Đặ t v ấn đề
Sắc tố melanin quyết định màu sắc của da, tóc, màng nhầy và võng mạc mắt, được sản xuất bởi các tế bào melanocytes ở lớp đáy thượng bì Melanin có tác dụng bảo vệ da khỏi tia cực tím UV từ mặt trời và được chia thành hai loại: Eumelanin, có màu đen hoặc nâu sẫm, giúp bảo vệ da khỏi tia UV, và Pheo-melanin, hay melanin đỏ, thường xuất hiện ở người có làn da trắng hoặc tóc đỏ, không có khả năng bảo vệ chống lại tia UV và có thể tạo ra gốc tự do gây hại cho da Tỷ lệ hai loại sắc tố này khác nhau ở mỗi cá nhân, ảnh hưởng đến màu da tự nhiên và độ rám nắng khi tiếp xúc với ánh nắng mặt trời.
Sắc tố da hình thành qua bốn giai đoạn phức tạp Đầu tiên, tia cực tím và các chất trung gian sinh học kích thích quá trình tạo sắc tố Tiếp theo, melanin được sản xuất bởi melanocytes Sau đó, melanin được phân phối qua hai lớp biểu bì da Cuối cùng, sắc tố melanin di chuyển đến bề mặt da thông qua sự đổi mới liên tục của các tế bào trong lớp biểu bì.
Nám da và sạm đen là dấu hiệu bệnh lý do sự gia tăng melanin trên da Để điều trị, nhiều người sử dụng hóa chất ức chế enzyme tyrosinase, nhưng việc này có thể gây tác dụng phụ và một số hóa chất đã bị cấm ở nhiều quốc gia Do đó, các hoạt chất chiết xuất từ dược liệu có khả năng ức chế tyrosinase đang được quan tâm vì hiệu quả làm trắng da và tính an toàn Các chiết xuất từ vi tảo như Endarachne binghamiae, Schizymenia dubyi, Ecklonia cava, Sargassum silquastrum và Scenedesmus obliquus đã chứng minh được hiệu quả này.
2 minh hoạt động ức chế tyrosinase mạnh mẽ tương tự như acid arbutin đối chứng
Nghiên cứu và phát triển thuốc ức chế tyrosinase là một quá trình tốn kém về thời gian và chi phí, với tỷ lệ thất bại cao Do đó, nghiên cứu này áp dụng phương pháp tính toán và mô phỏng phân tử (invitro silico) trên ba chủng vi tảo Spirulina Platensis để sàng lọc các hợp chất ức chế enzyme tyrosinase, nhằm giảm thiểu chi phí và thời gian tìm kiếm hợp chất tiềm năng.
M ục đích và yêu cầu đề tài
M ục đích của đề tài
Khảo sát và đánh giá khả năng ức chế enzyme tyrosinase từ ba loại cao chiết vi tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5.
Yêu c ầ u c ủa đề tài
Tách chiết thu cao chiết từ ba chủng vi tảo Spirulina platensis: S.platensis 1,
Nghiên cứu đánh giá thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ ba chủng vi tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5.
Ý nghĩa đề tài
Ý nghĩa khoa họ c
Sàng lọc và phát hiện các loại vi tảo có khả năng ức chế enzyme tyrosinase là bước quan trọng để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo, chẳng hạn như phát triển kem trắng sáng da.
Ý nghĩa thự c ti ễ n
Dựa vào kết qủa nghiên cứu để lựa chọn một số loại vi tảo làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm làm kem làm trắng da
Gi ớ i thi ệ u v ề enzyme tyrosinase
Khái ni ệ m và ngu ồ n g ố c c ủ a enzyme tyrosinase trong t ự nhiên
Enzyme tyrosinase (EC 1.14.18.1), hay còn gọi là enzyme polyphenol oxidase (PPO), là một enzyme monooxygenase chứa đồng, tham gia vào quá trình chuyển hóa melanin bằng cách hydroxyl hóa monophenol thành O-diphenol và oxi hóa O-diphenol thành O-quinon O-quinon sau đó tham gia vào các phản ứng để tạo thành melanin Nghiên cứu đã chỉ ra sự hiện diện của enzyme này trong mô động vật và thực vật, xúc tác quá trình oxy hóa từ tyrosine đến melanin và các sắc tố khác Trong thực vật, tyrosinase gây ra màu nâu không mong muốn khi tiếp xúc với không khí, như ở khoai tây Enzyme này có mặt trong các tế bào sắc tố da, đặc biệt là trong melanosome, và gen TYR mã hóa cho tyrosinase ở người.
Hình 2.1 Cấu trúc của enzyme tyrosinase
Tyrosinase có nhiều nguồn gốc và đặc tính cấu trúc đa dạng trong tự nhiên, dẫn đến việc không có loại protein chung nào được tìm thấy ở tất cả các loài Sự khác biệt này thể hiện qua cấu trúc chính, kích thước, vị trí hoạt động và cơ chế glycosyl hóa Tuy nhiên, tất cả các tyrosinase đều có tâm đồng loại III chứa hai nguyên tử đồng, mỗi nguyên tử được kết nối với sáu phân tử histidine tại vị trí hoạt động.
Enzyme tyrosinase đã được phân lập và tinh chế từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm thực vật, động vật, nấm và vi sinh vật Trong số đó, tyrosinase từ nấm như Agaricus bisporus, Neurospora crassa và Lentinula edodes là nguồn chính và rẻ, có tính tương đồng cao với tyrosinase của người Cấu trúc, chức năng và đặc điểm sinh hóa của tyrosinase nấm đã được nghiên cứu rộng rãi, phục vụ cho việc sàng lọc các chất ức chế và nghiên cứu tạo hắc tố Tyrosinase từ Agaricus bisporus, được phân lập lần đầu bởi Bourquelot và Bertrand năm 1895, có ba miền và hai vị trí liên kết đồng, tương tác với oxy trong vị trí hoạt động Ngoài ra, tyrosinase cũng được thu nhận từ các vi khuẩn như Rhizobium và Pseudomonas maltophilia, cũng như từ thực vật như nho Monastrell và hoa hướng dương.
Vai trò và ứ ng d ụ ng c ủ a enzyme tyrosinase
Ứng dụng y tế / lâm sàng
Tyrosinase là enzyme quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin trong các melanosome, tạo ra sắc tố cho da, tóc và mắt ở động vật có vú, đồng thời giúp bảo vệ cơ thể khỏi tác hại của tia UV.
UV đóng vai trò quan trọng trong phản ứng miễn dịch và quá trình chữa lành vết thương ở thực vật, động vật không xương sống và bọt biển Tyrosinase có ý nghĩa trong việc hình thành bào tử và bảo vệ sự tồn tại của các mô sau tổn thương ở nấm, đồng thời đóng vai trò thiết yếu trong việc bảo vệ vi khuẩn.
