Ứng dụng các kỹ thuật sắc ký để phân tích chất độc có trong muối tắm và nước biểnghb

PHÂN TÍCH SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG “ FLAKKA TRONG MUỐI TẮM “ VÀ “ GHB TRONG NƯỚC BIỂN” CÓ TRONG MẪU DỊCH SINH H C MÁU, HUYỌ ẾT TƯƠNG, NƯỚC TIỂU BẰNG CÁC KỸ THUẬT MI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

KHOA DƯỢC LBM HÓA PHÂN TÍCH – KIỂ M NGHI ỆM – ĐỘ C CH T Ấ

-   -

Bài báo cáo th c t p ự ậ

MÔN: ĐỘC CHẤT CHỦ ĐỀ 8: NG D NG CÁC K THU T S C KÝ Ứ Ụ Ỹ Ậ Ắ

“MUỐ I T ẮM” VÀ “NƯỚ C BI ỂN/GHB”

GVHD: PGS.TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ

Nhóm SVTH: 12 – Dược-LT K34

DANH SÁCH NHÓM

MỤC LỤC

DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

A MỞ ĐẦU 1

B NỘI DUNG 3

1 NGUỒN G C, TÍNH CH T LÝ HÓA: 3 Ố Ấ 1.1 Muối tắm 3

1.2 GHB 4

2 ĐỘC TÍNH, CƠ CHẾ GÂY ĐỘC VÀ XỬ LÝ NG Ộ ĐỘC 6

2.1 Flakka trong mu i t m 6 ố ắ 2.2 GHB trong nước biển 7

3 PHÂN TÍCH SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG “ FLAKKA TRONG MUỐI TẮM “ VÀ “ GHB TRONG NƯỚC BIỂN” CÓ TRONG MẪU DỊCH SINH H C ( MÁU, HUYỌ ẾT TƯƠNG, NƯỚC TIỂU) BẰNG CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH VÀ SẮC KÝ HIỆN ĐẠI 8

3.1 GHB trong nước biển 8

3.1.1 Kỹ thuật xét nghiệm sắc ký hiện đại 8

3.1.2 Kỹ thuật xét nghi m mi n dệ ễ ịch 10

3.2 Flakka trong mu i t m 12 ố ắ 3.1.3 Kỹ thuật xét nghiệm sắc ký hiện đại 12

3.1.4 Kỹ thuật xét nghi m mi n dệ ễ ịch 18

C TÀI LIỆU THAM KH O Ả

khí-LC Liquid chromatography Sắc kí lỏng

LC-HRMS Liquid chromatography -High

Resolution Mass Spectrometry

Sắc ký lỏng khối ph ổphân gi i cao ảLC-MS Liquid chromatography–mass

spectrometry

Phương pháp sắc ký

l ng-khỏ ối ph ổLOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng MDPV Methylenedioxypyrovalerone

MSTFA N-methyl-N- -tri

methylsilyltrifluoracetamide

DANH M C BỤ ẢNG

Trang

Bảng 1: Xét nghiệm chẩn đoán nhanh GHB với mẫu vật nước tiểu 10

Bảng : Tương quan mẫu vật2 …….12

Bảng 3: Chuyển tiếp phân mảnh lớn của chất chuyển tiếp và chất chuẩn nội 14

Bảng4: Các thông số Gradient sắc ký lỏng……….15

Bảng 5: Dữ liệu xác thực thu được từ phương pháp “pha loãng và bắn” cho tất cả các chất phân tích có trong xét nghiệm 16

Bảng 6: Dữ liệu NPS dương tính từ khoảng thời gian 14 tháng thử nghiệm 18

DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1: Cấu trúc phân t cử ủa α-PVP 3

Hình 2: Tổng h p Flakka 4 ợ Hình 3: Thành phần hóa học GHB 5

Hình 4: Quá trình sinh tổng h p acid GHB 6 ợ Hình 5: Bộ xét nghi m lệ ạm dụng thuốc có độ nhạy cao GHB Th nghiử ệm nhanh d i ả 3 mm 10

Hình 6: Sắc ký đồ LC-MS/MS 13

Hình 7: Sắc ký đồ phủ của 10 chất phân tích được xác định trong xét nghiệm 16

Hình 8: Sắc đồ cho thấy sự phân tách của các đồng phân etylone và butylone 17

Hình 9: Kit test xét nghiệm nhanh α-PVP (Nước tiểu) 20

Hình 10: Hướng dẫn sử dụng Panel 21

A MỞ ĐẦU

• Thực trạng s d ử ụng :

