(Luận văn) đặc điểm hla và kháng thể kháng hla trên bệnh nhân ghép thận tại bệnh viện trung ương thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ------ LÂM THỊ THU HƯƠNG ĐẶC ĐIỂM HLA VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG HLA TRÊN BỆNH NHÂN GHÉP THẬN TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN LUẬN VĂ

Trang 1

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

- -

LÂM THỊ THU HƯƠNG

ĐẶC ĐIỂM HLA VÀ KHÁNG THỂ KHÁNG HLA

TRÊN BỆNH NHÂN GHÉP THẬN TẠI BỆNH VIỆN

TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên - 2020

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào Mọi kết quả thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành tại Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên dưới sự hướng dẫn tận tình của TS Nguyễn Thị Ngọc Hà, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới Cô, người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết để hướng dẫn tận tình, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và viết bản luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học cùng toàn thể các thầy cô trong và ngoài trường đã giảng dạy giúp tôi trau dồi thêm rất nhiều kiến thức phục vụ cho việc học tập và nghiên cứu của bản thân Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy, Cô

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu

và làm luận văn

Xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2020

Học viên

Lâm Thị Thu Hương

Trang 4

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình suy thận mạn trên thế giới và ở Việt Nam 3

1.2 Bệnh thận mạn và suy thận mạn giai đoạn cuối 3

1.2.1 Chẩn đoán bệnh thận mạn và suy thận mạn giai đoạn cuối 3

1.2.2 Các giai đoạn của suy thận mạn 5

1.2.3 Các biến chứng của suy thận mạn giai đoạn cuối 6

1.2.4 Các phương pháp điều trị thay thận 7

1.3 Khái quát về ghép thận 9

1.3.1 Đại cương 9

1.3.2 Vai trò của sự hòa hợp HLA trong ghép thận 12

1.3.3 Kiểu gen miễn dịch, sự hòa hợp tổ chức trong ghép thận 13

1.3.4 Biến chứng của ghép thận 13

1.4 Phức hợp hòa hợp tổ chức chính (MHC) hay kháng nguyên bạch cầu người (HLA) 15

1.4.1 Giải phẫu vùng gen 15

1.4.2 Cấu trúc phân tử của HLA 17

1.4.3 Chức năng HLA 21

1.5 Các kỹ thuật xác định HLA - MHC 22

1.5.1 Kỹ thuật huyết thanh học – Thử nghiệm gây độc lympho bào 22

1.5.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử 23

1.5.3 Kỹ thuật PCR - SSP 24

1.5.4 Độ mẫn cảm trước ghép của người nhận 24

Trang 5

1.5.5 Kỹ thuật tiền mẫn cảm bằng kỹ thuật Miễn dịch – gắn men

(ELISA) (Panel reactive antibody test by ELISA) 25

1.5.6 Kỹ thuật thực hiện LABSCREEN kit (tìm kháng thể kháng HLA) 25

1.6 Các phương pháp theo dõi thận, đánh giá chức năng thận ghép 26

1.7 Tình hình nghiên cứu ghép thận ở Việt Nam 27

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng 28

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 28

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 28

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

2.2.1 Địa điểm nghiên cứu 28

2.2.2 Thời gian nghiên cứu: 28

2.3 Các chỉ tiêu nghiên cứu 29

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

2.4.1 Phương pháp thu thập số liệu 29

2.4.2 Phương pháp xử lý số liệu 29

2.4.3 Kỹ thuật định type HLA độ phân giải cao cho 1 Locus (A, B, C, DR, DQ, DP) bằng kỹ thuật PCR - SSO 29

2.4.4 Kỹ thuật thực hiện LABSCREEN kít của ONE LAMDA (Kháng thể kháng HLA) 32

2.4.5 Định lượng Creatinin máu 34

2.4.6 Định lượng ure máu 34

2.5 Sơ đồ nghiên cứu 35

2.6 Tuân thủ các vấn đề về đạo đức trong nghiên cứu 36

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 37

Trang 6

3.1 Đặc điểm chung về tuổi, giới, BMI của người cho thận và người nhận

thận 37

3.2 Đặc điểm HLA và sự hòa hợp HLA trên các cặp ghép thận 39

3.3 Đặc điểm kháng thể kháng HLA của người nhận thận 43

3.4 Liên quan giữa type HLA với chức năng thận người nhận thận sau ghép 44

3.5 Sử dụng thuốc ức chế miễn dịch ở bệnh nhân ghép thận 47

3.6 Liên quan giữa kháng thể kháng HLA với nồng độ Creatinin người nhận sau ghép 49

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 50

1 Kết luận 50

2 Khuyến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

Trang 7

DANH MỤC VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamin tetraacetic acid ELISA Enzyme-linked Immunosorbent assay

HLA Human Leucocyte Antigen MHC Major Histocompatibility Complex PCR Polymerase chain reaction

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SSO Sequence Specific Oligoprobes

SSP Sequence Specific primers SAPE (R-Phycoerythrin-Conjugated Streptavidin)

PE P-Phycoerythrin MDRD Modification of Diet in Renal Diseases BMI Body Mass Index

Trang 8

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Giai đoạn suy thận mạn tính theo mức lọc cầu thận 5

Bảng 3.1 Đặc điểm chung về tuổi, BMI của người cho thận 37

và người nhận thận 37

Bảng 3.2 Đặc điểm chung về giới của người cho thận và người nhận thận 37

Bảng 3.3 Quan hệ giữa người cho thận và người nhận thận 39

Bảng 3.4 Tỷ lệ tương thích HLA trên các cặp ghép thận 40

Bảng 3.5 Sự hòa hợp HLA theo lớp 41

Bảng 3.6 Phân bố HLA theo huyết thống 42

Bảng 3.7 Đặc điểm kháng thể kháng HLA của người nhận thận 43

Bảng 3.8 Nồng độ Creatinin và Ure huyết thanh sau ghép ở các thời điểm 44

Bảng 3.9 Liên quan giữa sự hòa hợp HLA và nồng độ ure huyết thanh sau ghép 45

Bảng 3.10 Liên quan giữa số lượng các alen HLA hòa hợp với chức năng thận sau ghép (nồng độ creatinin sau ghép) 46

Bảng 3.11 Liều Tac và nồng độ Tac ở bệnh nhân ghép thận 47

Bảng 3.12 Liên quan giữa số lượng các alen HLA hòa hợp với nồng độ thuốc ức chế miễn dịch Tac ở các cặp ghép thận 48

Bảng 3.13 Liên quan giữa kháng thể kháng HLA với nồng độ Creatinin người nhận sau ghép 49

