Giáo trình thực hành ký sinh trùng thú y

Hệ thống phóng đại gồm: Thị kính: là một bộ phận của kính hiển vi mà người xem để mắt vào để soi kính, có 2 loại ống đôi và ống đơn bản chất là một thấu kính hội tụ có tiêu cự rất ngắn,

NGUYỄN THỊ HỒNG CHIÊN | DƯƠNG ĐỨC HIẾU NGUYỄN THỊ NHIÊN | TRẦN HẢI THANH

Chủ biên: BÙI KHÁNH LINH

Ký sinh trùng thú y Giáo trình bao gồm những kỹ năng cơ bản về Ký sinh trùng và bệnh Ký sinh trùng có cập nhật và bổ sung những kiến thức mới trong lĩnh vực Ký sinh trùng thú y như: miễn dịch Ký sinh trùng, các phương pháp sinh học phân tử ứng dụng trong định danh và chẩn đoán Mỗi chương được viết bởi giảng viên có kinh nghiệm lâu năm trong việc nghiên cứu và giảng dạy Ký sinh trùng

Cuốn giáo trình này soạn thảo với mục đích nhằm hỗ trợ giảng dạy thực hành của

2 học phần: Ký sinh trùng thú y 1 và 2 gồm 4 tín chỉ trong chương trình đào tạo bắt buộc của Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Giáo trình cũng là nguồn tài liệu tham khảo quý giá cho nhiều đối tượng người đọc quan tâm đến lĩnh vực này Giáo trình Thực hành ký sinh trùng thú y gồm:

Chương 1: Giới thiệu về kính hiển vi thường dùng trong chẩn đoán, định danh ký sinh trùng, cấu tạo và cách sử dụng kính hiển vi

Chương 2: Trình bày những kỹ thuật xét nghiệm cơ bản bao gồm phương pháp thu thập, bảo quản và xử lý mẫu bệnh phẩm ký sinh trùng Trong đó từ bài 1-5 thuộc học phần Ký sinh trùng 1

Chương 3: Trình bày về các phương pháp định danh Ký sinh trùng thuộc học phần

Trong quá trình biên soạn không thể tránh được những thiếu sót, nhóm tác giả mong nhận được những ý kiến đóng góp từ các bạn đọc để lần tái bản sau, giáo trình sẽ tốt hơn

Chúng tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, 2020

Nhóm tác giả

1.1.1 Khái niệm kính hiển vi 1

1.1.2 Phân loại kính hiển vi 2

1.2 CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI 4

1.2.1 Cách sử dụng kính hiển vi ánh sáng truyền 4

1.2.2 Cách sử dụng kính hiển vi soi nổi 4

1.3 CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI 4

1.4 CÁCH CHUẨN ĐỘ KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC 4

Chương 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN KÝ SINH TRÙNG THÚ Y CƠ BẢN 6

BÀI 1 MỔ KHÁM TÌM KÝ SINH TRÙNG THEO PHƯƠNG PHÁP CỦA SKRJABIN K.I 6

1.1 Phân loại mổ khám 6

1.2 Chuẩn bị dụng cụ mổ khám 6

1.3 Quy trình mổ khám giun sán toàn diện đối với gia cầm 8

1.4 Quy trình mổ khám giun sán toàn diện đối với gia súc 10

1.5 Cách bảo quản mẫu giun sán 11

BÀI 2 THU THẬP, BẢO QUẢN BỆNH PHẨM CHO XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN 11

2.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm ký sinh trùng 11

2.2 Bảo quản, vận chuyển mẫu xét nghiệm ký sinh trùng 15

BÀI 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM PHÂN CƠ BẢN CHẨN ĐOÁN KÝ SINH TRÙNG 16

3.1 Phương pháp soi tươi trực tiếp 16

3.2 Phương pháp gạn rửa sa lắng 18

3.3 Phương pháp tập trung sa lắng sử dụng formalin - ether 19

3.4 Phương pháp phù nổi 21

3.5 Phương pháp Darling 22

3.6 Phương pháp Cherbovich 24

3.7 Phương pháp Baermann và Vaid 25

3.8 Phương pháp nuôi ấu trùng trên thạch agar 27

3.9 Phương pháp định lượng stoll 28

3.10 Phương pháp định lượng Mc Master 29

5.1 Phương pháp thu thập mẫu ve ghẻ 37

5.2 Phương pháp làm tiêu bản chẩn đoán bệnh ghẻ 37

5.3 Phương pháp làm tiêu bản chẩn đoán chấy, rận, ve, bọ chét 38

5.4 Phương pháp làm tiêu bản chẩn đoán côn trùng 38

BÀI 6 ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN KÝ SINH TRÙNG 39

6.1 Phương pháp PCR 39

6.2 Phương pháp giải trình tự gene 42

BÀI 7 ỨNG DỤNG MIỄN DỊCH HỌC TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH KÝ SINH TRÙNG 43

7.1 Phương pháp ELISA 44

7.2 Phương pháp Snap 45

Chương 3 ĐỊNH DANH MỘT SỐ NỘI, NGOẠI KÝ SINH TRÙNG VÀ KÝ SINH TRÙNG ĐƯỜNG MÁU PHỔ BIẾN 46

BÀI 1 ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOẠI GIUN TRÒN VÀ TRỨNG CỦA GIUN TRÒN KÝ SINH 46

1.1 Đặc điểm hình thái chung của lớp giun tròn 46

1.2 Định loại một số giun tròn ký sinh ở động vật ăn thịt 48

1.3 Định loại một số giun tròn ký sinh ở động vật nhai lại 54

1.4 Định loại một số giun tròn ký sinh ở lợn 60

1.5 Định loại một số giun tròn ký sinh ở gia cầm 66

BÀI 2 ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOẠI SÁN LÁ KÝ SINH VÀ TRỨNG SÁN LÁ 69

2.1 Đặc điểm hình thái chung của lớp sán lá 69

2.2 Định loại một số sán lá ký sinh ở động vật ăn thịt 70

2.3 Định loại một số sán lá ký sinh ở động vật nhai lại 74

2.4 Định loại sán lá ruột trên lợn 79

2.5 Định loại một số loài sán lá ký sinh ở gia cầm 80

BÀI 3 ĐỊNH DANH MỘT SỐ LOẠI SÁN DÂY KÝ SINH VÀ TRỨNG PHỔ BIẾN 82

3.1 Đặc điểm hình thái chung của lớp sán dây 82

3.2 Sán dây ký sinh trên động vật ăn thịt 83

3.3 Định loại một số loài sán dây ký sinh trên động vật nhai lại 88

3.4 Định loại một số loài sán dây ký sinh ở gia cầm 89

5.1 Dụng cụ chuẩn bị 98

5.2 Nội dung thực hành 98

MỘT SỐ HÌNH ẢNH BỆNH TÍCH BỆNH KÝ SINH TRÙNG 106

TÀI LIỆU THAM KHẢO 108

kính hiển vi quang học cơ bản dùng trong nghiên cứu ký sinh trùng Sau khi học xong chương này, sinh viên có thể sử dụng thành thạo kính hiển vi quang học, kính hiển vi soi nổi và biết cách bảo quản kính hiển vi

1.1 KHÁI NIỆM, PHÂN LOẠI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CẤU TẠO CỦA KÍNH HIỂN VI

1.1.1 Khái niệm kính hiển vi

Kính hiển vi được dùng để quan sát những động vật ký sinh nhỏ hoặc những bộ phận nhỏ trong cấu tạo chi tiết của động vật ký sinh lớn mà mắt thường không thể nhìn thấy được hoặc nhìn không rõ ràng

