Xác nhận giá trị sử dụng quy trình lamp phát hiện gen độc tố type a, b của vi khuẩn clostridium botulinum

Thiết kế thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C.. Độ nhạy,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

NGUYỄN ĐỨC TRƯỞNG

XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG QUY TRÌNH LAMP PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN

Clostridium botulinum TYPE A, B

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

MÃ SỐ CHUYÊN NGÀNH: 8720601

HÀ NỘI, 2022 HUPH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG

NGUYỄN ĐỨC TRƯỞNG

XÁC NHẬN GIÁ TRỊ SỬ DỤNG QUY TRÌNH LAMP PHÁT HIỆN GEN ĐỘC TỐ CỦA VI KHUẨN

Clostridium botulinum TYPE A, B

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thành đề tài này, tôi đã được TS Đặng Thị Thùy Dương và

TS Dương Hồng Quân nhiệt tình hướng dẫn, chỉnh sửa và giúp đỡ trong suốt thời gian qua Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến hai quý thầy cô hướng dẫn của mình

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Lê Huy Hoàng và ThS Tăng Thị Nga, Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và TS Phạm Bảo Yên cùng toàn thể thành viên nhóm

nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu sản xuất quy trình LAMP phát hiện nhanh gen độc

tố của Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt” mã số 02/2021/ĐX đã cho

phép tôi tham gia đề tài, sử dụng một phần số liệu và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, quý Thầy Cô Trung tâm Xét nghiệm, quý Thầy Cô Trường Đại học Y tế công cộng luôn tận tình hướng dẫn giúp

đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn ban Giám đốc, tập thể khoa Vi sinh bệnh viện Đa khoa tỉnh Hải Dương đã giúp đỡ, hỗ trợ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi để tôi hoàn thành khóa học Tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình, vợ và con tôi luôn đồng hành cùng tôi trong thời gian vừa qua

Ngoài ra tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến các Thầy Cô trong hội đồng đánh giá kết quả nghiên cứu đề tài của tôi Các Thầy Cô đã có rất nhiều đóng góp quý báu, chỉ dẫn giúp tôi hoàn thiện đề tài của mình tốt hơn

Đề tài là bước khởi đầu trong sự nghiệp học tập nghiên cứu khoa học của mình, vì vậy nh ng lời cảm ơn này chưa đủ để nói hết nh ng tình cảm thật đáng quý của tất cả mọi người đã bên tôi và giúp đỡ tôi Tôi s mang theo nh ng tình cảm này trong suốt hành trang cuộc đời mình

HUPH

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Vi khuẩn Clostridium botulinum 4

1.1.1 Đặc điểm hình thể và tính chất sinh vật hóa học Clostridium botulinum 4

1.1.2 Tính chất nuôi cấy 4

1.1.3 Phân nhóm độc tố 5

1.1.4 Thực phẩm thường gây ngộ độc C botulinum 7

1.2 Dịch tễ học của C botulinum trên thế giới và tại Việt Nam 7

1.2.1 Trên thế giới 7

1.2.2 Tại Việt Nam 8

1.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 9

1.3.1 Định nghĩa xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 9

1.3.2 Mục đích xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp 9

1.3.3 Phân biệt xác nhận phương pháp (Verification) và xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp (Validation) 10

1.3.4 Các thông số xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định tính sử dụng trong nghiên cứu 11

1.3.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 12

1.3.4.2 Độ nhạy (Se) 12

1.3.4.3 Độ đặc hiệu (Sp) 12

1.3.4.4 Tỷ lệ dương tính giả 13

1.3.4.5 Tỷ lệ âm tính giả 13

1.3.4.6 Độ đúng 13

1.3.4.7 Hệ số Kappa 14

1.4 Các phương pháp xác định độc tố C botulinum 15

1.4.1 Thử nghiệm gây chết chuột 15

1.4.2 Phương pháp miễn dịch học 15

HUPH

1.4.3 Quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type

A, B……… 16

1.4.4 Phương pháp sinh học phân tử 17

1.5 Kỹ thuật LAMP 18

1.5.1 Lịch sử phát triển của kỹ thuật LAMP 18

1.5.2 Nguyên lý chung của kỹ thuật LAMP 18

1.5.3 Thành phần cơ bản của phản ứng LAMP 19

1.5.4 Cơ chế phản ứng LAMP 20

1.5.5 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật LAMP 21

1.5.5.1 Ưu điểm của kỹ thuật LAMP 21

1.5.5.2 Nhược điểm của kỹ thuật LAMP 22

1.5.6 Ứng dụng của LAMP chẩn đoán tác nhân gây bệnh 27

1.5.7 Nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng quy trình LAMP trong phát hiện C botulinum 27

1.5.8 Nghiên cứu trong và ngoài nước đánh giá quy trình LAMP trong phát hiện C botulinum 28

1.5.9 Nghiên cứu sản xuất bộ kít LAMP phát hiện nhanh gen độc tố của Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc thịt 29

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 31

2.2 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.1 Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả: 31

2.1.1 Nghiên cứu so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 31

2.3 Thiết kế và nội dung nghiên cứu 32

2.3.1 Thiết kế thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 32

2.3.1.1 Thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện trên nền mẫu: 32

HUPH

2.3.1.2 Thí nghiệm xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ

dương tính giả 34

2.3.2 Thiết kế thí nghiệm so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 34

2.3.3 Sơ đồ nghiên cứu 36

2.4 Cỡ mẫu 37

2.5 Phương pháp chọn mẫu 37

2.6 Phương pháp thu thập số liệu 37

2.7 Các biến số nghiên cứu 38

2.8 Các quy trình sử dụng trong nghiên cứu 39

2.8.1 Quy trình tạo mẫu gây nhiễm thực nghiệm C botulinum 39

2.8.2 Quy trình LAMP với cặp mồi thiết kế đặc hiệu phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 39

2.8.2.1 Thành phần phản ứng LAMP 40

2.8.2.2 Các bước tiến hành 42

2.9 Phương pháp phân tích số liệu: 45

2.10 Vấn đề đạo đức của nghiên cứu 46

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 48

3.1 Xác định giá trị sử dụng của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 48

3.1.1 Mẫu thực phẩm (MMO) 48

3.1.2 Mẫu thực phẩm (MPC) 52

3.1.3 Mẫu lâm sàng (MP) 57

3.2 So sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 62

3.2.1 So sánh kết quả xét nghiệm C botulinum type A, B trên quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố 62

3.2.2 Kết quả so sánh khả năng áp dụng của quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố 66

Chương 4 BÀN LUẬN 69

HUPH

4.1.Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn

C botulinum type A, B 69

4.1.1 Giới hạn phát hiện (LOD) trên nền mẫu của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 70

4.1.2 Độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B trên nền mẫu………70

4.1.3 So sánh quy trình LAMP với quy trình PCR phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 71

4.2 So sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 73

4.2.1 So sánh kết quả quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 73

4.2.2 So sánh khả năng áp dụng của quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 75

KẾT LUẬN 78

KHUYẾN NGHỊ 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO 81

PHỤ LỤC 89

HUPH

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Acid Deoxy Ribonucleic

BoNT : Botulinum neurotoxin

CDC : Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ CFU : Colony Forming Units

CLSI : Clinical and Laboratory Standards Institute

ELISA : Enzyme – Linked Immunosorbent Assay

Kappa : Hệ số Kappa

LAMP : Loop – Mediated Isothermal Amplification

LOD : Giới hạn phát hiện

NIHE : Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

PCR : Polymerase Chain Reaction

Real – time PCR : Real – time Polymerase Chain Reaction

SARS–CoV–2 : Severe acute respiratory syndrome corona virus 2

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Hình ảnh vi khuẩn C botulinum dưới kính hiển vi điện tử 4