Muối tắm

Alpha-pyrrolidinovalerophenone (a-PVP) là m t ch t kích thích t ng h p bộ ấ ổ ợ ất hợp pháp có tên gọi đường ph là "flaka" Mố ặc dù nó được phát triển như một chất kích thích h ệ thần kinh trung ương vào những năm 1968, việc sử ụng nó để giả d i trí,

đã trở nên phổ biến trong 4-5 năm gần đây, và nhiều trường hợp ngộ độc và tử vong

đã được báo cáo do ch t này Chúng có th ấ ể được mua tr c tuy n ho c t các c a hàng ự ế ặ ừ ửbán l ẻ và thường được bán dưới dạng "muối tắm"

GHB/ nước biển

Gamma-hydroxybutyrate (GHB) là m t chộ ất ức ch hế ệ thần kinh trung ương chủ yếu được s dử ụng như một lo i thu c b l m dạ ố ị ạ ụng để ải trí, nhưng cũng dùng gi

để điều tr chứng ng ị ủ rũ với cataplexy bở ệnh nhân ngườ ớn và như một chất bổ trợ i l

để kiểm soát hội chứng cai rượu

• Đặt vấn đề

“Vì sao lại chọn nghiên cứu về ch t độc trong Mu i tắm và GHB/ nước biển” ấ ốHiện nay “Muối tắm” , “Nước biển” đã trở nên ph biổ ến hơn ở m t b ph n giộ ộ ậ ới trẻ Việt Nam, là hi m h a ma tuý nguy hiể ọ ểm ẩn n p v i nh ng tên gắ ớ ữ ọi tưởng ch ng ừ

Vì v y vi c l a ch n ch ậ ệ ự ọ ủ đề nhằm cung c p chúng ta m t cái nhìn khái quát v ngu n ấ ộ ề ồgốc, tính ch t lý hoá, thành ph n hoá h c, nh ng bi u hiấ ầ ọ ữ ể ện độc tính , cơ chế gây độc ,cách x lí khi ng ử ộ độc và cách sử d ng mụ ột số ỹ thuật mi n d ch và s c ký hi k ễ ị ắ ện đại

để định tính, định lượng “Flaka trong muối tắm” và “ GHB trong nước biển” có trong mẫu dịch sinh học

• Giải pháp để kiểm soát việc sử dụng “ Muố ắm” và “ i t GHB/ Nước biển”

+ Tuyên truyền v h u quề ậ ả tác h i cạ ủa ma tuý, tránh xa các ch t gây nghi n ấ ệ+ Có biện pháp ch tài nghiêm khế ắc đối với người buôn bán chất gây nghi n ệ+ Quản lí và bắt buộc cai nghiện đối đối với ngư i đã sử ụờ d ng và nghi n ệ

Một lo i ma túy t ng hạ ổ ợp được biết đến trên đường phố là “Flakka” (αpyrrolidinovalerophenone, α PVP) đã trở- nên phổ biến ở Hoa Kỳ Nó tương tự về mặt hóa h c vọ ới MDPV, còn được gọi là mu i t m, là nguyên nhân gây ra s ố ắ ự gia tăng các trường hợp say và kích động kỳ lạ Hoa Kỳ vài năm trướở c đây.

Công th c phân t là C15H21NO (C15H22NOCl ứ ử trong trường h p là mu i ợ ốclohydrid của nó)

Hình 1: C ấu trúc phân t c ử ủa α-PV P

Tổng hợp

Quá trình tổng hợp α-PVP trong phòng thí nghiệm theo bước 3

+ Bước 1, 1-phenyl1-pentanone đượ ạc t o thành t ph n ng c a valeronitril ừ ả ứ ủvới phenylmagnesium bromide, với một ph n ng t o axit ti p theo ả ứ ạ ế

+ Bước 2, brom hóa để ạo ra α-bromo xeton tương ứ t ng Ch t này ph n ng ấ ả ứvới pyrrolidine để tạo ra α-PVP (hi u su t 51%) ệ ấ

+ Bước 3, được chuy n thành mu i hydrochloride ể ố

Từ những năm 1970 đến 1980, nhiều trường hợp l m dạ ụng GHB đã được báo cáo trong s nhố ững người xây dựng cơ thể vì nó được cho là có khả năng làm tăng hormone tăng trưởng Trong suốt những năm 1980 và 1990, nó nổi tiếng như một chất kích thích hoạt động tình dục, đặc biệt là đố ới v i những người thường xuyên đi

hộp đêm Từ những năm 1990, GHB đã được chú ý nhiều hơn vì nhiều trường hợp ngộ độc cấp tính Năm 2000, Cơ quan Thực thi Ma túy Hoa Kỳ (DEA) đã đưa GHB vào B ng I c a các lo i ma túy do khả ủ ạ ả năng lạm d ng và phụ ụ thuộc về thể chất và tâm lý Năm 2003, nó được liệt vào danh sách thuốc loại C trong Đạo luật lạm dụng thuốc của Vương quốc Anh Là m t lo i thu c b l m d ng, GHB n m trong tộ ạ ố ị ạ ụ ằ ầm kiểm soát ở tất cả các nước thành viên EU Tuy nhiên, nó cũng được ứng d ng trong ụđiều tr chứng ngủ rũ và ít thường xuyên hơn như một chất bổ tr trong việc kiểm ị ợsoát các hội chứng cai rượu và nghiện rượu