Hình 1.1 Kính hiển vi quang học

1.1.2 Phân loại kính hiển vi

Hiện nay có rất nhiều loại kính hiển vi được phát triển cho các mục đích sử dụng khác nhau Có ba chủng loại kính hiển vi phổ biến trên thế giới đó là: Kính hiển vi quang học, Kính hiển vi điện tử và Kính hiển vi quét đầu dò

Kính hiển vi quang học: là dụng cụ quang học hỗ trợ cho mắt gồm nhiều lăng kính

với các độ phóng đại khác nhau, có tác dụng làm tăng góc trông ảnh của những vật rất nhỏ mà người xem không thể nhìn thấy bằng mắt thường

Kính hiển vi điện tử: là kính hiển vi mà nguồn bức xạ ánh sáng được thay thế

bằng các chùm điện tử hẹp có hiệu điện thế từ vài chục kV đến vài trăm kV Thay vì sử dụng thấu kính thủy tinh, kính hiển vi điện tử sử dụng các thấu kính từ để hội tụ chùm điện tử, và cả hệ được đặt trong buồng chân không cao Kính hiển vi điện tử có độ phân giải giới hạn bởi bước sóng của sóng điện tử, nhưng do sóng điện tử có bước sóng rất ngắn nên chúng có độ phân giải tốt nhất tới cấp độ hạ nguyên tử Ngoài ra, nhờ tương tác giữa chùm điện tử với mẫu vật, kính hiển vi điện tử còn cho phép quan sát các cấu trúc điện từ của vật rắn, đem lại nhiều phép phân tích hóa học với chất lượng rất cao

Kính hiển vi quét đầu dò: tạo ảnh bề mặt của mẫu vật được thực hiện bằng cách

quét một mũi dò nhỏ trên bề mặt của mẫu vật Khác với các loại kính hiển vi khác như quang học, hay hiển vi điện tử, kính hiển vi quét đầu dò không sử dụng nguồn bức xạ để tạo ảnh, mà tạo ảnh thông qua tương tác giữa đầu dò và bề mặt của mẫu vật Do đó, độ phân giải của kính hiển vi đầu dò chỉ bị giới hạn bởi kích thước của đầu dò

Ở bài này sẽ giới thiệu những loại kính hiển vi quang học thường gặp và ứng dụng

rộng rãi trong nghiên cứu ký sinh trùng cơ bản: kính hiển vi ánh sáng truyền và kính

hiển vi soi nổi

a Cấu tạo kính hiển vi ánh sáng truyền

Gồm 4 hệ thống:

Hệ thống giá đỡ gồm: bệ, thân, mâm gắn vật kính, bàn để tiêu bản (bàn sa trượt,

bàn đỡ mẫu), kẹp tiêu bản

Hệ thống phóng đại gồm: Thị kính: là một bộ phận của kính hiển vi mà người

xem để mắt vào để soi kính, có 2 loại ống đôi và ống đơn (bản chất là một thấu kính hội

tụ có tiêu cự rất ngắn, dùng để tạo ra ảnh thật của vật cần quan sát); Vật kính: là một bộ phận của kính hiển vi quay về phía có vật người xem muốn quan sát, có 4 độ phóng đại chính của vật kính: 10X, 20X, 40X, 100X (bản chất là một thấu kính hội tụ có tiêu cự ngắn, đóng vai trò như kính lúp để quan sát ảnh thật)

Hệ thống chiếu sáng gồm: Nguồn sáng (gương hoặc đèn); Màn chắn, được đặt

vào trong tụ quang dùng để điều chỉnh lượng ánh sáng đi qua tụ quang

Tụ quang, dùng để tập trung những tia sáng hoặc hướng luồng ánh sáng vào tiêu bản cần quan sát Vị trí của tụ quang nằm ở giữa gương và bàn để tiêu bản Di chuyển tụ quang lên xuống để điều chỉnh độ chiếu sáng

Hình 1.2 Thị kính Hình 1.3 Vật kính

Hệ thống điều chỉnh gồm: Núm điều chỉnh (ốc vi cấp); Núm chỉnh thô (ốc vĩ cấp);

Núm điều chỉnh tụ quang lên xuống; Núm điều chỉnh độ tập trung ánh sáng của tụ quang; Núm điều chỉnh màn chắn sáng (độ sáng); Núm di chuyển bàn sa trượt (trước, sau, trái, phải)

b Cấu tạo kính hiển vi soi nổi (Stereoscopic Microscope)

Kính hiển vi soi nổi gồm các bộ phận chủ yếu sau: Nguồn sáng phản xạ (và truyền qua); Bệ kính giữ thăng bằng có giá đặt mẫu; Lăng kính; Ống quan sát; Vật kính (thường bao gồm 2 vật kính hoặc vật kính phẳng cố định, cho phép quan sát mẫu vật ở các góc độ khác nhau, Độ phóng đại điển hình của vật kính: 1X; 1,5X; 2X); Núm chỉnh

độ phóng đại; Núm chỉnh độ hội tụ; Thị kính (là một ống hình trụ mang thấu kính Độ phóng đại điển hình của thị kính: 10X, 15X, 20X và 30X); Ống nối, camera (nếu có)

Hình 1.4 Kính hiển vi soi nổi

1.2 CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI 1.2.1 Cách sử dụng kính hiển vi ánh sáng truyền

- Đặt tiêu bản lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản

- Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp

- Điều chỉnh ánh sáng

- Điều chỉnh tụ quang: bắt đầu với vật kính 4X để lấy vi trường sau đó xoay mâm gắn vật kính để thay đổi đến các vật kính 10X, vật kính 40X và vật kính 100X (đối với vật kính 100X là vật kính dầu nên cần bổ sung dầu soi kính lên tiêu bản) Lấy nét hình ảnh bằng ốc vi cấp

- Điều chỉnh cỡ màn chắn tương ứng với vật kính

- Hạ vật kính sát tiêu bản (mắt nhìn tiêu bản)

- Mắt nhìn thị kính, tay vặn ốc vi cấp để đưa vật kính lên cho đến khi nhìn thấy hình ảnh mờ của vi trường

- Điều chỉnh ốc vi cấp để được hình ảnh rõ nét

1.2.2 Cách sử dụng kính hiển vi soi nổi

- Đặt tiêu bản lên bàn để tiêu bản, dùng kẹp để giữ tiêu bản

- Chọn vật kính: tùy theo mẫu tiêu bản và mục đích quan sát để chọn vật kính thích hợp (khi nhìn xuyên thị kính, từ từ xoay núm xoay cho đến khi mẫu nhìn thấy, khi nhìn thấy mẫu vật, hãy xoay chậm hơn để tập trung càng nhiều càng tốt Nếu không nhìn thấy hãy thử di chuyển mẫu vật xung quanh một chút trên bàn đựng tiêu bản để chắc chắn rằng mẫu vật nằm ngay dưới ống kính và sau đó tập trung lại)

- Điều chỉnh ánh sáng (nếu mẫu đang xem là đục hoặc rắn, ánh sáng không thể đi qua nó từ bên dưới, sử dụng ánh sáng trên để ánh sáng có thể phản xạ bề mặt của mẫu)