Hình 1.2 Hình ảnh khuẩn lạc C botulinum trong nuôi cấy trên thạch EYA 5

Hình 1.3 Hình ảnh cấu trúc phân tử độc tố C botulinum type A, B 6

Hình 1.4 Hình ảnh ghi nhận toàn cầu về ngộ độc thịt ở trẻ sơ sinh theo quốc gia từ năm 1976–2006 8

Hình 1.5 Hình ảnh các vị trí thiết kế các mồi LAMP 19

Hình 1.6 Hình ảnh tạo vật liệu khởi đầu 20

Hình 1.7 Hình ảnh tái bản và kéo dài chuỗi ADN 21

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu……….36

Hình 2.2 Hình ảnh tách chiết ADN từ mẫu thu thập 42

Hình 3 1 Xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MMO)………48

Hình 3.2 Xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type B trên mẫu thực phẩm (MMO) 49

Hình 3.3 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MPC) 53

Hình 3.4 Kết quả xác định giới hạn phát hiện giai đoạn một bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type B trên mẫu thực phẩm (MPC). 54

Hình 3.5 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trên mẫu lâm sàng (MP) 58

Hình 3.6 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type B trên mẫu lâm sàng (MP) 59

Hình 3.7 Hình ảnh kết quả sáu mẫu MP dương tính trên quy trình LAMP xác định gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A 63

Hình 3 8 Hình ảnh kết quả sáu mẫu MMO mẫu dương tính trên quy trình LAMP xác định gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A 63

Hình 3.9 Hình ảnh kết quả sáu mẫu MP dương tính trên quy trình LAMP xác định gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type B 65

HUPH

Hình 3.10 Hình ảnh kết quả sáu mẫu MMO dương tính trên quy trình LAMP xác

định gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type B 65

HUPH

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Công thức tính hệ số Kappa 14 Bảng 1.2 Đánh giá mức độ đồng thuận gi a 2 phương pháp dựa trên chỉ số Kappa 14 Bảng 1.3 Tóm tắt so sánh ưu nhược điểm của LAMP với quy trình thử nghiệm gây chết chuột, nuôi cấy, PCR, real – time PCR và ELISA 23 Bảng 2.1 Các biến số nghiên cứu……….38 Bảng 2.2 Trình tự mồi đặc hiệu của phản ứng LAMP phát hiện gen độc tố type A,

B của C botulinum 40

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng LAMP phát hiện gen độc tố type A, B của 42 Bảng 2.4 Các bước thực hiện quy trình LAMP 43 Bảng 2.5 Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả lý thuyết của quy trình LAMP 45 Bảng 2.6 Công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả và hệ số kappa (K) theo công thức 46 Bảng 3.1 Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát

hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm

(MMO)……… 50 Bảng 3.2 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen

độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm (MMO) 51

Bảng 3.3 Kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ

dương tính giả bằng LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A,

B trên mẫu thực phẩm (MMO) 52 Bảng 3.4 Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát

hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MPC) 55

Bảng 3.5 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng LAMP phát hiện gen độc tố của

vi khuẩn C botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm (MPC) 56

Bảng 3.6 Kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ

dương tính giả bằng LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A,

B trên mẫu thực phẩm (MPC) 57

HUPH

Bảng 3.7 Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát

hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MP) 60

Bảng 3.8 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng LAMP phát hiện gen độc tố của

vi khuẩn C botulinum type A, B trên mẫu lâm sàng (MP) 61

Bảng 3.9 Kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ

dương tính giả bằng LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A,

B trên mẫu lâm sàng (MP) 62 Bảng 3.10 Kết quả so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát

hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type A 64

Bảng 3.11 Kết quả so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát

hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type B 66

Bảng 3.12 Kết quả so sánh khả năng áp dụng quy trình LAMP với quy trình nuôi

cấy phân lập phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 67

HUPH

TÓM TẮT NGHIÊN CỨU

Độc tố thần kinh botulinum gây bệnh ngộ độc thịt được coi là một trong

nh ng chất độc mạnh, được tạo ra chủ yếu bởi vi khuẩn Clostridium botulinum (C

botulinum) Năm 2021, nhóm nghiên cứu do TS Lê Huy Hoàng tại Viện Vệ sinh

Dịch tễ Trung ương (NIHE) đã thiết lập quy trình khuếch đại đẳng nhiệt mạch vòng – Loop mediated isothermal amplification (LAMP) phát hiện nhanh gen độc tố của

vi khuẩn C botulinum gây bệnh ngộ độc thịt Trên cơ sở đó chúng tôi thiết kế một

nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme và protein, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với hai mục tiêu chính: 1) Xác định giới hạn phát hiện – Limit of Detection (LOD), độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện

gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B 2) So sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phát hiện độc tố type A, B của vi khuẩn C botulinum Nghiên

cứu được tiến hành từ tháng 10/2021 đến tháng 07/2022 Sử dụng plasmid tái tổ hợp

mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B và bộ mẫu tự nhiên thêm chuẩn (các mẫu tự nhiên được xác định âm tính với C botulinum type A, B 3 lần

bằng kỹ thuật nuôi cấy phân lập và PCR phát hiện độc tố tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương (NIHE)) để tiến hành thí nghiệm thực hiện mục tiêu 1 Sử dụng các mẫu thực phẩm (mật ong (MMO), mẫu pate chay (MPC)) và mẫu lâm sàng (mẫu phân (MP)) lưu tại NIHE và kết quả nuôi cấy phân lập xác định độc tố của vi khuẩn

C botulinum để mục tiêu 2

Kết quả nghiên cứu cho thấy giới hạn phát hiện của quy trình LAMP phát

hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm ( MMO,

MPC) và mẫu lâm sàng (MP) đều là 1.0x102 copies/gam Độ nhạy, độ đặc hiệu, độ

đúng của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A,

B trên mẫu thực phẩm (MMO, MPC) và mẫu lâm sàng (MP) là 100%, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả là 0%

Kết quả so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phát hiện gen độc tố

của vi khuẩn C botulinum type A, B như sau: Độ nhạy, độ đặc hiệu và độ đúng lần lượt là 91.6, 100, và 98.8%, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả lần lượt là 8.33 và

HUPH

0%, hệ số kappa là 0.986 cho thấy mức độ đồng thuận gần như hoàn toàn gi a 2 quy trình Quy trình LAMP cho thấy nhiều ưu điểm hơn so với quy trình nuôi cấy

phát hiện gen độc tố của vi khuẩn của vi khuẩn C botulinum type A, B, có khả năng

trở thành thường quy và thay thế quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố

của vi khuẩn C botulinum type A, B

HUPH

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngộ độc thực phẩm là một vấn đề nhức nhối không chỉ ở Việt Nam mà là

vấn đề chung của toàn cầu Độc tố botulinum được sản sinh bởi vi khuẩn

Clostridium botulinum (C botulinum) có thể xuất hiện trong thực phẩm, và gây nên

bệnh ngộ độc thịt sau khi ăn phải Các trường hợp ngộ độc C botulinum ở người

chủ yếu do hai loại độc tố type A, B Tại Mỹ mỗi năm có 70 – 100 trường hợp ngộ độc thịt được báo cáo, Nhật Bản và rất nhiều quốc gia khác trên thế giới đã có thống

kê về ngộ độc C botulinum (1) Theo báo cáo của trung tâm kiểm soát và phòng

ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) cho thấy khoảng 15% trong số 145 trường hợp ngộ độc thịt được báo cáo trong năm 2011 là do thực phẩm (2)