Trang 9

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh sau ghép thận 11

Hình 1.2: Vùng HLA của nhiễm sắc thể 6 (healthvietnam.vn) 16

Hình 1.3 Tóm tắt cấu trúc hệ HLA (healthvietnam.vn) 18

Hình 1.4 Phức hệ MHC loại I (vi.wikipedia.org) 19

Hình 1.5 Phức hệ MHC loại II (vi.wikipedia.org) 20

Hình 3.1 Tỷ lệ ghép thận ở nam và nữ 37

Hình 3.2 Phân bố độ tuổi lúc ghép thận 38

Trang 10

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Ghép thận được xem là phương pháp điều trị thay thế thận suy giai đoạn cuối hiệu quả nhất, không những thay thế chức năng bài tiết mà còn hồi phục chức năng nội tiết của thận Ghép thận là đỉnh cao tiến bộ của y học nói chung

và của ngành thận học, niệu học, miễn dịch học nói riêng Nhờ những hiểu biết về cơ chế thải ghép và những phát minh các thuốc giảm miễn dịch mới, ghép thận có nhiều thành công Nguồn thận cho có thể từ người sống hoặc người chết não Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng đã cho thấy rằng ghép thận đã giảm đáng kể nguy cơ tử vong, bệnh tim mạch cũng như cải thiện chất lượng cuộc sống so với lọc máu chu kì [1], [15], [27]

Trên 60 năm kể từ thành công hai trường hợp ghép thận ở Boston giữa những anh chị em sinh đôi khác trứng hiện nay trên thế giới đã có trên 400.000 trường hợp ghép [15], [27] Trong ghép tạng nói chung và ghép thận nói riêng, sự hòa hợp miễn dịch là rất quan trọng, được coi là tiêu chuẩn bắt buộc và quyết định đến sự thành công của ca ghép Để đánh giá sự hòa hợp về

mặt miễn dịch, xét nghiệm HLA (Human leucocyte antigen) - kháng nguyên

bạch cầu người là xét nghiệm cơ bản nhất trong tuyển chọn cặp ghép cho và

nhận HLA là một nhóm gen mã hoá cho các protein trình diện kháng

nguyên trên bề mặt tế bào của đa số động vật có xương sống Những protein này đóng vai trò quan trọng trong tổ chức miễn dịch của cơ thể cũng như

những cơ chế giao tiếp giữa các tế bào HLA là protein quan trọng liên quan

đến thải ghép, đặc biệt trong những năm đầu sau ghép Việc lựa chọn cặp ghép phù hợp kết hợp dùng thuốc ức chế miễn dịch sẽ làm tăng tỷ lệ thành công của cuộc ghép [1], [15], [17], [27]

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về HLA trong ghép tạng, tuy nhiên

còn nhiều quan điểm khác nhau Ở Việt Nam, số lượng những nghiên cứu

Trang 11

này còn ít và chưa thấy rõ được mối liên quan giữa HLA và chức năng thận

sau ghép Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên hiện nay đã thực hiện được trên 25 ca ghép thận thành công, tuy nhiên chưa nhiều nghiên cứu đánh giá về

vấn đề này Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Đặc điểm HLA và

kháng thể kháng HLA trên bệnh nhân ghép thận tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích mối liên quan giữa đặc điểm HLA và kháng thể kháng HLA với chức năng thận sau ghép

3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định đặc điểm HLA và kháng thể kháng HLA của các ca ghép thận

tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên

- Phân tích mối liên quan giữa mức độ hòa hợp HLA lên chức năng

thận sau ghép

Trang 12

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình suy thận mạn trên thế giới và ở Việt Nam

Thận là cơ quan quan trọng đảm nhiệm chức năng bài tiết chất độc ra khỏi cơ thể qua đường nước tiểu, điều hòa huyết áp, cân bằng lượng kiềm, lượng nước trong cơ thể đồng thời giúp điều hòa chuyển hóa các chất dinh dưỡng như caxi - photpho và quan trọng nhất đó là một trong những cơ quan

quan trọng để duy trì cuộc sống cho con người [10], [15], [27] Suy thận xảy

ra khi chức năng lọc máu của thận bị suy giảm khiến các chất độc hại đọng lại trong cơ thể

Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh – CDC, năm 2019 ở Mỹ có khoảng 37 triệu người mắc suy thận mạn chiếm tỷ

lệ 15,0% trong tổng số người lớn ở Mỹ Thống kê ở Pháp mỗi năm có khoảng 4.800 đến 6.000 ca mới mắc suy thận mạn Nhật và Đài Loan khoảng 2.400 ca [9], [33] Tại Việt Nam, ước tính khoảng 8 triệu người mắc suy thận mạn chiếm khoảng 10% dân số trong đó có 3,1% đến 3,6% suy thận mạn tiến triển

từ giai đoạn III đến giai đoạn V [47], [53]

1.2 Bệnh thận mạn và suy thận mạn giai đoạn cuối

1.2.1 Chẩn đoán bệnh thận mạn và suy thận mạn giai đoạn cuối

Năm 2012, hội thận học Mỹ (NKF/KDIGO-2012) (Kidney disease improving global outcomes) đưa ra tiêu chuẩn mới nhất chẩn đoán xác định suy thận mạn như sau [22]: Suy thận mạn tính được xác định khi có sự bất thường của thận về cấu trúc và chức năng kéo dài trên 3 tháng

Các tiêu chuẩn để chẩn đoán suy thận mạn tính:

- Các biểu hiện cho thấy thận bị tổn thương và phải kéo dài trên 3 tháng (một hoặc nhiều biểu hiện):

+ Có albumin niệu (≥30mg/24 giờ, [≥3mg/mmol/24 giờ])

+ Các bất thường phát hiện bởi mô bệnh học khi làm sinh thiết thận

Trang 13

+ Những bất thường về cấu trúc thận được phát hiện bởi chẩn đoán hình ảnh + Có tiền sử ghép thận

- Giảm mức lọc cầu thận (MLCT)l<60 ml/phút/1,73 m2 mà không cần biết đến các biểu hiện của thận bị tổn thương hay không

Suy thận mạn giai đoạn cuối là khi MLCT<15ml/phút (giai đoạn V) Bệnh nhân giai đoạn này bắt buộc phải điều trị thay thế thận suy

Có 3 công thức tính MLCT tính trên lâm sàng:

+Dùng công thức tính Cockroff- Gault

P cre : Nồng độ creatinin trong huyết thanh tính bằng µmol/lít

Nếu hiệu chỉnh tính với diện tích da Diện tích d: [Cân nặng (kg) x chiều cao (cm)/3600]1/2(m2) Mức lọc cầu thận x 1,73/diện tích da = mức lọc cầu thận ước tính ml/phút/1,73m2

+ Công thức tính MDRD (Modification of Diet in Renal Diseases) để tính MLCT ước tính ml/phút/1,73m2