1.3 CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI

Sử dụng và bảo quản kính hiển vi một cách thận trọng, tắt hệ thống đèn sau khi sử dụng Đặt kính ở nơi khô thoáng, vào cuối ngày làm việc, đặt kính hiển vi vào hộp có gói hút ẩm silicagel để tránh bị mốc Lau hệ thống giá đỡ hằng ngày bằng khăn lau sạch

có tẩm cồn, lau vật kính dầu bằng giấy mềm chuyên dụng có tẩm xylen, nước rửa vật kính chuyên dụng hoặc cồn Sau khi lau sạch, đưa vật kính về trạng thái nghỉ Bảo dưỡng, rửa kính lau hệ thống chiếu sáng phía trong định kì 3 hoặc 5 tháng một lần

1.4 CÁCH CHUẨN ĐỘ KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC

Khi đo trứng và ấu trùng phải dùng kính hiển vi có độ phóng đại khác nhau của vật kính và thị kính, có kèm theo với thước đo vật kính để xác định độ dài mỗi đơn vị

trên thước đo thị kính Thước đo thị kính có khắc độ dài là 1mm, chia làm 100 đơn vị bằng nhau, mỗi đơn vị 0,01mm Khi cần đo phải xác định chiều dài các đơn vị trên thước đo thị kính, trên cơ sở vimet thị kính ở độ phóng đại khác nhau và cách làm như sau:

Để thước đo thị kính vào ống kính, đặt tiếp thước đo vật kính trên kính hiển vi Điều chỉnh lên tiêu cự để nhìn rõ các vật trên thước đo vật kính và thước đo thị kính Sau đó xoay thước đo thị kính sao cho các vật giữa hai thước đo cùng trên một trục Tìm khoảng cách để hai vạch của thước đo trùng nhau Trên cơ sở độ dài khoảng cách của thước đo vật kính đã biết tính được độ dài mỗi đơn vị trên thước đo thị kính Sau đó

có thể đo trứng, ấu trùng trên thước đo thị kính đã biết độ dài ở những độ phóng đại cụ thể không cần đến thước đo thị kính

Hình 1.5 Thước đo vật kính (1mm ÷ 100 khoảng; 0,01mm)

Chương 2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN

KÝ SINH TRÙNG THÚ Y CƠ BẢN

Chương 2 giới thiệu các phương pháp xét nghiệm cơ bản, phổ biến trong chẩn đoán nội, ngoại ký sinh trùng và các loại ký sinh trùng đường máu Sau khi học xong chương này, sinh viên có thể thực hiện thành thạo các phương pháp xét nghiệm cơ bản tìm ký sinh trùng đồng thời hiểu rõ ưu, nhược điểm và phạm vi ứng dụng của từng phương pháp Từ đó, xác định chính xác tỷ lệ, cường độ nhiễm của từng loài giun sán

và bệnh tích do giun sán gây ra tại các cơ quan

BÀI 1 MỔ KHÁM TÌM KÝ SINH TRÙNG THEO PHƯƠNG PHÁP CỦA SKRJABIN K.I

Phương pháp mổ khám chủ yếu tìm giun sán và ấu trùng giun sán ở các cơ quan nội tạng khi mổ khám xác con vật Ưu điểm của phương pháp mổ khám là biết được chính xác thành phần loài giun sán ký sinh và mức độ nhiễm nặng hay nhẹ Tùy theo mục đích mổ khám mà có ba phương pháp: phương pháp mổ khám toàn diện, triệt để; phương pháp mổ khám toàn diện, triệt để ở một cơ quan và phương pháp mổ khám không toàn diện của Skrjabin K.I (1928)

1.1 Phân loại mổ khám

1.1.1 Mổ khám toàn diện, triệt để

Là phương pháp mổ khám giun sán ở tất cả các cơ quan, tổ chức của cơ thể gia súc, gia cầm (phát hiện giun sán ở xoang mắt, xoang miệng, xoang mũi, xoang ngực, xoang bụng, mô não; toàn bộ hệ tiêu hóa, kể cả gan, tụy; hệ hô hấp; hệ bài tiết; hệ sinh dục; tổ chức dưới da)

1.1.2 Mổ khám toàn diện, triệt để ở một cơ quan

Là phương pháp phát hiện tất cả các loài giun, sán ký sinh ở một cơ quan nào đó trong cơ thể

1.1.3 Mổ khám không toàn diện

Là phương pháp tìm một loài giun sán nào đó trong cơ thể gia súc, gia cầm

1.2 Chuẩn bị dụng cụ mổ khám

Dụng cụ mổ khám (sạch và bén nhọn): dao mổ, lưỡi, kéo (ít nhất 1 kéo 2 đầu nhọn

và 1 kéo có 1 đầu tù) nhíp, kẹp, kìm cắt xương, cưa, thau/xô dùng để chứa chất chứa, đèn sáng hoặc ánh sáng tự nhiên), găng tay cao su, khẩu trang, quần áo bảo hộ, ủng

Hình 2.1 Dụng cụ mổ khám

Dụng cụ lấy mẫu: ống chích, chất kháng đông, các môi trường chuyên chở và bảo

quản mẫu, tăm bông vô trùng, đèn cồn, lọ nhựa đựng formalin 10%

Ghi nhận những yếu tố liên quan đến ca bệnh (theo mẫu): tổng đàn, tỉ lệ bệnh, tỉ

lệ chết, thời gian bệnh, lứa tuổi mắc phải, giống, thức ăn, phương thức chăn nuôi,

chương trình chủng ngừa, đã điều trị chưa? Thuốc gì? Liệu trình điều trị

Biên bản mổ khám được chuẩn bị như sau: BIÊN BẢN MỔ KHÁM Tên (trại, chủ trại):

Địa chỉ:

Điện thoại: Fax: Email:

Giờ: Ngày: / / Thú chết, thú bị giết

Giờ: Ngày: / / mổ khám Loại gia súc (gia cầm): Giống: Tính biệt:

Tuổi: Khối lượng: Kg * Bệnh sử: Thời gian bắt đầu ổ dịch:

Tổng đàn: Số ốm: Số chết:

Tình trạng lây lan:

Điều trị (thuốc, ăn/uống/chích, thời gian):

Vaccin đã dùng (loại, thời gian):

Thức ăn, nước uống:

* Triệu chứng:

* Chẩn đoán lâm sàng:

* Định bệnh tạm:

* Bệnh tích:

1 Mũi, mắt, tai:

2 Miệng, yết hầu:

3 Vùng cổ (hạch, thực quản, khí quản):

4 Xoang ngực (tim, phổi, cuống phổi, các loại màng):

5 Xoang bụng (dạ dày, ruột, gan, mật, lách, tụy, phúc mạc, hạch):

6 Cơ quan tiết niệu (thận, bàng quang, các ống):

7 Cơ quan sinh dục (tinh hoàn, phó tinh hoàn, ống dẫn tinh, buồng trứng, ống dẫn trứng, tử cung, âm đạo, vú):

8 Hệ thần kinh (màng não, não, hành tủy, dịch):

9 Da, cơ, xương, khớp:

10 Các bệnh tích khác (túi khí, dây thần kinh, túi fabricius):

* Gửi bệnh phẩm: - Loại bệnh phẩm, số lượng:

- Tình trạng bệnh phẩm:

- Đề nghị xét nghiệm:

Xác nhận cơ quan , ngày …… tháng …… năm ……

Cán bộ mổ khám

1.3 Quy trình mổ khám giun sán toàn diện đối với gia cầm

Bước 1: Phải nhổ sạch lông, quan sát các u kén trên da Dùng dao giải phẫu hoặc kim để lấy ký sinh trùng trong u kén (nếu có)

Bước 2: Lột da, quan sát lớp dưới da tìm ký sinh trùng (thường gặp ấu trùng của

sán dây Sparganum mansoni)