Các ứng dụng y tế quan trọng bao gồm tổng hợp melanin cho mục đích điều trị, sản xuất
L-DOPA, một loại thuốc được sử dụng để điều trị bệnh Parkinson, sản xuất lincomycin kháng sinh và điều trị các bệnh thần kinh khác nhau tyrosinase nấm có ứng dụng lâm sàng để điều trị bệnh bạch biến Là tiền chất trong xét nghiệm miễn dịch và vi phân giải kháng thểđể sản xuất L-DOPA (Ali Nawaz và cs (2017)
Ngành công nghiệp thực phẩm
Tyrosianse tạo ra hydroxyl tyrosol, được sử dụng làm phụ gia thực phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong sản xuất theaflavin, một hợp chất trong trà đen có tác dụng chống ung thư Các chất tạo màng sinh học đang được phát triển với các đặc tính cụ thể, trong đó khả năng tạo gel và kết cấu của thịt là rất quan trọng cho sản phẩm thịt Sự kết dính của protein cơ do nhiệt ảnh hưởng lớn đến kết cấu sản phẩm cuối cùng Trong chế biến sữa, việc liên kết chéo các protein sữa cũng rất cần thiết Các tyrosinase như transglutaminase, laccase và tyrosinase đã được áp dụng để cải thiện các đặc tính gel hóa của protein trong thịt lợn và gà (Ali Nawaz và cs., 2017).
Khử nhiễm phenol bằng tyrosinase
Các ngành công nghiệp như giấy, hóa chất, dệt may, khai thác mỏ, than đá và dầu mỏ thải ra nước chứa phenol và các dẫn xuất của nó Tyrosinase có khả năng oxy hóa phenol thành các chất không hòa tan, có thể được loại bỏ qua kết tủa hoặc lọc Các hợp chất phenolic trong nước có thể được hấp phụ vào than hoạt tính dạng hạt Tyrosinase cũng là chất khử độc cho các xenobiotics có cấu trúc phenol, trong đó chlorophenol là một chất ô nhiễm đáng chú ý Ngành công nghiệp da, dệt, dược phẩm và giấy sản xuất nhiều loại thuốc nhuộm, chủ yếu là thuốc nhuộm azo, gây hại cho môi trường Dưới những điều kiện nhất định, chúng có thể bị vi khuẩn khử màu và sau đó phân hủy bởi tyrosinase.
6 chất nhũ hóa và sản xuất thực phẩm ít chất béo hơn và ít calo hơn Làm cảm biến sinh học để phát hiện hợp chất phenolic độc hại
Các polyme tự nhiên có thể được liên kết chéo bằng tyrosinase từ nấm, tạo ra các polyme mới với các đặc tính quan trọng cho nhiều lĩnh vực, bao gồm chế biến thực phẩm Tyrosinase cho phép ghép các hợp chất cụ thể với chất tạo màng sinh học, dẫn đến sản phẩm sinh học mới Phương pháp này giúp chuyển đổi sản phẩm phụ từ chế biến thực phẩm thành các mặt hàng thân thiện với môi trường, đồng thời cung cấp các đặc tính chức năng giá trị Ngoài ra, tyrosinase còn có khả năng chuyển đổi L-tyrosine thành L-DOPA và sau đó thành o-dopaquinone, mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng.
S ự hình thành enzyme tyrosinase trong t ự nhiên và hình thành s ắ c t ố da ở ngườ i
Sắc tố da Melanin, được hình thành từ tyrosinase - một acid amin trong tế bào sắc tố Melanocyte ở tầng thượng bì, quyết định màu sắc của da, tóc và mắt Melanin đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ da khỏi tác hại của tia UV từ ánh nắng mặt trời, giúp giảm thiểu nguy cơ tổn thương cấu trúc DNA và ung thư da Tuy nhiên, sự tích tụ Melanin cũng có thể dẫn đến các vấn đề như nám, sạm và thâm trên da.
Quy trình hình thành Melanin được chia làm ba bước, trong đó enzyme tyrosinase đóng vai trò hết sức quan trọng
Bước 1: Enzyme tyrosinase được kích hoạt dưới tác dụng của ánh nắng mặt trời, tổn thương vật lý, hormone, stress
Sau khi enzyme Tyrosinase được kích hoạt, nó sẽ khởi động quá trình sản xuất melanin trong melanosome, một phần của tế bào sắc tố, thông qua ba phản ứng hóa học.
Acid amin tyrosine⟶DOPA⟶Dopaquinone⟶Melanin (Pheo-melanin hay EU-melanin)
Bước 3: Melanin từ melanasome qua tế bào keratinocyce và đưa lên trên bề mặt da, tạo thành những vùng sạm, nám hoặc vết thâm
Sự hình thành melanin bị ảnh hưởng bởi yếu tố nội tiết và thần kinh, dẫn đến việc sắc tố da phụ thuộc vào cơ địa và điều kiện sinh lý của từng người.
Hình 2.2 Cơ chế tổng hợp melanin hình thành sắc tố da và vai trò của enzyme tyrosinase xảy ra trong melanosome
Sự hình thành vết nám và tàn nhang là do sự tích lũy melanin, sản phẩm chuyển hóa từ enzym tyrosinase, dưới tác động của tia UV từ ánh nắng mặt trời Tia UV kích hoạt tế bào melanocyte, dẫn đến tăng sản xuất melanin, gây ra các vết nám và tàn nhang trên da Khi melanin tích lũy quá mức, da sẽ trở nên không đồng nhất về màu sắc, ảnh hưởng đến thẩm mỹ Ngăn chặn hoặc loại bỏ melanin tích lũy dưới da sẽ giúp da trở nên sáng hơn, quá trình này được gọi là làm trắng sáng da.
Cơ chế này khác với việc làm trắng da nhanh chóng bằng các loại kem có tính axit mạnh, vì chúng chỉ tẩy lột da mà không ức chế sự hình thành melanin từ bên trong Do đó, lớp da mới sẽ tiếp tục bị nám sau một thời gian.
Lạm dụng kem làm sáng da có thể gây hại cho da, dẫn đến lão hóa không thể phục hồi và rối loạn tổng hợp melanin, gây ra tàn nhang và loang lổ màu da khó điều trị.
Hình 2.3 Sự hình thành các mảng sắc tốda dưới tác dụng của tia UV và enzyme tyrosinase
(Jean-Yves Berthon và cs, 2017)
Cơ chế ho ạt độ ng c ủ a enzyme tyrosinase
Cơ chế hoạt động của enzyme tyrosianse gồm ba giai đoạn:
Trong giai đoạn đầu, enzyme tyrosinase kết hợp với cơ chất thông qua các liên kết yếu, tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (E-S) không bền nhờ liên kết hydrogen Sự liên kết này làm thay đổi cấu hình không gian của cơ chất, dẫn đến sự biến đổi động năng và thế năng, giúp phân tử cơ chất trở nên linh hoạt hơn và tham gia phản ứng một cách dễ dàng.
Giai đoạn tiếp theo xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sựkéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng
Giai đoạn cuối cùng enzyme tyrosinase xúc tác lên cơ chất tạo thành sản phẩm, enzyme tyrosinase được giải phóng dưới dạng tự do.
Ảnh hưở ng c ủ a ch ấ t ứ c ch ế đế n ho ạt độ ng c ủ a enzyme tyrosinase
Chất ức chế enzyme là các phân tử liên kết với enzyme, làm giảm hoạt động của chúng Tốc độ phản ứng của enzyme sẽ bị giảm do tác động của các chất ức chế đặc hiệu, khi chúng kết hợp với enzyme và ngăn cản enzyme tương tác bình thường với cơ chất.
Các dạng chất kìm hãm thuận nghịch
Chất kìm hãm thuận nghịch liên kết với enzyme thông qua các liên kết phi đồng hóa trị như liên kết hydro, tương tác hydrophobic và liên kết ion Các liên kết yếu này tạo ra kiểu liên kết đặc thù giữa chất kìm hãm và trung tâm hoạt động của enzyme Khác với cơ chất và chất kìm hãm không thuận nghịch, chất kìm hãm thuận nghịch không tham gia vào phản ứng hóa học với enzyme và có thể dễ dàng bị loại bỏ bởi chất pha loãng hoặc chất thẩm tách Có ba kiểu ức chế thuận nghịch với các đặc điểm động học khác nhau: ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh và ức chế không cạnh tranh.