➢ Tính ch t lý hóa ấ

Gamma-hydroxybutyrate (GHB) là ti n ch t n i sinh c a axit gamma-ề ấ ộ ủaminobutyric (GABA) và chất gây suy nhược hệ thần kinh trung ương (CNS) đã trở nên khét ti ng vì b l m dế ị ạ ụng như một lo i thu c tiêu khiạ ố ển dưới d ng ch t l ng không ạ ấ ỏmàu, không mùi ho c màu tr ng bặ ắ ột, viên nén và viên nang dưới m t s ộ ố tên (“Georgia Home Boy”, “Juice”, “Liquid Ecstasy”, “Mils”, “G”, “Liquid X”, “Liquid G” và

Tổng h p ợ Con đường chính của sự tổng hợp GHB là thông qua chấ ẫt d n truyền thần kinh GABA; do đó, quá trình sinh tổng hợp của nó sẽ là quá trình mà nó được thể hiện trong hình 4, trong đó GABA-T s là enzym GABA transaminase; SSA-DH s ẽ ẽ

là enzyme succinic semialdehyde dehydrogenase; SSA s là succinic semialdehyde; ẽ

và SSA-R (hoặc SSR) s ẽ là enzyme succinic semialdehyde reductase

Hình 4: Quá trình sinh t ổng h p acid GHB ợ

và t vong có th xử ể ảy ra đặc bi t hành vi thi u h t nh n th c, các tri u ch ng mê s ng ệ ế ụ ậ ứ ệ ứ ảkèm theo hành vi b o lạ ực dẫn đế ựn t sát ho c giặ ết người

➢ Cơ chế gây độ c:

Tác dụng dược lý m nh c a Flakka ch y u qua trung gian c ch tái h p thu ạ ủ ủ ế ứ ế ấdopamine gây ảo giác đáng sợ ố, r i lo n tâm thạ ần hoang tưởng kích động cực độ và nhiều tr ng thái tâm th n khác nhau ạ ầ

➢ Xử trí ng ộ độc:

+ C p cấ ứu: Không có phương pháp đặc biệt điều trị ngộ độc Flakka, các biện pháp điều trị chỉ tập trung vào việc kiểm soát đối với rối loạn hành vi và kích động

+ Giải độc: Thu c Benzodiazepine ho c thu c ch ng lo n thố ặ ố ố ạ ần dường như là lựa chọn đầu tiên Lưu ý Bệnh nhân có d u hi u c a hấ ệ ủ ội ch ng mê s ng ph n khích ứ ả ấchống ch ỉđịnh dùng Benzodiazepine trong trường hợp này, hành vi b o lạ ực đột ng t, ộ

ảo giác và tử vong sau khi bị kiềm chế liên tục sau khi sử dụng Flak ka

+ H ỗ trợ điều trị: Các nghiên c u gứ ần đây cho thấy vi c tiêm phòng có th làm ệ ểgiảm tác dụng c a Flakka ủ

2.2 GHB trong nước biển

➢ Độc tính:

GHB có ảnh hưởng tiêu cực đáng kể đến trí nh và nh n th c, tuớ ậ ứ ỳ liều lượng

mà gây nên tri u chệ ứng khác nhau như an thần sau đó hôn mê, yếu cơ, chậm nhịp tim, ức chế hô h p, giấ ảm ý thức, buồn nôn, nôn mửa và vấn để liên quan đến hô hấp, mất trí nh ng n h n vv ngoài ra, không t nguy n c ớ ắ ạ ự ệ ử động, co gi t lú lậ ẫn, kích động

và hung hăng, gây ảo giác Nghiêm trọng có thể hôn mê và tử vong

➢ Cơ chế gây độc:

GHB là chất dẫn truy n thề ần kinh/ điều hoà thần kinh trung ương

Việc lạm dụng GHB dẫn đến việc ngăn chặn hoạt động t phát c a t bào thự ủ ế ần kinh GABA và do đó để ức ch t bào thế ế ần kinh dopamine gây độc tính th n kinh khi ầdùng kéo dài

