Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất 6 bromo 4,5 dimethylbenzothiazol báo cáo nghiên cứu khoa học

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐỀ TÀI: TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 6-BROMO-4,5-DIMETHYLBENZOTHIAZOL ĐỒNG NAI, 07/2020... BÁO CÁO NGHIÊN CỨU

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 6-BROMO-4,5-DIMETHYLBENZOTHIAZOL

ĐỒNG NAI, 07/2020

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

ĐỀ TÀI:

TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 6-BROMO-4,5-DIMETHYLBENZOTHIAZOL

ĐỒNG NAI, 07/2020

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC PHỤ LỤC viii

LỜI CẢM ƠN x

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 3

2.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH 3

2.1.1 Định nghĩa kháng sinh 3

2.1.2 Cơ chế tác động 3

2.1.3 Đề kháng kháng sinh 3

2.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ BENZOTHIAZOL VÀ DẪN CHẤT 5

2.2.1 Công thức chung 5

2.2.2 Tính chất lý hóa benzothiazol 6

2.2.3 Phương pháp tổng hợp benzothiazol 7

2.2.4 Tác dụng sinh học các dẫn chất benzothiazol 9

2.3 PHƯƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC 13

2.3.1 Phương pháp vật lý 13

2.3.2 Phương pháp hóa học 13

2.3.3 Phương pháp sắc kí 13

2.3.4 Phương pháp phổ 14

2.4 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP 15

2.4.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn 15

2.4.2 Xác định hoạt tính kháng nấm 16

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17

3.2 NGUYÊN LIỆU – TRANG THIẾT BỊ 17

3.2.1 Nguyên liệu 17

3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị 18

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 27

4.1 KẾT QUẢ TỔNG HỢP HÓA HỌC 27

4.1.1 Tổng hợp dẫn chất 2,3-dimethylphenylthioure 27

4.1.2 Tổng hợp dẫn chất 2-amino-6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol 30

4.1.3 Tổng hợp dẫn chất N-(6’-bromo-4’,5’-dimethylbenzothiazol-2’-yl)-2-cloroacetamid 33

4.1.4 Tổng hợp dẫn chất N-(6’-bromo-4’,5’-dimethylbenzothiazol-2’-yl)-2(-X)acetamid 36

4.2 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM 41

4.2.1 Kết quả định tính 41

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 43

5.1 KẾT LUẬN 43

5.1.1 Tổng hợp 43

5.1.2 Kiểm nghiệm và xác định cấu trúc 43

5.1.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 43

5.2 ĐỀ NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

IR Infrared spectrum Phổ hồng ngoại

MS Mass spectometry Khối phổ

1H – NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ proton

13C – NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ carbon

DMSO Dimethylsulfoxide Dimethyl sulfoxid

SDA Sabouraud Dextrose Agar Sabouraud Dextrose Agar

TSA Tryptycase Soy Agar Tryptycase Soy Agar

TSB Tryptycase Soy Broth Tryptycase Soy Broth

δ (ppm) Chemical shift δ (ppm) Độ dời hóa học

ν (cm-1) Elastic vibration ν (cm-1) Dao động co dãn

δ (cm-1) Bending vibration δ (cm-1) Dao động biến dạng

Hình 3.1 Cách chấm sắc kí 22

Hình 3.2 Phương pháp khuếch tán trên thạch 24

Hình 4.1 Thiết bị tổng hợp 2,3-dimethylphenylthioure 27

Hình 4.2 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 1 28

Hình 4.3 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 2 31

Hình 4.4 Thiết bị tổng hợp N-(benzothiazol-2’-yl)-2-cloroacetamid 33

Hình 4.5 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 3 34

Hình 4.6 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 4a 37

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Đỉnh hấp thu đặc trưng của các dẫn chất 4,5-dimethylbenzothiazol 23

Bảng 4.1 Kết quả sắc ký lớp mỏng sản phẩm 1 28

Bảng 4.2 Kết quả phổ hồng ngoại sản phẩm 1 29

Bảng 4.3 Kết quả phổ 1H-NMR sản phẩm 1 29

Bảng 4.4 Kết quả phổ 13C-NMR sản phẩm 1 29

Bảng 4.5 Kết quả sắc ký lớp mỏng sản phẩm 2 31

Bảng 4.6 Kết quả phổ hồng ngoại sản phẩm 2 32

Bảng 4.7 Kết quả phổ 1H-NMR sản phẩm 2 32

Bảng 4.8 Kết quả phổ 13C-NMR sản phẩm 2 32

Bảng 4.9 Kết quả sắc kí lớp mỏng của sản phẩm 3 35

Bảng 4.10 Kết quả phổ hồng ngoại sản phẩm 3 35

Bảng 4.11 Kết quả phổ 1H-NMR sản phẩm 3 35

Bảng 4.12 Kết quả phổ 13C-NMR sản phẩm 3 36

Bảng 4.13 Kết quả sắc kí lớp mỏng sản phẩm 4a 38

Bảng 4.14 Kết quả phổ hồng ngoại sản phẩm 4a 38

Bảng 4.15 Kết quả phổ 1H-NMR sản phẩm 4a 38

Bảng 4.16 Kết quả phổ 13C-NMR sản phẩm 4a 39

Bảng 4.17 Các dẫn chất N-(6’-bromo-4’,5’-dimethylbenzothiazol-2’-yl)-2(-X)acetamid và ký hiệu sản phẩm 40

Bảng 4.18 Kết quả định tính kháng khuẩn và kháng nấm 42

DANH MỤC PHỤ LỤC

PHỤ LỤC 1

Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 1 Phổ UV sản phẩm 1

Phổ IR sản phẩm 1 Phổ 1H-NMR sản phẩm 1 Phổ 13C-NMR sản phẩm 1 Phổ MS sản phẩm 1

PHỤ LỤC 2

Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 2 Phổ UV sản phẩm 2

Phổ IR sản phẩm 1 Phổ 1H-NMR sản phẩm 2 Phổ 13C-NMR sản phẩm 2 Phổ MS sản phẩm

PHỤ LỤC 3

Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 3 Phổ UV sản phẩm 3

Phổ IR sản phẩm 1 Phổ 1H-NMR sản phẩm 3 Phổ 13C-NMR sản phẩm 3 Phổ MS sản phẩm 3

PHỤ LỤC 4

Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 4a Phổ UV sản phẩm 4a

Phổ IR sản phẩm 1 Phổ 1H-NMR sản phẩm 4a Phổ 13C-NMR sản phẩm 4a Phổ MS sản phẩm 4a

PHỤ LỤC 5

Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 4b Phổ UV sản phẩm 4b

Phổ IR sản phẩm 1 Phổ 1H-NMR sản phẩm 4b Phổ MS sản phẩm 4b

PHỤ LỤC 6

Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 4c Phổ UV sản phẩm 4c

Phổ IR sản phẩm 1 Phổ 1H-NMR sản phẩm 4c Phổ MS sản phẩm 4c

PHỤ LỤC 7

Kết quả định tính sản phẩm 1-4c trên các chủng vi khuẩn Kết quả định tính của sản phẩm 1-4c trên chủng vi nấm