Các chất ức chế cạnh tranh kết hợp thuận nghịch với trung tâm hoạt động của enzyme, cạnh tranh với cơ chất để chiếm giữ trung tâm này Khi trung tâm hoạt động bị chất ức chế chiếm giữ, enzyme không thể kết hợp với cơ chất Sự kết hợp giữa chất ức chế cạnh tranh I và enzyme E tương tự như sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất, mặc dù chất ức chế không được chuyển hóa thành sản phẩm.
Hằng số phân ly Ki của phức hệ EI là:
Ki Hình 2.4 Sơ đồ chất kìm hãm cạnh tranh: cơ chất(S) và chất kìm hãm (I)
(GS.TS Mai Xuân Lương, 2005)
Đặc điểm của ức chế cạnh tranh là nó có cùng điểm cắt trục tung (1/Vmax) như phản ứng không ức chế Tuy nhiên, độ nghiêng của nó khác với phản ứng không ức chế do giá trị 1 + [I]/Km.
Là đồ thị có dạng tương tự: y = ax+ b
(GS.TS Mai Xuân Lương, 2005)
Đồ thị dưới đây minh họa rằng khi nồng độ của S cao, phản ứng ít bị ức chế Ngược lại, khi nồng độ của S giảm, mức độ ức chế tăng lên, tương ứng với các giá trị [I]/[S] và Kim.
Hình 2.6 Đồ thịđảo ngược kép mô tả các kiểu ức chế phản ứng enzyme
(GS.TS Mai Xuân Lương, 2005)
(a): ức chế competive, (b): ức chế uncompetitive, (c): ức chế noncompetitive
Km và Vmax được xác định thông qua độ dốc và các điểm cắt của phản ứng không ức chế, trong khi Ki được xác định từ độ dốc và/hoặc điểm cắt của phản ứng bị ức chế Ức chế không cạnh tranh kiểu thứ I (noncompetitive inhibition) là một khái niệm quan trọng trong nghiên cứu enzyme.
Trong trường hợp này, mức độ ức chế không liên quan đến nồng độ cơ chất mà chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế Khác với chất ức chế cạnh tranh, sự hình thành phức hợp enzyme-inhibitor (EI) diễn ra tại vị trí không phải nơi enzyme tiếp xúc với cơ chất.
CảEI và ESI đều là những phức hệ không hoạt động Có hai hằng số phân ly:
Các chất ức chế noncompetitive, như Ki EI và Ki ESI, không tác động trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme Thay vào đó, chúng gắn vào một vị trí khác trên phân tử enzyme, gây ra sự thay đổi hình dạng đáng kể Điều này ngăn cản trung tâm hoạt động kết hợp bình thường với cơ chất.
Nhiều hợp chất kết hợp không thuận nghịch với enzyme, tạo ra các dẫn xuất đồng hóa trị tại trung tâm hoạt động hoặc tại các bộ phận khác của phân tử không tham gia trực tiếp vào tương tác enzyme - cơ chất Những hợp chất này không phải là chất ức chế noncompetitive theo nghĩa chặt chẽ, vì chúng ức chế enzyme một cách không thuận nghịch Chẳng hạn, papain có một nhóm thyol duy nhất tại trung tâm hoạt động và phản ứng nhanh chóng với iodoacetate để tạo ra nhóm S-carboxylmethylcystein.
Mức độ ức chế papain bởi chất ức chế tỷ lệ thuận với mức độ S-carboxymethyl hóa Iodoacetate ức chế một số enzyme chứa nhóm thiol không tại trung tâm hoạt động, làm suy yếu hoạt tính xúc tác bằng cách biến đổi cấu trúc của phân tử enzyme Đây là một ví dụ về ức chế không cạnh tranh kiểu thứ II.
Kiểu ức chế này xảy ra khi chất ức chế chỉ kết hợp thuận nghịch với phức hệ ES để tạo ra ESI, nhưng không thể tạo ra sản phẩm Các chất ức chế noncompetitive có khả năng kết hợp với cả enzyme tự do và phức hệ ES.
Độ ng h ọ c ph ả n ứ ng enzyme tyrosinase
Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a n ồng độ enzyme đế n t ốc độ chuy ển hóa cơ
Trong điều kiện dư thừa cơ chất, khi nồng độ cơ chất [S] lớn hơn nhiều so với nồng độ enzyme [E], tốc độ phản ứng sẽ phụ thuộc vào nồng độ enzyme Công thức mô tả mối quan hệ này là V = K[E], có dạng y = ax Do đó, người ta có thể xác định nồng độ enzyme [E] thông qua việc đo tốc độ phản ứng mà enzyme đó xúc tác.
Trong nhiều trường hợp, trong môi trường có chứa chất ức chế hoặc hoạt hóa, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác không phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme [E].
Hình 2.7 Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E]
Nghiên c ứ u ảnh hưở ng c ủ a n ồng độ cơ chấ t
Ta khảo sát trường hợp đơn giản nhất chỉ một cơ chất với:
S: Cơ chất k1: Tốc độ chuyển hóa tạo ra phúc chất (ES) và ngược lại k2: Tốc độ chuyển hóa phúc chất (ES) tạo ra (E) và (P)
Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.
Gọi V-1là vận tốc của phản ứng tạo phân ly phức chất ES tạo thành E và S.
Gọi V2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm).
Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có: k-1[ES]+k2[ES] = k1[E][S]
Gọi E 0 là nồng độ ban đầu:
Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có: (k-1+k2)[ES] = k1([E0]-[ES]) [S]
(Km: gọi là hằng số Michelis Menten)
Mặt khác vận tốc phản ứng tạo thành sản phẩm P là:
Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:
Nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng lớn, và vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất.
Vmax= k2[E0] Thay vào phương trình (4) ta được:
Phương trình (5) gọi là phương trình Michelis Menten
Km là hằng số Michelis Menten, đặc trưng cho mỗi enzyme và thể hiện ái lực của enzyme với cơ chất Giá trị Km càng nhỏ, ái lực của enzyme với cơ chất càng lớn, dẫn đến vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác cũng tăng cao.
Hình 2.8 Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độcơ chất
(GS.TS Mai Xuân Lương, 2005)
Khi nồng độ chất nền [S] tăng, tốc độ phản ứng V cũng tăng theo Tuy nhiên, khi [S] đạt đến một giá trị nhất định, tốc độ phản ứng V sẽ đạt giá trị tối đa Vmax và không còn tăng thêm nữa, ngay cả khi nồng độ [S] tiếp tục được tăng lên.
Các ch ấ t ứ c ch ấ t enzyme tyrosinase
Các nguồn tự nhiên như thực vật, vi khuẩn và nấm đang thu hút sự chú ý ngày càng nhiều do khả năng ức chế enzyme tyrosinase của chúng thông qua việc sản sinh các hợp chất sinh học có hoạt tính.
