Khảo sát một số đặc điểm sinh học và ảnh hưởng của một số mẫu giống vi sinh vật nội sinh đến sinh trưởng của cây khoai tây in vitro (khóa luận tốt nghiệp)

30 4.1 Khảo sát khả năng phân giải lân của các mẫu giống vi sinh vật nội sinh 30 4.2 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA của các mẫu giống vi sinh vật nội sinh 31 4.3 Khảo sát khả năng

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

IN VITRO

HÀ NỘI – 2022

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận này hoàn toàn được hoàn thiện bằng sự say mê nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS Đinh Trường Sơn, Trưởng bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học, học viện Nông nghiệp Việt Nam Các số liệu, hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất cứ t ài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng và nhà trường

Hà Nội, ngày 31 tháng 5 năm 2022

Sinh viên

Vương Thị Thiết

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp tại bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, Học viện Nông nghiệp Việt Nam em đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các Thầy cô giáo, các anh chị

và các bạn thực hiện khóa luận trên bộ môn, cùng với sự nỗ lực, cố gắng của bản thân, em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình

Lời đầu tiên, em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới bộ môn Công nghệ sinh học Thực vật, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ cho sinh viên nói chung và em nói riêng khi được thực hiện thực tập tốt nghiệp tại bộ môn

Em xin chân thành cảm ơn và bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn đến TS Đinh Trường Sơn đã trực tiếp hướng dẫn, hỗ trợ, tận tình chỉ dạy và theo sát em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn đến các Anh, chị và các nghiên cứu viên trên bộ môn Công nghệ sinh học thực vật đã nhiệt tình giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn đồng hành, động viên, chia sẻ, cổ vũ tinh thần và giúp đỡ em khi em gặp khó khăn trong quá trình hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 31 tháng 5 năm 2022

Sinh viên

Vương Thị Thiết

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU viii

I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.3 Ý nghĩa 3

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Nguồn gốc, sự phân bố cây khoai tây 4

2.1.1 Đặc điểm, hình thái 4

2.1.2 Đặc điểm giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây khoai tây 6

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến cây khoai tây 7

2.2 Giới thiệu VSV nội sinh 11

2.2.1 VSV nội sinh là gì 11

2.2.2 Lịch sử, nguồn gốc của VSV nội sinh 11

2.2.3 Vai trò của VSV nội sinh đến cây trồng 12

2.2.4 Các nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh trong và ngoài nước 13

2.3 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

2.3.1 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật 14

2.3.2 Ưu điểm 17

2.3.3 Ứng dụng nuôi cấy mô 18

3.2 Địa điểm 19

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.4 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.1 Phương pháp nuôi vi khuẩn 20

3.4.2 Phương pháp đánh giá khả năng kích thích nảy mầm trên một số cây rau

ăn củ, lá 27

3.4.3 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào cây khoai tây Solara in vitro 27

3.4.4 Bổ sung vi sinh vật vào bình cây khoai tây nuôi cấy mô 28

IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Khảo sát khả năng phân giải lân của các mẫu giống vi sinh vật nội sinh 30 4.2 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA của các mẫu giống vi sinh vật nội sinh 31 4.3 Khảo sát khả năng cố định đạm của các mẫu giống vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây Solara 32

4.4 Đánh giá tác động của 14 mẫu giống vi sinh vật tới giai đoạn nảy mầm của một số cây rau

34 4.4.1 Ảnh hưởng của các mẫu vi khuẩn nội sinh tới quá trình nảy mầm của hạt rau cải ngọt 35

4.4.2 Đánh giá tác động của 14 mẫu giống vi sinh vật tới giai đoạn nảy mầm rau cải cúc 38

4.4.3 Đánh giá tác động của 14 mẫu giống vi sinh vật tới giai đoạn nảy mầm rau mùi 41

4.5 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của vi sinh vật đến sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây Solara in vitro 43

4.5.1 Đánh giá tác động của vi sinh vật đến chiều cao cây 47

4.5.2 Đánh giá tác động của 14 mẫu giống vi sinh vật nội sinh đến số lá, khối lượng lá49 4.5.3 Đánh giá tác động của vi sinh vật đến chiều dài rễ 51

4.5.4 Đánh giá tác động của vi sinh vật đến khối lượng tươi 52

4.5.5 Đánh giá tác động của vi sinh vật đến khối lượng khô 53

5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

5.1 Kết luận 54

5.2 Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 57

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu giống vi sinh vật dùng trong nghiên cứu 19

Bảng 3.3 Bảng số liệu đo nồng độ IAA ở bước sóng 530nm 23

Bảng 3.4 Thành phần thuốc thử và nồng độ của đường chuẩn NH4+ 25

Bảng 3.5 Bảng số liệu NH4+ ở bước sóng 640nm 26

Bảng 4.2 Nồng độ IAA của các mẫu giống VSV nội sinh 31

Bảng 4.3 Khả năng cố định đạm của 14 mẫu giống VSV nội sinh trên môi trường Burks lỏng không đạm 33

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của VSV đến khả năng nảy mầm của rau cải ngọt (sau 7 ngày gieo hạt) 36

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của VSV đến khả năng nảy mầm của rau cải cúc (sau 10 ngày gieo hạt) 39

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của VSV đến khả năng nảy mầm của rau rau mùi (sau 13 ngày gieo hạt) 42

Bảng 4.7 Khả năng sinh trưởng của cây khoai tây Solara in vitro 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.3 Đồ thị phương trình đường chuẩn IAA 23

Hình 3.4 Đồ thị phương trình đường chuẩn NH4+ 26

Hình 4.1 Các mẫu giống VSV có khả năng phân giải lân (sau 3 ngày) 30

Hình 4.2 Khả năng tổng hợp IAA của các mẫu giống VSV nội sinh sau khi

sử dụng thuốc nhuộm 31

Hình 4.3 Khả năng cố định đạm của các mẫu giống VSV nội sinh 32

Hình 4.4 Tác động của 14 mẫu giống vi sinh vật tới giai đoạn nảy mầm rau

cải ngọt 35

Hình 4.5 Tác động của 14 mẫu giống vi sinh vật tới giai đoạn nảy mầm rau

cải cúc (sau 10 ngày) 38

Hình 4.6 Tác động của 14 mẫu giống vi sinh vật tới giai đoạn nảy mầm rau

mùi (sau 8 ngày) 41

Hình 4.7.2a Ảnh hưởng của các mẫu giống VSV đến số lá cây khoai tây

Solara in vitro Các giá trị trung bình có cùng chữ cái là sai khác

không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05) 49

Hình 4.7.2b Ảnh hưởng của các mẫu giống VSV đến khối lượng lá cây

khoai tây Solara in vitro Các giá trị trung bình có cùng chữ cái là

sai khác không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05) 50

Hình 4.7.3 Ảnh hưởng của các mẫu giống VSV đến chiều dài rễ cây khoai

tây Solara in vitro Các giá trị trung bình có cùng chữ cái là sai

khác không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05) 51

Hình 4.7.4 Ảnh hưởng của các mẫu giống VSV đến khối lượng tươi cây

khoai tây Solara in vitro Các giá trị trung bình có cùng chữ cái là

sai khác không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05) 52

Hình 4.7.5 Ảnh hưởng của các mẫu giống VSV đến khối lượng khô cây

khoai tây Solara in vitro Các giá trị trung bình có cùng chữ cái là

sai khác không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05) 53

TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Khảo sát một số đặc điểm sinh học và ảnh hưởng của