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được cuốn khóa luận với đề tài “Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng

khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất 6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol”, bên cạnh

sự nỗ lực của bản thân đã vận dụng những kiến thức tiếp thu được, tìm tòi học hỏi cũng như thu thập tài liệu liên quan đến đề tài, em luôn nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và bạn bè

Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới cô ThS Phùng Thị Thu

Thủy đã hết lòng quan tâm, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn

thành tốt khóa luận này

Ngoài ra, trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện đề tài em còn nhận được nhiều sự quan tâm, góp ý, hỗ trợ quý báu của quý thầy cô ở bộ môn Hóa Dược Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Thầy Hồ Dũng Mạnh, Thầy Huỳnh Văn Thống, Thầy Kim Ngọc Sơn, Thầy Hoàng Viết Nhâm

Em xin cảm ơn: Cô Huỳnh Thị Anh Thư đã chăm lo dụng cụ, hóa chất, hết lòng giúp

đỡ em hoàn thành tốt khóa luận này

Em cũng biết ơn sự quan tâm và ủng hộ của gia đình Đó chính là nguồn động viên tinh thần rất lớn để em theo đuổi và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng mình xin gửi lời cảm ơn đến các bạn cùng làm khóa luận tại bộ môn Hóa dược, phòng I – 505 cơ sở 6 trường Đại học Lạc Hồng những người bạn đã hết lòng giúp

đỡ cùng tôi chia sẻ khó khăn, gắn bó trong suốt khoảng thời gian này

Trong quá trình thực hiện khóa luận, em còn nhiều thiếu sót và hạn chế, kính mong sự chỉ dẫn và đóng góp của các thầy cô giáo để khóa luận của em được hoàn thiện hơn

Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học – Năm học: 2019 – 2020 TỔNG HỢP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT 6-BROMO-4,5-DIMETHYLBENZOTHIAZOL

Võ Thị Trúc Ly Giáo viên hướng dẫn: ThS Phùng Thị Thu Thủy

Mở đầu và đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, benzothiazol và các dẫn chất đã và đang thu hút sự chú ý của các nhà khoa học trên khắp thế giới do chúng có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau Các dẫn chất của benzothiazol có tác dụng ngăn ngừa ung thư, chống khuẩn lao, chống

oxy hóa, chống viêm, chống ký sinh trùng như Euglena gracilis, đặc biệt khả năng kháng khuẩn như Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae và kháng nấm như Candida albicans, Aspergillus niger Các dẫn chất nhân benzothiazol trong những năm

qua không ngừng được quan tâm phát triển không chỉ trong tổng hợp những chất mới

mà còn nghiên cứu các đặc tính lý hóa, tìm hiểu cơ chế và cải tiến phương pháp tổng hợp Trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu

“Tổng hợp và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất dimethylbenzothiazol” với mục đích nghiên cứu tổng hợp những dẫn chất benzothiazol

4,5-với hy vọng tạo ra những chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tiềm năng

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Đối tượng: dẫn chất 6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol Phương pháp nghiên cứu:

– Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp nhằm chọn ra các chất

có tác dụng tốt

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự ra đời của kháng sinh là một bước ngoặt lớn của y học, giúp giảm thiểu đáng kể tỷ

lệ mắc bệnh và tử vong do nhiễm khuẩn Tuy nhiên việc lạm dụng kháng sinh đã gây ra tình trạng kháng kháng sinh ngày càng nghiêm trọng và trở thành vấn đề mang tính toàn cầu Hiện nay các thế hệ thuốc kháng sinh mới đang được nghiên cứu, nhưng hiệu quả chưa thực sự tốt Nhiều loại kháng sinh hiện đang dùng vẫn là các loại kháng sinh được

sử dụng từ thế kỷ 20 và đã bị đề kháng khá nhiều Đáng báo động, sự phát triển của các

chủng vi khuẩn đa kháng thuốc như Staphylococcus aureus đề kháng methicillin,

Escherichia coli [3], [12] ; đặc biệt là Staphylococcus aureus xuất hiện trong bệnh viện

và các bệnh nhiễm khuẩn cộng đồng đã đặt ra thách thức trong việc tìm ra các liệu pháp mới để điều trị Sự gia tăng các chủng vi khuẩn đa đề kháng trong bối cảnh nghiên cứu phát triển kháng sinh mới ngày càng hạn chế làm cho việc điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn ngày càng khó khăn và nguy cơ không còn kháng sinh để điều trị nhiễm khuẩn

trong tương lai [8] Do đó, ngoài việc sử dụng kháng sinh hợp lý thì nghiên cứu tổng

hợp các kháng sinh mới, có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm mạnh là một trong những

ưu tiên cấp bách hiện nay

Dị vòng benzothiazol có mặt trong nhiều hoạt chất đã được nghiên cứu các tác dụng dược lý khác nhau được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược như kháng ung thư [20], [48], [51], trị bệnh Alzheimer [28], kháng viêm và giảm đau [17], [45], [51], kháng HIV [37], chống oxy hóa, động kinh, tiểu đường, sốt rét, lao, trầm cảm, kháng histamin và nhiều tác dụng khác [32], [37], [43] Đáng chú ý, các dẫn chất benzothiazol còn có khả

năng kháng khuẩn, kháng nấm khá tốt trên các chủng: Pseudomonas aeruginosa,

Enterobacter, Staphylococcus aureus, Escherichia coli… và Candida albicans, Aspergillus niger… [15], [29], [42]

Các nghiên cứu về dị vòng benzothiazol trên thế giới khá đa dạng, tuy nhiên tình hình nghiên cứu trong nước về dị vòng benzothiazol và đặc biệt là nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm vẫn còn hạn chế Đáng lưu ý có các nghiên cứu về nhóm dẫn chất 2-acetamidobenzothiazol của nhóm tác giả Phùng Thị Thu Thủy, Trương Thị Ngọc Lâm, Trương Phương năm 2018 [13] và nhóm dẫn chất 6-cloro-2hidrazinylbenzothiazol của nhóm tác giả Phạm Hoàng Duy Nguyên, Huỳnh Văn Thống, Trương Phương năm 2019

[11] Chính vì các lí do trên mà chúng tôi chọn đề tài: “Tổng hợp và khảo sát hoạt tính

kháng khuẩn, kháng nấm của một số dẫn chất 6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol”

với mục đích tổng hợp những dẫn chất chứa nhân 6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol

với hy vọng tạo ra những chất có hoạt tính mạnh

Để thực hiện mục đích trên, chúng tôi đề ra các mục tiêu cụ thể như sau:

2.1.2 Cơ chế tác động

– Tác động trên thành tế bào vi khuẩn: β-lactam, vancomycin, bacitracin, D-cycloserin

