn lựa chọn 20 mẫu huyết thanh bao gồm người từ 18 đến 25 tuổi, đã tiêm đủ 3 mũi vaccine kháng SARS-CoV-2 và có tiền sử mắc SARS-CoV-2, đang sinh sống và làm việc tại Hà Nội Các đối tượng nghiên cứu sẽ điền vào phiếu thông tin và phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu trước khi tiến hành lấy mẫu Mẫu máu của những bệnh nhân đủ tiêu chuẩn sẽ được lưu trữ, tách huyết thanh và thực hiện xét nghiệm bằng phương pháp ELISA.
Trình bày phương pháp thu thập số liệu
Số liệu lấy từ kết quả đo nồng độ của 2 mẫu chuẩn đo trong 5 ngày mỗi ngày 2 lần,
Sáu mức nồng độ Cal sẽ được đo hai lần, cùng với nồng độ của 20 mẫu huyết thanh từ các đối tượng tham gia nghiên cứu Dữ liệu sẽ được lưu trữ bằng phần mềm Excel và tính toán theo hướng dẫn của CLSI trên Excel cũng như phần mềm SPSS 20.
Các biến số nghiên cứu
STT Biến số Định nghĩa Phương pháp thu thập
Nồng độ kháng thể chống
SARS-CoV-2 trong các mẫu huyết thanh (Biến liên tục)
Nồng độ kháng thể IgG trong mẫu huyết thanh đo (Đơn vị:
Kết quả giá trị mẫu QC định lượng 5 ngày mỗi ngày 5 lần
Kết quả mẫu QC định lượng (Đơn vị: U/mL)
Kết quả các giá trị mẫu Cal đã biết nồng độ để đánh giá độ tuyến tính (Biến liên tục)
Kết quả các giá trị mẫu Cal đã biết nồng độ để đánh giá độ tuyến tính (Đơn vị: U/mL)
Phương pháp phân tích số liệu
- Số liệu được thu thập tính toán bằng phần mềm Microplate Manager® 6 đối với 6 mức Cal để thiết lập khoảng tuyến tính
- Độ chụm, độ đúng được tính toán bằng Excel theo hướng dẫn của CLSI
- Khoảng tham chiếu sau khi so sánh với giá trị nhà sản xuất đưa ra được phân tích bằng phần mềm SPSS 20
Đánh giá độ chụm và độ đúng của phương pháp ELISA trong việc định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2 được thực hiện dựa trên hai thiết kế theo hướng dẫn EP15-A3 của CLSI.
Phương pháp ELISA được đánh giá về khoảng tuyến tính trong việc định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2, dựa trên hướng dẫn EP17-A của CLSI.
Xác nhận khoảng tham chiếu cho phương pháp ELISA nhằm định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2 được thực hiện theo hướng dẫn EP28A-3C của CLSI.
Quyết định hội đồng đạo đức
Nghiên cứu được thông qua Hội đồng Đạo đức Trường Đại học Y tế công cộng Quyết định số 022-2211DD-YTCC (Phụ lục 6 kèm theo)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Đánh giá độ chụm
Bảng 1 Số liệu thực nghiệm đánh giá độ chụm ở mức nồng độ 1 và mức nồng độ 2
Nội dung Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Trung bình
Bảng 2 trình bày kết quả thực nghiệm đánh giá độ chụm của phương pháp xét nghiệm ELISA trong việc định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2 trên máy miễn dịch bán tự động.
Sau khi thực hiện thí nghiệm với hai mẫu chuẩn có nồng độ 20 U/ml (mức 1) và 80 U/ml (mức 2), kết quả xét nghiệm được thu thập trong 5 ngày với tần suất 2 lần mỗi ngày Kết quả cho thấy giá trị xét nghiệm của mẫu chuẩn mức 1 dao động từ 15,95 U/ml đến 24,01 U/ml, trong khi mẫu chuẩn mức 2 có giá trị từ 85,33 U/ml đến 110,56 U/ml.