Phenolic compounds are the largest group of phytochemicals found in plants and play a crucial role in the activities of plant extracts Numerous studies have investigated the tyrosinase inhibitory activities of various plant extracts to discover new sources of anti-tyrosinase compounds Notable examples include the reported anti-tyrosinase activities of species such as Asphodelus microcarpus, Morus nigra L, Greyia radlkoferi Szyszyl, and Limonium tetragonum, among others Additionally, research has highlighted the tyrosinase inhibitory effects of 91 native plants from central Argentina, including Achyrocline satureioides and Artemisia verlotiorum Furthermore, plants from the Moraceae family, including the genera Morus, Artocarpus, and Broussonetia, have also shown significant potential in inhibiting tyrosinase activity.
(Chlorophora) và Ficus đã cho thấy sự ức chế tyrosinase in vitro Ngoài ra, chiết xuất etanolic và metanolic của một số cây khác như Ardisia elliptica Thunb,
Phyllanthus acidus (L.) Skeels, Rhinacanthus nasutus L Kurz (IC50 = 271.50 µg/ml), and Arbutus andrachne L (IC50 = 1 mg/ml) exhibit significant inhibition of tyrosinase activity, along with Withania somnifera L Dunal, Solanum nigrum L., Pulmonaria officinalis, Centarium umbellatum, and Bauhinia vahlii Among these plant extracts, Hypericum laricifolium Juss, Taraxacum officinale F.H.Wig (IC50 = 290.4 µg/ml), and Muehlenbeckia vulcanica Meisn (IC50 = 280.1 µg/ml) demonstrate the highest anti-tyrosinase activity (Samaneh Zolghadri et al., 2019).
Various fungi, including Aspergillus sp, Trichoderma sp, Paecilomyces sp, Phellinus linteus, Daedalea dickinsii, and Dictyophora indusiata, along with the liquid culture of Neolentinus lepideus, have been reported as new sources of tyrosinase inhibitors through the production of bioactive compounds Additionally, there are reports of tyrosinase inhibitors derived from certain marine fungi, such as Myrothecium sp., isolated from algae.
Pestalotiopsis sp Z233 has been studied for its potential to inhibit tyrosinase activity Additionally, there are reports highlighting the tyrosinase-inhibiting effects of various bacterial species and their metabolites, including Streptomyces sp.
Chẳng hạn như S hiroshimensis TI-C3 được phân lập từ đất, một actinobacterium tên là Streptomyces swartbergensis sp Nov và Streptomyces roseolilacinus NBRC
Vi khuẩn 12815 được xác định là nguồn tiềm năng có khả năng ức chế enzyme tyrosinase Ngoài ra, một số chất ức chế tyrosinase cũng đã được phát hiện từ vi khuẩn biển gram âm Thalassotalea sp.
Pp2-459 là một chủng vi khuẩn lam độc hại, Oscillatoria agardhii Một số chế phẩm sinh học như Lactobacillus sp đã được nghiên cứu và chứng minh là nguồn ức chế tyrosinase tự nhiên Các nghiên cứu cho thấy hoạt động sinh lý của chất chiết xuất lên men cao hơn đáng kể so với chất chiết xuất chưa lên men, đồng thời hoạt tính gây độc tế bào của chúng thấp hơn Gần đây, bốn chủng vi khuẩn acid lactic khác nhau được phân lập từ phân bò sữa cũng đã được xác nhận có khả năng ức chế tyrosinase (Samaneh Zolghadri và cộng sự, 2019).
Ngoài các nguồn ức chế enzyme tyrosinase tự nhiên, còn tồn tại các chất ức chế tyrosinase tổng hợp Những chất này được sử dụng để loại bỏ melanin tại các vùng da bị tăng sắc tố.
Công nghệ laser màu có thể gây tổn thương hoặc bong tróc da, mặc dù nó dựa trên nguyên tắc “Phân hủy quang nhiệt chọn lọc” để phá hủy melanin với ít tổn thương hơn Tuy nhiên, cần cải tiến để giảm thiểu tác động không mong muốn và thời gian phục hồi da Bên cạnh đó, nhiều người cũng sử dụng các hợp chất hóa học để tẩy lớp da cũ nhằm loại bỏ melanin tích lũy, nhưng việc sử dụng kem tẩy trắng da có thể dẫn đến hiện tượng bạch tạng cục bộ hoặc loang màu không thể phục hồi Do đó, nhiều nghiên cứu đã tìm kiếm các hợp chất hiệu quả để làm trắng sáng da.
Sử dụng tretinoin ở nồng độ thấp có hiệu quả trong việc điều trị rối loạn sắc tố da Tuy nhiên, sản phẩm này chỉ nên được áp dụng vào ban đêm và cần tránh ánh nắng mặt trời, vì tretinoin rất nhạy cảm với tia UV, có thể làm tăng độ mẫn cảm của da và dẫn đến tình trạng sạm da nghiêm trọng hơn.
Hydroquinone là một chất được sử dụng lâu năm để ức chế enzyme tyrosinase, từ đó giảm tổng hợp melanin Nồng độ thường thấy của hydroquinone là 2% và 4%, hoặc kết hợp với Tretinoin 0,05% – 0,1% để điều trị tăng sắc tố hiệu quả Tuy nhiên, việc sử dụng hai chất này có thể gây ra nhiều tác dụng phụ, bao gồm nguy cơ ung thư da, dẫn đến việc cấm lưu hành các sản phẩm chứa hydroquinone tại Châu Âu Ở Mỹ, FDA cho phép sử dụng hydroquinone với nồng độ dưới 2%, trong khi tại một số nước châu Á như Nhật Bản và Hàn Quốc, nồng độ dưới 4% vẫn được chấp nhận Tại Việt Nam, nhiều loại kem chứa hydroquinone với nồng độ 2% đang có mặt trên thị trường.
Acid arbutin là một hợp chất an toàn và hiệu quả trong công nghệ làm trắng da, được sử dụng thay thế cho Hydroquinone Mặc dù tác động của nó không mạnh mẽ như hydroquinone, nhưng arbutin không gây tác dụng phụ và cần thời gian để thấy được kết quả Về mặt hóa học, phân tử arbutin bao gồm gốc hydroquinone kết hợp với glucose.
Arbutin an toàn và phù hợp với nhiều loại da, nhờ vào nguồn gốc tự nhiên của nó từ chiết xuất cây dâu tằm và quả việt quất.
Axit kojic, một sản phẩm phụ từ quá trình sản xuất rượu sake truyền thống của Nhật Bản, có khả năng làm trắng da nhờ vào việc ức chế enzyme tyrosinase Mặc dù axit kojic mang lại hiệu quả làm sáng da, nhưng nó không bền và dễ bị phân hủy dưới ánh sáng mặt trời, dẫn đến việc khó duy trì hoạt tính sau thời gian bảo quản lâu Hiện tại, tác dụng phụ của axit kojic vẫn chưa được làm rõ và còn gây tranh cãi, nhưng nó vẫn là thành phần quan trọng trong nhiều sản phẩm mỹ phẩm làm trắng da.
Acid azelaic, tương tự như acid kojic, là một thành phần có nguồn gốc từ ngũ cốc như lúa mì, lúa mạch đen và lúa mạch Khi được sử dụng trong các loại kem chăm sóc da với nồng độ cao, acid azelaic có tác dụng điều trị các rối loạn da như trứng cá và làm sáng da Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng acid azelaic có khả năng ức chế enzyme tyrosinase, góp phần vào hiệu quả làm sáng da.