186 x (creatinin huyết thanh micromol/l x 72)-1,154 x (tuổi)-0,203 x 0,742 (nếu là nữ) x 1,21 (nếu là người da đen)

+ Dùng công thức tính CKD-EPI dùng cho người da trắng và da vàng Nữ: nếu creatinin huyết thanh ≤ 0,7 mg/dl thì mức lọc cầu thận ước tính

= 144 x (creatinin huyết thanh)-0,329 x (0,993)tuổi, nếu creatinin huyết thanh

>0,7mg/dl thì mức lọc cầu thận ước tính =144 x (creatinin huyết thanh)-1,209 x (0,993)tuổi

Trang 14

Nam: nếu creatinin huyết thanh ≤ 0,9 mg/dl thì mức lọc cầu thận ước tính = 141 x (creatinin huyết thanh)-0,411 x (0,993)tuổi, nếu creatinin huyết thanh >0,9mg/dl thì mức lọc cầu thận ước tính =141 x (creatinin huyết thanh)-

Trần Thị Bích Hương thấy cách tính MLCT ước tính theo công thức Cockcroft-Gault và MDRD có thể áp dụng được trong lâm sàng ở Việt Nam với ưu điểm là thông báo được trực tiếp kết quả từ phòng xét nghiệm sinh hóa cùng với kết quả của creatinin huyết thanh [4] Hiện nay ở Mỹ đã có 75% các nơi làm xét nghiệm báo cáo hàng ngày MLCT ước tính để cho phép phát hiện được suy thận sớm và điều chỉnh liều thuốc điều trị [50]

1.2.2 Các giai đoạn của suy thận mạn: được phân chia theo hội thận học của

Mỹ năm 2012 dựa vào mức lọc cầu thận ước tính [22]

Bảng 1.1 Giai đoạn suy thận mạn tính theo mức lọc cầu thận

Giai đoạn Biểu hiện

MLCT (ml/phút/1,73m 2 ) Chỉ định điều trị

1

Tổn thương thận nhưng mức lọc cầu thận bình thường hoặc tăng

≥90

Chẩn đoán và điều trị các bệnh kết hợp, các yếu tố nguy cơ tim mạch, làm chậm quá trình tiến triển bệnh thận

2

Tổn thương thận làm giảm nhẹ mức lọc cầu thận

60-89

Kiểm soát các yếu tố nguy cơ, các bệnh kết hợp làm chậm tiến triển

bệnh thận

3 Giảm mức lọc cầu

thận mức độ vừa 30-59

Chẩn đoán và điều trị các biến chứng do bệnh

thận gây ra

Trang 15

Giai đoạn Biểu hiện

MLCT (ml/phút/1,73m 2 ) Chỉ định điều trị

4 Giảm nghiêm trọng

mức lọc cầu thận 15-29

Chuẩn bị các phương pháp điều trị thay thế

1.2.3 Các biến chứng của suy thận mạn giai đoạn cuối

- Thiếu máu: là sự giảm một hoặc nhiều thành phần chính của tế bào máu: nồng độ hemoglobin, hematocrit và số lượng hồng cầu Tổ chức y tế thế giới định nghĩa thiếu máu là hemoglobulin ở nam và ở nữ giới đã mãn kinh giảm dưới 13g/dl và dưới 12g/dl đối với phụ nữ đang hành kinh Thiếu máu trong bệnh thận mạn tính là thiếu máu đẳng sắc (thiếu máu chỉ giảm số lượng hồng cầu còn kích thước hồng cầu và số lượng hemoglobin tương đối bình thường) Tỉ lệ biểu hiện thiếu máu ở bệnh thận mạn giai đoạn cuối khoảng 70% [14], [24], [29], [42]

- Các biến chứng về tim mạch: Các bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối dễ bị xơ vữa mạch máu và do đó dễ mắc các bệnh có liên quan đến tim mạch và làm cho tiên lượng của bệnh xấu đi nhiều

+ Huyết áp tăng chiếm tới 80% ở bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Tăng huyết áp sẽ làm tăng nguy cơ suy tim đặc biệt là suy tim trái

+ Bệnh lý mạch vành: Suy vành và nhồi máu cơ tim do rối loạn chuyển hóa lipid máu Chẩn đoán các biến chứng về mạch vành chủ yếu dựa vào điện tâm đồ, chụp mạch vành

+ Bệnh lý van tim: Do vôi hóa van và các tổ chức dưới van Ngoài ra giãn các buồng tim cũng gây ra bệnh lý van tim Vôi hóa van 2 lá thường gặp hơn cả

Trang 16

tiếp đến là vôi hóa van động mạch chủ gây ra hẹp hoặc hở van Chẩn đoán dựa trên siêu âm tim

+ Viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn: Siêu âm tim và nhất là siêu âm tim qua thực quản sẽ giúp cho chẩn đoán biến chứng này

+ Rối loạn nhịp tim: Do rối loạn điện giải tăng kali máu, suy tim, bệnh mạch vành Kali máu tăng gây ra gây ra những rối loạn về nhịp tim và có thể

tử vong do ngừng tim đột ngột Tăng Kali máu thường xảy ra khi mức lọc cầu thận giảm dưới 20-25ml/phút/1,73 m2 Với MLCT này thì thận không thể đào thải được kali và có thể gây ra thiểu niệu hoặc vô niệu Kali máu có thể còn tăng cao hơn khi có sự toan máu và thiếu insulin

- Các biến chứng về tiêu hóa: chảy máu chân răng, xuất huyết tiêu hóa

- Các biến chứng về thần kinh:

+ Viêm thần kinh ngoại vi: tốc độ dẫn truyền thần kinh giảm, bệnh nhân

có cảm giác rát bỏng ở chân, kiến bò

+ Hôn mê do tăng ure máu cao là biểu hiện lâm sàng hay gặp ở bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối Ở giai đoạn tiền hôn mê bệnh nhân có thể

có co giật, rối loạn tâm thần, nói nhảm, tri giác giảm

- Các biến chứng về rối loạn điện giải, chuyển hóa:

Toan chuyển hóa hay gặp do tăng trong máu sulfat, phosphate, acid uric Toan chuyển hóa sẽ làm thay đổi hoạt động của các enzyme, tăng kali máu và làm rối loạn hoạt động của tim và màng thần kinh Toan chuyển hóa cũng do

tế bào của ống lượn gần giảm khả năng đào thải ammoniac Trên lâm sàng xét nghiệm khí máu để chẩn đoán [42]

1.2.4 Các phương pháp điều trị thay thận

Khi cả hai quả thận không còn chức năng và không có khả năng hồi phục gọi là suy thận giai đoạn cuối Vậy để duy trì cuộc sống, người bệnh cần phải

sử dụng một trong ba phương pháp chữa trị tốt nhất hiện nay đó là: chạy thận nhân tạo, lọc màng bụng và ghép thận Trong đó ghép thận là phương pháp