– Tác động trên màng sinh chất: polymycin, amphotericin B, nystatin

– Ức chế tổng hợp acid nucleic: quinolon, sulfamid, fluoroquinolon

– Ức chế tổng hợp protein: aminosid, macrolid, cyclin, tetracyclin [12], [14]

2.1.3 Đề kháng kháng sinh

2.1.3.1 Định nghĩa

Sự đề kháng là vi khuẩn không bị tiêu diệt, không bị ức chế bởi sự điều trị kháng khuẩn

Sự đề kháng có thể là tự nhiên (hiện diện trước khi tiếp xúc với thuốc) hoặc mắc phải (phát triển sau khi tiếp xúc với thuốc) Đó là do sự biến đổi sinh hóa của nhóm vi khuẩn làm cho mục tiêu phân tử của kháng sinh trở nên ít nhạy cảm hơn hoặc là dẫn đến sự hấp thu kháng sinh vào trong tế bào bị giảm

Kháng kháng sinh là một hệ quả của sử dụng kháng sinh, đặc biệt trong trường hợp lạm dụng kháng sinh, sử dụng kháng sinh không hợp lý dẫn đến phát triển vi sinh vật đột biến hoặc có gen kháng thuốc [12], [14]

2.1.3.2 Cơ chế đề kháng kháng sinh

Vi khuẩn đề kháng kháng sinh theo một số cơ chế:

– Tiết men hủy kháng sinh: β-lactamase

– Thay đổi sự vận chuyển kháng sinh

– Biến đổi cấu trúc đích

– Phosphoryl hóa, acetyl hóa, glycosyl hóa… [12], [14]

2.1.3.3 Tình hình đề kháng kháng sinh trên thế giới

Số liệu nghiên cứu giám sát ANSORP từ tháng 1/2000 đến tháng 6/2001 của 14 trung

tâm từ 11 nước Đông Nam Á cho thấy tỷ lệ kháng cao của vi khuẩn Streptococcus

pneumoniae Trong số 685 chủng vi khuẩn S pneumoniae phân lập được từ người bệnh,

có 483 (52,4%) chủng không còn nhạy cảm với penicillin, 23% ở mức trung gian và 29,4% đã kháng với penicillin (MIC ≥ 2mg/l) Kết quả phân lập vi khuẩn cho thấy tỷ lệ kháng penicillin ở Việt Nam cao nhất (71,4%) tiếp theo là Hàn Quốc (54,8%), Hồng Kông (43,2%) và Đài Loan (38,6%) Tỷ lệ kháng erythromycin cũng rất cao, ở Việt Nam

là 92,1%, Đài Loan là 86%, Hàn Quốc là 80,6%, Hồng Kông là 76,8% và Trung Quốc

là 73,9% Số liệu từ nghiên cứu giám sát đa trung tâm đã chứng minh rõ ràng về tốc độ

và tỷ lệ kháng của S pneumoniae tại nhiều nước châu Á, những nơi có tỷ lệ mắc bệnh

nhiều nhất thế giới [4]

Theo số liệu nghiên cứu KONSAR từ 2005-2007 ở các bệnh viện Hàn Quốc cho thấy

Staphylococcus aureus kháng Methicillin (MRSA) 64%; Klebsiella pneumoniae kháng

cephalosporin thế hệ 3 là 29%; Escherichia coli kháng fluoroquinolone 27%,

Pseudomonas aeruginosa kháng 33%, Acinetobacter spp kháng 48%; P aeruginosa

kháng amikacin 19%, Acinetobacter spp kháng 37% Enterococcus faecium kháng vancomycin và Acinetobacter spp kháng imipenem tăng lên dần Tỷ lệ kháng phát hiện tại các phòng xét nghiệm của E coli và K pneumoniae đối với cephalosporin thế hệ 3

và P aeruginosa đối với imipenem cao hơn trong bệnh viện [5]

2.1.3.4 Tình hình đề kháng kháng sinh ở Việt Nam

Tình trạng kháng kháng sinh ở Việt Nam đã ở mức độ cao Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các căn nguyên kháng thuốc Châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức

độ kháng penicillin cao nhất (71,4%) và kháng erythromycin (92,1%) 75% các chủng

pneumococci kháng với 3 loại kháng sinh trở lên Tình trạng kháng phổ biến ở các vi

khuẩn Gram-âm (enterobacteriaceae) Theo kết quả nghiên cứu công bố năm 2009 cho thấy 42% các chủng enterobacteriaceae kháng với ceftazidime, 63% kháng với

gentamicin và 74% kháng với nalidixic acid Tỉ lệ kháng cao này được ghi nhận ở người khỏe mạnh trong cộng đồng Do tỉ lệ kháng cao, nhiều liệu pháp kháng sinh được khuyến cáo trong các tài liệu hướng dẫn điều trị đã không còn hiệu lực Mặc dù khó đánh giá một cách định lượng nhưng rõ ràng thực trạng kháng kháng sinh đã, đang và sẽ gây ra những tác động tiêu cực đối với ngành y tế và kinh tế Việt Nam [9]

Thực trạng này là hậu quả tất yếu của mức độ sử dụng kháng sinh cao cả trên người và trong nông nghiệp, mà đa phần là tình trạng sử dụng không hợp lý Theo báo cáo của

một nghiên cứu dựa trên cộng đồng tiến hành năm 1999, 78% kháng sinh được mua từ các nhà thuốc tư mà không có đơn 67% khách hàng tham khảo tư vấn của nhân viên bán thuốc trong khi 11% tự quyết định về việc sử dụng kháng sinh Chỉ có 27% số nhân viên bán thuốc có kiến thức về sử dụng kháng sinh và kháng kháng sinh Mặc dù có các qui chế và các tài liệu hướng dẫn về kháng sinh, việc bán kháng sinh không có đơn vẫn

là tình trạng diễn ra phổ biến ở Việt Nam Theo một nghiên cứu khác tại cộng đồng năm

2006 cho thấy tình trạng sử dụng kháng sinh không cần thiết trong điều trị nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp thể nhẹ ở trẻ dưới năm tuổi tại khu vực nông thôn Việt Nam 63% trẻ nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp thể nhẹ đã được điều trị với kháng sinh Trong khi kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp, sự ảnh hưởng của nó đối với mức độ kháng kháng sinh của các tác nhân gây bệnh trên người còn chưa rõ ràng ở Việt Nam cũng như các nước khác trên thế giới

2.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ BENZOTHIAZOL VÀ DẪN CHẤT 2.2.1 Công thức chung

Năm 1887, thiazol lần đầu tiên được mô tả bởi Hamtzsch và Waber Popp xác định cấu trúc của vòng thiazol vào năm 1889

Đánh số trên vòng thiazol bắt đầu từ nguyên tố lưu huỳnh

Benzothiazol là hệ thống vòng thơm ngưng tụ Benzothiazol chứa một vòng benzen được kết hợp với một vòng thiazol tại vị trí 4, 5 của thiazol, 2 vòng này tạo nên cấu trúc căn bản 1,3-benzothiazol [51]