Ứ ng d ụ ng ch ấ t ứ c ch ế enzyme tyrosinase
Trên thị trường hiện nay, có nhiều sản phẩm làm đẹp với các loại kem dưỡng trắng da chứa thành phần hoạt tính khác nhau Những sản phẩm này thường bao gồm các hợp chất như acid arbutin, acid kojic, và flavonoid từ cây dâu tằm, giúp làm đều màu da và ngăn chặn sự hình thành melanin Chúng không chỉ làm mờ các vùng da sạm màu mà còn cung cấp độ ẩm sâu và toàn diện cho làn da Ngoài ra, các hợp chất flavonoid còn có khả năng hấp thu tia UV, bảo vệ da khỏi tác hại của ánh nắng mặt trời.
Ánh nắng mặt trời có thể gây ra nhiều tác hại cho da, nhưng các hợp chất dẫn xuất từ vitamin B, C, E có khả năng ngăn ngừa gốc tự do và chống oxy hóa, giúp làm mờ sắc tố và mang lại làn da trắng sáng Đặc biệt, chiết xuất từ hoa anh đào đã được chứng minh có tác dụng cải thiện tình trạng nám da và tàn nhang bằng cách ức chế enzyme tyrosinase và tế bào melanona B16, từ đó ngăn chặn sự hình thành hắc sắc tố melanin Sản phẩm tinh chất dưỡng trắng da Naris Nature Whitening Serum Nhật Bản kết hợp chiết xuất hoa anh đào và tinh chất trà xanh, giúp làm sáng da, ngừa nám sạm, đồng thời cung cấp độ ẩm, mang lại làn da tươi sáng và rạng rỡ.
Các nghiên c ứ u v ề sàng l ọ c các ch ấ t ứ c ch ế enzyme tyrosinase
Nghiên c ứ u ho ạt độ ng ứ c ch ế enzyme tyrosinase t ừ t ả o lam
Vấn đề lão hóa và sạm da đang trở thành mối quan tâm lớn trong lĩnh vực thẩm mỹ Từ xưa, con người đã sử dụng nhiều hợp chất tự nhiên để điều trị các đốm da không mong muốn Hiện nay, xu hướng sử dụng sản phẩm tự nhiên trong chăm sóc bản thân ngày càng gia tăng Các loài vi tảo, với sự đa dạng về phân loại và khả năng ổn định môi trường cao, có thể là nguồn cung cấp tiềm năng cho mỹ phẩm Trong bối cảnh này, chiết xuất từ ethyl acetate và ethanol (96%) của Spirulina platensis đã cho thấy khả năng ức chế tyrosinase.
Nghiên cứu đánh giá 21 mẫu cho thấy dịch chiết ethanol (96%) có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cao hơn dịch chiết ethyl acetate, với IC50 lần lượt là 1,4 × 10 −3 g/ml và 7,2 × 10 −3 g/ml Acid ferulic và caffeic trong chiết xuất ethanol có thể là những chất ức chế chính của tyrosinase do cấu trúc tương tự với cơ chất của enzyme này.
Khái quát chung v ề Spirulina platensis lo ạ i vi t ả o có ho ạ t tính ứ c ch ế tyrosinase
2.6 1.1.Đặc điểm sinh học và phân bố của Spirulina platensis
Spirulina platensis, được đặt tên bởi nhà tảo học người Đức Deurben vào năm 1827, có hình dạng đặc trưng là sợi xoắn ốc với 5-7 vòng đều nhau và không phân nhánh Loài này thuộc ngành Cyanobacteria, chi Arthrospira, và họ Osciliatoriaceae, cho phép chúng di chuyển tiến hoặc lùi nhờ vào các lông fimbria có đường kính 5-7 nm và dài 1-2 µm Các lông này hoạt động như tay chớp giúp vi khuẩn lam hoạt động hiệu quả Spirulina platensis cũng có khả năng tạo ra các không bào khí nhỏ (gas vesicle) với đường kính khoảng 70 nm, được cấu trúc từ các sợi protein bện lại.
Hình 2.10 Hình ảnh tảo S.Platensis 1, S.Platensis 3, S.Platensis 5 được chụp dưới kính hiển vi
Chú thích: Hình ảnh 3 loại vi tảo S.Platensis 1, S.Platensis 3, S.Platensis 5 tương ứng được chụp dưới kính hiển vi độphóng đại 40X
Ho ạ t ch ấ t sinh h ọ c có trong Spirulina platensis
Spirulina platensis có hàm lượng protein cao nhất trong các thực phẩm hiện nay, đạt từ 56-77% trọng lượng khô, gấp ba lần thịt bò và gấp đôi đậu tương Ngoài ra, tảo xoắn này còn chứa nhiều vitamin, với 1 kg Spirulina platensis cung cấp 55 mg vitamin B1, 40 mg vitamin B2, 3 mg vitamin B6 và 2 mg vitamin B12.
113 mg vitamin PP, 190 mg vitamin E, 4.000mg caroten trong đóβ-Caroten khoảng
1700 mg (tăng thêm 1000% so với cà rốt), 0,5 mg acid folic, inosit khoảng 500-
Hàm lượng khoáng chất trong tảo xoắn Spirulina platensis có thể thay đổi tùy theo điều kiện nuôi trồng, với sắt đạt 580–646 mg, mangan 23–25 mg, magiê 2.915-3.811 mg, selen 0,4 mg, và canxi, kali, photpho khoảng 1.000-3.000 mg hoặc cao hơn, trong đó hàm lượng canxi vượt hơn 500% so với sữa Phần lớn chất béo trong Spirulina platensis là acid béo không no, bao gồm acid linoleic 13.784 mg và γ-linoleic 11.980 mg trên 1 kg tảo xoắn.
Spirulina platensis là một loại tảo hiếm có với hàm lượng cacbon hydrat khoảng 16,5% Gần đây, đã có thông tin về việc sử dụng glucoza chiết xuất từ tảo này trong các nghiên cứu chống ung thư Nghiên cứu về hiệu quả của các hợp chất tự nhiên có hoạt tính chống oxy hóa ngày càng gia tăng, trong khi việc sử dụng các chất chống oxy hóa tổng hợp bị hạn chế do nguy cơ ngộ độc và ung thư.
Spirulina platensis và các thành phần của nó đã được chứng minh có lợi ích tích cực cho sức khỏe con người, từ việc cải thiện tình trạng suy dinh dưỡng đến các đặc tính chống oxy hóa Cao chiết từ cồn của Spirulina platensis có khả năng ức chế quá trình peroxide hóa lipid lên đến 65%, vượt trội hơn so với các chất chống oxy hóa hóa học như α-tocopherol (35%), hydroxyanisol butylated (45%) và β-carotene (48%) Ngoài ra, cao chiết từ nước của tảo Spirulina platensis cũng cho thấy tác dụng chống oxy hóa cao hơn (76%) so với acid gallic (54%) và acid chlorogenic (56%) Nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa và chống ung thư của cao chiết tảo Spirulina platensis cho thấy cao chiết từ nước có tổng hàm lượng phenolic và khả năng chống oxy hóa cao.
Gi ớ i thi ệ u v ề m ộ t s ố phương pháp chiế t
Phương pháp chiế t Soxhlet
Dụng cụ: Gồm một hình cầu A đặt trong một bếp đun có thể diều chỉnh nhiệt độ,
Bộ phận chứa bột mẫu tảo bao gồm ba ống: ống D có đường kính lớn để chứa bột dược liệu, ống B với đường kính trung bình dẫn dung môi từ bình A vào ống D, và ống E có đường kính nhỏ để dẫn dung môi từ ống D trở lại bình A Trên cùng là ống C dùng để ngưng hơi Hệ thống này bao gồm bộ phận chứa dung môi, bộ phận chứa mẫu và các nút mài.