Trang 17

được điều trị ưu tiên cho bệnh nhận suy thận, chỉ với một quả thận mới phù hợp có thể đảm đương được tất cả các chức năng của 2 quả thận bị tổn thương kia và đời sống sau khi ghép thận thành công hầu như bình thường

Hiện nay tại Việt Nam cũng như trên thế giới có 3 phương pháp điều trị thay thế thận suy đó là phương pháp thận nhân tạo, lọc màng bụng và ghép thận

 Phương pháp thận nhân tạo

Chạy thận nhân tạo hiện nay vẫn là phương pháp điều trị suy thận mạn giai đoạn muộn được lựa chọn phổ biến nhất ở Việt Nam Đây là phương pháp lọc máu bằng cách tạo một vòng tuần hoàn ngoài cơ thể nhằm mục đích lấy đi những sản phẩm cặn bã và nước dư thừa nhờ các cơ chế: siêu lọc, khuếch tán, đối lưu rồi sau đó máu được dẫn trở lại cơ thể Như vậy để chạy thận nhân tạo chu kỳ thông thường sẽ được tạo một miệng nối giữa động mạch và tĩnh mạch Vị trí hay thực hiện miệng nối là giữa động mạch quay và tĩnh mạch đầu ở cổ tay

- Thận nhân tạo được hoạt động bằng cách máu của bệnh nhân được vào

bộ lọc, dịch lọc được bơm vào khoang đối diện với máu theo chiều ngược lại

Áp lực thủy tĩnh trong khoang máu cao hơn khoang dịch do bơm máu và bơm dịch tạo ra, làm nước từ khoang máu di chuyển sang khoang dịch đồng thời kéo theo các chất hòa tan Các chất như ure, creatinin, kali và các phân tử có trọng lượng phân tử thấp, có nồng độ cao trong máu sẽ khuếch tán từ khoang máu sang khoang dịch lọc do chênh lệch nồng độ riêng phần Sự khuếch tán phụ thuộc vào tính chất màng lọc, độ chênh nồng độ các chất cần lọc giữa máu và dịch lọc, tốc độ máu và tốc độ dịch lọc qua hai bên màng lọc

- Đa số bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối cần chạy thận nhân tạo từ 12-18 giờ/tuần và thường chia ra làm 3 lần chạy bằng nhau Như vậy, người bệnh phải đến nơi lọc máu trung bình 3 lần/tuần [27], [29]

Trang 18

 Lọc màng bụng

Lọc màng bụng là phương pháp đặt một catheter và đưa dịch lọc qua catheter này vào khoang màng bụng Lúc này màng bụng như một máy thận nhân tạo cho phép một số chất qua lại, trao đổi, dẫn tới đào thải các chất độc hại cho cơ thể vào dịch lọc mà sau một thời gian sẽ được rút ra khỏi khoang màng bụng bằng chính catheter đưa vào [16]

 Ghép thận

- Ghép thận là đưa vào cơ thể bệnh nhân suy thận mạn giai đoạn cuối một quả thận còn chức năng tốt Đây là phương pháp điều trị suy thận giai đoạn cuối hiệu quả, giúp cho người bệnh duy trì được cuộc sống bình thường và cùng với 2 phương pháp chạy thận nhân tạo và lọc màng bụng làm kéo dài thời gian sống của người bệnh

- Trên thế giới ghép thận được thực hiện từ năm 1993 Ở Việt Nam ghép thận thực hiện được tiến hành từ những năm 1960 nhưng mãi đến năm 1992

ca ghép thận đầu tiên thành công mới được thưc hiện tại bệnh viện 103 Đến năm 2000 số lượng ghép đã lên đến 31 ca được thực hiện ở 3 trung tâm bệnh viện 103, bệnh viện Chợ Rẫy và bệnh viện Việt Đức Từ đó đến nay đã có rất nhiều bệnh viện trên cả nước tiến hành ghép thận thành công và hiện nay đã

có hơn 1000 ca ghép thận được thực hiện tại Việt Nam

- Có 2 nguồn thận ghép: Thận cho từ người sống và người chết não Nguồn thận ghép cho đến hiện nay ít hơn nhiều so với nhu cầu ghép thận vì vậy tỷ lệ ghép thận thường thấp hơn so với các phương pháp điều trị thay thế thận khác [6], [7], [15]

1.3 Khái quát về ghép thận

1.3.1 Đại cương

Ghép thận là đỉnh cao tiến bộ của y học nói chung và của ngành thận học, niệu học, miễn dịch học nói riêng Đây là phương pháp điều trị được lựa chọn cho bệnh nhân suy thận giai đoạn cuối Ghép thận thành công sẽ mang

Trang 19

lại chất lượng cuộc sống tốt hơn và kéo dài tuổi thọ hơn so với lọc máu [1], [15], [27] Lịch sử phát triển năm 1902 tại Viên (Áo), Emerich Ullmann là người đầu tiên thông báo kết quả lấy thận chó ghép sang cừu Cùng năm Alexis Carrel đã thực hiện nhiều trường hợp ghép thận và được nhận giải thưởng Nobel năm 1912 về công trình ghép tạng thực nghiệm Sau đó, cùng với những thành tựu về miễn dịch học, sinh học phân tử, giải phẫu, sinh lý, gây

mê hồi sức và việc ứng dụng công nghệ hiện đại trong chẩn đoán điều trị, theo dõi bệnh nhân Phẫu thuật ghép tạng nói chung và đặc biệt là ghép thận trong nửa cuối thế kỷ XX càng ngày càng đạt được những kết quả đáng khích lệ mang lại cuộc sống có chất lượng cho những người suy thận Năm 1954 ca ghép thận trên người được tiến hành cho cặp anh em song sinh ở Boston do Josep Murray và Jonh Merril thực hiện Trên thế giới hiện nay những nước có

số lượng lớn ghép thận là Mỹ có khoảng 10.000 ca thận/năm, ở Pháp 2.000 ca thận/năm Ở châu Á ca ghép thận đầu tiên được thực hiện vào năm 1964 tại Nhật bản, hàng năm toàn châu Á ghép thận khoảng 8.000 ca Trong đó một số nước có số bệnh nhân ghép nhiều là Trung Quốc, Nhật bản, Ấn độ Ở Việt Nam, năm 1992 tại Viện Quân Y 103 - Học Viện Quân Y đã thực hiện 3 ca ghép thận đầu tiên thành công với sự tham gia của các bệnh viện Việt Đức, Chợ Rẫy, Trung ương Huế, Bạch Mai, Hữu nghị và Bệnh viện 108 Tiếp theo

là hai ca ghép thận được thực hiện thành công tại bệnh viện Chợ Rẫy

Trang 20

Để có được ca ghép thận thành công, điều quan trọng đầu tiên là người hiến thận và người nhận thận phải có sự hòa hợp về mặt miễn dịch Sự hòa hợp về mặt miễn dịch giữa các cá thể được đánh giá bằng sự tương thích về

các allen HLA của người cho và người nhận thận và tình trạng tiền mẫn cảm của người nhận với HLA của người cho Như vậy cần phải tìm được người hiến thận thích hợp (hòa hợp về HLA)[15], [33]