Khi phân tích số liệu theo hướng dẫn CLSI về độ chụm của phương pháp bằng phần mềm Excel, kết quả CV% tại mức nồng độ 1 và 2 lần lượt là 21.41 và 19.37, cao hơn nhiều so với giá trị xác nhận ở mức nồng độ 1 và 2 là 7.31.
Đánh giá độ đúng
Bảng 3 Kết quả thực nghiệm đánh giá độ đúng của xét nghiệm ELISA định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2 trên máy miễn dịch bán tự động
Trung bình thực nghiệm_𝑥̅ 20,64 94,17 Độ lệch chuẩn thực nghiệm_SD 4,08 16,91
Sai số của trung bình_𝑆𝐸 𝑥̅ 0,82 3,38
SD vật liệu tham chiếu_𝑆𝐷 ấ𝑛 đị𝑛ℎ 4,00 16,00 Độ không đảm bảo đo U 4,083 16,35
Giá trị ấn định của vật liệu 20 80
Khi phân tích số liệu theo hướng dẫn CLSI về độ đúng của phương pháp bằng phần mềm Excel, kết quả cho thấy giá trị ấn định của mẫu QC là 20 ở mức 1 và 80 ở mức 2 Cả hai giá trị ấn định của vật liệu tham chiếu đều nằm trong khoảng giới hạn xác nhận (9,22 – 32,06 và 49,418 – 138,922), xác nhận độ đúng của phương pháp trong phòng xét nghiệm phù hợp với công bố của nhà sản xuất Tuy nhiên, giá trị ấn định ở mức 2 với nồng độ 80 U/ml không nằm trong khoảng tin cậy (84,71 – 103,62).
Đánh giá khoảng tuyến tính (Linearity range)
Bảng 4 Bảng đánh giá độ tuyến tính phương pháp xét nghiệm ELISA định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2 trên máy miễn dịch bán tự động
Số thứ tự mẫu Cal Giá trị mẫu Cal
(U/ml) Độ hấp thụ sau khi trừ nền (đo ở bước sóng 450nm)
Hệ số tương quan r 2 = 0,956 nằm trong khoảng 0,95 đến 1.Vì vậy có sự tương quan tuyến tính giữa giá trị đo được và giá trị thực của mẫu
Biểu đồ thể hiện sự tuyến tính trong xét nghiệm ELISA định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2 Đường biểu diễn này có phương trình là \$y = \frac{(A-D)}{1+\left(\frac{x}{C}\right)^B}+D\$.
Khoảng tuyến tính được kiểm tra từ 5 U/ml đến 1000 U/ml
Biểu đồ 1 minh họa sự tuyến tính trong việc xét nghiệm phương pháp ELISA, cho thấy nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2 được đo trên máy miễn dịch bán tự động.
Xác nhận khoảng tham chiếu (Verifying Reference Intervals)
Bảng 5 Kết quả đánh giá khoảng tham chiếu của xét nghiệm ELISA định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2 trên máy miễn dịch bán tự động
STT Giới tính Kết quả (U/ml) Khoảng tham chiếu của nhà sản xuất
Tham chiếu hang công bố >22U/ml
Bảng 6 Kiểm định Shapiro-Wilk cho 20/20 người có giá trị nồng độ kháng thể nằm trong khoảng tham chiếu của hãng đã công bố (>22U/ml)
Kiểm định Kolmogorov-Smirnov Kiểm định Shapiro-Wilk
Statistic df Sig Statistic df Sig
Biểu đồ 2: Biểu diễn 20/20 mẫu tạo nên khoảng giá trị tham chiếu
Kết quả từ 20 mẫu cho thấy chúng tạo thành một phân phối chuẩn Với cỡ mẫu 20 (dưới 50 mẫu), kiểm định Shapiro-Wilk cho giá trị sig=0.075 (>0.05), chứng minh rằng phân phối giá trị kháng thể chống SARS-CoV-2 ở 20 người tình nguyện (độ tuổi từ 18-25) là chuẩn Do đó, khoảng tham chiếu nghiên cứu phù hợp với khoảng tham chiếu của nhà sản xuất cho đối tượng có kháng thể.