Tại việt Nam đầu năm 2020 trên phạm vi nhiều tỉnh thành của cả nước đã xuất hiện nhiều ca nghi ngờ ngộ độc thịt đến khám và điều trị (3) Thực tế lâm sàng

cho thấy bệnh ngộ độc thịt do độc tố thần kinh của C botulinum mang tính cấp tính

nặng, tiến triển nguy kịch rất nhanh, tỉ lệ tử vong và gây biến chứng rất cao vì vậy việc chẩn đoán nhanh, chính xác là điều kiện tiên quyết cứu sống người bệnh, giúp người bệnh phục hồi, giảm biến chứng Hiện nay, có bốn loại xét nghiệm chính để

chẩn đoán C botulinum bao gồm xét nghiệm miễn dịch phát hiện độc tố, thử nghiệm gây chết chuột, nuôi cấy phân lập phát hiện độc tố C botulinum và phương

pháp khuếch đại gen sinh độc tố (4) Xét nghiệm miễn dịch có ưu điểm nhanh, đơn giản nhưng độ nhạy, độ đặc hiệu thấp; thử nghiệm gây chết chuột có độ nhạy, đặc hiệu cao nhưng mất công sức, thao tác phức tạp, giá thành đắt và liên quan đến vấn

đề y đức do sử dụng động vật sống làm thí nghiệm; nuôi cấy phân lập phát hiện độc

tố C botulinum cần thời gian dài Do vậy các phương pháp này đều chưa đáp ứng được tính cấp thiết trong chẩn đoán ca bệnh ngộ độc do C botulinum Trong

phương pháp khuếch đại gen sinh độc tố, quy trình LAMP là một kỹ thuật khuếch đại axit nucleic diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt (trong khoảng 60–65˚C) Khi được tối ưu, phản ứng LAMP có thể đạt ngưỡng bão hòa với nồng độ khuôn từ vài bản sao với thời gian dưới 30 phút, cho phép phát hiện nhanh hơn và giới hạn phát hiện thấp hơn 100 lần so với PCR (5)

HUPH

Năm 2021, Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương (NIHE) đã thiết lập quy trình

LAMP (thiết kế mồi, điều kiện phản ứng…) phát hiện nhanh gen độc tố của C

botulinum gây bệnh ngộ độc thịt Đây cũng là công trình nghiên cứu đầu tiên ứng

dụng quy trình LAMP trong chẩn đoán bệnh ngộ thịt ở nước ta Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu chưa đánh giá các thông số xác nhận giá trị sử dụng phương pháp như giới hạn phát hiện, độ nhạy, đặc hiệu trên các mẫu lâm sàng để đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu, quá trình tách chiết đến hiệu quả của quy trình LAMP Do vậy, học

viên tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu “Xác nhận giá trị sử dụng của quy trình

LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum type A, B”

HUPH

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1 Xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C

botulinum type A, B

2 So sánh thông số kỹ thuật (độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính

giả, tỷ lệ âm tính giả, hệ số kappa) quy trình LAMP và quy trình nuôi cấy phát hiện

gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B

HUPH

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vi khuẩn Clostridium botulinum

1.1.1 Đặc điểm hình thể và tính chất sinh vật hóa học Clostridium botulinum

Clostridium botulinum (C botulinum) là trực khuẩn kỵ khí, có khả năng di

động và sinh nha bào Nha bào hình oval, ở gần đầu tế bào, chỗ có nha bào bị phình

ra Trên tiêu bản nhuộm gram, vi khuẩn bắt màu gram dương, có hình dạng thẳng hoặc hơi cong, kích thước chiều rộng 0.5 – 2 µm, chiều dài 1.6 – 22 µm, có nha bào

uốn ván, độc tố C botulinum mạnh gấp 7 lần Liều gây nhiễm tối thiểu là 104 – 105CFU/g thực phẩm (4)

Khuẩn lạc C botulinum tròn, bờ không đều và đường kính khoảng 3mm,

nhưng đường kính có thể tăng đến 8mm sau thời gian ủ dài hơn Khuẩn lạc có thể

HUPH

vồng lên hoặc dẹt, thô ráp hoặc trơn bóng và thường có xu hướng lan Tuy nhiên,

hình thái khuẩn lạc của các chủng thuần khiết thuộc giống Clostridium có thể rất

khác nhau nên nuôi cấy thường bị nhầm lẫn Khi cấy chuyển các khuẩn lạc thuần thì

khuẩn lạc thường giống nhau gi a các nhóm khác nhau Chủng vi khuẩn C

botulinum sản sinh enzyme lipolytic (enzyme tiêu mỡ), tạo ra a xít béo tự do từ lòng

đỏ trứng (trong thạch EYA) kết tủa phía dưới khuẩn lạc và tạo màng óng ánh (lớp ngọc trai – Hình 1.2) bao phủ khuẩn lạc Một số chủng của nhóm III còn có khả

năng sinh lecithinase (vùng kết tủa) Nhìn chung, khuẩn lạc của tất cả các nhóm C

botulinum thường được bao quanh bởi vòng tan máu hoàn toàn Nuôi cấy kỵ khí đặc

trưng bởi mùi hôi thối do sinh a xít béo bay hơi, sản phẩm cuối cùng của amin và

H2S (4)

Hình 1.2 Hình ảnh khuẩn lạc C botulinum trong nuôi cấy trên thạch EYA (7)

1.1.3 Phân nhóm độc tố

Dựa vào đặc điểm huyết thanh, độc tố thần kinh của C botulinum được chia

thành các type độc tố kí hiệu từ A đến H và một số subtype Tuy nhiên sự phân loại

này đã lỗi thời mà dựa vào kiểu gen và kiểu hình người ta chia C botulinum làm 4 nhóm khác nhau đánh số từ I – IV C botulinum nhóm I là nhóm ly giải protein và

nhóm II là nhóm không ly giải protein (4) Thông thường nhóm I, II gây bệnh trên người, nhóm III gây bệnh trên động vật, nhưng có xuất hiện ngoại lệ Nhóm IV

thường không gây bệnh, hiện nay được đổi tên thành C argentinense Trong số

HUPH

chủng gây bệnh trên người, chủng nhóm I sản sinh độc tố type A, B hoặc F và chủng nhóm II sinh độc tố type B, E hoặc F (4)

Về cấu trúc phân tử độc tố C botulinum là protein lớn có trọng lượng phân

tử type A và B lần lượt là 900 kDa và 150 kDa với hoạt tính của enzym zinc- endopeptidase (Hình 1.3) Phân tử độc tố thần kinh được tiết ra nguyên bản có chứa

cả cấu phần độc tố cũng như cấu phần không độc tố Cấu phần không độc tố bảo vệ cấu phần độc tố khỏi áp lực môi trường và hỗ trợ cấu phần độc tố thẩm thấu vào cơ thể Phân tử độc tố thần kinh chứa 2 tiểu đơn vị gồm 1 chuỗi nặng và 1 chuỗi nhẹ (8, 9)

Hình 1.3 Hình ảnh cấu trúc phân tử độc tố C botulinum type A, B (10)

Độc tố type A và B là hai type gây bệnh chủ yếu (11-13) Hiện nay có bốn phương pháp chính phát hiện và phân loại độc tố thần kinh bao gồm thử nghiệm gây chết chuột, phương pháp miễn dịch học, phương pháp sinh học phân tử (PCR, realtime PCR) và quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện độc tố Thử nghiệm chết chuột được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán xác định độc tố botulinum type

A, B Tuy nhiên phương pháp này tốn kém, phức tạp và có liên quan đến vấn đề đạo đức do sử dụng động vật thí nghiệm nên chỉ được sử dụng hạn chế tại một vài phòng thí nghiệm trên thế giới Phương pháp miễn dịch có độ nhạy và độ đặc hiệu