Người hiến tặng thận thích hợp có thể là người cùng huyết thống hoặc là người không cùng huyết thống Hiện nay, nguồn thận từ người cho cùng huyết thống rất hiếm nên phần lớn là nguồn thận từ người cho không cùng huyết thống Chính vì vậy, việc xét nghiệm tuyển chọn người hiến thận phù

hợp về HLA là rất quan trọng để có thể mang lại thành công cao sau các ca

Trang 21

ghép thận [17], [33] Khi đã đủ điều kiện nhận thận và hiến thận, cả người nhận và hiến thận sẽ được làm các xét nghiệm nhằm mục đích xác định sự phù hợp Có hai nhóm xét nghiệm quan trọng: thứ nhất là nhóm xét nghiệm

tìm sự hòa hợp miễn dịch (nhóm máu, HLA, đọ chéo huyết thanh, tiền mẫn

cảm của người nhận) và nhóm thứ hai đánh giá các chức năng khác của cặp ghép (xét nghiệm sinh hóa, huyết học, đông máu, vi khuẩn, virus, ký sinh trùng …) Nếu tất cả các xét nghiệm đảm bảo yêu cầu thì phẫu thuật lấy thận

để ghép và phẫu thuật ghép thận sẽ được tiến hành

1.3.2 Vai trò của sự hòa hợp HLA trong ghép thận

Thải ghép là vấn đề chính gây mất chức năng mảnh ghép Phù hợp miễn dịch giữa người nhận và người cho càng cao thì cơ hội mảnh ghép bảo tồn được chức năng càng tốt Nếu người nhận và người cho là anh chị em sinh đôi cùng trứng, nghĩa là hòa hợp về mặt miễn dịch 100%, không cần phải dùng thuốc chống thải ghép Nếu người nhận và người cho cùng huyết thống gần chẳng hạn anh chị em ruột với nhau, bố hoặc mẹ cho con thì phù hợp về kháng nguyên hòa hợp tổ chức thường đạt 50% và liều thuốc ức chế miễn dịch chống thải ghép thấp hơn những người nhận thận từ người sống cho khác huyết thống hoặc từ người chết não, tỷ lệ thải ghép cũng thấp hơn Đối với những trường hợp ghép

thận mà người cho là người chết não thì tầm quan trọng của HLA vẫn còn đang

tranh cãi dù trong kỉ nguyên Azathioprine hay Cyclosporin thì có mối liên quan

giữa hòa hợp HLA và tỉ lệ sống của mô ghép [17], [34], [38] Theo Shi X và cộng sự năm 2018 đã chỉ ra rằng sự gia tăng số lượng HLA-A, -B, -DR không

tương hợp liên quan đến sự gia tăng nguy cơ suy thận trong lần ghép thận đầu tiên [44] Thêm vào đó theo báo cáo của Mary Carmelle Philogene và

cộng sự thì có sự liên quan chặt chẽ giữa typ HLA và tỷ lệ sống của mảnh

ghép Những bệnh nhân được điều trị với Azathioprine và Prednisone thì sự

không hòa hợp HLA là nguyên nhân giảm thời gian nửa đời của mô ghép Sự phù hợp HLA có vai trò quan trọng trong miễn dịch ghép, trong đó các locus

Trang 22

HLA-D đóng vai trò trung tâm trong khởi phát đáp ứng miễn dịch với kháng

nguyên ghép Phù hợp HLA càng cao thì cơ thể càng dễ chấp nhận mảnh ghép

và càng giảm được lượng thuốc chống thải ghép cần dùng [33]

1.3.3 Kiểu gen miễn dịch, sự hòa hợp tổ chức trong ghép thận

Sự thành công của ghép tạng bị giới hạn chủ yếu bởi sự thải ghép mô, xảy ra do cơ chế miễn dịch chống lại các tác nhân xâm nhập bên ngoài Hai kháng nguyên bề mặt tế bào có vai trò chính trong sự sống sót của mảnh ghép là kháng nguyên nhóm máu ABO và phức hợp hòa hợp tổ chức chính (MHC) Little và Johnson chỉ ra rằng sự khác biệt thành phần người cho tại vị trí mã hóa những kháng nguyên hòa hợp mô chi phối sự chấp nhận của thận cấy ghép Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng ghép thận giữa hai người sinh đôi cùng trứng được chấp nhận vĩnh viễn Hệ thống gen chính - vùng MHC sẽ quyết định kết quả của việc ghép [1], [15], [32], [33]

1.3.4 Biến chứng của ghép thận

* Viêm ống kẽ thận cấp tính: Do ảnh hưởng của các yếu tố bao gồm tình

trạng người cho, kỹ thuật hồi sức trong chết não, phương pháp lấy thận, thời

gian thiếu máu lạnh Lâm sàng biểu hiện: thiểu niệu, vô niệu

* Sự thải ghép: Lâm sàng được phân loại dựa trên thời gian mà phân

thành tối cấp, cấp tính nhanh, cấp, mạn

- Thải ghép tối cấp là thải ghép xảy ra trong vài phút đến vài giờ sau khi kẹp mạch máu của thận ghép được tháo ra Bệnh sinh của thải ghép tối cấp là viêm mạch máu do cơ chế miễn dịch Hiện tượng này xảy ra do các yếu tố miễn dịch có sẵn trong huyết thanh người nhận như độc tế bào, kháng thể

kháng HLA lớp I (IgG đồng dạng) hoặc kháng thể kháng nhóm máu ABO

(IgM đồng dạng) Thận ghép sẽ đổi màu xanh tím hoặc tái, cứng sau đó thậm chí bị vỡ Cần phải lấy bỏ thận ghép Cho đến nay chưa thể điều trị thành công thải ghép tối cấp Có thể dự phòng được thải ghép tối cấp bằng các xét nghiệm chuẩn bị trước ghép như nhóm máu ABO, phản ứng tiền mẫn cảm,

Trang 23

phản ứng đọ chéo để phát hiện kháng thể kháng lại kháng nguyên của mảnh ghép có sẵn trong huyết thanh người nhận