Danh pháp benzothiazol theo IUPAC là 1,3-benzothiazol

2.2.2 Tính chất lý hóa benzothiazol

2.2.2.1 Tính chất vật lý

Benzothiazol là một chất lỏng không màu, hơi nhớt có nhiệt độ nóng chảy 2 °C, nhiệt

độ sôi 227-228 °C, khối lượng riêng 1,238 g/ml (25 °C) và khối lượng phân tử 135,19 g/mol Rất tan trong ether, tan trong aceton và ít tan trong nước [15], [16]

Phản ứng với tác nhân ái nhân

Khi cho benzothiazol tác dụng với tác nhân nucleophil mạnh như sodamid, nguyên tử H

ở vị trí carbon số 2 trên vòng benzothiazol sẽ bị thay thế bởi tác nhân này [46]

Phản ứng thế bởi nucleophil xảy ra nhanh hơn nếu tại vị trí carbon số 2 của vòng benzothiazol cũng có một nucleophil [46]

Muối alkylbenzothiazolium phản ứng với các tác nhân nucleophil mạnh hơn so với benzothiazol Trong môi trường kiềm, muối 3-, 2-alkylbenzothiazolium mở vòng thiazol do tác nhân nucleophil (OH-) tấn công vào vị trí carbon số 2 tạo ra một pseudobase không bền [46]

2.2.3 Phương pháp tổng hợp benzothiazol

Guo và các cộng sự đã chứng minh sự ngưng tụ đồng nhất acid của 2-aminothiophenol

và dẫn chất aldehyd, xúc tác H2O2 / HCl trong ethanol ở nhiệt độ phòng [23]

Mortimer và các cộng sự đã tổng hợp phenylbenzothiazol bằng phản ứng của aminothiophenol và các chất benzaldehyd trong ethanol (EtOH) [31]

2-Sattler và đồng sự đã tổng hợp yl]metanol từ sự ngưng tụ của hydroxymethylfurfural (HMF) và 2-aminobenzenethiol khi có acid acetic (AcOH) [38]

[5-(2,3-dihydro-1,3-benzothiazol-yl)oxolan-Maleki và cộng sự đã phát triển một phương pháp tổng hợp các dẫn chất

2-arylbenzothiazol từ ngưng tụ 2-aminothiophenol với aldehyd thơm bằng cách sử dụng amoni clorid làm chất xúc tác trong metanol/nước (15:1) hệ dung môi kép ở nhiệt độ phòng [27] Ưu điểm chính của phản ứng này là sử dụng amoni clorid, một loại thuốc thử rẻ tiền và có sẵn Các nghiên cứu so sánh đã sử dụng các dung môi hữu cơ khác

nhau như cloroform, ethanol, acetonitril, dicloromethan và nước Tuy nhiên, methanol/nước là hệ dung môi tốt nhất về hiệu suất

Xue và các đồng sự đã thực hiện phản ứng ngưng tụ các ceton thơm đơn giản với các dẫn chất anilin bằng cách sử dụng NaSH.nH2O và CuO/CuI cùng với bazơ (Cs2CO3)

và 1,10-phenanthrolin trong dimethyl sulfoxid (DMSO) ở 120 °C để tổng hợp các dẫn chất 2-acylbenzothiazol [49]

Hugerschoff đã tổng hợp 2-aminobenzothiazol bằng cách cho dẫn chất của anilin đóng vòng với KSCN trong brom và cloroform tạo ra 2-aminobenzothiazol [25]

Pd/C được sử dụng làm chất xúc tác để tổng hợp các dẫn chất benzothiazol thông qua

phản ứng ngưng tụ của các dẫn chất o-iodothiobenzanilid ở nhiệt độ phòng [50]

Một phản ứng ba thành phần của nitroaren, rượu và bột lưu huỳnh đã tổng hợp các chất benzothiazol thế ở vị trí số 2 với hiệu suất tốt thông qua khử nitro, ngưng tụ CN và hình thành liên kết CS [35]

Allen đã sử dụng natri thiocyanat và đóng vòng các dẫn chất thế p-anilin thành các dẫn

chất thế ở vị trí 6 của 2-aminobenzothiazol với xúc tác acid sulfuric [19]

2.2.4 Tác dụng sinh học các dẫn chất benzothiazol

2.2.4.1 Kháng khuẩn, kháng nấm Sreenivasa và cộng sự đã tổng hợp và nghiên cứu cho các hoạt động kháng khuẩn, kháng

nấm một số dẫn chất 6-fluoro-7-(R)-(2-N-p-anilinosulfonamido)benzothiazol (với R=

o-nitroanilino, m-nitroanilino, p-nitroanilino, o-cloroanilino, m-cloro , dimethylamino)

Tất cả các hợp chất có khả năng chống lại S aureus, S albus và C ablicans [20],

Ojha và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp và thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn của các

dẫn chất pyrazolin khác nhau của benzothiazolylcarboxamido Dẫn chất mang nhóm thế

R = CH3 và R1 = o-OCH3C6H4, không cho tác dụng khuẩn trên các chủng thử nghiệm

Dẫn chất mang nhóm thế R = Cl và R1 = p-OCH3C6H4, cho tác dụng trên S aureus Tất

cả các dẫn chất còn lại cho tác dụng trên S aureus, E coli, Pseudomonas aeruginosa,

Klebsiella pneumoniae và Proteus mirabilis [33]

Bhawsar và cộng sự đã tổng hợp một số dẫn chất (benzothiazol-2'-yl)aminomethyl đồng

thời kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn chống lại S aureus, E coli và kháng nấm chống lại

Alternaria brassicicola, Fusarium udam Tất cả các hợp chất đều cho hoạt tính kháng

khuẩn, kháng nấm [18]

2.2.4.2 Kháng ung thư Kashiyama và cộng sự đã tổng hợp 2-(4’-aminophenyl)benzothiazol cho kết quả tốt

trong các thử nghiệm in-vitro chống lại các dòng tế bào MCF-7 và MDA-468 của khối

u vú nhạy cảm Gắn nhóm thế methyl hoặc halogen vào vị trí 3'-phenyl giúp tăng cường hiệu lực và mở rộng phổ tác dụng cho một số dòng tế bào đại tràng, phổi, khối u ác tính trên thận và buồng trứng [25]

Hutchinson và cộng sự đã tổng hợp 2-(4’-amino-3’-methylphenyl)-5-fluorobenzothiazol

có tiềm năng trong các thử nghiệm in-vitro chống lại các dòng tế bào ung thư vú và

tuyến tiền liệt [24]

Schnur C Rodney và cộng sự đã tổng hợp

N-(5’-fluorobenzothiazol-2’-yl)-2-guanidinothiazol-4-carboxamid điều trị ung thư phổi Lewis [40]