Bước 3: Mổ khám xoang bụng, ngực bộc lộ các cơ quan bên trong Máu trong xoang được cho vào cốc thuỷ tinh và kiểm tra theo phương pháp gạn rửa sa lắng Kiểm tra ký sinh trùng trong xoang cơ thể bằng mắt thường và kính lúp

Bước 4: Mổ lấy não, tuỷ sống, mắt, một số khớp xương Mổ xoang trán, xoang mũi và dùng sống dao hoặc phiến kính nạo niêm mạc và ép trên hai phiến kính, quan sát dưới kính lúp, kính hiển vi tìm ký sinh trùng Dùng bút lông, kim giải phẫu để thu lượm Niêm mạc miệng, lưỡi cũng được nạo vét và kiểm tra như trên

Bước 5: Mổ khám từng cơ quan:

- Cơ quan tiêu hoá: Tách thực quản, diều, dạ dày, mề, ruột non, ruột già, manh

tràng, gan, tuyến hạ vị, túi Fabricius

+ Với thực quản: Lấy kéo cắt dọc, phanh rộng ra, quan sát bằng kính lúp tìm ký sinh trùng Sau đó dùng phiến kính nạo lấy niêm mạc ép giữa hai phiến kính để kiểm tra

và thu lượm ký sinh trùng

+ Với diều: Chất chứa bên trong không xét nghiệm Ký sinh trùng thường ở bên trong và bên dưới niêm mạc Khi thu lượm phải dùng kim giải phẫu trích và lấy từ từ ký sinh trùng nguyên vẹn Niêm mạc diều cũng được nạo vét, ép và kiểm tra dưới kính hiển vi

+ Với dạ dày: Dùng kéo cắt theo chiều dọc của dạ dày Chất chứa cho vào bô can hoặc cốc thuỷ tinh để dội rửa Khi dội rửa phải tránh rơi vãi, để yên 5-10 phút, đổ đi lớp nước phía trên sau đó tiếp tục dội nước vào Cứ lặp lại vài lần cho đến khi cặn lắng trở nên sạch và được đưa lên đĩa petri Dùng kim giải phẫu lần lượt tìm và thu lượm ký sinh trùng trong cặn lắng

+ Với mề (dạ dày cơ): dùng kéo cắt đường cong lớn Chất chứa bên trong không xét nghiệm: bóc lớp cutin, quan sát tìm ký sinh trùng dưới lớp này và thu lượm bằng dao trích mổ

+ Với ruột non: Dùng kéo cắt theo chiều dọc và ở vị trí đối diện với màng treo ruột Chất chứa bên trong được cho vào cốc hoặc bô can để dội rửa Niêm mạc ruột non được nạo vét, ép và kiểm tra dưới kính hiển vi

+ Với ruột già, manh tràng: cách làm tương tự như đối với ruột non

+ Với túi Fabricius (ở gà non): dùng kéo cắt, kiểm tra niêm mạc tìm và thu lượm

ký sinh trùng

+ Với gan: đặt vào khay, bóc lấy túi mật và mổ trên hộp lồng Sau đó, dùng phương pháp dội rửa để tìm ký sinh trùng trong dịch mật Với gan, phải dùng tay xé thành mẩu nhỏ và bằng phương pháp dội rửa để tìm ký sinh trùng

+ Với tuyến tuỵ: xử lý tương tự như với gan

- Cơ quan hô hấp: Với phổi dùng kéo cắt khí quản, phế nang; nạo vét niêm dịch,

ép giữa hai phiến kính kiểm tra tìm ký sinh trùng Dùng tay xé nát phổi, tiến hành dội rửa nhiều lần tìm ký sinh trùng ở cặn lắng

- Cơ quan bài tiết: Với thận dùng dao cắt thành những lát mỏng, ép giữa hai phiến kính, kiểm tra dưới kính hiển vi tìm ký sinh trùng

- Cơ quan sinh sản:

+ Với dịch hoàn: dùng dao cắt thành những lát mỏng, ép giữa 2 phiến kính, kiểm tra dưới kính hiển vi

+ Với ống dẫn trứng: dùng kéo cắt dọc ống, dùng phiến kính (hoặc dao) nạo vét niêm mạc, ép giữa 2 phiến kính, tìm ký sinh trùng dưới kính hiển vi (Prosthogoniums thường ký sinh ở ống dẫn trứng)

+ Với tim: cắt thành từng lát mỏng, ép và tìm ký sinh trùng dưới kính hiển vi Với huyết quản lớn, mổ khám trong nước muối sinh lý Máu được chứa vào cốc và dội rửa nhiều lần để tìm ký sinh trùng

1.4 Quy trình mổ khám giun sán toàn diện đối với gia súc

Các bước khám về cơ bản tương tự như ở gia cầm, tiến hành như sau:

- Lột da, chú ý quan sát các u, kén dưới da để tìm ký sinh trùng

- Mổ khám các xoang bụng, ngực Bộc lộ các cơ quan bên trong

- Lấy mẫu cơ chân, cơ hoành cách mô, cắt thành những mẫu nhỏ, mỏng, ép trên 2 phiến kính ép giun bao, hoặc đặt vào lọ chứa dung dịch tiêu cơ Sau đó tìm ấu trùng giun bao dưới kính hiển vi ở trong kính ép hoặc ở cặn lắng của dung dịch tiêu cơ

- Mổ lấy não, tuỷ sống, mắt, một số khớp xương Mổ khoang trán, mũi, tai Quan sát bằng kính lúp để phát hiện và thu lượm ký sinh trùng

+ Với ruột: phải tách riêng ruột non, ruột già, manh tràng Dùng kéo cắt dọc ống phía đối diện màng treo ruột Chất chứa được xử lý bằng phương pháp dội rửa nhiều lần Niêm mạc được nạo vét để kiểm tra dưới kính hiển vi

+ Với gan: cắt dọc theo thành ống mật Dùng tay xé nhỏ từng miếng trong nước (nên dùng nước ấm 38-40C), để yên khoảng 30 phút Lắng cặn nước tìm giun sán + Với mật: dùng phương pháp dội rửa nhiều lần dịch mật

+ Tuỵ tạng: tiến hành tương tự như gan

- Cơ quan hô hấp: Với phổi, dùng kéo cắt dọc khí quản, phế quản Kiểm tra niêm

dịch trên kính hiển vi Sau đó, dùng tay xé nhỏ phổi trong nước và dội rửa nhiều lần tìm giun sán

- Cơ quan bài tiết: Với thận, cắt thành từng lát mỏng, ép giữa 2 phiến kính kiểm

tra dưới kính hiển vi tìm giun sán Sau đó, kiểm tra và mổ các u kén xung quanh niệu

đạo Dùng kéo cắt dọc niệu đạo và kiểm tra niêm mạc với bàng quang, nước tiểu xử lý theo phương pháp dội rửa nhiều lần

- Cơ quan sinh sản:

+ Với ống dẫn trứng: được giải phẫu bằng kéo, niêm mạc được nạo vét và kiểm tra dưới kính hiển vi

+ Với tinh hoàn: cũng được cắt thành những lát mỏng, ép giữa 2 phiến kính tìm

ký sinh trùng

- Các cơ quan khác: tiến hành tương tự như gia cầm

1.5 Cách bảo quản mẫu giun sán

Trong quá trình thu lượm, giun sán phải được giữ nguyên vẹn, rửa sạch và để chết

tự nhiên trong nước (hoặc nước sinh lý)