một số mẫu giống VSV nội sinh đến sinh trưởng của cây khoai tây in vitro” đã

khảo sát các đặc điểm sinh học của 14 mẫu giống VSV nội sinh trong rễ cây khoai tây Nhận thấy có 4 mẫu giống là 2, 11, 17, 20 có khả năng chuyển hóa hợp chất photpho khó tan thành dễ tiêu đối với cây trồng bằng xác định định tính qua vòng phân giải trên môi trường đặc; tất cả mẫu giống VSV có khả năng sinh tổng hợp IAA giúp kích thích ra rễ thông qua xác định định lượng trên môi trường LB lỏng có bổ sung Tryptophan; cũng như khả năng tổng hợp nguồn Nitơ cho cây trồng dưới tác động của VSV qua xác định định lượng trên môi trường Burk lỏng không đạm Sau đó, tiếp tục đánh giá khả năng nảy mầm của các loại hạt giống dưới tác động của các mẫu giống VSV Xác định được có 6 mẫu giống VSV là 2, 17, 19, 22, 27, 31.1 đã ảnh hưởng tốt đến giai đoạn nảy mầm của cây cải ngọt Có 2 mẫu giống VSV là 11 và 16 đã tác động tốt đến giai đoạn nảy mầm của cây cải cúc Có 3 mẫu giống VSV là 5, 11.1, 27 ảnh hưởng tốt đến giai đoạn nảy mầm của cây rau thơm Đã thực hiện đánh giá được ảnh

hưởng của các mẫu giống VSV trên cây khoai tây Solara in vitro Nhận thấy các

mẫu giống đã giúp kích thích tăng chiều cao cây, khối lượng lá, chiều dài rễ, khối lượng tươi và khối lượng khô Chứng tỏ, sử dụng các chủng VSV trên cây khoai tây là cần thiết

I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Khoai tây (Solanum tuberosum), thuộc họ Cà (Solanaceae) Ở nước ta, cây

khoai tây là loài cây nông nghiệp quan trọng chỉ đứng sau lúa nước và ngô Khoai tây có thời gian sinh trưởng ngắn và chứa 80% là nước, khoai tây còn rất giàu carbohydrate và hàm lượng cao protein, chất xơ Khoai tây giàu chất dinh dưỡng có thể bổ sung năng lượng và đem lại một số lợi ích sức khỏe cho cơ thể

Ở Việt Nam, khoai tây được trồng nhiều ở các tỉnh miền Bắc, Vùng Bắc Trung bộ, Tây Nguyên Khoai tây là một trong những cây thực phẩm quan trọng

và đem lại hiệu quả kinh tế cao Thời gian sinh trưởng và phát triển của cây chỉ vào khoảng từ 80 – 100 ngày, cây khoai tây đã cho giá trị thu nhập cao gấp từ 2 đến 3 lần giá trị thu nhập so với cây lúa Cây khoai tây là loại cây lương thực trồng vụ đông nhưng cũng nhạy cảm với các điều kiện về thời tiết, khí hậu, phân bón, thuốc bảo vệ thực vật,… Do đó khi khoai tây phát triển mạnh sẽ kéo theo tăng diện tích trồng trọt và cả áp lực về sâu bệnh, phân bón

Tuy nhiên, người nông dân vẫn chưa thực sự tìm hiểu và sử dụng thuốc bảo

vệ thực vật, phân bón theo hướng dẫn của nhà sản xuất Đó là nguyên nhân chính dẫn tới sản phẩm rau không an toàn ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng Gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến môi trường đất, nguồn nước, sinh thái

Để khắc phục tình trạng ô nhiễm môi trường (đất, nước, ) do sử dụng phân bón hóa học quá mức, hiện nay đã và đang có nhiều nghiên cứu ứng dụng phân bón sinh học trong sản xuất nông nghiệp đặc biệt là khoai tây Đây là một trong những biện pháp cải thiện đất giúp khoai tây phát triển tốt, hạn chế sâu bệnh, đạt năng suất ổn định, cho chất lượng tốt, làm giảm ô nhiễm môi trường Tuy nhiên, giá thành của các loại phân bón sinh học này vẫn còn cao Để hạn chế việc sử dụng phân bón hóa học, thúc đẩy sử dụng phân bón sinh học thì cần hạ giá thành Do đó, việc nghiên cứu và tìm ra các loại vi khuẩn cộng sinh có khả năng sinh trưởng, phát triển cây trồng là một nhu cầu cấp thiết

Qua tìm hiểu, nhận thấy một số mẫu giống vi sinh vật cộng sinh có khả năng sinh tổng hợp IAA, cố định đạm, phân giải lân,…, rất có lợi đối với cây trồng Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu sử dụng VSV cộng sinh với các cây trồng nuôi cấy mô, giúp cây trồng phát triển tốt mà không cần bổ sung các chất dinh dưỡng, chất điều tiết sinh trưởng từ bên ngoài, còn có thể giảm lượng các chất dinh dưỡng hay chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy mô…

Các vi sinh vật này cộng sinh trong điều kiện in vitro qua các lần cấy chuyển

cũng như ngoài môi trường tự nhiên chúng sẽ phát huy tác động có lợi lâu dài

Vì vậy, đây sẽ là hướng ứng dụng rất lớn đặc biệt cho các cây trồng nông nghiệp

và lâm nghiệp

Trong sản xuất trồng trọt khoai tây, hệ vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây đóng một vai trò quan trọng đối với quá trình phát triển của cây khoai tây

Do đó, việc nghiên cứu hệ vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây có thể góp

phần tìm ra giải pháp sản xuất tốt hơn Vì những lý do trên mà đề tài ‟Khảo sát

một số đặc điểm sinh học và ảnh hưởng của một số mẫu giống vi sinh vật

nội sinh đến sinh trưởng của cây khoai tây in vitro” được thực hiện nhằm

mục đích đánh giá hiệu quả của các vi sinh vật nội sinh tác động đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây, giúp tăng năng suất cây trồng, giúp giảm lượng phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật và góp phần bảo vệ môi trường

Nghiên cứu ảnh hưởng của các mẫu giống VSV cộng sinh đến khả năng sinh

trưởng, phát triển của cây khoai tây Solara in vitro

1.3 Ý nghĩa

Đề tài là cơ sở để chọn lọc các mẫu giống VSV có lợi giúp tăng khả năng sinh

trưởng và phát triển của cây khoai tây in vitro Ngoài ra, còn làm tăng tốc độ nảy

mầm của các loại hạt giống khác làm rút ngắn thời gian nảy mầm và sinh trưởng

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gốc, sự phân bố cây khoai tây