HUPH

không cao Phương pháp nuôi cấy phân lập phức tạp và gặp khó khăn trong việc

định danh được vi khuẩn C botulinum ngay cả trên nh ng hệ thống định danh tự động do C botulinum là vi khuẩn dùng làm vũ khí sinh học nên WHO, CDC Hoa kì

quản lý chặt ch thư viện máy Để định danh vi khuẩn và xác định type độc tố phương pháp PCR thường được áp dụng dựa trên nh ng cặp mồi đặc hiệu nhận biết

sự có mặt của các ADN đặc hiệu quy định độc tố type A và B Chính vì vậy các quy trình sinh học phân tử (PCR, realtime PCR) đang là phổ biến hiện nay để chẩn đoán

và phân loại độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B) (14)

1.1.4 Thực phẩm thường gây ngộ độc C botulinum

Vi khuẩn C botulinum có mặt phổ biến trên thực phẩm đóng hộp, đặc biệt là

thức ăn có độ acid thấp (pH> 4.5), đây là nguồn thực phẩm có nguy cơ cao nhiễm độc tố botulinum; 10% số ca ngộ độc do độc tố botulinum trong thực phẩm liên quan đến các sản phẩm thực phẩm chế biến thương mại Độc tố botulinum được

sinh ra do vi khuẩn C botulinum trong môi trường kỵ khí Các sản phẩm từ rau, củ,

quả, thịt, hải sản lên men, đóng hộp không đảm bảo điều kiện an toàn thực phẩm có

nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn C botulinum và sinh độc tố botulinum.Trong các vụ

dịch bùng phát gây ra bởi hải sản, type E gây ra khoảng 50%; các type A và B gây

ra phần còn lại (15)

Một số ca lâm sàng khi ăn thực phẩm nướng còn thừa để ở nhiệt độ phòng hoặc để trong lò nướng qua đêm Hầu hết bệnh ngộ độc thịt liên quan tới đồ hộp làm tại nhà, thực phẩm có độ a xít thấp, sản phẩm thịt như xúc xích, pa tê và giăm bông, cá muối hoặc cá lên men Ngoài ra, các sản phẩm như s a chua lên men truyền thống thời gian dài, phô mai mềm, dầu tỏi và khoai tây bọc giấy bạc nướng cũng có thể gây bệnh ngộ độc thịt (16) Trong khi hàm lượng độc tố trong mô của động vật vừa chết vẫn còn chưa rõ, một vài ca lâm sàng đã báo cáo do ăn các mô sống từ xác cá voi (17)

1.2 Dịch tễ học của C botulinum trên thế giới và tại Việt Nam

1.2.1 Trên thế giới

Theo một báo cáo mới nhất của CDC trong năm 2017 tại hoa kỳ, 182 trường hợp ngộ độc thịt được các phòng thí nghiệm xác định đã được báo cáo cho CDC

HUPH

Trong đó 141 (77%) trường hợp là trẻ sơ sinh, 19 (10%) trường hợp do thực phẩm,

19 (10%) trường hợp đến từ vết thương và 3 (1%) trường hợp khác Cũng theo công

bố này của CDC trong các trường hợp ngộ độc thịt được báo cáo có 87 trường hợp

do độc tố của C botulinum type A và 89 trường hợp do C botulinum type B (18)

Theo một nghiên cứu có quy mô lớn của Ruth Koepke và CS trong giai đoạn

từ năm 1976 – 2006 tại tất cả các tiểu Bang của Hoa Kỳ và các quốc gia châu Á bao

gồm Nhật Bản, Trung Quốc cũng đã xác định nh ng ca ngộ độc do C botulinum

(19) (Hình 1.4)

Hình 1.4 Hình ảnh ghi nhận toàn cầu về ngộ độc thịt ở trẻ sơ sinh theo quốc

gia từ năm 1976–2006 (20)

1.2.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam tính đến thời điểm trước năm 2020, chưa có báo cáo ca bệnh ngộ độc thịt trên người nào được báo cáo.Vài năm trước chỉ có một số ít nghiên cứu

về bệnh ngộ độc thịt ở vịt và việc phân lập C botulinum do một số tác giả tại Cần

thơ (21-23) Tuy nhiên cho đến đầu tháng 8 năm 2020 trên phạm vi nhiều tỉnh thành trong cả nước đã có xuất hiện nhiều ca nghi ngờ bệnh ngộ độc thịt đến khám và điều trị tại các bệnh viện (bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện bệnh Nhiệt đới thành phố

Hồ Chí Minh, bệnh viện Chợ Rẫy, bệnh viện Đa khoa Vĩnh Đức ở Quảng Nam) Điển hình là chùm ca bệnh là 2 vợ chồng ăn pate Minh Chay, xuất hiện triệu chứng tăng tiết đờm dãi, khó nuốt, khó thở, tê yếu 2 tay, sụp mí mắt 2 bên, nhìn mờ và

HUPH

phải thở máy Tuy nhiên gần 2 tuần sau MPC và MP bệnh nhân mới được gửi tới phòng thí nghiệm vi khuẩn kỵ khí viện NIHE xét nghiệm và kết luận mẫu pate

dương tính với C botulinum độc tố B và MP âm tính với C botulinum(3) Gần đây

nhất, tháng 3 năm 2021 theo báo cáo của sở y tế Kon Tum cho biết đã có 25 người

nhập viện vì nhiễm độc tố của C botulinum, 3 trường hợp trong số đó đã tử vong (24) Việt Nam hiện cũng chưa sẵn có thuốc điều trị đặc hiệu (kháng độc tố C

botulinum), bệnh nhân phải chờ nhập thuốc nước ngoài, nên bệnh tình càng trầm

trọng Tổng hợp tài liệu trên y văn cũng cho thấy, kháng độc tố có hiệu quả tốt nếu dùng ở giai đoạn bệnh sớm, khi độc tố chưa bám vào đầu mút thần kinh

1.3 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

1.3.1 Định nghĩa xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra và cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra Kết quả của xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích Trong các tiêu chuẩn phiên bản mới nhất TCVN/ISO 15189:2015 (25); TCVN/ISO 17025:

2017 (26) đều dùng thuật ng xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (Validation) thay cho thẩm định phương pháp như trước đây

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp có hai dạng Một là xác xác nhận phương pháp (Verification) áp dụng với các phương pháp theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như TCVN, ISO,

ASTM, AOAC…Hai là xác nhận giá trị sử dụng phương pháp (Validation): Áp

dụng với các phương pháp không tiêu chuẩn, phương pháp nội bộ do phòng xét nghiệm xây dựng, phương pháp chuẩn được sử dụng ngoài phạm vi áp dụng, hoặc phương pháp tiêu chuẩn nhưng có sửa đổi (25, 26)

1.3.2 Mục đích xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp

Mục đích chung của xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là đánh giá sai số, trong đó bao gồm việc xác định tiêu chuẩn kỹ thuật (analytical goal) phù hợp mục đích sử dụng trước khi đưa phương pháp vào áp dụng Chuyển các số liệu sang

HUPH

sai số ước tính bằng thống kê So sánh sai số ước tính với các tiêu chuẩn sai số cho phép về y khoa (27, 28)

Theo yêu cầu của ISO 17025 (26), ISO 15189 (25), phương pháp phân tích phải được xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp khi (29): 1) Nhà sản xuất muốn đưa một phương pháp xét nghiệm mới, hoặc phương pháp cũ được cải tiến ra thị trường thì xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là yêu cầu bắt buộc; 2) Phương pháp áp dụng không phải là phương pháp tiêu chuẩn (nonstandard method); 3) Phương pháp do phòng xét nghiệm tự xây dựng mới trước khi đưa vào sử dụng thành thường quy; 4) Có sự thay đổi về đối tượng áp dụng nằm ngoài đối tượng áp dụng của phương pháp đã thẩm định hoặc phương pháp tiêu chuẩn; và 5) Có sự thay đổi các điều kiện thực hiện phương pháp đã được thẩm định (ví dụ: thiết bị phân tích với các đặc tính khác biệt, nền mẫu, )