2.2.4.3 Chống co giật Rana và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất (benzothiazol-2-yl)benzamid, đánh giá về hoạt tính chống co giật, độc tính thần kinh, nghiên cứu tác dụng ức chế thần kinh trung ương và các nghiên cứu độc tính khác [36]

Singh và cộng sự đã tổng hợp và kiểm tra hoạt tính chống co giật của một số dẫn chất

2-(4-arylthiosemicarbazidocarbonylthio)benzothiazol trên chuột và thấy rằng tất cả các hợp chất đều có hoạt tính chống co giật có thể đo được [41]

2.2.4.6 Thuốc hạ đường huyết

Moreno-Díaz tổng hợp các dẫn chất N-(6-R-1,3-benzothiazol-2-yl)benzensulfonamid

cho hoạt tính chống đái tháo đường [30]

Patil và cộng sự tổng hợp và thử khả năng điều trị đái tháo đường của các dẫn chất 3-(benzo[d]thiazol-2-yl)aminophenylprop-2-en [47]

(E)-2.2 4.7 Ức chế enzym Greco Micheal N đã tổng hợp benzothiazolhydroxyure là chất ức chế enzym 5-lipoxygenase xúc tác sự chuyển hóa acid arachidonic thành leukotrien A4 [22]

2.2.4.8 Kháng lao

Shieke V G tổng hợp các dẫn chất 2-(arylamino)-5R1-6R2-benzothiazol cho hoạt tính kháng lao [17]

2.2.4.9 Hoạt tính chống oxy hóa

Tzanova và cộng sự tổng hợp hiệu quả của ba loại thuốc nhóm mới có chứa benzothiazol

Khả năng chống oxy hóa được đánh giá in-vitro trên ba dòng tế bào (MCF7 gây ung

thư, tế bào động vật có vú HTERT-HME1 không ung thư và tế bào cardiomyoblastic

H9c2) với tác nhân oxy hóa là tert-butyl hydroperoxide (tBHP) [44]

2.3 PHƯƠNG PHÁP KIỂM ĐỊNH VÀ XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC

Kiểm nghiệm và xác định cấu trúc sản phẩm là bước quan trọng trong nghiên cứu tổng hợp các chất mới, đây là cơ sở chứng minh kết quả thu được là phù hợp với lý thuyết,

và cần sự phối hợp của rất nhiều phương pháp Hiện nay, với sự tiến bộ của khoa học

kỹ thuật hiện đại, người ta có thể phối hợp nhiều phương pháp khác nhau để xác định

độ tinh khiết và cấu trúc của các chất tổng hợp như quang phổ tử ngoại, hồng ngoại, cộng hưởng từ hạt nhân, khối phổ…

2.3.1 Phương pháp vật lý

Nếu chất tổng hợp là chất rắn thì việc xác định nhiệt độ nóng chảy là một tiêu chuẩn để kiểm tra độ tinh khiết của chất đó Nếu tạp chất xuất hiện thì dù ít hay nhiều đều làm thay đổi khoảng nóng chảy

Đối với những chất có điểm chảy được ghi trong tài liệu thì việc đối chiếu giữa điểm chảy xác định được với điểm chảy trong tài liệu có thể giúp đánh giá sơ bộ về độ tinh khiết của hợp chất đang nghiên cứu [16]

2.3.2 Phương pháp hóa học

Các phản ứng hóa học đặc trưng giúp xác định thành phần các nhóm chức, cấu trúc đặc trưng có trong sản phẩm tổng hợp Từ đó có thể xác định được sơ bộ cấu trúc chất đang nghiên cứu [16]

2.3.3 Phương pháp sắc kí

Sắc ký là một công cụ góp phần đắc lực trong nghiên cứu Ngoài việc xác định độ tinh khiết của một chất tổng hợp, sắc ký còn có ý nghĩa trong định tính, định lượng, tách các chất trong một hỗn hợp

Có nhiều phương pháp sắc ký thông dụng khác nhau như sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy, sắc ký cột, sắc ký khí,

Trong đó, sắc ký lớp mỏng thường được sử dụng nhất trong nghiên cứu tổng hợp do có nhiều ưu điểm như có thể áp dụng rộng rãi trong nhiều trường hợp chất khác nhau, nhanh

và rẻ tiền, dễ thực hiện, thời gian tiến hành ngắn [10]

2.3.4 Phương pháp phổ

2.2.4.1 Quang phổ hồng ngoại IR

Phổ hồng ngoại là một phương pháp góp phần đắc lực vào việc nghiên cứu cấu trúc của chất tổng hợp Về bản chất, phổ hồng ngoại là phổ động quay của các phân tử hay của các nhóm chức có trong phân tử tạo nên các đỉnh hấp thu đa dạng và đặc trưng Do đó, việc sử dụng phổ hồng ngoại trong định tính bằng cách so sánh với chất chuẩn là khá chính xác Đối với các chất tổng hợp mới chưa có chất chuẩn thì phổ hồng ngoại cũng góp phần xác định phần nào các nhóm chức có trong công thức bằng các dao động đặc trưng [1]

2.3.4.2 Quang phổ tử ngoại UV

Phổ tử ngoại là phương pháp để định tính và định lượng một cách nhanh chóng, chính xác Bản chất của phổ tử ngoại là phổ điện tử vì năng lượng ở vùng tử ngoại có thể gây

ra thay đổi năng lượng của các điện tử Phổ tử ngoại cho bởi các hợp chất có liên kết

p-л, л-л nên nó chỉ sử dụng cho các hợp chất có nối đôi, nối ba, nối đôi liên hợp là chủ yếu Ứng dụng chủ yếu của phổ tử ngoại là để định lượng Tuy nhiên vẫn có thể dùng phổ tử ngoại để phân tích định tính một chất vì hệ số hấp thu và cực đại hấp thu của phổ tử ngoại là hai hằng số quan trọng có tính đặc trưng cho mỗi chất [1]

2.3.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ NMR (1H, 13C, 19F, 31P…) cho phép xác định cấu trúc phân tử (công thức khai triển

và cấu trúc lập thể) Trong đó, phổ 1H-NMR và 13C-NMR thường được sử dụng nhất trong việc xác định cấu trúc các chất tổng hợp [1], [7]

2.3.4.4 Khối phổ MS

Khối phổ (mass spectometry - MS), khác với các kỹ thuật quang phổ, không dùng các bức xạ điện từ Đây là một kỹ thuật đo trực tiếp tỉ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí của phân tử hoặc nguyên tử của mẫu Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (1 đơn vị khối lượng nguyên tử bằng 1/12 khối lượng của cacbon 12C) hoặc bằng 1 dalton (1 dalton Da bằng khối lượng của nguyên

Nó cung cấp thông tin định tính (khối lượng phân tử, nhận dạng các chất) xác định cấu trúc và định lượng các chất [1],[6]

2.4 XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHẤT TỔNG HỢP 2.4.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn

2.4.1.1 Định tính hoạt tính kháng khuẩn chất thử nghiệm

Nguyên tắc: phương pháp khuếch tán trên thạch

Môi trường: TSA hay Mueller-Hinton Chuẩn bị vi khuẩn: có 2 phương pháp

Phương pháp tăng sinh

Lấy 3 - 5 khóm vi khuẩn tinh khiết chuyển vào 4 - 5 ml môi trường thích hợp (Tryptic Soy Broth, Mueller-Hinton ), ủ ở 35 oC trong 2 - 6 giờ hoặc cho đến khi độ đục lớn hơn hay bằng 0,5 đơn vị Mcfacland Hiệu chỉnh về độ đục 0,5 Mcfacland tương đương lượng vi khuẩn 1 - 2 x 108 CFU/ml (CFU: coloni forming unit) Xác định độ đục bằng

đo quang ( = 625 nm, A = 0,08 - 0,10) hay soi trực tiếp trên nền trắng có 1 vạch đen với chuẩn Mcfacland 0,5

Phương pháp trực tiếp

Chọn ngẫu nhiên khóm đã ấp 16 - 24 giờ trên thạch treo vào nước muối sinh lý hay Tryptic Soy Broth Sau đó hiệu chỉnh độ đục để được 0,5 Mcfacland

Cấy vi khuẩn: dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch treo vi khuẩn 0,5 Mcfacland; sau

đó trải đều trên mặt thạch, mở nắp hộp 2 - 3 phút cho khô mặt thạch

Đặt kháng sinh: đặt đĩa giấy hoặc đục lỗ trong thạch

Đọc kết quả: quan sát sự hiện diện vùng ức chế quanh chỗ đặt thuốc thử, nếu có thì kết

quả dương tính (chất thử nghiệm có hoạt tính kháng khuẩn) [2]

và phải tính toán phức tạp

Phương pháp đục lỗ

Với phương pháp này cần phải thăm dò để tìm ra một dung dịch đệm và môi trường để thuốc khuếch tán tốt Phương pháp này đòi hỏi thời gian và kinh nghiệm

Pha loãng trong môi trường lỏng

Trong một dãy các ống nghiệm có chứa môi trường đã được pha sẵn chất thử nghiệm ở những nồng độ khác nhau, dùng pipet vô khuẩn để đưa vi khuẩn thử nghiệm vào Đem

ấp ở 37 oC trong vòng 18-24 giờ Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng Phương pháp này có ưu điểm là nhanh gọn, chính xác, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được đối với chất tan được trong nước

Pha loãng trên bản thạch

Chất thử nghiệm được pha loãng ở các nồng độ khác nhau trong môi trường nuôi cấy có chứa thạch đã được hấp tiệt trùng, đổ vào hộp petri, chờ thạch đông Tiếp tục dùng micropipet lấy một lượng vi khuẩn theo qui định đưa lên bản thạch ở những vị trí đã được đánh dấu sẵn Đem ấp ở 37 oC trong vòng 18-24 giờ Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ ức chế vi khuẩn trên bản thạch Phương pháp này thích hợp cho những chất khó tan trong nước [2]

Các phương pháp: tương tự phần kháng khuẩn

Các chủng vi nấm thực hiện trong thử nghiệm:

- Candida albicans

CHƯƠNG 3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các dẫn chất 6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol được tổng hợp từ nguyên liệu đầu là 2,3-dimethylanilin 2,3-Dimethylanilin phản ứng với kali thiocyanat trong môi trường

acid tạo 2,3-dimethylphenylthioure (1), sản phẩm này đóng vòng với natri bromid bão

hòa trong dung dịch acid sulfuric đậm đặc, đồng thời thế brom vào nhân thơm tạo các

dẫn chất 2-amino-6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol (2) Tiếp theo, (2) phản ứng với

cloroacetyl clorid tạo thành các dẫn chất

N-(6’-bromo-4’,5’-dimethylbenzothiazol-2’-yl)-2-cloroacetamid (3) Cuối cùng, (3) phản ứng các amin dị vòng no tạo ra các dẫn

chất N-(6’-bromo-4’,5’-dimethylbenzothiazol-2’-yl)- 2-(X)acetamid (4a-4c), theo sơ

đồ dưới:

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất 6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol 3.2 NGUYÊN LIỆU – TRANG THIẾT BỊ

3.2.1 Nguyên liệu

3.2.1.1 Nguyên liệu dùng trong tổng hợp và tinh chế

– 2,3-dimethylanilin, kali thiocyanat, acid hydrocloric, natri bromid, acid sulfuric đậm đặc, natri carbonat, cloroacetyl clorid, dung dịch ammoniac

– Amin dị vòng no: morpholin, phenylpiperazin, 4-methylpiperidin

– Dung môi hữu cơ: ethanol 96%, methanol, aceton

3.2.1.2 Nguyên liệu dùng trong kiểm nghiệm

– Iod, bản mỏng tráng sẵn Kieselgel 60 F254 của Merk

– Các dung môi chạy sắc ký: cloroform, ethyl acetat, aceton, n-hexan

3.2.1.3 Nguyên liệu thử vi sinh

- Các chủng vi khuẩn dùng trong thử nghiệm

Gram dương: Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Bacillus subtilis

Gram âm: Escherichia coli, Salmonella, Shigella

- Các chủng nấm dùng trong thử nghiệm

Nấm men: Candida albicans

- Môi trường thử nghiệm Tryptic Soy Agar, Tryptic Soy Broth

3.2.2 Dụng cụ và trang thiết bị

3.2.2.1 Trang thiết bị dùng trong tổng hợp và tinh chế

– Các dụng cụ thủy tinh dùng trong tổng hợp hóa học: bình cầu, bercher, cổ nối hai nhánh, pipet, ống đong, ống nghiệm

– Máy khuấy từ gia nhiệt, cá từ, bếp điện

– Máy hút chân không, phễu buchner, sinh hàn

3.2.2.2 Trang thiết bị dùng trong kiểm nghiệm

– Bình khai triển sắc kí, ống mao quản, đèn soi UV

– Máy đo điểm chảy tự động Kruss

– Máy đo quang phổ tử ngoại UV-Vis LABOMED

– Máy đo quang phổ hồng ngoại IR: FTIR TENSOR 27 – BRUKER – GERMANY – Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker 500 MHz

– Máy khối phổ Bruker Compass Data Analysis 4.0, Shimadzu LC/MS

3.2.2.3 Trang thiết bị dùng trong thử nghiệm vi sinh

– Đĩa petri, ống nghiệm, eppendorf, que cấy, đèn cồn, bông không thấm nước – Pipet, micropipet, đầu col vàng, trắng, xanh

– Tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ hấp, bếp cách thủy, bếp điện, máy đo độ đục Novaspec Plus

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Tổng hợp dẫn chất benzothiazol