Khoai tây (Solanum tuberosum) là cây trồng cổ đại, được tìm thấy ở phía

nam Chile (Nam Mỹ) Cây khoai tây được đưa đến Tây Ban Nha từ Nam Mỹ (1570) rồi phổ biến ra nhiều nước và 100 năm sau khoai tây có mặt ở khắp các nước trên châu Âu

Năm 1600, tại Pháp hai nhà thực vật học người Thụy Sỹ C.Bauhin và J.Bauhin mang khoai tây tới và 1773 được trồng trọt phổ biến Năm 1610, khoai tây xuất hiện tại Ấn Độ, Trung Quốc (1700) và Nhật Bản (1766) Cuối thế kỷ

17, Khoai tây lan rộng ra khắp Châu Âu như Áo, Italia, Đức…

Khoảng sau 1870, khoai tây được trồng trọt trên quy mô lớn và tới thế kỉ XIX lan rộng khắp các châu lục

Ở Việt Nam, Pháp đưa khoai tây vào trồng trọt (1890) tại một số vùng như:

Tú Sơn-Hải Phòng (1901), Trà Lĩnh-Cao Bằng (1907), Thường Tín-Hà Tây (1917) Hiện nay, khoai tây trồng phổ biến tại các vùng đồng bằng sông Hồng,

Đà Lạt (Lâm Đồng) Ngoài ra, khoai tây được trồng thêm tại vùng núi phía Bắc như Sapa (Lào Cai), Hòa An (Cao Bằng) Qua thực tế, cho thấy khoai tây trồng

ở độ cao so với mặt nước biển đều cho chất lượng tốt và năng suất cao, cây có tính thích ứng cao, ít bị sâu bệnh

2.1.1 Đặc điểm, hình thái

Cây khoai tây thuộc họ Cà (Solanaceae) là

cây ngắn ngày trồng hằng năm, thân thảo

a Rễ

Khoai tây mọc từ hạt rễ chính và rễ chùm

Khoai tây trồng từ củ giống chỉ hình thành rễ

chùm Khi cắt củ bắt đầu nẩy mầm, phần gốc mầm

bắt đầu có những chấm nhỏ (mầm rễ)

Phần thân ngầm dưới mặt đất (còn gọi là tia củ) có khả năng ra rễ, nhưng

rễ ngắn và ít phân nhánh Các loại rễ đều tham gia vào quá trình hấp thu nước và dinh dưỡng để nuôi cây cũng như thân củ

Sau trồng 25-30 ngày rễ xuất hiện, rễ phân bố trên đất canh tác từ 0-40 cm Các kỹ thuật làm đất, tính chất vật lý cúa đất, độ ẩm, giống và các yếu tố ngoại cảnh khác ảnh hưởng đến mức độ phát triển của bộ rễ

 Phần thân dưới mặt đất (thân củ)

Củ khoai tây thực chất là do sự phình to và rút ngắn của tia củ

Củ khoai tây giống như cấu tạo của một thân khi dựa vào hình thái và cấu tạo Mắt củ xuất hiện ở điều kiện bóng tối Mỗi mắt sẽ có một mầm chính và còn

có mầm bên Khi mọc mầm chính, các mầm bên sẽ bị ức chế Mầm bên mọc sau khi mầm chính bị gãy

Thể hiện cho đặc trưng của giốngkhoai tây là hình dạng, màu sắc củ và số mầm mọc trên củ

Các bộ phân trên và dưới mặt đất có mối quan hệ chặt chẽ ở giữa giai đoạn sinh trưởng thân lá và tích lũy dinh dưỡng ở củ

c Lá

Đầu tiên là các lá nguyên đơn, sau đó hình thành lá kép lẻ (chưa hoàn chỉnh) và cuối cùng là các lá hoàn chỉnh Khả năng hấp thụ ảnh sáng của lá phụ thuộc và quyết định vào kích thước, số lượng và sự sắp xếp của lá trên thân Các

lá ở tầng giữa sẽ có khả năng quang hợp mạnh nhất Diện tích che phủ đạt 38.000-40.000 m2/ha thì khả năng quang hợp là lớn nhất và cho năng suất đạt cao nhất Do đó nếu diện tích lá giảm đi một nửa, năng suất sẽ giảm tối thiểu 30%

d Hoa, quả, hạt

Hoa: là loại hoa tự thụ phấn Hạt phấn hoa của khoai tây thường bất thụ dẫn đến tỷ lệ đậu quả thấp Hoa có cấu trúc hình sim, 5 cánh, màu trắng, tím, tím hồng hoặc trắng phớt tím (tùy thuộc loài, giống)

Quả: quả mọng hình tròn hoặc trái xoan, màu xanh lục, có 2-3 noãn tạo 2-3 ngăn chưa hạt rất nhỏ

Hạt: dạng tròn dẹt, màu xanh đen, khối lượng 1000 hạt 0,5g Hạt có thời gian ngủ nghỉ dài như củ giống

2.1.2 Đặc điểm giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây khoai tây

a Thời kỳ ngủ nghỉ

Củ khoai tây mới thu hoạch sẽ không có khả năng mọc mầm (hiện tượng ngủ nghỉ) Thời kỳ ngủ nghỉ dài hay ngắn phụ thuộc chủ yếu vào giống, bên cạnh đó còn có các yếu tố tác động bên ngoài khác như sự chà sát cơ giới, hoá chất Hết thời kỳ ngủ nghỉ hoặc sau khi được xử lý phá ngủ thì củ khoai tây mới

có khả năng mọc mầm

b Thời kỳ mọc mầm

Thời kỳ đầu tiên trong chu kỳ phát triển của cây khoai tây Mầm ở các mắt

củ sẽ phát triển dần thành cây con Khả năng và tốc độ mọc mầm phụ thuộc vào các yếu tố: Chất lượng củ giống (củ giống to, khoẻ, hết thời kỳ ngủ sinh lý, củ không bị xây xát, thối hỏng mọc mầm nhanh, mầm khoẻ và đều); Điều kiện nhiệt độ môi trường (nhiệt độ thuận lợi là khoảng 22 – 30°C) nhiệt độ thấp cây

sẽ chậm mọc mầm; Độ ẩm đất (đất có độ ẩm vừa phải khoảng 80 – 85% thuận

lợi nhất cho quá trình mọc mầm) Nếu đất quá khô mầm mọc chậm còn đất quá

ẩm củ dễ bị thối

Củ thu hoạch đúng tuổi sẽ mọc mầm tốt hơn củ thu hoạch sớm Khi nhiệt

độ ấm áp, đủ ẩm củ mọc mầm nhanh, khoẻ Trong một mắt củ, mầm ở giữa sẽ mọc mầm trước Đối với các mầm ở phần đỉnh củ mọc nhanh và khoẻ hơn mầm