HUPH thể kháng SARS-CoV-2 trong máu đạt mức >22 U/ml, với khoảng tham chiếu nghiên cứu từ 117,64 đến 11243,15 U/ml sau khi loại bỏ hai giá trị ngoại lai (12826 U/ml và 12243 U/ml) Giá trị trung bình của 20 mẫu được ghi nhận là 5360,5 U/ml.
BÀN LUẬN
Khoa học công nghệ phát triển kéo theo sự cải tiến liên tục trong các phương pháp xét nghiệm, nâng cao hiệu suất và chất lượng kết quả Phòng xét nghiệm phải thường xuyên thích ứng với những thay đổi về phương pháp và trang thiết bị Việc xác nhận phương pháp là cần thiết trước khi đưa máy xét nghiệm vào sử dụng, đặc biệt sau khi có chỉnh sửa từ nhà sản xuất hoặc khi di chuyển thiết bị, nhằm đảm bảo các thông số kỹ thuật phù hợp với điều kiện thực tế Mục tiêu chính của phòng xét nghiệm là cung cấp dịch vụ xét nghiệm phục vụ chẩn trị bệnh, do đó, việc đảm bảo kết quả xét nghiệm chính xác là nhiệm vụ vô cùng quan trọng.
Nghiên cứu này áp dụng hướng dẫn EP15-A3 của CLSI để đánh giá độ chụm và độ đúng của phương pháp, cung cấp quy trình xác nhận các công bố của nhà sản xuất So với các hướng dẫn khác như EP05, EP09 và EP15-A2, EP15-A3 yêu cầu ít thực nghiệm hơn, chỉ cần một thử nghiệm duy nhất trong 5 ngày, giúp tiết kiệm thời gian và thân thiện với người dùng Mặc dù việc tính toán thống kê theo EP15-A3 có thể phức tạp hơn, nhưng quy trình thực hiện lại đơn giản hơn và vẫn đảm bảo độ tin cậy Kết quả cho thấy độ chụm của phương pháp xét nghiệm ELISA định lượng nồng độ kháng thể chống SARS-CoV-2 không phù hợp với giá trị công bố của nhà sản xuất, có thể do quy trình thực hiện xét nghiệm còn nhiều điểm cần cải thiện.
Kỹ thuật thực hiện xét nghiệm HUPH chưa đạt yêu cầu do thao tác pipet và rửa không ổn định, cùng với việc hệ thống đọc kết quả iMark microplate absorbance reader không được bảo trì thường xuyên, dẫn đến sai số trong kết quả Thực tế cho thấy, thời gian ủ giếng phản ứng ảnh hưởng đến nồng độ kết quả, với giếng ủ lâu hơn cho kết quả cao hơn Để đảm bảo độ chính xác, người thực hiện cần nắm vững quy trình và luyện tập kỹ lưỡng trước khi làm trên mẫu bệnh nhân Phòng xét nghiệm nên sử dụng pipet đa kênh để đồng nhất thời gian ủ giữa các giếng Hệ thống đọc không ổn định cũng ảnh hưởng đến độ chụm của phản ứng, do đó cần bảo trì thường xuyên và hạn chế thời gian bật máy So với nghiên cứu của Tạ Thành Văn về xét nghiệm Anti-SARS-CoV-2 trên máy tự động Roche Cobas E801, cho thấy xét nghiệm này có độ chụm và độ đặc hiệu phù hợp với công bố của nhà sản xuất, trong khi kỹ thuật ELISA phụ thuộc nhiều vào tay nghề người thực hiện, dẫn đến kết quả không đạt yêu cầu.