1.3.3 Xác nhận phương pháp (Verification) và xác nhận giá trị sử dụng của

và kết quả này phải phù hợp với yêu cầu của phòng thử nghiệm; 2) Phòng thử nghiệm cần đảm bảo có thể đạt được các thông số được mô tả trong phương pháp tiêu chuẩn sau khi xác nhận lại giá trị sử dụng (25-28)

Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp (Validation) thực hiện với các phương pháp không tiêu chuẩn, phương pháp nội bộ do phòng xét nghiệm xây dựng, phương pháp chuẩn được sử dụng ngoài phạm vi áp dụng, hoặc phương pháp tiêu chuẩn nhưng có sửa đổi Quá trình này phải trải qua nhiều bước hơn, bắt đầu từ quá trình nghiên cứu khảo sát phương pháp, tối ưu hóa phương pháp đến khi hoàn

HUPH

thiện phương pháp Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp là một yêu cầu bắt buộc phải thực hiện đi kèm với việc phát triển phương pháp mới và áp dụng các phương pháp không tiêu chuẩn vào thực hiện thành thường quy (25-28)

1.3.4 Các thông số xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp định tính sử

dụng trong nghiên cứu

Phòng thử nghiệm thường sử dụng nhiều phương pháp khác nhau Dựa vào nguồn gốc có thể phân loại các phương pháp thành hai nhóm: 1) Các phương pháp tiêu chuẩn : Các phương pháp thử theo tiêu chuẩn quốc gia, quốc tế, hiệp hội khoa học được chấp nhận rộng rãi trên thế giới như TCVN, ISO, ASTM, AOAC…; 2) Các phương pháp không tiêu chuẩn hay phương pháp nội bộ: Là các phương pháp

do phòng thử nghiệm tự xây dựng, phương pháp theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị, phương pháp theo các tạp chí, tài liệu chuyên ngành (27, 28)

Việc lựa chọn các thông số thẩm định tùy thuộc vào kỹ thuật áp dụng trong phương pháp, yêu cầu của phương pháp, điều kiện và nguồn lực của phòng thử nghiệm Từng trường hợp cụ thể các thông số thẩm định có thể có sự khác nhau

Đối với phương pháp định tính hoặc bán định lượng ví như phương pháp LAMP Theo Trần Cao Sơn, các thông số cần lựa chọn để thẩm định gồm: giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ lệch dương (tỷ lệ dương tính giả), độ lệch âm (tỷ

lệ âm tính giả) (27)

Tiêu chuẩn cải tiến phòng thí nghiệm lâm sàng – CLIA (Vol 23, No 3) User

Validation of Laboratory-Developed Molecular Assays for Infectious Diseases (CLIA) (30) là tổ chức phi lợi nhuận, thiết lập và duy trì các tiêu chuẩn, thúc đẩy kiểm tra chất lượng, tăng cường cung cấp dịch vụ chăm sóc bệnh nhân và cải thiện sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới và được Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận CLIA tham gia xây dựng các tiêu chuẩn quốc tế với tư cách là ban thư ký của ủy ban kỹ thuật ISO So sánh gi a bộ tiêu chuẩn TCVN ISO 15189:2014 (25) và tiêu chuẩn ISO 17025:2017 (26) thì các hướng dẫn của CLIA (30) có số thực nghiệm và thời gian phân tích ít hơn Vì vậy, trong đề tài này chúng tôi sử dụng các hướng dẫn của CLIA để xác định giá trị sử dụng phương pháp để tiết kiệm hơn về chi phí và thời gian

HUPH

1.3.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện – Limit of Detection (LOD) của một phương pháp là nồng độ vi sinh vật thấp nhất trong mẫu có thể xác định được bằng phương pháp đó Đối với phương pháp định tính giới hạn phát hiện được tính ở nồng độ có thấp nhất

có 95% mẫu cho kết quả dương tính (27, 28)

Theo quy định của tiêu chuẩn AOAC, giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chọn ở các cấp độ khác nhau Thấp nhất là 1 – 5 tế bào/25gam mẫu, cao nhất là 10 – 50 tế bào/25gam mẫu thực phẩm (giới hạn này được khảo sát ở các cấp độ là: 0,1 – 10, 10 – 100 tế bào/25gam mẫu thực phẩm) (31)

Theo hướng dẫn của CLIA (Vol 23, No 3) (30) để xác định giới hạn phát

hiện của phương pháp định tính phòng thí nghiệm cần tiến hành phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ xác định giới hạn phát hiện dự kiến, và lặp lại thí

nghiệm 12 lần trên tất cả các nồng độ khảo sát Nồng độ thấp nhất mà tại đó luôn có

cho kết quả dương tính với phương pháp chính là giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện với độ tin cậy 95% (LOD95) được tính toán trên phần mềm MEDCALC (30)

1.3.4.2 Độ nhạy (Se)

Độ nhạy – Sensitivity (Se) của một xét nghiệm là tỷ lệ nh ng trường hợp

thực sự có bệnh và có kết quả xét nghiệm dương tính trong toàn bộ các trường hợp

có bệnh Nói cách khác trong xét nghiệm vi sinh vật độ nhạy là tỷ lệ của các vi sinh vật đích có thể được phát hiện (27, 28)

Dựa theo hướng dẫn viện tiêu chuẩn lâm sàng và phòng xét nghiệm (CLIA (Vol 23, No 3) (30) để thực hiện tính độ nhạy cần bố trí thí nghiệm đảm bảo đủ 40 điểm d liệu ở nồng độ lớn hơn 20% của LOD Độ nhạy được tính bằng công thức:

Se (%) = Mẫu dương tính thật + mẫu âm tính giảMẫu dương tính thật x100

1.3.4.3 Độ đặc hiệu (Sp)

Độ đặc hiệu – Specificity (Sp) của một xét nghiệm là tỷ lệ nh ng trường hợp thực sự không có bệnh và có kết quả xét nghiệm âm tính trong toàn bộ các trường hợp không bị bệnh Độ đặc hiệu 100% có nghĩa là toàn bộ minh người khỏe mạnh (không mắc bệnh) có kết quả xét nghiệm là âm tính (27, 28)

HUPH

Dựa theo hướng dẫn của CLIA (Vol 23, No 3) (30) để thực hiện tính độ đặc

hiệu cần bố trí thí nghiệm đảm bảo đủ 40 điểm d liệu ở nồng độ lớn hơn 20% của LOD Độ đặc hiệu được tính bằng công thức:

Sp (%) = Mẫu âm tính thật + mẫu dương tính giảMẫu âm tính thật x100

1.3.4.4 Tỷ lệ dương tính giả

Tỷ lệ mẫu cho kết quả dương tính giả trong tổng số mẫu cho kết quả dương tính hoặc dương tính giả (Mẫu chứng có kết quả âm tính, kết quả phân tích cho kết quả dương tính) (27, 28)

Việc bố trí thí nghiệm tính toán tỷ lệ dương tính giả dựa trên kết quả thí nghiệm cho việc tính độ nhạy, độ đặc hiệu (30, 32) Tỷ lệ dương tính giả được tính bằng công thức:

Tỷ lệ dương tính giả (%) = Số mẫu dương tính giả

Tổng số mẫu dương tính x100

1.3.4.5 Tỷ lệ âm tính giả

Tỷ lệ mẫu cho kết quả âm tính giả trong tổng số mẫu cho kết quả âm tính hay nói cách khác âm tính giả là tỷ lệ nh ng mẫu chứng có kết quả dương tính, kết quả phân tích lại cho kết quả âm tính (27, 28)

Việc bố trí thí nghiệm tính toán tỷ lệ dương tính giả dựa trên kết quả thí nghiệm cho việc tính độ nhạy, độ đặc hiệu (30, 32) Tỷ lệ dương tính giả được tính bằng công thức:

Tỷ lệ âm tính giả (%) = Số mẫu âm tính giả

HUPH

Độ đúng (%) = Mẫu âm tính thật + Mẫu dương tính thật N x100

(N = Mẫu âm tính giả + Mẫu dương tính giả + Mẫu âm tính thật + Mẫu

Dương tính Dương tính thật (a) Dương tính giả (a)

Âm tính Âm tính giả (c) Âm tính thật (c)

Hệ số Kappa (K) ( ) [( )( ) ( )( )]

[( )( ) ( )( )Đánh giá kết quả: Đánh giá mức độ đồng thuận gi a 2 phương pháp dựa trên giá trị Kappa như sau (Bảng 1.2) (33):

Bảng 1.2 Đánh giá mức độ đồng thuận giữa 2 phương pháp dựa trên chỉ số

1.4 Các phương pháp xác định độc tố C botulinum

1.4.1 Thử nghiệm gây chết chuột

Thường quy chuẩn (tiêu chuẩn vàng) để phát hiện độc tố ngộ độc thịt là thử nghiệm gây chết chuột Thử nghiệm bằng cách tiêm mẫu pha loãng trong đệm phốt phát vào phúc mạc động vật thí nghiệm Nếu mẫu chứa độc tố, chuột s xuất hiện dấu hiệu lâm sàng của bệnh ngộ độc thịt như dựng lông, yếu cơ và suy hô hấp

mà đặc trưng là bụng co hóp lại Nh ng triệu chứng này thường xuất hiện sau một ngày tiêm mẫu 48 giờ nhưng cũng có thể xuất hiện sau vài ngày Độ nhạy của phương pháp tỷ lệ nghịch với thời gian kể từ khi bắt đầu xuất hiện các triệu chứng đầu tiên (4)

Trong phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng, thử nghiệm này được dùng cho

MP, huyết thanh, dịch dạ dày, mẫu vết thương và mẫu thức ăn cũng như nước nổi của dịch vi khuẩn Tuy nhiên, đây là thử nghiệm khá mất công, giá thành đắt và liên quan đến vấn đề y đức do sử dụng động vật thí nghiệm sống Chỉ có một số ít phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng thử nghiệm này Đối với nh ng mẫu lâm sàng nghi ngờ ngộ độc thịt cần điều trị ngay thì thử nghiệm chuột cũng cho kết quả chẩn đoán chậm (4)

1.4.2 Phương pháp mi n dịch học

Có nhiều ưu điểm so với thử nghiệm trên chuột như kĩ thuật đơn giản, dễ thực hiện và phiên giải kết quả nhanh Tuy nhiên nhiều thử nghiệm đã sử dụng như miễn dịch huỳnh quang, thẩm thấu gel, ngưng kết hồng cầu thụ động hoặc ELISA đều có độ nhạy và độ đặc hiệu kém Một hạn chế đối với thử nghiệm miễn dịch là kháng thể có chất lượng tốt thường không có sẵn Thêm vào đó hoạt tính sinh học của độc tố thần kinh ( bất hoạt sau khi xử lí với nhiệt độ) có thể cho kết quả dương tính giả Hơn n a, sự khác nhau về kiểu gen ở nh ng typ huyết thanh khác nhau của độc tố thần kinh có thể dẫn đến làm giảm ái lực đối với kháng thể đơn dòng gây ra kết quả âm tính giả (4)

Kĩ thuật ELISA có thể kiểm tra độc tố ngộ độc thịt tinh khiết hoặc chủng C

botulinum độc tố hoặc từ thức ăn liên quan đến vụ dịch ngộ độc thịt hoặc nh ng sản

phẩm từ người nhiễm độc tố ngộ độc thịt hoặc từ vi khuẩn C botulinum Một

HUPH

nghiên cứu hợp tác gi a 11 phòng thí nghiệm cho thấy kĩ thuật ELISA có độ tái lặp cao khi kiểm tra thức ăn nhiễm độc tố ngộ độc thịt Nh ng thành phần trong thức ăn

có thể làm giảm độ nhạy của kĩ thuật ELISA, tuy nhiên kĩ thuật này vẫn thành công khi phát hiện độc tố ngộ độc thịt từ cá file, cá hồi đóng hộp và thịt bò muối, thịt gà tây, pho mát , mì ống, khoai tây, ớt, đậu Hà Lan và nấm đóng hộp Có ít báo cáo

về việc sử dụng kĩ thuật ELISA trên mẫu lâm sàng như huyết thanh, MP Kĩ thuật ELISA từ MP có độ nhạy giảm đáng kể Một phương pháp xét nghiệm miễn dịch

mới đã được áp dụng để đo các độc tố type A, B và E từ C botulinum Nguyên lý

của kỹ thuật này dựa trên phương pháp miễn dịch liên kết với enzyme nhạy cảm để phát hiện độc tố type A, B và E bằng cách sử dụng khuếch đại tín hiệu thông qua xét nghiệm đông máu liên kết với enzyme (4) ELISA được khuyến cáo thử nghiệm trên mẫu lâm sàng phức tạp như máu và chất thải nhưng cho đến nay chưa có bài báo công bố (4)

1.4.3 Quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum

type A, B

Vi khuẩn C botulinum được liệt kê vào nhóm vi sinh vật chọn làm vũ khí

sinh học nên việc nhập khẩu chủng chuẩn gặp nhiều khó khăn ở nhiều quốc gia

trong đó có Việt Nam Kỹ thuật nuôi cấy phân lập vi khuẩn kỵ khí C botulinum từ

mẫu tự nhiên rất khó khăn do điều kiện nuôi cấy phức tạp, số lượng vi khuẩn trong mẫu ít và các chủng có đặc điểm sinh lí đa dạng Việc nuôi cấy dựa trên việc nhân lên của vi khuẩn chính vì vậy yêu cầu đòi hỏi rất cao về mẫu bệnh phẩm, vi khuẩn còn sống và đòi hỏi điều khắt khe trong quá trình nuôi cấy (4)

Quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type

A, B gồm 2 bước nuôi cấy phân lập và PCR đa mồi phát hiện gen độc tố của vi

khuẩn C botulinum type A, B (11) Quy trình đòi hỏi về máy móc trang thiết bị

phức tạp, việc đòi hỏi có đầy đủ trang thiết bị hiện đại để nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn kỵ khí như tủ nuôi cấy kỵ khí Bugbox là bắt buộc cho việc nuôi cấy Yêu cầu về con người, chuyên môn cho quy trình nuôi cấy cũng rất cao Thời gian nuôi cấy phân lập, và định danh vi khuẩn lâu (4 – 6 ngày) (12) Giá thành cho xét

HUPH

nghiệm nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí nói chung là rất cao Độ đặc hiệu cao nhưng độ nhạy thấp hơn so với các quy trình sinh học phân tử (LAMP, PCR) (34)

1.4.4 Phương pháp sinh học phân tử

Thử nghiệm gây chết chuột, phương pháp miễn dịch miễn dịch thường có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp, đắt tiền, mất công và liên quan đến vấn đề y đức

do sử dụng động vật thí nghiệm trong chẩn đoán C botulinum (35) Nhu cầu thực tế

bức thiết cần có một phương pháp chẩn đoán chính xác có độ nhạy và độ đặc hiệu

cao Vì vậy rất nhiều nghiêncứu sinh học phân tử về C botulinum được tiến hành

do các phương pháp này độ nhạy và độ đặc hiệu cao (36-42) Các kỹ thuật PCR được ứng dụng là PCR truyền thống, PCR lồng (nested – PCR), PCR đa mồi (43), real – time PCR và real – time PCR đa mồi là phương pháp được phát triển sau này

và được sử dụng để thay thế PCR nhanh chóng xác định các vi khuẩn bằng cách phát hiện các gen BoNT (botulinum neurotoxin), mã hóa cho các độc tố thần kinh với độ nhạy cao (14, 41, 44-52) Nhiều xét nghiệm sinh học phân tử đã được được

thiết kế để phát hiện C botulinum, với gen đích là gen BoNT và gen

nontoxic-nonhemagglutinin (NTNH) (4) tính đặc hiệu của các kết quả này đã được xác nhận thêm bằng trình tự rRNA 16S Trong nhiều khảo sát dịch tễ học, kỹ thuật LAMP