ở phần gốc củ Trên một củ, mầm mọc trước phát triển nhanh hơn và ức chế các mầm ở gốc Khi mầm này bị gãy các mầm khác sẽ có cơ hội phát triển

c Thời kỳ hình thành tia củ

Cây khoai tây hình thành tia củ rất sớm (ngay từ thời điểm sau mọc mầm

15 – 20 ngày) Thời kỳ hình thành tia củ sẽ kéo dài 30 – 45 ngày tuỳ thuộc vào giống, thời vụ trồng và chế độ chăm sóc Nhiệt độ thích hợp là 17- 20°C, độ ẩm đất 70 -80%, thời gian chiếu sáng ngày ngắn và dinh dưỡng đầy đủ, đất tơi xốp

và thông thoáng

d Thời kỳ thân củ phát triển

Tiếp theo là thời kỳ tia củ phình to Chất dinh dưỡng sẽ được vận chuyển

về củ làm cho củ lớn nhanh Sự chệnh lệch giữa nhiệt độ ngày và đêm liên quan đến sự phát triển của củ, sự chênh lệc càng cao thì củ càng phát triển Tuỳ thuộc vào giống, đối với thời kỳ này sẽ kéo dài từ 25 – 30 ngày Sự phát triển của củ diễn ra thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ thấp, ánh sáng ngày ngắn, đất đủ ẩm và được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng

2.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến cây khoai tây

a Đất và độ pH

Khoai tây là có thể thích nghi với nhiều loại đất và độ pH khác nhau Tuy nhiên, để đạt được năng suất và chất lượng của củ khoai tây cao nhất thì nên trồng trên đất cát pha, đất phù sa bên sông và đất thịt nhẹ, tơi xốp, tầng canh tác dày, giàu chất dinh dưỡng

Khoai tây nên trồng xa khu công nghiệp, hầm mỏ, nguồn nước thải Độ

pH thuận lợi cho khoai tây sinh trưởng là từ 5,5-7,5 tốt nhất là 6-6,5 Trong chế độ luân canh cây trồng, có một số loại cây không thể trồng trước khi

trồng khoai tây như cà chua hay các cây họ cà Nên luân canh khoai tây với các loại cây trồng khác họ như: lúa nước, hành, tỏi, bầu, bí, cây lấy sợi

b Chất dinh dưỡng:

Khoai tây là loại cây trồng có nhu cầu rất lớn về chất dinh dưỡng trong đất

so với nhiều cây rau khác, là loại rau chịu phân bón Vì khoai tây là cây trồng lấy củ, khối lượng thân lá lớn, năng suất cao

Khi bón phân cho khoai tây cần dựa vào kết quả phân tích đất, hàm lượng chất dinh dưỡng trong thân củ, đặc tính của giống Như vậy mới làm tăng hiệu quả của công việc bón phân

Khoai tây cần có nguyên tố đa lượng (N,P,K) và các nguyên tố vi lượng như: Mangan(Mn), Kẽm(Zn) trong các thời kỳ sinh trưởng

 Ni tơ(N)

Đạm là yếu tố dinh dưỡng giúp thúc đẩy quá trình quang hợp của bộ lá và thúc đẩy sự nảy mầm Đạm là yếu tố có tính chất quyết định đối với năng suất Nếu đạm thừa hoặc thiếu đều có ảnh hưởng không tốt đến quá trình sinh trưởng

và phát triển của cây

Thừa đạm sẽ ức chế sự nảy mầm, thân lá mềm yếu và dễ bị sâu bệnh hại phá hoại Đạm quá nhiều sẽ làm tăng chất Nitrat (NO3-) trong thân củ, chất gây độc hại cho sức khoẻ của con người, ngoài ra còn làm giảm thời gian bảo quản của khoai tây

Thiếu đạm cây sẽ còi cọc, sinh trưởng kém, củ nhỏ, giảm số lượng củ trong khóm, dẫn đến làm giảm năng suất

 Phốt pho(P)

Lân có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng của cây, tăng số củ trong khóm, tăng khả năng chống chịu đối với sâu bệnh hại và giá rét Lân còn có tác dụng làm thúc đẩy quá trình ra hoa và hình thành củ

Khoai tây có nhu cầu lớn đối với lân ở thời kỳ nảy mầm và thời kỳ cây con

Nếu thiếu lân thì thân lá sẽ phát triển không bình thường, thay đổi màu lá (màu xanh tối hoặc màu rỉ đồng) Vì vậy dẫn đến làm giảm năng suất và chất lượng củ

Nếu bón lân quá nhiều (100kg lân nguyên chất/1000m2) sẽ gây ức chế sự sinh trưởng của rễ và ngọn

 Kali (K)

Trong 3 nguyên tố đa lượng (N,P,K) thì cây khoai tây cần kali nhiều nhất Lượng kali cần gấp 2-5 lần so với lân và 1,5-2 lần so với đạm Kali giúp làm tăng sự sinh trưởng bề mặt lá, kéo dài sự hoạt động của tầng lá giữa và lá gốc

Do đó có tác dụng thúc đẩy quá trình quang hợp của cây Kali có tác dụng xúc tiến sự hình thành củ, vận chuyển các chất dinh dưỡng vào củ, góp phần làm tăng năng suất và tăng chất lượng củ

Mặt khác kali còn có khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất thuận và sâu bệnh hại Tác dụng của kali phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, đặc biệt là độ ẩm Khi thừa kali sẽ ức chế sự sinh trưởng của cây làm kéo dài thời gian nảy mầm, đồng thời làm tăng khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng một cách đáng kể

 Nguyên tố vi lượng

Khi hàm lượng kali (K) và phốt pho (P) trong đất thấp thì cần thiết phải bón phân vi lượng Khoai tây mẫn cảm với sự thiếu hụt mangan (Mn) và cũng mẫn cảm với sự thiếu hụt kẽm (Zn)

Nhiệt độ cao cũng gây khó khăn đến quá trình tạo củ Khi nhiệt độ không khí trên 25 độ C sẽ xảy ra hiện tượng vống của các loại thân, lóng vươn dài, thân

củ kéo dài thành hình ô van Trong điều kiện nhiệt độ cao, khô hạn, ánh sáng mạnh, khoai tây có hiện tượng sinh trưởng lần 2 Điều đó có nghĩa là trên củ mới mọc thêm một củ nhỏ hoặc mầm cây và trên củ xuất hiện nhiều mắt Trong sản xuất cần hạn chế hiện tượng này Thông qua biện pháp kỹ thuật như: trồng đúng thời vụ, giữ ẩm thường xuyên và vun cho khoai tây

d Ánh sáng

Khoai tây là cây ưa ánh sáng Thiếu ánh sáng làm cho mầm vươn dài, có màu trắng hoặc vàng úa Khi không đủ ánh sáng, cây sinh trưởng yếu, lá nhỏ, làm giảm năng suất và chất lượng Hầu hết, tất cả giống khoai tây đều yêu cầu thời gian chiếu sáng dài để phát triển thân lá và xúc tiến nở hoa Chỉ có một số giống yêu cầu ánh sáng ngắn để sinh trưởng phát triển