Hình 2.11 Hình ảnh dụng cụ Soxhlets
Để tiến hành tạo cao chiết bằng bộ chiết Soxhlet, bột dược liệu khô cần được cho vào túi giấy lọc và đặt trong ống D Cần lưu ý đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống D để tránh nghẹt lối ra vào của ống thông nhau E Sau đó, rót dung môi đã chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở nút mài số 2, giúp dung môi thấm ướt bột dược liệu trước khi chảy xuống bình cầu qua ống thông nhau E Cuối cùng, kiểm tra hệ thống kín và mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống.
Ngưng hơi là quá trình quan trọng trong chiết xuất, bắt đầu bằng việc cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt độ để dung môi trong bình cầu sôi nhẹ Khi dung môi tinh khiết được đun nóng, nó sẽ bốc hơi lên cao qua ống B và tiếp tục lên ống ngưng hơi, nơi hơi dung môi được làm lạnh và ngưng tụ thành chất lỏng Chất lỏng này rơi xuống ống D chứa bột dược liệu, nơi dung môi thẩm thấu vào bột và chiết xuất các chất hữu cơ hòa tan Trong quá trình này, dung môi không chỉ rơi vào ống D mà còn dâng lên trong ống E Khi đạt đến mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút vào bình A, rút lượng dung môi trong ống D, và quy trình chiết xuất tiếp tục diễn ra.
Phương pháp chiết Soxhlet cho phép thu hồi các hợp chất trong bình cầu, trong khi dung môi tinh khiết sẽ bay hơi để tiếp tục quá trình chiết Sau khi hoàn tất, dịch cao chiết được thu lại trong bình cầu A, và cồn sẽ được loại bỏ hoàn toàn Ưu điểm của phương pháp này là tiết kiệm dung môi, chỉ cần một lượng nhỏ để chiết kiệt mẫu mà không cần tốn công lọc hay bổ sung dung môi mới, đồng thời thao tác đơn giản và dễ sử dụng.
Phương pháp chiết Soxhlet có một số nhược điểm đáng chú ý Kích thước của thiết bị hạn chế lượng bột cần thiết cho quá trình chiết Trong quá trình này, các hợp chất chiết ra từ bột được lưu giữ trong bình cầu và đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi, điều này có thể ảnh hưởng đến các hợp chất kém bền nhiệt Hơn nữa, do toàn bộ hệ thống thiết bị được làm bằng thủy tinh và gia công thủ công, nên giá thành khá cao và dễ bị vỡ.
Ng ấ m ki ệ t
Ngâm nhỏ giọt (ngấm kiệt) là phương pháp chiết xuất hoạt chất hiệu quả, trong đó dung môi chảy chậm qua khối dược liệu trong “bình ngấm kiệt” mà không cần khuấy trộn Nguyên tắc của phương pháp này là duy trì sự tiếp xúc liên tục giữa dược liệu và dung môi mới, tạo ra chênh lệch nồng độ hoạt chất cao, từ đó cho phép chiết kiệt hoạt chất một cách tối ưu.
CO 2 t ớ i h ạ n
Một chất có thể tồn tại ở ba trạng thái: rắn, lỏng và khí, tùy thuộc vào điều kiện Khi nén khí đến áp suất cao, nó sẽ hóa lỏng, nhưng có một áp suất nhất định mà khi nhiệt độ tăng, chất lỏng không trở về trạng thái khí mà chuyển sang trạng thái siêu tới hạn (supercritical) Ở trạng thái này, vật chất có đặc tính của cả chất khí và chất lỏng, tạo ra một dung môi trung gian Khi CO2 đạt nhiệt độ và áp suất cao hơn điểm tới hạn (31 °C, 73,8 atm), nó sẽ chuyển sang trạng thái siêu tới hạn, mang lại khả năng phân tách trong quá trình chiết xuất và chưng cất CO2 có khả năng hòa tan tốt các chất cần tách ra ở cả ba dạng rắn, lỏng và khí, và để thu hồi sản phẩm, chỉ cần giảm áp suất xuống dưới áp suất tới hạn.
CO2 được chuyển đổi thành dạng khí và thoát ra ngoài, trong khi sản phẩm được thu thập ở bình hứng Mỗi điều kiện nhiệt độ và áp suất khác nhau sẽ tương ứng với các đối tượng cần chiết tách khác nhau.
Hình 2.12 Sơ đồ hoạt động bộ chiết CO 2 siêu tới hạn
Lôi cu ốn hơi nướ c
Phương pháp đầu tiên để tách tinh dầu khỏi nguyên liệu thực vật là chưng cất hơi nước Nguyên tắc của phương pháp này là nhiệt độ sôi của hỗn hợp thấp hơn nhiệt độ sôi của các cấu tử thành phần Nhờ đó, khi chưng cất, các cấu tử tinh dầu được tách ra ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của nước, giúp hạn chế sự biến tính hóa học như oxy hóa và nhiệt phân của các cấu tử tinh dầu.
Trong quá trình chưng cất, hơi nước thẩm thấu vào mô nguyên liệu, hòa tan và khuếch tán các hợp chất hữu cơ trong tinh dầu Dịch chưng cất sau đó gặp lạnh tại ống sinh hàn, được ngưng tụ và phân tách thành hai lớp: lớp tinh dầu ở trên và lớp nước ở dưới Sự khuếch tán diễn ra dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một khoảng thời gian nhất định.
Hình 2.13 Sơ đồ hoạt động chưng cất lôi cuốn hơi nước
PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đối tượ ng, v ậ t li ệ u nghiên c ứ u
Đối tượ ng nghiên c ứ u
Ba mẫu chủng vi tảo Spirulina platensis : Spirulina platensis 1 (Sp1), Spirulina platensis 3 (Sp3) , Spirulina platensis 5 (Sp5)
Nguyên li ệ u, hóa ch ấ t, d ụ ng c ụ
- Bột tảo khô Spirulina platensis: : Spirulina platensis 1 (Sp1), Spirulina platensis 3 (Sp3) , Spirulina platensis 5 (Sp5))
- Cơ chất L-DOPA (99%) (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine)
- Cốc thủy tinh, ống nghiệm, bình cầu, ống đong, cốc đong, que khuấy, giấy lọc,…
Thi ế t b ị
Địa điể m và th ờ i gian nghiên c ứ u
Viện nghiên cứu Vi tảo và Dược mĩ phẩm – Tầng 2, nhà B – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học ứng dụng Vi Tảo - Khoa Công Nghệ Sinh Học – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
Phòng thí nghiệm Khoa Nông Học – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
– Thời gian tiến hành thí nghiệm: tháng 10/2021 – 3/2022
N ộ i dung nghiên c ứ u
Tách chiết thu cao chiết từ ba chủng vi tảo Spirulina Platensis: S.platensis 1,
S.platensis 3, S.platensis 5 bằng dung môi khác nhau, ở thời gian khác nhau
Nghiên cứu, đánh giá, thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ cao chiết của ba chủng vi tảo Spirulina platensis: S.platensis 1, S.platensis 3, S.platensis 5
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp tách chiế t, t ạ o cao b ằ ng k ỹ thu ậ t Soxhlet
Để chiết xuất mẫu bột tảo, chuẩn bị 10 gram bột khô cho vào túi giấy lọc và đặt vào bình chiết Soxhlet Lắp bình đã sấy khô vào máy, đổ dung môi vào khoảng 2/3 thể tích bình Đảm bảo nước chảy liên tục vào ống làm mát và đun nóng dung môi từ từ trên bếp điện Khi dung môi sôi, hơi nước sẽ ngưng tụ trong tháp chiết, tạo ra chu trình chiết xuất Quá trình này tiếp tục trong 8 giờ, với dung môi bay hơi và dịch chiết giữ lại trong bình.