- Thải ghép cấp tính nhanh là thải ghép xảy ra trong vòng vài ngày sau

ghép (từ 24 giờ tới 4 ngày sau ghép) Thải ghép cấp tính nhanh xảy ra khi người nhận đã được mẫn cảm với kháng nguyên mảnh ghép từ trước có thể do người nhận đã cấy ghép mô tạng trước đây hay do truyền máu, mang thai nhiều lần Thải ghép cấp tính nhanh cũng xảy ra khi người nhận thận được ghép thận lần hai cũng từ những người cho sống cùng huyết thống Thải ghép cấp tính nhanh khó điều trị được bằng các thuốc ức chế miễn dịch hiện tại và có thể làm mất chức năng mảnh ghép sớm

- Thải ghép cấp là thải ghép xảy ra từ ngày thứ 5 đến vài tuần sau ghép

(thường từ 7 đến 90 ngày sau ghép) là loại thải ghép thường gặp nhất Biểu hiện của thải ghép cấp là bệnh lý viêm hệ thống với nhiều triệu chứng như sốt, đau cơ, đau khớp, thận to, đái ít, protein niệu, ure và creatinin máu tăng Chẩn đoán nhờ siêu âm đặc biệt là nhờ sinh thiết thận Tổn thương mô học

hay gặp nhất là viêm ống thận Thải ghép cấp đáp ứng với liệu pháp steroid

- Thải ghép mạn tính là thải ghép xảy ra chậm sau vài tháng tới vài năm

sau ghép Đặc trưng bởi xơ hóa cầu thận, teo ống thận, nứt vỡ màng nền cầu thận, xơ hóa kẽ thận và tiến triển tới mất chức năng mảnh ghép Sau năm đầu tiên mảnh ghép tồn tại thì thải ghép mạn tính tăng 3 - 5% mỗi năm theo Cecka

1998 Thải ghép mạn tính thường liên quan đến kháng thể kháng người cho

cơ quan ghép Ngoài ra, nó còn chịu ảnh hưởng của các yếu tố không miễn dịch khác như tổn thương mạch máu người cho, thời gian thiếu máu lạnh kéo dài trước khi ghép, thiếu hụt dòng máu thận của người nhận tất cả những yếu

tố đó dẫn đến tổn thương thiếu máu cục bộ Tổn thương thải ghép mạn là typ mẫn cảm muộn, thiếu máu mạn tính và vai trò của thuốc ức chế miễn dịch như cyclosporin Tổn thương thải ghép mạn thường không đáp ứng với các phương pháp điều trị hiện có

Trang 24

1.4 Phức hợp hòa hợp tổ chức chính (MHC) hay kháng nguyên bạch cầu

người (HLA)

Phức hợp kháng nguyên phù hợp tổ chức của người MHC (Major Histocompatibility Complex) hay còn được gọi là kháng nguyên bạch cầu

người HLA lần đầu tiên phát hiện được ở trên tế bào bạch cầu Kháng nguyên

HLA lần đầu tiên được phát hiện khi nghiên cứu hiện tượng thải ghép Khi

cấy mô ghép cho một cơ thể khác không giống nhau về các kháng nguyên này (tức là không hòa hợp với tổ chức) chúng sẽ kích thích cơ thể nhận đáp ứng miễn dịch, dẫn đến thải bỏ mô ghép [33], [35] [42]

1.4.1 Giải phẫu vùng gen [1], [17]

Hệ thống gen HLA nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 6 (band 6p21.3)

mã hóa các protein chủ yếu tham gia vào hoạt động miễn dịch của cơ thể

Riêng gen mã hóa cho chuỗi β2-microglobulin của MHC loại I nằm trên nhiễm sắc thể 15 (15q21-q22.2) và không có tính đa dạng kiểu hình (gen này

không được xem là thuộc hệ HLA)

Các chuỗi được mã hóa bởi các gen HLA có chung một số đặc điểm với

các globulin miễn dịch và được xếp vào họ các phân tử globulin miễn dịch

Trong khu vực các gen của hệ HLA còn có các gen của các thành phần

khác của hệ miễn dịch (một số bổ thể, TNF α và β, lymphotoxin B) cũng như các gen CYP21A, CYP21B, TAP1 và TAP2

Các gen HLA loại I

Ba gen HLA-A, -B và -C mỗi gen mã hóa một chuỗi α của MHC loại I (tương ứng với các phân tử HLA-A, -B và -C) Mỗi gen được tổ chức thành

8 exon: exon 1 mã hóa peptide tín hiệu, sẽ bị cắt trong quá trình vận chuyển phân tử ở nội bào, các exon 2, 3, 4 mã hóa lần lượt cho các domain α1, α2 và

α3, các exon 5, 6, 7, 8 mã hóa peptide liên kết, phần xuyên màng và phần nội bào của phân tử MHC cũng như vùng 3' không dịch mã Tính đa dạng tập trung ở các hai exon 2 và 3 (mã hóa cho α1 và α2 - vị trí gắn peptide) [49]

Trang 25

Các gen HLA loại II

Các gen HLA-D mã hóa cho các chuỗi α và β của MHC loại II Tổ chức của HLA-D đa dạng hơn của các gen thuộc MHC loại I, bao gồm các locus

HLA-DR (D-related), -DQ, -DP Tại mỗi locus có hai gen A1 và B1 mã hóa

tương ứng cho các chuỗi α và β cùng một số các pseudogen Sự biểu hiện các

gen thuộc HLA-DR rất phức tạp, tùy theo kiểu gen, một hoặc hai phân tử DR

sẽ được giải mã

Các gen MHC loại II được tổ chức thành 5 hoặc 6 exon: exon 1 mã hóa peptide tín hiệu, các exon 2, 3 mã hóa cho các domain ngoại bào, exon 4 mã hóa peptide liên kết, phần xuyên màng và đoạn đầu của phần nội bào, các exon 5 và 6 mã hóa đoạn cuối phần nội bào và vùng 3' không dịch mã [49]

Hình 1.2: Vùng HLA của nhiễm sắc thể 6 (healthvietnam.vn)

Trang 26

Ba đặc tính cơ bản của các gen HLA

Di truyền theo bộ đơn bội: một người sẽ thừa hưởng nguyên một bloc

gen HLA của cha và một bloc gen HLA của mẹ Các gen HLA liên kết khá

chặt chẽ, hiện tượng tái tổ hợp rất hiếm (khoảng 1 % giữa các locus B và DR)

Tính đa dạng: nhiều locus có rất nhiều (lên đến hàng trăm) allen khác nhau

Đó là kết quả của các đột biến cổ xưa cũng như của hiện tượng chuyển gen

Hiện tượng đồng trội: cả hai allen (từ cha và từ mẹ) cùng được biểu hiện

Danh pháp [49], [51], [54]