Khoai hình thành tia củ (hay cây ra nụ) yêu cầu thời gian chiếu sáng dài Khoai tây cần ánh sáng ngắn trong thời kỳ sinh trưởng và phát triển củ Trong điều kiện ánh sáng dài, củ sẽ không hình thành Hiện tượng vỏ củ có màu xanh

là do có ánh sáng trực tiếp chiếu lên củ Củ có màu xanh sẽ làm giảm giá trị sản phẩm Vì vậy, để khắc phục điều đó trong trồng trọt và sản xuất cây khoai tây, biện pháp xới vun là rất quan trọng Vun đất vào gốc cây, vừa tạo được bóng tối, lại vừa làm cho củ tránh được ánh sáng mặt trời

e Nước

Khoai tây tìm thấy ở vùng ẩm ướt có hệ rễ ăn nông, diện tích lá lớn, năng suất cao, vì vậy khoai tây cần nước trong cả quá trình sinh trưởng Tuy nhiên, hệ

rễ yếu, khoai tây không chịu ngập úng, cũng như không thể chịu hạn

Thiếu nước khi trồng, cây sẽ mọc chậm, thừa nước ở cuối thời kỳ sẽ gây khó khăn cho công việc thu hoạch Ở thời kỳ hình thành tia củ, thiếu nước sẽ ảnh hưởng tới kích cỡ và khối lượng củ Ngoài ra, nó còn làm cho vỏ củ xù xì, hình thành những u nhỏ trên củ hay sinh trưởng lần 2

Vì vậy, cần duy trì độ ẩm đất là biện pháp kỹ thuật rất cơ bản trong kỹ thuật trồng khoai tây Độ ẩm đạt 70-80% thỏa mãn nhu cầu về nước trong suốt thời kỳ sinh trưởng của cây khoai tây Độ ẩm không khí cao khoai tây dễ bị bệnh

hại ví dụ như bệnh mộc sương Trước khi thu hoạch 2-3 tuần, cần để ruộng khô ráo thuận tiện cho công việc thu hoạch, vận chuyển và bảo quản

2.2 Giới thiệu VSV nội sinh

2.2.1 VSV nội sinh là gì

Vi sinh vật nội sinh (Endophytes) là vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn và nấm) có mặt ở thực vật nhưng không gây hại hay ảnh hưởng tới thực vật

Hầu hết tất cả thực vật đều có endophytes và trong trường hợp endophytes

có mặt ở hạt giống và nó sẽ thúc đẩy sự phát triển, sinh trưởng của cây ngay sau khi hạt nảy mầm

Chức năng của vi sinh vật nội sinh là chúng giúp mang các chất dinh dưỡng

từ đất vào cây trồng, điều chỉnh sự phát triển của cây, tăng khả năng chống chịu của cây trồng, ngăn chặn độc lực của mầm bệnh, tăng khả năng kháng bệnh ở cây trồng và ngăn chặn sự phát triển của các loài thực vật cạnh tranh

Qua nhiều nghiên cứu, các vi sinh vật nội sinh đã được chứng minh là giúp thu nhận chất dinh dưỡng trong đất và chuyển chất dinh dưỡng cho cây trồng trong chu trình thân rễ và các cộng sinh chuyển chất dinh dưỡng khác; tăng sinh trưởng và phát triển của cây trồng; giảm stress oxy hóa của vật chủ; bảo vệ thực vật khỏi dịch bệnh; ngăn động vật ăn cỏ ăn; và ngăn chặn sự phát triển của các loài thực vật cạnh tranh Từ những chức năng hiệu quả của vi sinh vật nội sinh, tiến tới các nghiên cứu làm giảm việc sử dụng hóa chất nông nghiệp (phân bón, thuốc diệt nấm, thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ) trong trồng trọt sản xuất cây trồng

2.2.2 Lịch sử, nguồn gốc của VSV nội sinh

Endophytes được nhà thực vật học người Đức Johann Heinrich Friedrich Link phát hiện vào năm 1809 Khi đó, chúng được cho là nấm ký sinh thực vật Sau đó, chúng được nhà khoa học người Pháp Béchamp đặt tên là

"microzymas" Người ta tin rằng, trong điều kiện vô trùng không có vi sinh vật thì thực vật sẽ hoàn toàn khỏe mạnh Năm 1887, Victor Galippe phát hiện ra trong các mô thực vật thường xuất hiện vi khuẩn Mặc dù vậy, hầu hết các nghiên cứu nội sinh báo cáo mối quan hệ tương hỗ của vi khuẩn và nấm, Das và

cộng sự, (2019) đã báo cáo về vi sinh vật nội sinh và chức năng của chúng có

thể xảy ra trong cơ chế bảo vệ thực vật

2.2.3 Vai trò của VSV nội sinh đến cây trồng

Điều hòa sự phát triển của cây con bằng endophytes là kết quả của quá trình tiến hóa ở thực vật, trong sự cộng sinh liên tục với các vi khuẩn sống trên các mô thực vật Nhiều vi khuẩn đã tạo ra dinh dưỡng cho thực vật (chẳng hạn như oxit nitric), chất điều hòa sinh trưởng (như auxin và ethylene)

Các nghiên cứu cho thấy rằng những cây cỏ con sau khi bị làm sạch, hầu hết các vi sinh vật nội sinh của chúng sẽ mất phản ứng hấp dẫn của rễ ( nghĩa

là rễ không mọc xuống), từ đó cây con thường bị giảm kích thước do giảm hoặc không hình thành lông rễ Việc cấy lại các cây mầm axenic với các vi khuẩn sống bên trong cây con dẫn đến thu được phản ứng hấp dẫn của rễ và tăng chiều cao của cây cũng như sự phát triển lông rễ

Một số nghiên cứu cho thấy rằng, các sợi lông ở rễ dài ra cho đến khi tất cả các vi khuẩn được đẩy ra khỏi lông Sự dài ra của lông ở rễ được kích hoạt bởi quá trình sản xuất oxit nitric hoặc ethylene do các nguyên bào vi khuẩn nội bào tập trung ở phần ngọn của lông (nhưng điều này chưa được chứng minh) Người

ta chưa tìm ra chất nào được tạo ra hoặc phân huỷ bởi vi khuẩn nội bào để bắt đầu phản ứng hấp dẫn ở rễ cây con Vi sinh vật nội sinh trong thực vật cũng đã được chứng minh là có khả năng tăng cường sự phát triển của rễ và tăng sự phân nhánh của rễ, hơn nữa dẫn đến sự phát triển của cây trồng Những ảnh hưởng của endophytes đối với sự phát triển của rễ được cho là do vi khuẩn có thể sản xuất ra các chất điều hòa sinh trưởng Tuy nhiên, việc tiếp nhận chất dinh dưỡng

từ vi sinh cũng góp phần tăng cường sự phát triển của cây trồng

Các nghiên cứu đã tìm thấy vi sinh vật cộng sinh rễ làm tăng hiệu quả hấp thu chất dinh dưỡng và cho phép cây trồng tồn tại trong môi trường dinh dưỡng thấp Do đó VSV cộng sinh trực tiếp góp phần loại trừ cạnh tranh của các loại cây khác (O’Connor, Smith, and Smith 2002) Vi khuẩn Rhizosphere làm thay đổi sự sẵn có của các dạng nitơ hoặc phốt pho trong đất và ảnh hưởng đến tương

tác thực vật-thực vật thông qua việc hòa giải phân vùng tài nguyên (Reynolds et

al 2003) Tài nguyên đất cũng có thể được chuyển giao bởi các loại nấm cộng sinh chung được gọi là mạng mycorrhizal phổ biến (CMNs) (Simard and Durall 2011)