+ H ỗ trợ điề u trị: S d ng các lo i thu c cử ụ ạ ố ụ thể ức ch Enzym GABA-ế T đểđiều tr cho bệnh nhân này vì thuốc có tác dụng là giảm nị ồng độ GHB trong não Baclofen cũng là m t ch t ch v n GABA-B, có th h ộ ấ ủ ậ ể ỗ trợ trong quá trình cai nghi n ệ

3 PHÂN TÍCH SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH

LƯỢNG “ FLAKKA TRONG MUỐI TẮM “ VÀ “ GHB TRONG NƯỚC

BIỂN” CÓ TRONG MẪU DỊCH SINH HỌC ( MÁU, HUYẾT TƯƠNG,

NƯỚC TIỂU) BẰNG CÁC KỸ THUẬT MIỄ N D CH VÀ SẮC KÝ HIỆN ĐẠI Ị

3.1 GHB trong nước biển

3.1.1 Kỹ thuật xét nghi m s c ký hiệ ắ ện đại

Giới thiệu phương pháp

Axit gamma-hydroxybutyric (GHB) là m t lo i thu c an thộ ạ ố ần được s dử ụng trong các tội ph m ma túy Cạ ửa sổ phát hi n cệ ủa nó rất ngắn GHB trải qua quá trình chuyển hóa giai đoạn I chuyên sâu thành các axit hữu cơ : axit glycolic, axit succinic, axit dihydroxybutyric

Phương pháp sắc ký khí-khối phổ (GS/MC) s d ng chi t lử ụ ế ỏng-lỏng và t o ạ

dẫn xu t vấ ới N-metyl-N-tri-metylsilyltrifluoracetamit đã được phát triển cho phép phát hiện và định lượng mức độ ộ n i sinh c a các chủ ất chuyển hóa này trong các m u ẫsinh học (máu và nước tiểu)

Mẫu nước tiểu:

Để tránh ô nhiễm vi khuẩn trong mẫu nước tiểu, thêm vào hai đến ba giọt cloroform, mẫu được b o quả ản ở 20°C cho đế - n khi s d ng (T t nh t là trong 4 gi ử ụ ố ấ ờđầu sau khi sử dụng GHB)

hợp được lắc kỹ trong 1 phút và ly tâm ở tốc độ 3000 vòng / phút trong 3 phút Phần nổi phía trên được c n th n chuy n sang mẩ ậ ể ột ống nghi m thệ ủy tinh khác Sau đó, 100

μL HCl (0,1 mol / L trong 2 propanol) đượ- c thêm vào, và phần nổi phía trên được làm khô dưới dòng nitơ nhẹ ở nhiệt độ phòng Cặn khô được tạo dẫn xuất và trimetylsilyl hóa bằng cách s dử ụng 500 μL MSTFA ở 60 ° C trong 60 phút H n h p ỗ ợphản ứng được chuy n vào l l y m u tể ọ ấ ẫ ự động và 2 μL được tiêm vào hệ thống GC – MS

Điều ki n máy sắệ c ký kh i phổ GC/MS ố

GC/MS được thực hi n b ng cách s d ng MSD 5975C (Agilent Technologies, ệ ằ ử ụSanta Clara, USA) được trang bị 7890A GC (Agilent) và bộ lấy mẫu tự động 7683B (Agilent)

Cột mao quản được sử d ng là TG-ụ 5SILMS (30 m × 0,25 mm i.d., độ dày màng 0,25 μm) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)

GC được vận hành ở chế độ phân chia (tỷ lệ phân chia 1/20), và nhiệt độ ủa ckim phun và đầu báo được đặt lần lượt ở 280 ° C và 230 ° C

Chương trình nhiệt độ được sử dụng như sau: tăng 10 ° C / phút từ 80 ° C đến

300 ° C, v i nhiớ ệt độ ban đầu được duy trì trong 2 phút và nhiệt độ cuối cùng được duy trì trong 3 phút

Heli có độ tinh khiết cao được sử dụng làm khí mang ở tốc độ dòng chảy 0,9

mL / phút

Các h p ch t b ion hóa bợ ấ ị ởi tác động của điệ ửn t 70 eV Detector ch n l c khọ ọ ối lượng được sử dụng ở chế độ giám sát ion đã chọn để phân tích định lượng Các ion sau được theo dõi (sử dụng th i gian dừng là 20 ms) ờ

Các n ồng độ chấ t n i sinh axit glycolic, GHB, axit succinic, axit 2,4-ộ

dihydroxybutyric, axit 3,4-dihydroxybutyric là cơ sở ế k t lu n có s d ng GHB hay ậ ử ụ