Sau đó, tuỳ loài giun sán mà bảo quản trong các dung dịch sau đây:

Với sán lá (Trematoda) Sán dây (Cestoda) Giun đầu gai (Acanthocephala)

Trong quá trình trên, phải có nhãn tạm thời gắn liền với các mẫu giun sán Khi ngâm giữ trong các lọ tiêu bản phải có nhãn viết rõ ràng bằng bút với đầy đủ các nội dung như: tên bệnh súc, tên khí quan, số lượng, nơi mổ khám, ngày mổ khám,…

Các lọ tiêu bản phải được chứa trong dung dịch ngâm ít nhất gấp 10 lần toàn bộ thể tích của mẫu và xếp thành từng lớp trật tự trong các bô can lớn Các bô can này cũng được đổ đầy dung dịch ngâm của mẫu vật, được đậy nắp và bọc parafirm

BÀI 2 THU THẬP, BẢO QUẢN BỆNH PHẨM CHO XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN 2.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm ký sinh trùng

2.1.1 Nội ký sinh trùng

Nội ký sinh trùng thường thấy ở các tổ chức là máu, cơ, phổi, dạ dày, ruột, gan, tim, thận Các loại ký sinh trùng không chỉ có trong các khoang rỗng của tổ chức mà còn thấy ở thành vách của một tổ chức Do đó khi mổ khám phải kiểm tra toàn diện, mẫu thu thập được rửa 3-4 lần bằng nước cất hoặc nước muối sinh lí sau đó bảo quản trong cồn Ethanol 70% và dung dịch Formalin 10%

a Mẫu phân

Đeo găng tay bảo hộ, lấy phân trực tiếp trong trực tràng của con vật hoặc lấy phân con vật vừa thải ra ngoài môi trường, đựng mẫu phân lấy được trong túi zip sạch, có ghi

mã số con vật

Với mẫu phân gà nhốt chuồng, lấy mỗi chuồng 5 mẫu tại 5 điểm khác nhau (4 góc

và 1 điểm trung tâm) Lượng phân lấy tối thiếu 5 g/túi Kiểm tra phân ngay sau khi lấy

để phát hiện ra đơn bào ký sinh Trường hợp chưa kiểm tra được ngay, mẫu cần được bảo quản trong formalin 10% hoặc bảo quản trong hộp đựng mẫu có đá khô để kiểm tra trứng giun sán tại phòng thí nghiệm Mẫu phân phải được bảo quản lạnh (2-8C)

Hình 2.2 Dụng cụ thu và bảo quản mẫu phân

b Mẫu giun sán

Hình 2.3 Thu và bảo quản mẫu giun sán trưởng thành

Trong quá trình mổ khám, nội quan được mở ra, kiểm tra bề mặt niêm mạc để phát hiện bệnh tích đại thể và sự hiện diện của giun sán loại lớn Trường hợp kiểm tra

toàn diện khu hệ giun sán, phần cần lấy làm mẫu bệnh phẩm phải buộc lại để thu các chất chứa bên trong

Bệnh phẩm được bảo quản trong dung dịch cồn ethanol và formalin 10%, bao gói,

có nhãn đính kèm gửi đi xét nghiệm và phân loại giun sán

c Mẫu máu

Trước khi lấy máu con vật cần xét nghiệm, phải cắt lông trên vùng sẽ lấy, sát trùng bằng cồn Ethanol 70% rồi dùng bơm kim tiêm vô trùng lấy từ 1ml đến 5ml máu Tiến hành làm tiêu bản máu trên phiến kính và cố định bằng cồn Methanol

Thu huyết thanh: máu lấy ra được chứa trong bơm tiêm, rút pittông tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi kí hiệu mẫu trên bơm tiêm hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45 trong hộp đựng mẫu, để đông máu 30 phút ở nhiệt

độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp

Hình 2.4 Thu huyết thanh bằng bơm tiêm

Sau đó, chắt huyết thanh sang ống nghiệm vô trùng khác (hoặc ống eppendorf) và ghi kí hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh Huyết thanh đạt yêu cầu cần phải có màu trong hơi vàng và không có hồng cầu vỡ Máu không được làm đông lạnh hoặc để bên ngoài quá lâu (hồng cầu sẽ tự phá hủy) Huyết thanh được bảo quản trong tủ âm sâu (-20C)

Lấy đúng quy trình, đủ máu và sử dụng chất chống đông phù hợp với yêu cầu của xét nghiệm

Tránh làm vỡ hồng cầu Với xét nghiệm đông máu: Không garo quá lâu, không lấy máu quá lâu hoặc lấy ven nhiều lần

Hình 2.5 Lấy máu tĩnh mạch cổ trên gia súc

Hình 2.6 Lấy máu tĩnh mạch khoeo, tĩnh mạch chi trước

Ghi chú: a - Tĩnh mạch đầu; b - Tĩnh mạch đầu phụ; c - Tĩnh mạch hiển saphenous

Chó, mèo lấy máu ở tĩnh mạch khoeo Đối với con vật mới chết lấy máu tim Tất cả các mẫu đều phải được đánh mã hoặc ghi rõ thông tin (loại mẫu, thời gian lấy mẫu, điều kiện bảo quản) trước khi gửi đi xét nghiệm

2.1.2 Ngoại ký sinh trùng

Đối với mẫu ngoại ký sinh trùng, tiến hành bảo quản mẫu trong cồn ethanol 70% (đối với những phương pháp định loại bằng sinh học phân tử) và muốn giữ màu sắc tự nhiên lưu mẫu bằng dung dịch formalin 10% (đối với những phương pháp định loại bằng hình thái) Tuỳ từng loại ngoại ký sinh trùng khác nhau, phương pháp thu mẫu cũng khác nhau:

Ve: dùng kẹp gắp hoặc dùng Ether, Chloroform nhỏ lên mình ve để chúng tự rời đi

Bọ chét và chấy rận: dùng chổi lông, lược đã làm ướt với Xylen chải xuống một

tờ giấy trắng

Mò, mạt, ghẻ ngầm, mò bao lông: dùng dao mổ cạo sâu xuống lớp da có bệnh tích

Hình 2.7 Dụng cụ thu ngoại ký sinh trùng

2.2 Bảo quản, vận chuyển mẫu xét nghiệm ký sinh trùng

2.2.1 Quy trình bảo quản, vận chuyển mẫu

Bệnh phẩm phải đặt trong hộp bảo quản lạnh trong quá trình vận chuyển Phiếu gửi bệnh phẩm, danh sách mẫu kèm theo phải ghi rõ ràng, đầy đủ các thông tin cung cấp cho phòng xét nghiệm và đựng trong một túi nilon khác tách biệt với mẫu bệnh phẩm, tránh gây ướt làm thông tin không chính xác Mẫu bệnh phẩm sau khi lấy, gửi tới phòng xét nghiệm càng nhanh càng tốt

- Mẫu bệnh phẩm là ngoại ký sinh trùng, nội ký sinh trùng: bảo quản trong cồn ethanol 70% để phân tích mẫu bằng phương pháp sinh học phân tử hoặc formalin 10%

- Mẫu huyết thanh: dùng trong các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học, bảo quản ở -20C