2.2.4 Các nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh trong và ngoài nước

Ở Việt Nam, hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về vi sinh vật nội sinh ở nhiều loại cây trồng Vào năm 2011, Đỗ Kim Nhung và Vũ Thành Công đã nghiên cứu khảo sát khả năng sinh tổng hợp IAA và cố định đạm của vi khuẩn Gluconacetobacter sp và Azospirillum sp được phân lập từ cây mía được thực hiện nhằm sản xuất phân bón vi sinh Qua nghiên cứu 14 dòng vi khuẩn

Gluconacetobacter sp và 12 dòng Azospirillum sp đã chọn ra được 2 dòng A1

và G10 vừa có khả năng tổng hợp IAA vừa có khả năng cố định đạm đạt mức cao nhất (Đỗ Kim Nhung và Vũ Thành Công, 2011) Vào năm 2013, Nguyễn Thị Huỳnh Như, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Minh Đời, Trần Nguyễn Nhật Khoa và Thái Trần Phương Minh đã nghiên cứu khảo sát 43 dòng vi khuẩn nội sinh được phân lập từ rễ chuối trồng ở Đồng bằng sông Cửu Long để sản xuất phân bón vi sinh Qua khảo sát, tất cả các dòng vi khuẩn đều có khả năng sinh tổng hợp IAA và cố định đạm (Nguyễn Thị Huỳnh Như, Nguyễn Hữu Hiệp, Nguyễn Minh Đời, Trần Nguyễn Nhật Khoa và Thái Trần Phương Minh, 2013) Năm 2019, Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh và Nguyễn Hữu Hiệp đã tiến hành nghiên cứu 100 dòng vi khuẩn nội sinh được lấy từ rễ, lá, trái cây cà phê tại Đắk Lắk để nghiên cứu sản xuất phân bón vi sinh phù hợp giúp tăng năng xuất cây cà phê Nhận thấy, dòng L.R150-3 có khả năng tổng hợp NH4+ cao nhất là 0,289 mg/L; dòng B.R157-2 có khả năng phân giải lân khó tan đạt 4,3 mg P2O5/mL; dòng L.R150-1 có khả năng sinh tổng hợp IAA tốt đạt 19,206 μg/mL Ba dòng L.R150-3, B.R157-2 và L.L150-1 được nhận diện theo thứ tự là Kosakonia sp L.R150-3, Burkholderia sp B.R157-2 và Enterobacter sp L.L150-1

Ở nước ngoài, (2016) Verbon và Liberman đã nghiên cứu về sự tương tác giữa rễ cây và vi khuẩn có lợi trong rhizosphere của chúng định hình thành phần cộng đồng vi khuẩn, và tăng cường sự phát triển của thực vật và bảo vệ mầm bệnh thực vật Rhizobacteria thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGPR) ảnh hưởng đến sự phân chia và biệt hóa tế bào dẫn đến những thay đổi trong kiến trúc hệ thống rễ, góp phần tăng cường tăng trưởng chồi Những thay đổi này được thiết lập bằng cách thay đổi các con đường tín hiệu nội sinh thực vật (Verbon and Liberman 2016) Năm 2009, B Ali,A.N Sabri,K Ljung,S Hasnain đã nghiên

cứu về tiềm năng của các chủng vi khuẩn Bacillus, Pseudomonas, Escherichia, Micrococcus và Staphylococcus để giúp tăng năng xuất và chất lượng cây nông

nghiệp Nghiên cứu đã thực hiện xác định hàm lượng IAA nội sinh và kết quả các chủng vi khuẩn đều có khả năng làm tăng hàm lượng IAA nội sinh và phát

triển của T aestivum var Inqalab-91

2.3 Giới thiệu về nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào là phương pháp nuôi cấy tế bào sử dụng môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng Trong môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hormones tăng trưởng

và đường Việc nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào thực vật có rất nhiều ý nghĩa

quan trọng trong việc tái tạo hoặc phát triển các giống loài ưu việt hơn

2.3.1 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa các giả thuyết của Schleiden

và Schwann vào thực nghiệm để chứng minh tính toàn thế của tế bào, nhưng ông

đã thất bại khi nuôi cấy các tế bào lá một số cây một lá mầm Ngày nay, hiểu được nguyên nhân thất bại của ông là do cây một lá mầm rất khó nuôi cấy và ông còn sử dụng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh

Năm 1934, White (Người Mỹ) nuôi cấy thành công đầu rễ cà chua

(Lycopersium esculentum) trong một thời gian dài Mở ra giai đoạn thứ hai trong

nuôi cấy mô tế bào thực vật Cũng trong thời gian này, ở Pháp đã tiến hành nuôi cấy mô tế bào tượng tầng một số cây gỗ và nhận thấy tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo của IAA và nhóm ba vitamin B do White đề nghị: Thiamin (B1), Pyridoxin (B6), Nicotinic acid Việc phát hiện IAA, NAA, 2,4-D và Kinetin cũng như vitamin và nước dừa chính là bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ hai Trong năm 1945 - 1954, kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn (các tế bào sống độc lập không dính vào tế bào khác) đã được phát triển Nuir, Hildebrandt

và Riker đã tách các tế bào của mô sẹo thành một huyền phù các tế bào đơn bằng cách lắc trên máy lắc Skoog và Miller đã công bố nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ Cytokinin/Auxin (1954) Tỷ lệ này thấp sẽ ảnh hưởng đến rễ và nếu tỷ lệ cao sẽ kích thích tạo chồi từ mô sẹo Từ đó mở ra giai đoạn thứ 3 cho nuôi cấy mô tế bào thực vật

Năm 1956, Nickell nuôi cấy liên tục được huyền phù tế bào đơn cây đậu

(Phaseolus vulgaris)

Năm 1959, Melchers và Beckman đã nuôi các tế bào đơn liên tục trong bình sục khí có dung tích khá lớn liên tục và sau một thời gian nhất định sẽ thu hoạch tế bào, sau đó dung dịch dinh dưỡng mới được bổ sung thêm

Năm 1960, Morel đã nuôi cấy các đỉnh sinh trưởng của các loài địa lan

(Cymbidium) và hình thành các Protocorm Khi cắt và nuôi cấy tiếp sẽ hình

thành nên Protocorm mới Hình thành cây lan con sau khi nuôi cấy trong một điều kiện thích hợp Kỹ thuật này cũng có thể sử dụng với một số cây trồng như khoai tây, dâu tây, cây ăn quả và nhiều loại cây nhân giống vô tính khác Cùng năm đó, Bergman công bố có thể sử dụng phương pháp lọc đơn giản để thu được huyền phù không có các tế bào dính cụm Nhờ kỹ thuật của Bergman,

nhiều tác giả khác cũng đã thành công trong việc tạo cây hoàn chỉnh từ một tế bào và chứng minh được tính toàn năng của tế bào thực vật

Năm 1964, Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được

cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà Datura Kỹ thuật này đã được sử

dụng tạo dòng đơn bội (1x), dòng thuần nhị bội kép (2x), cố định ưu thế lai Năm 1972, Carlson và CS lần đầu tiên lai tế bào soma giữa các loài, tạo