- Danh pháp hiện hành của các gen HLA:

- Công thức chung của tên các allen là Tên gen + dấu * + mã số allen +

mã số của sub-allen

Thí dụ:

 HLA loại I: A*1101 (A11,A11E theo các danh pháp cũ): locus HLA-A,

allen 11, tiểu loại 01

 HLA loại II: HLA-DRB1*0101 (DR1,Dw1 theo danh pháp cũ): locus

DRB1 (mã hóa chuỗi β1), allen 01, tiểu loại 01

Cho tới nay người ta đã biết khoảng 23907 alleles của HLA Trong đó,

HLA-I cóa17191 alleles, HLA-II có 6716 alleles [17]

1.4.2 Cấu trúc phân tử của HLA

Các vi sinh vật gây bệnh có thể tạm chia thành hai loại: loại phát triển ở nội bào (virus, một số vi khuẩn nội bào ) và loại xâm nhập khu vực ngoại bào (thí dụ: hầu hết các vi khuẩn) Các tế bào T cũng gồm hai loại tương ứng với hai hình thức nhiễm bệnh đó Lympho T CD8 có đặc tính độc tế bào với vai trò chính là tiêu diệt các tế bào bị nhiễm các tác nhân mang kháng nguyên nội sinh Còn lympho T CD4 có chức năng chính là giúp đỡ các tế bào khác của hệ miễn dịch chống lại các tác nhân mang kháng nguyên ngoại sinh

Trang 27

Hình 1.3 Tóm tắt cấu trúc hệ HLA (healthvietnam.vn)

Hệ thống MHC rất đa dạng về kiểu hình, nhưng đại thể có thể chia làm hai nhóm chính: các MHC loại I trình diện kháng nguyên cho lympho T CD8; MHC loại II trình diện kháng nguyên cho tế bào T CD4 Tuy khác nhau về đối tượng hoạt động, hai loại MHC có cấu trúc phân tử gần giống nhau (đều

là các loại glycoprotein màng)

MHC loại I có trên bề mặt của hầu hết tất cả các tế bào có nhân của cơ thể, chúng gắn với các peptide được cắt ra từ các kháng nguyên tạo ra trong tế bào, các kháng nguyên này có thể là các protein của chính cơ thể hoặc các protein hoặc của các virus hay vi khuẩn nội bào

Trang 28

Vị trí gắn mẩu peptide ở giữa hai domain α1 và α2 (là những domain ở xa màng tế bào nhất) Khác với chuỗi α, chuỗi β2-microglobulin là chuỗi duy nhất không có tính đa dạng kiểu hình và không được mã hóa bởi các gen thuộc phức

hệ MHC

Khối lượng của chuỗi α là 44 kDa, chuỗi β2-microglobulin là 12 kDa

Trang 29

MHC loại II

Hình 1.5 Phức hệ MHC loại II (vi.wikipedia.org)

Không như MHC loại I, các phân tử MHC loại II chỉ có trên một số loại

tế bào của hệ miễn dịch, như các tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp (đại thực bào, tế bào tua) hoặc các lympho B, đã hoạt hóa Các tế bào này thực bào các kháng nguyên, "biên tập" chúng thành các đoạn peptide trước khi gắn với MHC loại II rồi phơi bày trên màng tế bào

Phức hệ phân tử MHC loại II gồm hai chuỗi xuyên màng (α và β) Cả hai đều thuộc về họ các phân tử globulin miễn dịch và được mã hóa bởi các gen trong hệ MHC Mỗi chuỗi góp một domain (α1 và β1) tạo nên vị trí gắn mẩu peptide

Khối lượng chuỗi α khoảng 33-35 kDa, chuỗi β 26-28 kDa

Trang 30

Cơ chế chọn lọc giữa MHC với các loại lympho bào T

Các tế bào T CD8 chỉ nhận diện các kháng nguyên qua phân tử MHC loại I còn các lympho bào T CD4 chỉ nhận diện các kháng nguyên thông qua MHC loại II Trên MHC I, α3 có sequence tương tác với phân tử CD8 và trên MHC II, β2 có cấu tạo tương hợp với CD4

“dán nhãn hiệu cá nhân” để phân biệt tế bào đó là của mình hay của kẻ khác

Nhãn hiệu này được gắn vào màng tế bào, gồm nhiều protein có cấu tạo đặc biệt, không ai giống ai Protein này được tạo thành bởi các cặp gen nằm trên nhiễm sắc thể số 6 trong nhân tế bào Những cấu trúc gen này được gọi là hệ

HLA, là hệ thống sẽ trình diện các kháng nguyên lạ khi xâm nhập cơ thể Nhờ

nó, khi kháng nguyên lạ xuất hiện, các bạch cầu nhận dạng được ngay và báo cho các tế bào có thẩm quyền miễn dịch Một đáp ứng miễn dịch sẽ được triển khai nhằm tiêu diệt vi trùng xâm lược hoặc làm bong những mảng tế bào lạ, những mô lạ ghép vào túc chủ [1], [10], [25], [28]

Nếu hệ HLA bị hỏng (hay có những vấn đề về hoạt động bình thường,

nghĩa là rối loạn), không nhận ra kẻ thù thì các tác nhân gây bệnh và các mô

lạ (như khối u, tế bào nhiễm virut ) sẽ tự do tàn phá cơ thể Đôi khi có loại

virus ức chế hoặc làm HLA không nhận diện được nên không trình diện được

cho các tế bào miễn dịch

Trang 31

Mặc dù những phân tử MHC đảm nhận vai trò kháng nguyên trong ghép

mô, tuy nhiên vai trò sinh lý của chúng rất khác nhau từ tên gọi đến các peptid ngoại sinh, các tế bào T đã khởi động đáp ứng miễn dịch bao gồm hoạt hóa dòng, tăng sinh và biệt hóa Dựa trên thành phần của MHC tế bào T được chia thành CD8 tế bào T nhận biết kháng nguyên liên quan với MHC I và CD4 tế bào T nhận biết kháng nguyên liên quan với MHC II Sự phát triển của quá trình đồng miễn dịch, tế bào T người nhận trực tiếp nhận diện kháng nguyên ngoại sinh từ tế bào người cho hay nhận diện gián tiếp qua sự trình diện của tế bào người nhận [36]