Như đã trình bày ở phần tổng quan, vòng benzothiazol có thể tổng hợp từ nhiều phản ứng đi từ những nguyên liệu khác nhau nhưng trong khuôn khổ khóa luận này, chúng tôi chọn phương pháp tổng hợp trung gian 2,3-dimethylphenylthioure sau đó đóng vòng 2- amino-6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol

- Phương pháp tinh chế Sản phẩm 2,3-dimethylphenylthioure kém tan trong nước, tan trong ethanol nên kết tinh lại sản phẩm trong hỗn hợp ethanol và nước Hòa tan sản phẩm trong một lượng vừa đủ hỗn hợp ethanol – nước (1:1) nóng Lọc nóng, tẩy màu bằng than hoạt, kết tinh trong điều kiện lạnh Lọc, sấy khô sản phẩm

3.3.1.2 Tổng hợp các dẫn chất 2-amino-6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol

2,3-Dimethylphenylthioure đóng vòng với natri bromid bão hòa trong dung dịch acid sulfuric đậm đặc, đồng thời thế brom vào nhân thơm tạo các dẫn chất 2-amino-6-bromo-4,5-dimethylbenzothiazol Việc tạo brom mới sinh khi cho acid sulfuric đậm đặc tác

dụng với dung dịch natri bromid bão hòa sẽ tránh việc sử dụng brom lỏng trực tiếp, do

đó tránh gây nguy hiểm cho người thực hiện phản ứng

- Cơ chế phản ứng

-Các yếu tố ảnh hưởng Dung môi: trong phản ứng đóng vòng, acid sulfuric vừa đóng vai trò môi trường cho phản ứng xảy ra vừa hòa tan 2,3-dimethylphenylthioure

-Phương pháp tinh chế Sản phẩm thu được ở dạng muối, kiềm hóa để tạo thành dạng base không tan trong nước, lọc lấy tủa

Sản phẩm tan trong ethanol, không tan trong nước nên tinh chế lại sản phẩm trong hỗn hợp ethanol và nước

3.3.1.3 Tổng hợp dẫn chất

N-(6’-bromo-4’,5’-dimethylbenzothiazol-2’-yl)-2-cloroacetamid Acetyl hóa 2-amino-6-bromo-4,5-dimetylbenzothiazol bằng tác nhân cloroacetyl clorid Cloroacetyl clorid là một tác nhân acetyl hóa mạnh, phản ứng xảy ra nhanh

Đây là phản ứng thế ái nhân Cặp điện tử tự do của nitơ làm cho amin có tính base và

có tính ái nhân Do vậy, amin phản ứng thế ái nhân với cloroacetyl clorid, là chất có trung tâm ái điện tử

- Các yếu tố ảnh hưởng Cloroacetyl clorid là tác nhân acetyl hóa mạnh, tuy nhiên dễ bị thủy phân, đồng thời phản ứng sinh ra HCl, dùng Na2CO3 làm tác nhân phản ứng thu hồi HCl mới sinh Phản ứng cần diễn ra trong môi trường khan

Nhiệt độ càng tăng thì tốc độ phản ứng càng tăng, tuy nhiên nhiệt độ cao quá có thể phá

3.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc

3.3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết

Sắc ký lớp mỏng

Mục đích sắc ký lớp mỏng: Kiểm tra sơ bộ độ tinh khiết của sản phẩm

Pha tĩnh là bản mỏng tráng sẵn Kieselgel 60 F254 (Merk)

- Mẫu thử Dịch mẫu thử được hòa tan trong dung môi thích hợp, có nồng độ khoảng 2 mg/ml chấm khoảng 5 µl

Vết chấm:

1 Nguyên liệu

2 Sản phẩm

- Phát hiện Soi dưới đèn UV – Vis ở bước sóng 254 nm

Sử dụng thuốc thử iod

Hình 3.1 Cách chấm sắc kí

- Dung môi khai triển Tùy thuộc vào tính chất và độ phân cực khác nhau của từng sản phẩm mà lựa chọn

3 hệ dung môi khác nhau để khai triển sắc ký Quãng đường dung môi khai triển là

7 cm, trong bình bão hòa dung môi, ở nhiệt độ phòng

Chất thử được xem là tinh khiết khi Rf của sản phẩm trên sắc kí đồ khác Rf của nguyên liệu và không có vết lạ trên cả 3 hệ dung môi đã chọn

3.3.2.2 Xác định thông số đặc trưng – Xác định nhiệt độ nóng chảy

Do các sản phẩm trung gian và các sản phẩm cuối đều là chất rắn nên tiến hành xác định nhiệt độ nóng chảy

– Phổ tử ngoại (UV) Hòa tan mẫu đo vào dung môi hòa tan ở nồng độ thật loãng (khoảng 10 ppm) Tiến hành

đo song song với mẫu trắng

– Sắc ký lớp mỏng – giá trị Rf 3.3.2.3 Xác định cấu trúc – Phổ tử ngoại (UV)

Sử dụng phương pháp quét phổ với bước sóng từ 200-400 nm

– Quang phổ hồng ngoại IR

Đo trên máy FTIR TENSOR 27 – BRUKER

Sau đây là đỉnh đặc trưng của một số nhóm chức chính có trong cấu trúc của các dẫn chất 4,5-dimethylbenzothiazol

Bảng 3.1 Đỉnh hấp thu đặc trưng của các dẫn chất

500 MHz

– Khối phổ (MS)

Các sản phẩm sẽ được xác định khối lượng phân tử bằng máy khối phổ Bruker Compass Data Analysis 4.0 hay máy Shimadzu LC/MS

3.3.3 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

3.3.3.1 Định tính hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm

- Nguyên tắc: Phương pháp đục lỗ

- Chuẩn bị môi trường

Vi khuẩn: Môi trường TSA (Tryptycase Soy Agar)

Vi nấm: Môi trường SDA (Sabouraud Dextrose Agar)

- Chuẩn bị vi sinh vật Đối với vi khuẩn: phân lập trên môi trường TSA, ủ ở nhiệt độ 37 °C trong 12 giờ, lấy một khóm vi khuẩn cho vào môi trường TSB hoạt hóa trong 4 giờ Sau đó điều chỉnh mật độ vi khuẩn 107 CFU/ml

Đối với nấm men: phân lập trên môi trường SDA, ủ ở nhiệt độ 35 °C trong 48 giờ Lấy một khóm nấm men cho vào nước muối sinh lý và điều chỉnh mật độ vi nấm là 107

CFU/ml

- Tiến hành Môi trường sau khi pha được hấp vô trùng bằng hơi nước ở 121 oC trong 2 giờ

Môi trường được đổ đều vào đĩa petri vô trùng, để cho thạch đông tự nhiên

Dùng que bông vô trùng nhúng vào dịch treo vi sinh vật, sau đó trải đều trên bề mặt thạch