được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N.langsdorfii Melchers và cs (1978) lai xa tế bào trần cây thuốc lá và cà chua

tạo ra cây lai soma “Cà chua thuốc lá”

Từ năm 1980-1992 hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gene thực vật được công bố Nhờ các plasmid, phân tử DNA vòng thường có trong các tế bào vi khuẩn, được lắp ghép, cấu trúc lại sao cho plasmid gắn thêm một gene xác định và đã thành công

Ngoài ra, có nhiều phương pháp chuyển gene khác như: Kỹ thuật sử dụng xung điện (electroporation), kỹ thuật vi tiêm (micro injection), sử dụng siêu âm (ultrasonic gene transfer), súng bắn gene (particle gun) đang được phát triển mạnh tại các phòng thí nghiệm trên thế giới và đạt kết quả tốt

Ngày nay, chúng ta đang bắt đầu giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô tế bào thực vật Khi nuôi cấy mô được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn để chọn giống, nhân giống, bảo tồn giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào nghiên cứu lý luận di truyền bậc cao

b Việt Nam

Theo Phạm thanh Huyền (2008) thì nuôi cấy mô tại Việt Nam đã phát triển

và đạt được nhành thành tựu sau:

Sau năm 1975, nước ta mới bắt đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, viện Khoa học Việt Nam do Tiến sĩ Lê Thị Muội khới xuống

Bước đầu phòng tập trung nghiên cứu các phương pháp cơ bản như nuôi cấy bao phấn, nuôi cấy mô sẹo, Protoplast Thành công nuôi cấy bao phấn lúa và

thuốc lá được công bố vào năm 1978 (Lê Thị Muội và ctv,1978; Lê Thị xuân và ctv, 1978; Nguyễn Đức Thành và lê Thị Muội, 1980,1981)

Tại phân Viện Khoa học Việt Nam ở TPHCM, Đai học Nông nghiệp I Hà Nội và Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt nam và các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào cũng được thành lập, tập trung chủ yếu vào vi nhân giống khoai tây

Đến nay có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tại Viện nghiên cứu Viện

Di truyền Nông nghiệp, Viện Rau Quả Trung Ương và ở một số tỉnh với các cở

sở sản xuất như Đà Lạt, Yên Bái, Hưng Yên, thanh Hóa, Cần Thơ, Nghệ Tĩnh Giữa 1980 đến nay, nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh mẽ Trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây đã đạt được những kết quả đáng khích lệ tại Viện Công nghệ sinh học, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Lâm nghiệp Một số kết quả đã được ghi nhận trong lĩnh vực chọn dòng tế bào kháng bệnh (Lê Bích Thủy và ctv,1994), chọn dòng chịu muối, chịu mất nước (Nguyễn Tường Vân và ctv, 1994; Định Thị Tòng và ctv,1994) Các kết quả về dung hợp tế bào trần, chuyển gen lục lạp cũng thu được kết quả lý thú (Nguyễn Đức Thành và ctv, 1993, 1997) Nuôi cấy bao phấn đã tạo dòng thuần

đã được ứng dụng nhiều tại Viện Công nghệ Sinh học và Di truyền giống Nông nghiệp

 Giúp tái sinh các loài cây hoàn chỉnh từ những tế bào thực vật đã được biến đổi gen, tạo ra các loài mới tốt hơn

 Giúp làm sạch viruss ở cây, tăng năng suất và làm nguồn nguyên liệu

2.3.3 Ứng dụng nuôi cấy mô

Nhờ những ưu điểm trên, nuôi cấy mô tế bào đang được áp dụng ngày càng rộng rãi trong cả nghiên cứu và sản xuất Phương pháp nuôi cấy phấn và chồi được áp dụng để tạo ra các loài cây cảnh với số lượng lớn

Dựa trên cơ sở tế bào học của nuôi cấy mô, các nhà khoa học có thể bảo tồn được giống cây quý hiếm hoặc đang bị đe dọa Đồng thời các nhà khoa học

có thể sàng lọc được những cây có tính trạng tốt, tạo ra các dược phẩm sinh học hay cứu phôi của một số loài khó sinh trưởng

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

- Giống khoai tây Solara in vitro

- 14 mẫu giống vi sinh vật được phân lập tại Viện Công nghệ sinh học

Bảng 3.1 Danh sách các mẫu giống vi sinh vật dùng trong nghiên cứu

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Nghiên cứu khả năng phân giải lân của các mẫu giống vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây

3.3.2 Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp IAA của các mẫu giống vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây

3.3.3 Nghiên cứu khả năng cố định đạm của các mẫu giống vi sinh vật nội sinh trong cây khoai tây

3.3.4 Đánh giá khả năng kích thích nảy mầm trên cây rau cải ngọt

3.3.5 Đánh giá khả năng kích thích nảy mầm trên cây rau cải cúc

3.3.6 Đánh giá khả năng kích thích nảy mầm trên cây rau mùi

3.3.7 Nghiên cứu sự ảnh hưởng của vi sinh vật đến sự sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây in vitro

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp nuôi vi khuẩn

a Hoạt hóa vi khuẩn bằng môi trường LB (Luria-Bertani)

Sử dụng môi trường nuôi cấy LB đặc (Luria-Bertani) để hoạt hóa vi khuẩn

đang được bảo quản trong dung dịch glyxerol 30%

Cách pha chế: Hòa tan hoàn toàn các thành phần, đun sôi, chuẩn độ pH

7,0 Sau đó hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,0 atm trong 20 phút

Dụng cụ: Đĩa peptri (đã hấp vô trùng), que cấy, đèn cồn, box cấy vô trùng Cách tiến hành: Các bước tiến hành thí nghiệm được thực hiện trong box

cấy vô trùng Đổ môi trường LB ra đĩa peptri, sau đó cấy ria vi sinh vật lên môi trường LB đặc Nuôi cấy trong điều kiện tủ nuôi 30oC Kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật sau 48 tiếng

b Phương pháp nuôi vi khuẩn trong môi trường Pikovskaya (PVK)

Sử dụng môi trường nuôi cấy PVK đặc để xác định định tính khả năng phân giải Lân của vi sinh vật

Thành phần môi trường Pikovskaya (g/L)

Ca3(PO4)2 5g (NH4)2SO4 0,5g

MgSO4.7H2O 0,1g

MnSO4H2O 0,002g FeSO47H2O 0,002g

Cách pha chế: Hòa tan hoàn toàn các thành phần, chuẩn độ 6,8 – 7,0 và

hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,0 atm trong 20 phút

Dụng cụ: ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, box cấy vô trùng

Cách tiến hành: Các bước tiến hành thí nghiệm được thực hiện trong box

cấy vô trùng Đổ môi trường vào đĩa peptri, sau đó cấy điểm vi sinh vật vào môi trường PVK Nuôi cấy trong điều kiện tủ nuôi 30oC Kiểm tra sự phát triển của

vi sinh vật sau 72 giờ nuôi cấy

Cách thực hiện: Để xác định định tính các mẫu giống VSV có khả annwg

phân giải lân hay không Xác định bằng vòng sáng qua điểm cấy VSV trên môi trường PVK Nếu trên bề mặt đĩa môi trường có vòng sáng chính tỏ mẫu giống VSV đó có khẳ năng phân giải Lân và ngược lại Khi vòng sáng có bán kính càng rộng thì chính tỏ mẫu giống VSV đó có khả năng phân giải lân càng mạnh

c Phương pháp nuôi vi khuẩn trong môi trường LB lỏng có chứa

Cách pha chế: Hòa tan hoàn toàn các thành phần, chuẩn độ pH 6,8-7,0 và

đong vào ống nghiệm 10ml có nắp đậy Hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,0 atm trong 20 phút