2.2.2 Quy trình bảo quản, vận chuyển máu

a Đối với mẫu máu toàn phần dùng chống đông EDTA

Bảo tồn hình dạng và khối lượng của tế bào máu trong một thời gian dài: sử dụng trong xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý máu Bảo quản ở nhiệt độ phòng (20-25C) và chuyển về phòng xét nghiệm phân tích trước 24 giờ từ khi lấy mẫu

b Đối với mẫu máu chống đông Natricitrat 3,8%

Dùng cho xét nghiệm đông máu, định lượng các yếu tố đông máu, khảo sát sự đông và cầm máu Bảo quản ở nhiệt độ phòng và chuyển về phòng thí nghiệm phân tích trước 4 giờ sau khi lấy Đối với mẫu máu sử dụng huyết tương, huyết thanh trong xét nghiệm sinh hóa:

- Mẫu máu chuyển về phòng thí nghiệm để phân tích trong vòng 1 giờ kể từ khi lấy máu

- Nếu không chuyển ngay được về phòng thí nghiệm, phải tách huyết tương/huyết thanh để bảo quản máu

- Huyết tương (có chống đông): tách sớm trong vòng 1 giờ sau khi lấy máu

- Huyết thanh (không sử dụng chất chống đông): tách trong vòng 2 giờ kể từ khi lấy máu

- Huyết thanh hoặc huyết tương: cho phép được bảo quản dưới 4 giờ ở nhiệt độ phòng, 1-2 ngày ở 2-8C, -20C được 6 tháng rã đông 1 lần

Lưu ý:

Các ống có chất chống đông phải lắc ống nhẹ nhàng để trộn đều máu và chất chống đông Bơm máu chậm vào thành ống lưu mẫu, thao tác với ống nghiệm nhẹ nhàng để tránh làm vỡ các tế bào máu

Lấy đúng đủ lượng máu yêu cầu ghi trên ống bảo quản

Các mẫu máu khi vận chuyển cần được bọc đá khô xung quanh, được phân loại và đóng gói để vận chuyển về nơi xét nghiệm

BÀI 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM PHÂN CƠ BẢN CHẨN ĐOÁN

KÝ SINH TRÙNG 3.1 Phương pháp soi tươi trực tiếp

3.1.1 Mục đích

Sử dụng phân hòa tan trong dung dịch glycerin 0,5% (nước muối sinh lý) nhằm quan sát sự xuất hiện của đơn bào, trứng giun sán, ấu trùng và các thể bất thường trong phân

3.1.2 Chuẩn bị

Dụng cụ: kính hiển vi, phiến kính, lamen, que gỗ hoặc đũa thủy tinh

Hóa chất: glycerin 0,5%; nước muối sinh lý

3.1.3 Phương pháp tiến hành

Bước 1: Dùng panh lấy phân của đối tượng cần xét nghiệm có kích thước bằng hạt

đỗ, cho lên phiến kính sạch

Bước 2: Nhỏ thêm 1-2 giọt glycerin 0,5% vào mẫu phân

Bước 3: Dùng đũa thủy tinh trộn đều, cặn bã được gạt ra 2 đầu phiến kính

Bước 4: Dàn mỏng dung dịch phân đều trên phiến kính, soi dưới kính hiển vi (vật kính 10X)

Hình 2.8 Dụng cụ sử dụng trong phương pháp soi tươi

Cách trả lời kết quả xét nghiệm phân:

Trên phiếu trả lời kết quả xét nghiệm phân, phải ghi các nội dung sau:

- Đặc tính của phân: cứng, mềm, nhão, có khuôn, lỏng…

- Màu sắc của phân: Vàng, xanh, nâu, đen…

- Các yếu tố bất thường thấy được bằng mắt thường: chất nhày, máu, đốt sán…

- Phương pháp xét nghiệm phân

- Kết quả: âm tính, dương tính với ký sinh trùng, cường độ nhiễm trên tiêu bản Phạm vi ứng dụng: Do dụng cụ và thao tác đơn giản nên dễ áp dụng ở các cơ sở sản xuất, phương pháp này có thể phát hiện được các loại trứng giun sán Do lượng mẫu nhỏ nên độ chính xác không cao, vì vậy khi xét nghiệm nên làm từ 8-10 mẫu trên mỗi đối tượng cần xét nghiệm Phương pháp này chỉ nên áp dụng để xét nghiệm phân của gia cầm và những súc vật có khối lượng phân nhỏ

3.2 Phương pháp gạn rửa sa lắng

3.2.1 Nguyên lý

Gạn rửa sa lắng là phương pháp xét nghiệm phân dựa trên sự chênh lệch tỷ trọng giữa nước sạch và tỷ trọng của trứng sán Do đốt sán dây và trứng sán lá có tỷ trọng lớn hơn nước nên sẽ chìm xuống dưới

Bước 1: Lấy khoảng 5g

phân của đối tượng cần xét nghiệm cho vào

dạ cỏ, sán lá ruột lợn…) Đơn giản dễ làm nên dễ áp dụng ở cơ sở sản xuất

3.3 Phương pháp tập trung sa lắng sử dụng formalin - ether

3.3.2 Chuẩn bị

Dụng cụ: kính hiển vi, máy ly tâm, giá đựng ống nghiệm, que gỗ hoặc đũa thủy tinh, lưới lọc kim loại, ống hút, cốc thí nghiệm, ống ly tâm 15ml, phiến kính, lamen Hóa chất: dung dịch formalin 10%, tween 20, ether hoặc ethyl acetate

Hình 2.11 Dụng cụ và hoá chất dùng trong phương pháp tập trung sa lắng sử dụng formalin - ether

3.3.3 Phương pháp thí nghiệm

Bước 1: Lấy khoảng 1g

phân cho vào ống Falcon

Bước 2: Cho 7ml dung

dịch formalin 10% đánh tan và lọc qua lưới lọc

Bước 5: Cho 3ml dung

dịch ether vào trong ống ly tâm, thêm 3-4 giọt tween

20, lắc đều Ly tâm 2000

vòng/phút trong 1-2 phút

Bước 6: Ly tâm 3.000 vòng/phút trong 5 phút

Chất dịch trong ống nghiệm được chia thành 4 lớp

(trên hình)

Bước 7: Đổ bỏ 3 lớp

trên cùng, dùng ống hút lấy 1 giọt nhỏ lên phiến kính rồi đậy lamen lên,

soi dưới kính hiển vi

Hình 2.12 Các bước tiến hành của phương pháp sa lắng sử dụng formalin-ether

Chất béo

Cặn chứa

ký sinh trùng Ether

Formalin

Phạm vi ứng dụng: Phát hiện hầu hết các loại trứng giun sán ký sinh, ấu trùng Dễ dàng loại bỏ tạp chất là chất béo từ các mẫu phân, thao tác đơn giản và dễ thực hiện Tuy nhiên, phương pháp này sử dụng ether hoặc ethyl acetat là những chất dễ cháy, đòi hỏi phải bảo quản và lưu giữ cẩn thận

3.4 Phương pháp phù nổi (Fulleborn)

3.4.1 Nguyên lý

Phương pháp này dựa trên sự chênh lệch tỷ trọng của dung dịch muối ăn (NaCl) bão hòa có tỷ trọng d = 1,18, lớn hơn tỷ trọng của trứng giun sán, làm cho trứng giun sán nổi lên bề mặt dung dịch

3.4.2 Chuẩn bị

Hình 2.13 Dụng cụ và hoá chất dùng trong phương pháp Fullebor

Dụng cụ: kính hiển vi, que gỗ hoặc đũa thủy tinh, giá hoặc phễu lọc, panh, cốc nhựa (khoảng 20ml), bình tam giác, vòng vớt, phiến kính, lamen, lọ tiêu bản