Sau 12 giờ, dịch chiết sẽ được thu được sau khi bay hơi Trong quá trình chiết, cần chú ý kiểm tra xem nước lạnh có chảy liên tục hay không, đồng thời đảm bảo màn hình nhiệt độ sưởi không thay đổi.
Dung môi sử dụng lần lượt là ethanol (96%), etyl acetate với thể tích dung môi là 200ml
Chú ý: Dịch chiết thu được sau khi chiết được bảo quản trong nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng
Trước khi tiến hành thí nghiệm, cần lấy 10ml dịch chiết mỗi loại cho vào đĩa petri đã được cân và ghi lại trọng lượng Sau khi để bay hơi, thu được cao dịch chiết, tiếp theo cân một lượng cao chiết nhất định để sử dụng trong thí nghiệm.
Phương pháp thử ho ạ t tính enzyme tyrosinase
Phương pháp này được sử dụng bằng máy đọc ELISA để đo độ hấp thụ huỳnh quang
Hình 3.1 Máy đọc miễn dịch ELISA MR-96A Mindray Xuất xứ: Trung Quốc và giếng ELISA (96 giếng )
3.3.2.1 Chu ẩn bị hóa chất
3.3.2.1.1 Pha đệm Potassium phosphate nồng độ 0,1M; pH = 6,8
Mục đích: Đệm Potassium phosphate để pha loãng enzyme tyrosinase, cao chiết
Bước 1: Cân K2HPO4 1,74 gam, KH2 PO4 1,36 gam
Bước 2: Hòa tan 1,74 gam K2HPO4 vào bình định mức 100ml nước cất
Hòa tan 1,36 gam KH2PO4 vào 100ml nước cất Sau đó, hút 38ml K2HPO4 0,1M và 62ml KH2PO4 0,1M vào bình định mức, tạo ra dung dịch đệm potassium 0,1M với tổng thể tích 100ml.
Bước 4: Kiểm tra độ pH bằng giấy quỳ sao cho dung dịch đệm có pH= 6,8 (Chỉnh pH bằng HCl hoặc NaOH)
Bảng 3.1 Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha của đệm Potassium
STT Thành phần Lượng cân
Chỉnh pH = 6,8 bằng HCl hoặc NaOH
Pha L-DOPA dung môi nước cất
L-DOPA là cơ chất tham gia phản ứng do enzyme xúc tác, nồng độ L-DOPA gốc pha 10 mM, nồng độ cuối cùng trong 1 phản ứng là 5mM
Bước 2: Hòa tan 0,02 gam L-DOPA và định mức thể tích lên thể tích 1ml bằng nước cất, được 1ml dung dịch L-DOPA gốc nồng độ 100mM
Bước 3: Cho thêm 0,9ml nước cất vào 0,1ml dung dịch L-DOPA gốc nồng độ
100mM, lắc đều được 1ml dung dịch L-DOPA nồng độ 10mM
Bước 4: Cho thêm 0,5ml nước cất vào 0,1ml dung dịch L-DOPA nồng độ 10nM, lắc đều được 1ml dung dịch L-DPOA nồng độ 5nM
Bảo quản L-DOPA sau khi pha: L-DOPA được bảo quản trong ống falcon, xung quanh được cuốn giấy bạc kín, bảo quản ở phòng lạnh, tối
Hình 3.2 Hóa chất L-DOPA (3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-L-alanine) 98%
Bảng 3.2 Khối lượng hóa chất, thể tích, nồng độ cần pha của hóa chất
Thể tích pha cuối cùng (ml)
Nồng độ cuối cùng phản ứng (mM)
Pha acid arbutin bằng dung môi nước cất
Acid arbutin dùng để làm chất đối chứng dương (+).
Bước 1: Cân 0,05 gam acid arbutin
Bước 2: Hòa tan 0,05 gam acid arbutin trong 1,8ml nước cất dựng trong ống eppendof(2ml) được 1,8ml dung dịch acid arbutin nồng độ 100mM (dung dịch gốc)
Bước 3: Hút 0,1 ml dung dịch acid arbutin gốc 100mM vào 0,9 ml nước cất được 1ml dung dịch acid arbutin 10mM
Bước 4: Hút 0,1 ml dung dịch acid arbutin 10mM vào 0,9ml nước cất được 1ml dung dịch acid arbutin 1mM ( dung dịch gốc phụ)
Từ dung dịch gốc phụ pha thành dãy nồng độ sau :
Bảng 3.3 Dãy nồng độ pha loãng của acid arbutin
Nồng độ dung dịch cuối cựng làm việc (àM)
V nước cất cần thờm (àl)
Bảo quản acid arbutin sau khi pha ở phòng lạnh, tránh ánh sáng
Hình 3.3 Hóa chất acid arbutin 98% - Hãng Acros organics
Bảng 3.4 Khối lượng, thể tích, nồng độ cần pha của hóa chất acid arbutin
Nồng độ cuối cùng phản ứng (àM)
3.3.2.1.4 Dung môi DMSO (Dimethyl sulfoxit)
Dimethyl sulfoxit (DMSO) là một hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh với công thức hóa học (CH3)2SO Chất lỏng không màu này hoạt động như một dung môi không cung cấp proton, có khả năng hòa tan cả các hợp chất phân cực và không phân cực DMSO có thể trộn lẫn với nhiều dung môi hữu cơ và nước Đặc biệt, nó dễ dàng thâm nhập qua da, gây ra một mùi giống như tỏi trong miệng sau khi tiếp xúc.
Bảo quản trong nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng
Pha enzyme trong đệm potassium photphase 0,1M pH=6.8 Khối lượng enzyme mushroom tyrosinase = 3,49 mg, 7164 units/ mg, sốlượng units là :
Bước 1 : Hòa tan hoàn toàn 3,49 mg enzyme mushroom tyrosinase trong 5 ml đệm, sau đó chia vào 5 ống eppendof (1,5 ml), được 5 ống đựng 1 ml enzyme 5000 units/ml ( dung dịch gốc)
Bước 2: Hút 0,5 ml dung dịch enzyme gốc 5000 units/ml vào ống eppendof thêm tiếp 0,5 ml dung dịch đệm, được 1 ml dung dịch enzyme 2500 units/ml (dung dịch gốc phụ)
Bước 3: Hút 0,4 ml dung dịch enzyme 2500units/ml vào ống eppendof thêm tiếp 0,6ml dung dịch đệm, được 1ml dung dịch enzyme 1000units/ml ( dung dịch phản ứng)
Bảo quản Enzyme mushroom tyrosinase sau khi đo ở trong nhiệt độ -4 độ C
Hình 3.4 Enzyme mushroom tyrosinase – Hãng Sigma Aldrich - Mỹ
3.3.2.1.6 Pha dịch chiết của mẫu chiết trong các dung môi
Cân 1 lượng cao chiết của ba loại cao chiết tảo S.platensis được thu từ dịch chiết khi chiết bằng dung môi Ethanol (96%)
Cách pha dịch chiết của mẫu chiết được chiết trong dung môi ethyl acetate:
Hòa tan 0,026 gram cao chiết S.platensis 1 vào 1 ml DMSO để đạt nồng độ gốc 0,026 g/ml Tiếp theo, hủy 38 µl dung dịch cao chiết gốc và pha thành 1 ml dung dịch gốc phụ với nồng độ 1 mg/ml Cuối cùng, hòa tan 0,027 gram cao chiết S.plantensis 3 vào 1 ml DMSO.