Dụng cụ: Ống nghiệm 10ml, que cấy, đèn cồn, box cấy vô trùng

Cách tiến hành: Các bước tiến hành thí nghiệm được thực hiện trong box

cấy vô trùng Cấy vi sinh vật vào ống nghiệm có sẵn môi trường LB + tryptophan Nuôi cấy trong điều kiện tủ lắc, 30oC, 300 vòng/phút Kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật sau 48 giờ nuôi cấy

Cách thực hiện: Để xác định nồng độ IAA có trong dịch lên men dựa theo

phương pháp của Brick và cộng sự (Brick JM, 1991) Dịch sau khi lên men được

ly tâm tốc độ 10000 vòng/10 phút ở 4oC Hút 500µl dịch trong vào ống eppendorf mới, bổ sung thêm 500µl thuốc thử Salkowski (FeCl3 0.5 M : HClO4 35% - 2:100) Ủ mẫu trong buồng tối 30 phút tại nhiệt độ phòng Sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng λ= 530nm, xác định nồng độ IAA dựa vào phương trình đường chuẩn

Đường chuẩn IAA được dựng trên các mẫu có chứa nồng độ IAA chuẩn khác nhau, sau đó bổ sung thuốc thử Salkowski, sau thời gian ủ đo OD ở bước sóng λ= 530nm, kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Bảng số liệu đo nồng độ IAA ở bước sóng 530nm

Hình 3.3 Đồ thị phương trình đường chuẩn IAA

d Phương pháp nuôi vi khuẩn trong môi trường Burk

Sử dụng môi trường Burk lỏng không đạm (Park et al.,2005) được sử dụng

để nuôi các dòng vi khuẩn và đánh giá khả năng cố định đạm

0 0.013 0.032

0.073

0.115

0.147

y = 0.0191x - 0.0034 R² = 0.9973

-0.02 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16

Thành phần môi trường Burk không đạm lỏng

Na2MoO4.2H2O 0,0025g

Cách pha chế: Đun sôi, hòa tan hoàn toàn các thành phần, chuẩn độ pH

6,8-7,0 Hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,0 atm trong 20 phút

Dụng cụ: ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, box cấy vô trùng

Cách tiến hành: Các bước tiến hành thí nghiệm được thực hiện trong box

cấy vô trùng Cấy vi sinh vật vào ống nghiệm có sẵn môi trường Burk không đạm lỏng Nuôi cấy trong điều kiện tủ lắc, 30oC Kiểm tra sự phát triển của vi sinh vật sau 6 ngày nuôi cấy

Cách thực hiện: Các bước thực hiện theo công thức của Solarzano (1969)

Tỉ lệ mẫu và thuốc thửu được sử dụng theo khuyến cáo nhưng thể tích mẫu và thời gian ổn định mẫu đã được sửa đổi Quy trình thí nghiệm có thể chia làm 3 bước: chuẩn bị thuốc thử, xây dựng đường chuẩn, đo và xử lí kết quả

- Chuẩn bị thuốc thử: Pha thuốc thử dưới dạng các “stock” riêng biệt để

bảo quản Mỗi lần đo mẫu sẽ pha trộn các stock với nhau theo tỉ lệ nhất định để

sử dụng Chuẩn đạm cần dùng 3 loại hỗn hợp hỗn hợp thuốc thử: (1) dung dịch

‘phenol-ethanol’, (2) dung dịch nitroprusside, (3) dung dịch oxide hóa

Để pha dung dịch (1): hòa tan 10g phenol với cồn 95% v/v, thêm nước cất cho đủ thể tích 100ml

Để pha dung dịch (2): hòa tan 1g sodium nitroprrusside dihydrate (Na2[Fe(CN)5NO].2H2O) (Sigma-Aldrich) trong nước DI cho đủ thể tích 200

mL, bảo quản trong lọ tối màu và sử dụng tối đa trong vòng một tháng Lưu ý,

do phenol và nitroprusside đều có tính độc, do vậy nên thực hiện pha chế và sử dụng thuốc thử một cách cẩn thẩn

Để pha dung dịch (3): hỗn hợp chất oxide hóa mạnh gồm hỗn hợp hai loại chất kiềm (trisodium citrate và sodium hydroxide) được pha với một loại chất tẩy rửa chứa ít nhất 1,5N sodium hypoclorite Hòa tan 100g trisodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7.2H2O) và 5g sodium hdroxide (NaOH) trong nước DI cho

đủ 500 Ml, tiếp theo trộn hỗn hợp kiềm này với nước Javel 10-12% NaClO theo

tỉ lệ 4:1 và dùng luôn

- Xây dựng đường chuẩn: Chuẩn bị 6 ống nghiệm, đánh số từ 0-5 Cho

nước cất vào 6 ống nghiệm với thể tích lần lượt là 4,00; 3,95; 3,90; 3,85; 3,80; 3,75 (ml) và một lượng dung dịch NH4+ chuẩn 100ppm [10ml Ammonium Standard Solution 119812 9Certipur® Merck Milipore) 1000 ppm, trong 90 ml nước cất] với thể tích lần lượt là 0,00; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 (ml) sodium nitroprusside (2) và 0,5ml dung dịch oxide hóa (3) Khi đó, nồng độ NH4+ của

đường chuẩn lần lượt sẽ là 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 (mg/l)

Bảng 3.4 Thành phần thuốc thử và nồng độ của đường chuẩn NH 4 +

NH4+ chuẩn 100ppm (ml) 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 Phenol-ethanol (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 Sodium nitroprusside (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 Dung dịch oxide hóa (ml) 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50 Nồng độ NH4+ (mg/l) 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00

- Đo và xử lí kết quả: Dịch nuôi cấy vi sinh vật đã lên men sau 6 ngày

nuôi cấy, lấy 5ml cho vào ống eppendorf, ly tâm với tốc độ 12.000 rpm trong 5 phút để lắng tế bào vi khuẩn, chiết rút phần dịch trong để tiến hành phản ứng màu Thực hiện phản ứng tạo màu bằng cách hút 1ml mẫu (dịch huyền phù vi

khuẩn đã lắng tế bào) cho vào ống nghiệm Thêm 3ml nước cất và 1ml hỗn hợp thuốc thử với thành phần và tỉ lệ như Bảng 3.4 ở trên Trộn đều hỗn hợp bằng máy vortex, để ổn định 30 phút Sau đó tiến hành đo OD ở bước sóng λ= 640nm, xác định nồng độ NH4+ dựa vào phương trình đường chuẩn

-0.05

0 0.05