Kết quả cho thấy giá trị ấn định của mẫu QC là 20 ở mức 1 và 80 ở mức 2, cả hai đều nằm trong khoảng giới hạn xác nhận (9,22 – 32,06 và 49,418 – 138,922) Thực nghiệm xác nhận độ đúng của phương pháp trong phòng xét nghiệm phù hợp với công bố của nhà sản xuất Tuy nhiên, giá trị ấn định ở mức 2 với nồng độ 80 U/ml không nằm trong khoảng tin cậy (84,71 – 103,62).
Trong quá trình thực nghiệm, nhóm nghiên cứu đã áp dụng đường chuẩn được thiết lập bằng phần mềm tích hợp theo máy, thay vì sử dụng đường chuẩn từ các phần mềm khác có hiệu quả đo thấp hơn Để đạt được hiệu quả cao nhất trong việc xây dựng đường chuẩn, cần thực hiện các bước xét nghiệm theo đúng thiết kế của nhà sản xuất.
Việc chạy mẫu trắng là rất quan trọng trong việc xây dựng đường chuẩn chính xác hơn trong kỹ thuật ELISA, theo hướng dẫn của nhà sản xuất Điều này giúp loại bỏ các sai số của hệ thống, từ đó nâng cao độ chính xác của kết quả đo Nếu không chạy mẫu trắng, các giá trị Cal sẽ có độ hấp thụ cao hơn do chưa trừ giá trị nền, dẫn đến sai số trong kết quả đo Hơn nữa, việc này cũng giúp kiểm soát nhiễm chéo trong quá trình thực hiện kỹ thuật.
Có 20/20 mẫu có kết quả nằm tạo thành phân phối chuẩn (Bảng 5) Với cỡ mẫu là
Nghiên cứu với 20 mẫu (dưới 50 mẫu) sử dụng kiểm định phân phối chuẩn Shapiro-Wilk cho giá trị sig=0.075 (>0.05), cho thấy phân phối kháng thể chống SARS-CoV-2 của 20 người tình nguyện (tuổi từ 18-25) là chuẩn (Biểu đồ 1) Mẫu được thu thập ngẫu nhiên và chỉ có giá trị tham khảo cho phương pháp xét nghiệm Nhóm nghiên cứu đã thu thập mẫu từ 20 người đã tiêm đủ 3 mũi vaccine và mắc SARS-CoV-2, với việc thu mẫu tình nguyện Lượng kháng thể trung bình của quần thể này là 5360,5 U/ml, và 100% đối tượng có kháng thể SARS-CoV-2 trong máu Nghiên cứu của Catharina Gerhardsa và cộng sự cho thấy hiệu giá kháng thể ổn định, chỉ ra khả năng miễn dịch lâu dài sau khi tiêm đủ 3 mũi vaccine và mắc SARS-CoV-2 hai tháng trước Giá trị tham chiếu này xác nhận tính hiệu quả của phương pháp xét nghiệm, nhưng chưa đủ để nghiên cứu nồng độ kháng thể trong cộng đồng do cần mẫu lớn hơn và nghiên cứu thêm về các yếu tố ảnh hưởng.
KHUYẾN NGHỊ
Trong quá trình xác nhận giá trị sử dụng của các phương pháp xét nghiệm định lượng bằng máy bán tự động, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng việc đào tạo kỹ thuật viên về quy trình và thao tác thực hiện là rất quan trọng Cần tuân thủ đúng hướng dẫn của nhà sản xuất để đánh giá chính xác giá trị sử dụng của KIT xét nghiệm, không được thay đổi quy trình đã được cung cấp Các thông số như độ chụm, độ đúng, khoảng tuyến tính và khoảng tham chiếu có thể thay đổi tùy thuộc vào số lượng mẫu, thiết kế và phương pháp xét nghiệm Do đó, khi xác nhận giá trị sử dụng, cần linh hoạt áp dụng hướng dẫn CLSI để phù hợp với điều kiện thực tế của phòng xét nghiệm.