Nồng độ gốc của dung dịch là 0,027 g/ml, với 34 được pha loãng thành 1 ml dung dịch gốc phụ có nồng độ 1 mg/ml Để tạo ra dung dịch cao chiết S.Plantensis, hòa tan 0,021 gram vào 1 ml DMSO, đạt nồng độ 0,021 g/ml Sau đó, 48 được pha loãng thành 1 ml dung dịch gốc phụ với nồng độ 1 mg/ml.
Cách pha dịch chiết của mẫu chiết được chiết trong dung môi ethanol:
Hòa tan 0,026 gam cao chiết S.Platensis 1 vào 1 ml DMSO để đạt nồng độ gốc 0,026g/ml Sau đó, hủy 38 µl dung dịch cao chiết gốc và pha thành 1 ml dung dịch gốc phụ với nồng độ 1mg/ml Tương tự, hòa tan 0,027 gam cao chiết S.Plantensis 3 vào 1 ml DMSO để có nồng độ gốc 0,027g/ml, rồi hủy 37 µl dung dịch gốc và pha thành 1 ml dung dịch gốc phụ nồng độ 1mg/ml Cuối cùng, hòa tan 0,021 gam cao chiết S.Plantensis 5 vào 1 ml DMSO để đạt nồng độ gốc 0,021g/ml, sau đó hủy 48 µl dung dịch gốc và pha thành 1 ml dung dịch gốc phụ nồng độ 1mg/ml.
Từ dung dịch gốc phụ ta pha thành dãy nồng độ sau:
Bảng 3.5 Dãy nồng độ pha loãng từ dung dịch gốc
3.3.3.2.Quy trình th ực hiện thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu động học enzyme tyrosinase
Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu nồng độ enzyme tyrosinase tối ưu cho phản ứng
Bước 1: Hỳt 70 àl đệm potassium vào 5 giếng
Bước 2: Hỳt 30 àl enzyme với nồng độ lần lượt là 10U, 20U, 30U, 40U, 50U vào 5 giếng
Bước 3: Hỳt 110 àl dung dịch L-DOPA 5mM vào 5 giếng Đo ởbước sóng 492nm
Thí nghiệm lặp lại 3 lần
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hàng ngang thứ nhất từ giếng A1 đến giếng A5: đệm potassium, dung dịch L-DOPA (5mM) và enzyme tyrosinase nồng độ từng giếng lần lượt là 10,20,30, 40,
50U Để lặp lại thí nghiệm 3 lần, hàng ngang thứ hai và thứ ba từ giếng B1 đến giếng B5 và từ giếng C1 đến giếng C5 tương tự giống hàng ngang thứ nhất
Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu nồng độcơ chất L-DOPA tối ưu cho phản ứng
Bước 1: Hỳt 70àl đệm potassium vào 5 giếng
Bước 2: Hút 30 mM enzyme nồng độ 40U vào 5 giếng
Bước 3: Hỳt 110 àl dung dịch L-DOPA nồng độ lần lượt là 1,2,3,4,5mM Đo ởbước sóng 492nm
Thí nghiệm lặp lại 3 lần
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hàng ngang thứ nhất từ giếng 1 đến giếng 5 chứa đệm potassium, enzyme tyrosinase với nồng độ 40U và L-DOPA có nồng độ lần lượt là 1, 2, 3, 4, 5 mM Để đảm bảo tính chính xác, thí nghiệm được lặp lại 3 lần với hàng ngang thứ hai từ giếng B1 đến giếng B5 và hàng ngang thứ ba từ giếng C1 đến giếng C5, tương tự như hàng ngang thứ nhất.
Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu khảnăng phân giải arbutin của enzyme tyrosinase của dịch chiết vi tảo
Bảng 3.6 Thể tích hút của mỗi chất vào giếng trên bản ELISA
STT Tờn thành phần Thể tớch (àl)
Bước 1: Hỳt 70 àl dịch chiết theo cỏc dải nồng độ tăng dần vào mỗi giếng trên bản ELISA
Bước 2: Thờm 30 àl enzyme, trộn đều trong mỗi giếng Ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng
Bước 3: Thờm 110 àl L-DOPA 5mM, trộn đều trong mỗi giếng
Đối chứng (-) được thực hiện bằng cách thay thế thể tích dịch chiết bằng đệm potassium phosphate, trong khi đối chứng (+) sử dụng arbutin Các mẫu trên bản ELISA được ủ trong máy đọc ELISA ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và sau đó được đo ở bước sóng 492 nm.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần
Trong đó : Ađối chứng(-) : enzyme + L-DOPA + đệm
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hàng dọc thứ nhất từ giếng A1 đến giếng C3 lần lượt là: blank, dung dịch L-DOPA và đệm potassium, đối chứng âm D1 (dung dịch L-DOPA, đệm, enzyme
Hàng dọc thứ hai từ giếng A2 đến giếng D2 chứa enzyme tyrosinase, dung dịch L-DOPA và dịch chiết S.platensis 1 với nồng độ lần lượt là 50, 200, 400, 800 µg/ml Hàng dọc thứ ba từ giếng A3 đến giếng D3 tương tự như hàng dọc thứ hai nhưng thay dịch chiết S.platensis 1 bằng dịch chiết S.platensis 3 Hàng dọc thứ tư từ giếng A4 đến giếng D4 cũng tương tự nhưng sử dụng dịch chiết S.platensis 5 Cuối cùng, hàng dọc thứ năm từ A5 đến D5 là đối chứng dương (arbutin) với nồng độ lần lượt là 10, 100, 500, 1000 µM.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu tốc độ phản ứng của enzyme tyrosinase và L-DOPA có mặt chất ức chế
Dịch chiết tảo trong dung môi ethyl acetate
Bước1: Hỳt 70àl dịch chiết S.platensis 1 nồng độ lần lượt là: 50,200, 400 và
Bước 2: Hỳt 30àl enzyme nồng độ 40U vào mỗi giếng
Bước 3: Hỳt 110àl dung dịch L-DOPA nồng độ 4 mM vào mỗi giếng Ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Đo ởbước sóng 492nm
Thí nghiệm lặp lại 3 lần Đối với mẫu chiết S.platensis 3, S.platensis 5 bố trí thí nghiệm tương tự
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hàng ngang thứ nhất từ giếng 1 đến giếng 4 chứa enzyme tyrosinase với nồng độ 40U, dung dịch L-DOPA có nồng độ 4 mM, và dịch chiết tảo S.platensis 1 với các nồng độ 50, 200, 400, 800 µg/ml Hàng ngang thứ hai từ giếng B1 đến giếng B4 được thay thế bằng dịch chiết tảo S.platensis 3 với các nồng độ 50, 200 µg/ml.
400, 800àg/ml Hàng ngang thứ ba từ giếng C1 đến giếng C4 được thay là dịch chiết tảo S.platensis 5 nồng độ lần lượt là 50, 200, 400, 800àg/ml 400àg/ml
Bố trí thí nghiệm tương tự với dịch chiết tảo trong dung môi ethanol (96%)