Hóa chất: nước muối bão hòa

3.4.3 Phương pháp tiến hành

Bước 1: Dùng panh lấy 2-3g

phân của đối tượng cần xét

nghiệm cho vào cốc sạch

Bước 2: Đổ nước muối bão

hòa gấp 5-10 lần thể tích

phân

Bước 3: Dùng đũa thủy tinh

(hoặc panh) khuấy nát mẫu

phân trong dung dịch

Bước 4: Lọc dung dịch qua giá

và phễu lọc vào cốc đong, cặn bã

phía trên bỏ đi

Bước 5: Đổ đầy dung dịch lên

Hình 2.14 Các bước tiến hành của phương pháp phù nổi Fulleborn

Phạm vi ứng dụng: Phương pháp Fulleborn phát hiện tốt trứng giun tròn, noãn nang cầu trùng, trứng giun đầu gai Đây là một trong các phương pháp dễ làm và rẻ tiền,

Hình 2.15 Dụng cụ và hoá chất dùng trong phương pháp Darling

3.5.3 Phương pháp tiến hành

Bước 1: Lấy 2-3g phân của đối

tượng cần xét nghiệm, cho tiếp vào đó 1 lượng nước sạch Dùng đũa thủy tinh khuấy nát phân

Bước 2: Lọc qua giá và phễu

lọc vào ống ly tâm

Bước 3: Ly tâm 1 lần với tốc độ

1.000-2.000 vòng/phút trong 1-2 phút

Bước 4: Gạn lớp nước có ở phía

trên, giữ lại cặn

Bước 5: Dùng pipette trộn đều

dung dịch cặn, nhỏ lên phiến

Phạm vi ứng dụng: Phương pháp Darling giúp phát hiện trứng giun tròn và noãn nang cầu trùng Phương pháp này có độ chính xác cao, tiến hành trong thời gian ngắn được dùng để chẩn đoán giun sán trong phòng thí nghiệm

3.6 Phương pháp Cherbovich

3.6.1 Nguyên lý

Dựa vào sự chênh lệch giữa trứng giun sán và những dung dịch có tỷ trọng lớn (MgSO4, NaHSO4), đồng thời sử dụng lực ly tâm để phân ly những trứng giun sán có tỷ trọng nặng ra khỏi phân

3.6.2 Chuẩn bị

Dụng cụ: kính hiển vi, máy ly tâm, ống ly tâm, que gỗ hoặc đũa thủy tinh, giá đựng ống nghiệm, vòng vớt, giá hoặc phễu lọc, dụng cụ đựng phân, cốc nhựa

Hóa chất: Dung dịch MgSO4 hoặc NaHSO3

Hình 2.17 Dụng cụ và hoá chất dùng trong phương pháp Cherbovich

3.6.3 Phương pháp tiến hành

Bước 1: Dùng pipet hoặc

đũa thủy tinh lấy 5-10g phân của đối tượng định xét

nghiệm cho vào cốc sạch

Bước 2: Đổ nước vào với một

lượng gấp khoảng 10 lần khối lượng phân Dùng đũa thủy tinh khuấy nát phân và lọc qua

phễu lọc vào ống ly tâm

Bước 3: Ly tâm với tốc độ

2.000-3.000 vòng/phút Loại bỏ dịch nổi và

bổ sung dung dịch MgSO 4 hoặc NaHSO 3 vào Trộn đều, tiếp tục ly tâm

với tốc độ 2.000-3.000 vòng/phút

Bước 5: Dùng vòng vớt hoặc đũa thủy tinh vớt lớp váng của dung

dịch đặt lên phiến kính sạch, đậy lá kính

Bước 6: Kiểm tra dưới kính hiển vi

vật kính 10X và 40X

Hình 2.18 Các bước tiến hành của phương pháp Cherbovic

Phạm vi ứng dụng: Phương pháp này có độ chính xác cao, giúp chẩn đoán nhanh, phát hiện được cả những trứng giun tròn nặng (có ấu trùng bên trong) như trứng giun

phổi (Metastrongylus sp.), trứng giun đầu gai, sán dây (ở ngựa)

3.7 Phương pháp Baermann và Vaid

Bước 1: Lắp đặt hệ thống Baermann: đặt phễu thủy tinh

Đặt lưới kim loại lên phễu Lắp ống cao su vào phễu và kẹp chặt ống cao su lại Trên lưới kim loại đặt 2 miếng gạc (nếu phân lỏng, lót dưới miếng gạc 2 lớp giấy thấm) Cho khoảng 150g phân tươi lên tấm gạc trên phễu Đổ vào phễu nước

ấm 45C sao cho nước vừa ngập phân Để yên từ 1-3 giờ

5 phút.

Bước 4: Loại bỏ phần

nước nổi Bước 5: Dùng pipette trộn đều dung dịch cặn, nhỏ lên phiến kính và đậy lamen Bước 6: Kiểm tra dưới kính hiển vi vật kính 10X.

Hình 2.19 Các bước tiến hành của phương pháp Baermann

Trong trường hợp không có hệ thống Baermann như mô tả, có thể sử dụng cách thức sau:

Bước 1: Cho 10-15g phân vào

mảnh vải gạc, buộc túi phân vào 1 que gỗ hoặc đũa thủy tinh Đặt túi phân vào cốc Đổ nước ấm vào cốc cho ngập túi phân Để yên vài giờ

Bước 2: Hút phần nước phía

đáy cốc

Bước 3: Nhỏ 1 giọt dung dịch lên

phiến kính, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi vật kính 10X

Hình 2.20 Các bước tiến hành của phương pháp Baermann đơn giản

Đối với phương pháp Vaid, các bước tiến hành đơn giản hơn so với phương pháp Baermann, tuy nhiên hiệu quả không cao, thường dùng để tìm ấu trùng trong phân gia súc có dạng viên như phân dê, cừu

Phương pháp tiến hành:

- Bước 1: Đặt 4-5 viên phân vào đĩa petri và cho vào một ít nước ấm

- Bước 2: Sau 15-30 phút vớt các viên phân bỏ đi

- Bước 3: Nước ở hộp lồng đem quan sát dưới kính hiển vi tìm ấu trùng

Phạm vi ứng dụng: Phương pháp Baermann và Vaid là hai phương pháp phổ biến được dùng xác định ấu trùng có trong mẫu phân của gia súc, tuy nhiên thời gian phương pháp kéo dài, hiệu quả thấp

3.8 Phương pháp nuôi ấu trùng trên thạch agar

Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạc agar

20%, cho vào các đĩa petri nhỏ Lấy 2g phân đặt vào chính giữa đĩa thạch

Bước 2: Đặt đĩa thạch

vào trong đĩa petri to

Bước 3: Cố định 2 đĩa petri với

nhau bằng băng dính 2 mặt

Bước 4: Đổ 5ml glycerin 25% vào

đĩa petri to

Bước 5: Đậy nắp đĩa thạch

quấn parafin và để vào tủ ấm từ 25-28oC

Bước 6: Sau 3-8 ngày soi

dưới kính hiển vi soi nổi để tìm giun ở trên bề mặt thạch

cho vào đĩa thạch để rửa đĩa thu ấu trùng Rửa 2-3 lần

Bước 9: Hút hết dung dịch trên

mặt thạch cho vào ống falcol chứa 1,4ml cồn tuyệt đối ta thu được dung dịch cồn 70 chứa ấu trùng

Hình 2.22 Các bước tiến hành của phương pháp nuôi ấu trùng trên thạch agar

Phạm vi ứng dụng: Đây là phương pháp phổ biến để thu và tinh sạch ấu trùng giun tròn (như giun lươn, giun móc,…) nhằm mục đích lưu giữ mẫu, định loại hay thu