được đánh giá tăng khả năng chẩn đoán C botulinum lên cao hơn so với các kỹ thuật qPCR (hay real – time PCR) (4) Lượng ADN đặc hiệu của C botulinumtrong các xét nghiệm sinh học phân tử có thể trực tiếp tương quan với cường độ nhiễm C

botulinum của người bệnh Nhược điểm của phương pháp PCR truyền thống và real

– time PCR là một kỹ thuật khó, cần được thực hiện bởi các chuyên viên, kỹ thuật viên có trình độ chuyên môn cao, được đào tạo bài bản với các trang thiết bị, máy móc hiện đại Giá thành thực hiện khá cao cũng như không phải trung tâm xét nghiệm nào cũng đủ tiêu chuẩn thực hiện xét nghiệm PCR Để khắc phục nh ng giới hạn của phương pháp PCR truyền thống và real – time PCR trong chẩn đoán xác định mầm bệnh tại thực địa, các nghiên cứu gần đây có xu hướng chuyển sang các phương pháp khuếch đại ADN đẳng nhiệt Điển hình là kỹ thuật LAMP với

nh ng ưu điểm là khuếch đại đẳng nhiệt nên chỉ cần các thiết bị xét nghiệm đơn giản, nhỏ gọn, thời gian xét nghiệm được rút ngắn chỉ còn 30 – 60 phút, đặc biệt các

HUPH

kỹ thuật khuếch đại đẳng nhiệt có khả năng phát triển thành các bộ kit phân tử cho phép ứng dụng được tại thực địa (5)

Trong nghiên cứu mới nhất so sánh kỹ thuật real – time PCR với LAMP để

chẩn đoán C botulinum của Yufei Chen và CS tháng 4 năm 2021 cho thấy quy trình

LAMP có độ nhạy cao hơn 10 lần so với quy trình PCR (13) Nh ng kết quả này chứng minh rằng xét nghiệm LAMP cho thấy độ nhạy cao hơn so với quy trình PCR.Từ kết quả của nghiên cứu này có thể thấy hệ số Kappa của kỹ thuật LAMP và real – time PCR đạt 0,824, độ tương đồng của 2 kỹ thuật là gần như hoàn toàn (53)

Vì vậy kỹ thuật LAMP dùng trong chẩn đoán C botulinum đang trở thành xu hướng

được nghiên cứu nhiều để đưa vào sử dụng ở nh ng vùng còn thiếu thốn về cơ sở

hạ tầng như các vùng nông thôn cũng như nh ng trung tâm kiểm soát an toàn thực phẩm của các xã, huyện và thành phố

1.5 Kỹ thuật LAMP

1.5.1 Lịch sử phát triển của kỹ thuật LAMP

LAMP được phát triển bởi Notomi và CS năm 2000 dựa trên phản ứng khuếch đại acid nucleic ở điều kiện đẳng nhiệt thông qua các cặp mồi được thiết kế đặc biệt để tạo ra sản phẩm có cấu trúc vòng lặp Đây một phương pháp nhân bản gen, có thể tổng hợp một đoạn ADN lớn mà không cần chu trình biến nhiệt Kỹ thuật khuếch đại ADN này tương tự như PCR, nhưng quá trình khuếch đại ADN được hoàn thành trong một bước duy nhất và ở một nhiệt độ ổn định (5)

1.5.2 Nguyên lý chung của kỹ thuật LAMP

Khác với phản ứng PCR thông thường, kỹ thuật LAMP sử dụng từ 4 đến 6 mồi có trình tự đặc hiệu tương ứng với 6 hoặc 8 vùng xác định trên đoạn trình tự đích Ngoài cặp mồi thông thường (F3 – B3), cặp mồi tạo vòng lặp bên trong (forward và backward loop inner – FIP – BIP) và cặp mồi vòng lặp bổ sung (loop forward và backward – LF – LB) giúp khuếch đại trình tự đích với hiệu quả lên tới

109 copies trong vòng 30 – 60 phút ở khoảng nhiệt độ 60 – 65oC Thành phần phản ứng gồm có ADN khuôn, mồi, enzyme Bst ADN polymerase, dung dịch đệm phản ứng Quá trình tái bản gen đích chỉ diễn ra trong một bước duy nhất thường ở

55oC – 65 oC, hiệu quả khuếch đại cao khoảng 109– 1010

copies trong thời gian từ

HUPH

15 – 60 phút Sản phẩm của phản ứng có thể quan sát bằng mắt thường do sự kết tủa của muối pyrophotphate (Mg2P2O7) dưới dạng vẩn đục màu trắng hoặc phát quang khinhuộm bằng các chất chỉ thị màu (SYBR green) Do vậy, LAMP thường được sử dụng để tạo các bộ kit chẩn đoán nhanh (54), (55) Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật LAMP nhiều bộ kit chẩn đoán mầm bệnh được phát triển, thương mại hóa trên thị trường

1.5.3 Thành phần cơ bản của phản ứng LAMP

Mồi: Tối thiểu 4 mồi dựa theo 6 đoạn riêng biệt trên đoạn gene quan tâm: đoạn F3c, F2c và F1c ở đầu 3' và đoạn B1, B2 và B3 ở đầu 5' (Hình 1.5)

Hình 1.5 Hình ảnh các vị trí thiết kế các mồi LAMP (56)

+ FIP (Forward Inner Primer – Mồi xuôi trong): bao gồm đoạn F2 (ở đầu 3')

bổ sung cho đoạn F2c, và đoạn giống như đoạn F1c ở đầu 5'

+ F3 (Forward Outer Primer – Mồi xuôi ngoài): bao gồm đoạn F3 bổ sung cho đoạn F3c

+ BIP (Backward Inner Primer – Mồi ngược trong): bao gồm đoạn B2 (ở đầu 3’) bổ sung cho đoạn B2c và đoạn giống như B1c ở đầu 5’

+ B3 (Backward Outer Primer – Mồi ngược ngoài) bao gồm đoạn B3 bổ sung cho đoạn B3c

Enzyme: sử dụng phổ biến trong phản ứng LAMP là enzyme Bst polymerase được phân lập từ vi khuẩn Bacillus stearothermophilus có khả năng xúc tác tổng hợp ADN và tự tách chuỗi cao, hoạt động tối ưu ở 65o

C

dNTPs và đệm phản ứng: tương tự như kỹ thuật PCR

ADN khuôn: Không đòi hỏi mức độ tinh sạch cao, có thể sử dụng các

HUPH

phương pháp tách ADN đơn giản, để rút ngắn thời gian chuẩn bị

Chất chỉ thị màu biểu hiện kết quả: Có thể sử dụng nhiều loại chất chỉ thị màu như Syber Green, Hydroxyl Naphthol Blue (HNB), Calcein, xanh malachite…

1.5.4 Cơ chế phản ứng LAMP

Gồm ba bước chính: tạo vật liệu khởi đầu, tái bản và kéo dài chuỗi, cuối cùng là lặp lại chu kỳ (57)

Bước 1 – Tạo vật liệu khởi đầu:

Một trong nh ng mồi LAMP s bám vào trình tự ADN đích, sau đó dưới tác dụng của enzyme Bst polymerase tách sợi và kéo dài sợi mới theo chiều 3’ – 5’do cấu trúc bổ sung của mồi với các đoạn trình tự đích trong quá trình kéo dài sợi tạo

ra sản phẩm ADN đơn có giới hạn bởi 2 mồi là FIP và BIP Sợi ADN này 2 đầu cuộn lại hình thành cấu trúc gốc vòng (stem – loop) là cấu trúc khởi đầu cho quá trình tái bản của quy trình LAMP (chu kỳ lặp lại LAMP) (58) (Hình 1.6)

Hình 1.6 Hình ảnh tạo vật liệu khởi đầu (56) HUPH

Bước 2 – Chu kỳ tái bản và kéo dài chuỗi:

Mồi FIP liên kết với vòng trong cấu trúc ADN gốc vòng (stem – loop ADN)

ở vùng F2/F2c và tổng hợp sợi ADN thay thế, đồng thời do cấu trúc vòng ở đầu 3’ (do trình tự FIP tạo thành) s được kéo dài và hình thành cấu trúc vòng ở vị trí kết thúc của trình tự BIP Cấu trúc vòng của trình tự BIP lại được kéo dài hình thành nên cấu trúc sợi kép được gấp khúc ở gi a và một sợi đơn có cấu trúc vòng ở hai đầu Hai sản phẩm này s là ADN khuôn cho mồi BIP trong các chu kỳ tái bản tiếp theo Cuối cùng tạo ra hỗn hợp ADN gốc vòng với cấu trúc gấp khúc và độ dài khác nhau của cùng một trình tự (Hình 1.7)

Hình 1.7 Hình ảnh tái bản và kéo dài chuỗi ADN (56)

Bước 3 – Lặp lại chu kỳ:

Cứ như vậy, các mồi FIP và BIP của cả hai sợi khuôn thay phiên nhau tổng hợp ADN bổ sung và tạo gốc vòng ở cuối mỗi sợi Phản ứng tiếp tục, tạo nên 109 –

1010 copies ADN mạch trong vòng 15 phút đến 1 giờ

1.5.5 Ưu, nhược điểm của kỹ thuật LAMP

1.5.5.1 Ưu điểm của kỹ thuật LAMP

Đầu tiên, xét nghiệm LAMP được vận hành trong điều kiện đẳng nhiệt không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền (bể ổn nhiệt, tủ nuôi cấy hoặc thiết bị gia nhiệt có

HUPH

thể gi nhiệt độ ổn định ở 55oC – 65oC trong khi PCR được thực hiện trong môi trường chu kỳ nhiệt độ, luôn tốn thời gian và đòi hỏi độ chính xác cao của các thiết

bị PCR, real – time PCR Hơn n a, quy trình LAMP được đánh giá bằng phương pháp độ đục trong phản ứng dương tính bằng cách kiểm tra thời gian thực của hỗn hợp phản ứng với phát hiện huỳnh quang trực quan bằng mắt thường (phát hiện sản phẩm trực tiếp bằng các chất chỉ thị màu.) mà không cần thực hiện điện di trên gel agarose Thời gian xét nghiệm nhanh (15 – 60 phút) so với các nghiên cứu trước đây, dành 24 giờ cho xét nghiệm PCR hay từ 4 – 6 ngày cho xét nghiệm nuôi cấy (48) Độ nhạy và độ đặc hiệu tương đương quy trình phát hiện ADN khác như PCR hay real – time PCR Điều này là do xét nghiệm LAMP sử dụng các đoạn mồi được thiết kế đặc biệt để nhận ra trình tự đích của bốn hoặc sáu trong số sáu đến tám vùng độc lập trong trình tự ADN mục tiêu, trong khi mồi PCR chỉ nhận ra hai vùng

độc lập của trình tự đích (59)

Thứ ba, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng việc tinh sạch mẫu ADN nói chung không cần thiết trong các phản ứng LAMP vì nó ít bị ảnh hưởng bởi các thành phần khác nhau trong mẫu hơn so với quy trình PCR ADN làm khuôn trong LAMP

không đòi hỏi độ tinh sạch cao như quy trình PCR (59)

Chính vì nh ng lý do nêu trên quy trình LAMP cho thấy hiệu quả, dễ áp dụng, chi phí thấp hơn hơn so với các quy trình hiện nay chúng ta đang sử dụng

trong chẩn đoán C botulinum (Bảng 1.3)

1.5.5.2 Nhược điểm của kỹ thuật LAMP

Đây là kỹ thuật sinh học phân tử vì vậy việc chuẩn bị mẫu giống như PCR hay real – time PCR vẫn phải bao gồm bước tách chiết ADN nên vẫn cần hóa chất,

thiết bị cơ bản như máy ly tâm, micropipette để thực hiện Do có độ nhạy cao, nên

dễ tạp nhiễm, gây hiện tượng dương tính giả Giá thành cao hơn so với phương

pháp hình thái học và ELISA và thấp hơn so với PCR hay real – time PCR (Bảng 1.3)

HUPH

Bảng 1.3 Tóm tắt so sánh ưu nhược điểm của LAMP với quy trình thử nghiệm gây chết chuột, nuôi cấy, PCR, real – time

Thử nghiệm gây chết chuột Miễn dịch (Elisa)

1 Nhiệt độ của

phản ứng Đẳng nhiệt Luân nhiệt biến thiên

Tủ ấm, tủ kỵ khí (cồng kềnh, đắt

tiền)

Sử dụng môi trường, tủ nuôi chuột đảm bảo nhiệt độ thích

nghi của chuột

Máy ủ nhiệt, hoặc

hệ thống xét nghiệm miễn dịch

quan

Yêu cầu độ chính xác cao của phát hiện trên điện di trên gel

agarose hoặc tín hiệu huỳnh quang trên máy luân nhiệt real –

time PCR

Kiểm tra sự xuất hiện khuẩn lạc bằng mắt

thường

Độc tố có thể được phát hiện bằng biểu hiện tê liệt, chết chuột sau khi tiêm độc

tố vào chuột

Phát hiện sự kết hợp đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể trên máy đo quang

đặc hiệu

HUPH

Thử nghiệm gây chết chuột Miễn dịch (Elisa)

4 Độ đặc hiệu và

độ nhạy

Tăng lên nhờ các đoạn mồi được thiết

kế đặc hiệu để nhận

ra bốn hoặc sáu vùng độc lập trên

trình tự đích

Mồi PCR chỉ nhận ra hai vùng độc lập trên

trình tự đích

Độ đặc hiệu cao nhưng độ nhạy thấp hơn so với các phương pháp sinh học phân tử (LAMP,

PCR)

Độ nhạy giảm dần theo thời gian sau khi xuất hiện các biểu

hiện đầu tiên

và các hợp chất h u

cơ do gắn với ADN

Môi trường, điều kiện nuôi cấy đòi hỏi cao cho khả năng sống và phát triển của vi khuẩn kỵ khí

Rất dễ bị ức chế bởi các chất chống độc trên một số cơ thể chuột

Đòi hỏi độ tinh sạch cao trong thành phần phản ứng hạn chế ức chế ngưng kết kháng nguyên – kháng thể

HUPH

Thử nghiệm gây chết chuột Miễn dịch (Elisa)

mở ngắn

7 Yêu cầu về con

người Không yêu cầu cao

Yêu cầu con người có kinh nghiệm và

chuyên môn cao

Yêu cầu cao về con người thực

hiện

Yêu cầu cao về con người thực

hiện

Yêu cầu cao về con

người, chuyên môn

Thực hiện tách chiết ADN giống các phương pháp sinh học

phân tử khác

Yêu cầu đòi hỏi cao mẫu bệnh phẩm, vi khuẩn còn sống và đòi

Yêu cầu nuôi và bảo quản chuột trước thử nghiệm

phức tạp

Dễ dàng

HUPH

Thử nghiệm gây chết chuột Miễn dịch (Elisa)

khe trong quá

trình nuôi cấy

HUPH