Điểm nổ ậ i b t Self testing drug

kits, drug test strip

Mô tả

Axit-Hydroxybutyric (GHB), còn được gọi là axit 4-hydroxybutanoic, là một chất dẫn truyền thần kinh tự nhiên và một loại thuốc thần kinh Nó đã được sử dụng trong môi trường y tế như một loại thuốc gây mê nói chung và như là một phương pháp điều trị bệnh cataplexy, chứng ngủ rũ và nghiện rượu Nó cũng được sử dụng bất hợp pháp như một chất gây say, để cố gắng tăng hiệu suất thể thao, và như một loại thuốc hiếp dâm ngày Nó thường được sử dụng dưới dạng muối, chẳng hạn như natri-hydroxybutyrate (Na.GHB, natri oxybate) hoặc kali-hydroxybutyrate (K.GHB, kali oxybate) Nước tiểu thường là mẫu vật thường dùng cho mục đích theo dõi lạm dụng thuốc Cả-butyrolactone (GBL) và 1,4-butanediol đều được chuyển đổi thành GHB trong cơ thể

Nguyên tắc kiểm tra

GHB-DH (gammahydroxybutyrate dehydrogenase) xúc tác phản ứng của GHB

và NAD+ để tạo ra NADH, và một phản ứng nhuộm tetrazoliym cặp diaphorase dẫn đến việc tạo ra phức hợp thuốc nhuộm màu tím Các thuốc thử đã được ổn định và được sử dụng để tạo ra xét nghiệm sàng lọc GHB trong nước tiểu ở mức 10 μg / mL Hạn chế

1 Băng thử nghiệm nhanh chỉ cung cấp kết quả phân tích sơ bộ, định tính Một phương pháp phân tích thứ cấp phải được sử dụng để có được kết quả xác nhận Phương pháp sắc ký khí / quang phổ khối (GC/MS) là phương pháp xác nhận

2 Có thể có các lỗi kỹ thuật, cũng như các chất gây nhiễu khác trong mẫu nước tiểu có thể gây ra kết quả sai

3 Chất pha trộn, chẳng hạn như thuốc tẩy hoặc phèn, trong mẫu nước tiểu có thể tạo ra kết quả sai lệch bất kể phương pháp phân tích được sử dụng Nếu nghi ngờ, xét nghiệm nên được lặp lại với một mẫu nước tiểu khác

4 Một kết quả dương tính cho thấy sự hiện diện của thuốc hoặc các chất chuyển hóa của nó nhưng không cho thấy mức độ nhiễm độc, đường dùng hoặc nồng độ trong nước tiểu

5 Một kết quả âm tính có thể không nhất thiết chỉ ra nước tiểu không có thuốc Kết quả âm tính có thể thu được khi có thuốc nhưng dưới mức giới hạn của xét nghiệm

* So sánh băng thử nghiệm nhanh GHB (Nước tiểu) và GC/MS Các kết

quả sau đây được lập bảng:

Bảng 2: Tương quan mẫu vật

kết quả Kiểm tra

nhanh GHB

Các kết quả

Tích cực

Tiêu cực Tích

Khảo sát 50 người sử dụng GHB bằng th nghi m nhanh GHB thì ch có 46 ử ệ ỉ

người cho kết quả dương tính => sai số là 4 người (âm tính) => độ nhạy c a pp này ủ

Mẫu huyết thanh và nước tiểu được gi trong t lữ ủ ạnh cho đến khi đem đi phântích thường được thực hiện vào cùng ngày hoặc ngày hôm sau Bảo quản mẫu trong thời gian dài hơn được th c hiự ện ở - 80 ° C Phép đo các chất tác động thần kinh được thực hi n bệ ằng phương pháp sắc ký lỏng-khối phổ (LC-MS) hoặc đa thành phần LC-

độ phân gi i cao (LC-HRMS / MS), d a trên các tín hiả ự ệu ghi đối v i hai ion s n phớ ả ẩm cho m i ch t phân tích ỗ ấ ở chế độ theo dõi ph n ng tích cả ứ ực được ch n ọ(SRM) Phương pháp LC-HRMS thường xuyên được c p nh t các ch t m i, khi ậ ậ ấ ớchúng xuất hi n trên thệ ị trường thuố c

Hình 6: S ắc ký đồ LC-MS/MS

Vật liệu và phương pháp phân tích

Thuốc thử

Tất cả các hợp chất chuẩn đối chứng Dung môi, bao gồm metanol, axetonitril

và axit fomic Nước tiểu bình thường không chứa thuốc