ấu trùng tinh sạch để điều chế kháng nguyên

Dụng cụ: bình stoll (bình tam giác cổ cao, miệng rộng có 2 vạch định mức 50ml

và 60ml), nút bình, bi thủy tinh đường kính 3-4mm, phiến kính, micropipette loại 0,2ml,

lọ chứa phân, que gỗ hoặc thủy tinh

Hóa chất: dung dịch NaOH

Hình 2.23 Hình ảnh bình Stoll

3.9.3 Phương pháp tiến hành

- Bước 1: Dùng ống đong có chia vạch, cho vào 56ml dung dịch NaOH 0,1N

- Bước 2: Dùng panh lấy phân của đối tượng cần xét nghiệm cho từ từ vào ống đong đến vạch 60ml Như vậy lượng phân tương đương là 4 gram

- Bước 3: Cho bi thủy tinh vào bình

- Bước 4: Dùng đũa thủy tinh khuấy đều phân trong dung dịch

- Bước 5: Dừng lại đột ngột, hút 0,15ml dung dịch đưa ra phiến kính sạch soi dưới kính hiển vi

- Bước 6: Đếm tất cả số trứng có trong 0,15ml dung dịch đó

Cách tính:

Tính số trứng đếm được trên 1gam phân:

Gọi n là số trứng trong 0,15(ml) phân Gọi N là số trứng có trong 1gam phân = 1.000mg

Số trứng đếm được trong 1gam phân

n 60N

số lượng trứng tìm thấy trong phân Tuy nhiên, phương pháp này chỉ có thể giúp chúng ta đánh giá được khái quát mức độ nhiễm, không thể chính xác tuyệt đối, vì phụ thuộc vào các giai đoạn của giun sán, giun đực hay cái, phân lỏng hay đặc hay kĩ thuật đếm trứng

3.10 Phương pháp định lượng Mc Master

3.10.1 Chuẩn bị

Dụng cụ: kính hiển vi, cốc, cân, buồng đếm Mc Master, pipette pasteur

Hóa chất: nước muối bão hòa

Hình 2.24 Dụng cụ và hoá chất dùng trong phương pháp định lượng Mc Master

Bước 6: Đợi khoảng 5 phút sau

đó soi dưới kính hiển vi qua vật kính 10X

Hình 2.25 Các bước tiến hành của phương pháp định lượng Mc Master

Cách tính:

Tính số trứng đếm được trên 1gam phân:

Gọi n1, n2 lần lượt là số trứng trong 0,15 (ml) ở mỗi buồng đếm Gọi N là số trứng có trong 1gam phân = 1.000mg

Số trứng đếm được trong 1gam phân

n1 n2

302N

0,15 2



Phạm vi ứng dụng: Đây là một phương pháp khác dùng để xác định số lượng trứng giun tròn có trong 1g phân Ưu điểm của phương pháp này là thời gian tiến hành nhanh, kĩ thuật đơn giản tuy nhiên cần phải có buồng đếm chuyên dụng Mc Master

Bảng 1 So sánh một số phương pháp xét nghiệm phân cơ bản

hoạt động của đơn bào ký sinh trong mẫu phân

- Là một phương pháp bổ sung sau khi tiến hành các phương pháp xét nghiệm khác

- Độ nhạy thấp do chỉ xét nghiệm khối lượng phân nhỏ

Phù nổi (sử dụng nước muối bão hòa, nước đường bão hòa hay một số dung dịch muối bão hòa khác)

- Phương pháp phổ biến ứng dụng trong xét nghiệm phân tìm trứng giun tròn và đơn bào như cầu trùng Eimeria

- Không tìm được trứng sán lá, trứng sán dây bộ Giả diệp và

ấu trùng giun tròn

Sa lắng sử dụng Formalin Ether

- Ứng dụng trong xét nghiệm mẫu phân có lượng lớn chất béo trong đó

- Tốn nhiều thời gian

phân

- Tốn nhiều thời gian

Nuôi ấu trùng trên thạch agar - Thu và tinh sạch ấu trùng giun

tròn trong phân

- Tốn nhiều thời gian

BÀI 4 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM KÝ SINH TRÙNG TRONG MÁU 4.1 Phương pháp nhuộm giemsa

Giemsa Cồn Methanol

Hình 2.26 Dụng cụ và hoá chất dùng trong phương pháp nhuộm Giemsa

Pha dung dịch đệm (phosphat buffer solution):

- KH2PO4: 0,7g

- NaH2PO4: 1,0g

- Cho mỗi loại muối trên vào 1 cốc chứa 150ml nước cất, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho tan hết Đổ 2 loại vào ống đong rồi cho thêm nước cất cho đủ 1.000ml Khuấy đều, kiểm tra và điều chỉnh pH = 7,2

Pha dung dịch nhuộm Giemsa:

- Nhuộm thường quy: Dung dịch Giemsa 3-4%: Pha 9,7ml dung dịch đệm với 0,3ml Giemsa mẹ, khi nhuộm để 30-45 phút

- Nhuộm nhanh: Dung dịch Giemsa 10%: Pha 9ml dung dịch đệm với 1ml Giemsa mẹ Khi nhuộm để 15-20 phút

4.1.3 Phương pháp tiến hành làm tiêu bản máu

Chuẩn bị: Phiến kính sạch trong không bụi, mẫu máu

Phiến kính Ống chống đông

Hình 2.27 Dụng cụ dùng làm tiêu bản máu

Phương pháp tiến hành phiết máu:

Bước 1: Nhỏ 1 giọt máu cách đầu

phiến kính 1cm, giữ phiến kính ngang bằng 1 tay

Bước 2: Đặt phiến kính khác lên

giọt máu (nghiêng 45o) sao cho

máu lan tỏa theo cạnh này

Bước 3: Đẩy nhanh phiến kính theo

chiều dài của phiến kính, để máu khô

tự nhiên, đánh dấu tiêu bản

Hình 2.28 Các bước phiết máu

Chú ý: Tiêu bản tốt là tiêu bản được dàn đều, không quá mỏng cũng không quá

dày, cách 2 đầu phiến kính 1cm, phiến đuôi kính tạo thành hình lưỡi mèo; Tiêu bản sạch; Không kéo 2 lần trên 1 giọt máu

Phương pháp tiến hành nhuộm:

- Bước 1: Tay trái cầm tiêu bản nghiêng 30, tay phải cầm pipet nhỏ 3-4 giọt cồn tuyệt đối lên phần đầu của tiêu bản Dùng pipette gạt ngang cho cồn tràn phủ khắp diện tích mẫu bệnh phẩm, vừa gạt vừa nghiêng tiêu bản cho cồn chảy hết về đuôi của tiêu bản Cắm tiêu bản lên giá cho khô

- Bước 2: Xếp tiêu bản lên giá, nhỏ giọt dung dịch thuốc nhuộm phủ kín diện dích mẫu bệnh phẩm, để thời gian đúng với quy định

- Bước 3: Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, không đổ thuốc nhuộm trước, không để nước xối trực tiếp vào máu, để tiêu bản khô tự nhiên

- Bước 4: Soi tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính 100X (có dầu soi kính) và ghi kết quả

Phạm vi ứng dụng: Tiêu bản máu, tiêu bản chất dịch (dịch phế quản, dịch các màng, dịch ổ bụng…)

4.2 Phương pháp nhuộm nhanh Diff - Quick