Đục lỗ có đường kính 5 mm trên bản thạch

Cân 3,8 mg mẫu thử cho vào eppendorf, thêm 1484 ml DMSO hòa tan, sau đó hút lấy

39 µl cho vào eppendort, rồi thêm 960µl DMSO 10% làm loãng, rồi bơm vào lỗ trong hộp petri, để khô tự nhiên

Ủ ở 35 oC trong 48 giờ đối với nấm mem, 37 oC trong 12 giờ đối với vi khuẩn, đọc kết

quả

Hình 3.2 Phương pháp khuếch tán trên thạch

3.3.3.2 Xác định MIC MIC (Minimum Inhibitory Concentration) là nồng độ tối thiểu ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn, vi nấm quan sát được bằng mắt thường

- Nguyên tắc Phương pháp pha loãng trên bản thạch

- Môi trường

Vi khuẩn: Môi trường Hirn-Herz-Agar

Vi nấm: Môi trường Mueller – Hinton bổ sung Glucose

Chuẩn bị vi khuẩn Thử tác dụng trên vi khuẩn theo thứ tự và được pha loãng đến nồng độ 107 CFU/ml

1 Candida albicans

Tiến hành – Chất thử được hòa tan trong DMSO đạt nồng độ cao gấp 100 lần nồng độ thử nghiệm cao nhất Pha loãng trong môi trường lỏng sao cho nồng độ của DMSO nhỏ hơn 1% – Pha loãng thành dãy chất thử nghiệm có nồng độ giảm dần từ 512, 256, 128, 64, 32,

16, 8, 4, 2 µg/ml

– Cấy vi khuẩn, vi nấm: dùng micropipet chấm 1,5 µl đối với vi khuẩn, 2 µl đối với vi nấm đưa lên bản thạch ở những vị trí đã được đánh dấu sẵn

– Ủ vi khuẩn ở 37 oC trong vòng 24 giờ Vi nấm ở 35 oC trong 48 giờ

– Đọc kết quả, tiến hành so với mẫu chứng chỉ chứa môi trường, không có chất thử nghiệm và một mẫu chứa DMSO là dung môi pha chất thử nghiệm

- Đọc kết quả – Đọc kết quả bằng mắt thường: soi đĩa petri dưới ánh sáng, nhìn từ trên xuống, bề mặt thạch ở vị trí cấy vi khuẩn đục thì ở đó có vi khuẩn phát triển, bề mặt thạch trong là

không có vi khuẩn phát triển MIC là nồng độ thấp nhất ức chế sự phát triển của vi khuẩn

– Để đánh giá hoạt tính của một chất là mạnh hay không thì cần phải so sánh với MIC chuẩn của một kháng sinh đã được biết đến trên chủng vi khuẩn, vi nấm thử nghiệm

3.4 AN TOÀN LAO ĐỘNG

Trong quá trình thực hiện các phản ứng tổng hợp cần phải tuân thủ các qui định về

an toàn lao động Một số hóa chất sử dụng cho phản ứng như 2,3-dimethylanilin, acid hydrocloric, acid sulfuric, dung dịch cloroacetyl clorid là các chất lỏng độc và

ăn mòn, gây kích ứng với da, mắt và niêm mạc; có thể gây ung thư, tổn thương gan, phổi Do đó, cần hạn chế tiếp xúc trực tiếp với hóa chất độc hại, các phản ứng phải được thực hiện trong tủ hút, quá trình thao tác cần có đầy đủ các trang bị bảo hộ lao động như găng tay, khẩu trang, kính bảo hộ

Mặt khác, không được tiến hành phản ứng tổng hợp khi chỉ có cá nhân trong phòng thí nghiệm để đề phòng trường hợp tai nạn xảy ra có người tiếp cứu

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

4.1 KẾT QUẢ TỔNG HỢP HÓA HỌC 4.1.1 Tổng hợp dẫn chất 2,3-dimethylphenylthioure

a Tổng hợp

- Nguyên liệu 2,3-Dimethylanilin, kali thiocyanat, acid hydroclorid đậm đặc, ethanol

- Dụng cụ Bình cầu, bếp từ, sinh hàn, bercher, pipet, cá từ, nồi cách thủy

Hình 4.1 Thiết bị tổng hợp 2,3-dimethylphenylthioure

- Tiến hành Cho 11 ml 2,3-dimethylanilin (0,09 mol), 7,5 ml acid hydrocloric đậm đặc và 24 ml nước cất vào bình cầu 2 cổ 100 ml Lắp ráp hệ thống sinh hàn, khuấy từ cho nguyên liệu tan hoàn toàn

Cho vào bình phản ứng 26,19 g KSCN (0,27 mol) đã được hòa tan trong 15 ml nước, đun cách thủy trong 8 giờ ở 75 – 85 oC, để qua đêm, tủa xuất hiện

Lọc lấy tủa, rửa tủa kĩ bằng nước cất Sấy khô Thu được 10,62 g sản phẩm, hiệu suất 65,56%

- Tinh chế

Hòa tan tủa thô trên trong một lượng tối thiểu hỗn hợp ethanol – nước (1:1) đun sôi, tẩy màu bằng than hoạt Lọc nóng, để lạnh sản phẩm sẽ kết tinh dạng tinh thể Lọc lấy tinh thể, sấy ở 60 oC

- Lưu ý khi tiến hành phản ứng Kiểm soát nhiệt độ trong khoảng từ 75 – 85 oC và lượng acid HCl không quá dư vì sẽ gây ra sự polymer hóa (sản phẩm sẽ có màu vàng) và giảm hiệu suất

Nếu cho không đủ lượng muối KSCN sẽ không tạo tủa

b Tính chất Tinh thể trắng, óng ánh, không mùi Hơi tan trong nước, tan tốt trong methanol, ethanol

và một số dung môi hữu cơ khác như aceton, cloroform, ethylacetat

c Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc

- Nhiệt độ nóng chảy Sản phẩm thu được có nhiệt độ nóng chảy là 188,9 oC, khác so với nguyên liệu đầu là 2,3-dimethylanilin (3,5 oC) Điều này chứng tỏ phản ứng đã xảy ra và tạo thành sản phẩm mới

- Sắc ký lớp mỏng Vết chấm

1 2,3-dimethylanilin trong aceton

2 Sản phẩm 1 trong aceton

Hệ dung môi khai triển: sử dụng các hệ 1, 2 và 3

Phát hiện: soi UV ở bước sóng 254 nm

0,82 0,41

0,44 0,25

0,80 0,57

Hình 4.2 Sắc ký lớp mỏng sản phẩm 1

Nhận xét: trên sắc ký đồ, sản phẩm 1 cho một vết duy nhất có Rf khác với Rf của nguyên liệu ở cả ba hệ dung môi, chứng tỏ có sự khác biệt về cấu trúc và sản phẩm 1 sau khi tinh chế đã tinh khiết

- Phổ tử ngoại Sản phẩm được pha loãng trong ethanol có λmax ở bước sóng 243 nm

- Phổ hồng ngoại (Kết quả xem bảng 4.2, và phụ lục 1)