1.5 Các kỹ thuật xác định HLA - MHC

Trải qua nhiều giai đoạn kể từ khi phát minh ra hệ thống HLA cho đến

nay có rất nhiều kỹ thuật đã được áp dụng trong việc xác định kháng nguyên của hệ thống này, người ta tạm chia nó ra làm hai nhóm: kỹ thuật huyết thanh

học và kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định tính đa dạng của HLA bộc lộ

trên bề mặt tế bào

1.5.1 Kỹ thuật huyết thanh học – Thử nghiệm gây độc lympho bào

Thử nghiệm thường dùng nhất để định typ HLA là thử nghiệm gây độc

lympho bào Tế bào lympho sống được tách từ máu ngoại vi bằng ly tâm gradient tỷ trọng Dung dịch tế bào sau đó được trộn với các huyết thanh định typ khác nhau, sau đó bổ thể (người ta thường dùng huyết thanh thỏ bình thường để làm nguồn cung cấp bổ thể) được thêm vào Sau khi ủ một thời gian ở 370C, những tế bào được kháng thể nhận diện sẽ bị giết bằng phản ứng

ly giải qua trung gian bổ thể Tế bào chết được phát hiện qua khả năng chúng không thể ngăn thuốc nhuộm xâm nhập Nếu đa số (>90%) các tế bào bị giết bởi một kháng huyết thanh nào đó, thì điều đó có nghĩa rằng chúng ta đã

mang HLA tương ứng nên đã bị kháng thể nhận diện Thử nghiệm này chỉ được tiến hành thường quy ở những chuyên khoa chuyên định typ HLA cho các trường hợp ghép cơ quan Hiện nay việc định typ HLA được thực hiện

Trang 32

bằng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện gen HLA Kỹ thuật này tốn

kém hơn nhưng có độ chính xác và độ nhạy cao hơn [10] [49]

1.5.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử

Sự hiểu biết gen của lớp I (1980) và lớp II (1982) cũng ngày càng sâu sắc hơn giúp cho giải thích được ADN bổ sung và bộ gen (genomique) cho phép

chúng ta sử dụng cách thứ hai của HLA Người ta có thể sử dụng cách này

trong phản ứng lai với ADN của bộ gen để nghiên cứu tính đa dạng của loci hay của allen Kỹ thuật sinh học phân tử đầu tiên được áp dụng trong định

nhóm HLA dựa trên sự phân tích số lượng và kích thước đoạn ADN lai với sond đặc hiệu của HLA sau khi nó bị cắt bởi enzym giới hạn (RFLP) Đây là kỹ thuật định nhóm HLA được sử dụng chủ yếu trong Workshop - HLA 1997 và

cho thấy có nhiều tiến bộ quan trọng, nhất là trong xác định và nghiên cứu tính

đa dạng của lớp II trong ghép cơ quan và tổ chức Kỹ thuật RFLP cũng lần đầu

tiên cho phép xác định HLA-DP mà không cần đến kỹ thuật tế bào và giải thích

những hiện tượng không giống nhau của DP trong nuôi cấy hỗn hợp hai quần thể tế bào (culture mixte) [15] Nó cũng còn là một cuộc cách mạng về mối liên

quan giữa HLA và bệnh, miễn dịch kháng bạch cầu giữa mẹ và con

Kỹ thuật phản ứng chuỗi khuyếch đại gen (polymerase chain reaction - PCR) là một cuộc cách mạng cho mọi nghiên cứu về gen, giải trình tự gen và nhất là nghiên cứu về tính đa dạng Kỹ thuật này có độ nhạy cao, đặc hiệu và đơn giản trong những nghiên cứu về gen Điều quan trọng trong là sự chọn lựa đoạn mồi sao cho đạt được những yêu cầu về tính đặc hiệu Dựa trên những nguyên tắc chính mà người ta tạm chia nó làm 3 nhóm phương pháp như sau: Phản ứng chuỗi polymerase với những oligosondes đặc hiệu đánh dấu phóng xạ hoặc enzym của allen hay trình tự gen (PCR - SSO: Polymerase Chain Reaction -Sequence Specific Oligoprobes)

Kỹ thuật PCR cho phép đánh dấu sự tiến bộ trong xác định tính đa dạng

của gen HLA lớp II và nhận biết đựợc chính xác những allen khác nhau của

Trang 33

DRB1 và DPB1 Tính đa dạng của lớp I cũng gặp những khó khăn khi sử dụng

kỹ thuật PCR vì lý do giàu pseudogens cùng khuyếch đại trong vùng của lớp I

1.5.3 Kỹ thuật PCR - SSP

Ngày nay trong nhiều phòng thí nghiệm hoà hợp mô trên thế giới người

ta sử dụng kỹ thuật PCR là kỹ thuật thường quy để định nhóm kháng nguyên bạch cầu Năm 1999 Phạm Đăng Khoa, Vũ Triệu An và cộng sự của bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh Trường Đại học Y Hà Nội đã thực hiện kỹ thuật này

để định nhóm DRB1 Từ tháng 10 - 2000 tại phòng thí nghiệm Y Sinh học của trường Đại học Y Hà Nội cũng đưa vào thực hiện kỹ thuật PCR - SSP để

định nhóm cho HLA- A, B, DR, DQ Loại kit sử dụng là “Độ phân giải thấp

(Low resolution)” của Dynal, nó cho kết quả tương đương với kết quả làm huyết thanh học Kỹ thuật PCR - SSP được sử dụng để chọn lựa người cho và

người nhận trong ghép tuỷ, ghép cơ quan, tìm mối liên quan giữa HLA với

một số bệnh Đối với kít “Độ phân giải cao (High resolution)” xác định được allen có mặt trên nhiễm sắc thể sẽ cho kết quả có độ phân tích cao hơn nhưng giá thành đắt

Kỹ thuật PCR - SSP độ phân giải thấp có một số ưu điểm sau:

+ Chất lượng kỹ thuật: không cho hoặc rất ít hiện tượng dương tính giả + Thời gian thực hiện kỹ thuật ngắn

+ Giá thành xét nghiệm không cao + Không gây độc nhiều cho người thực hiện do hoá chất sử dụng gây ra

Kỹ thuật PCR - SSP là kỹ thuật sử dụng những mồi được khuyếch đại từ phía đầu tận 3’ Phản ứng chỉ bao gồm 2 giai đoạn chính là PCR và điện di trên gen agarose để đọc kết quả

1.5.4 Độ mẫn cảm trước ghép của người nhận

Trong quá trình sống con người đã tiếp xúc với các kháng nguyên lympho lạ, sau đó cơ thể sinh ra kháng thể chống lại các kháng nguyên này, đặc biệt là trong truyền máu nhiều lần, phụ nữ đã mang thai nhiều lần hay

Tiêu đề	Đặc điểm HLA và kháng thể kháng HLA trên bệnh nhân ghép thận tại Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên
Tác giả	Lâm Thị Thu Hương
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Thị Ngọc Hà
Trường học	Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên
Chuyên ngành	Sinh học ứng dụng
Thể loại	Luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Thái Nguyên

Định dạng
Số trang	66
Dung lượng	1,52 MB