VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Cây Trầu bà cánh én (Philodendron Florida)
Hình 3.1 Cây Trầu bà cánh én
Vật liệu nghiên cứu, hoá chất và dụng cụ nghiên cứu
Cây con giống in vitro cây Trầu bà cánh én, có chiều cao từ 1 đến 2 cm, được cung cấp bởi Khoa Công nghệ Sinh học thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Trong nghiên cứu, các dụng cụ thiết yếu bao gồm nồi hấp khử trùng, box cấy vô trùng, bình tam giác, pipet, máy chuẩn độ pH, panh, dao, kéo, dao cắt, đèn UV, cân kỹ thuật, cân phân tích, tủ sấy, hệ thống giàn đèn và máy khuấy từ.
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các loại hóa chất quan trọng bao gồm muối đa lượng và vi lượng theo công thức Murashige và Skoog (1962), đường, agar, cùng với các chất điều tiết sinh trưởng như BA, Kinetin, α-NAA, IBA, IAA và nước dừa Những thành phần này đóng vai trò thiết yếu trong việc tạo môi trường nghiên cứu hiệu quả cho sự phát triển của tế bào thực vật.
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng BA và α- NAA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Trầu bà cánh én
Công thức Nồng độ BA (mg/l ) Nồng độ α-NAA (mg/l) ĐC 0,0 0,0
Môi trường nền: MS + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar, pH = 5,8
3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng Kinetin và α-NAA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro cây Trầu bà cánh én
Công thức Nồng độ Kinetin (mg/l ) Nồng độ α-NAA (mg/l) ĐC 0,0 0,0
Môi trường nền: MS + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar, pH = 5,8
3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro của cây Trầu bà cánh én
Công thức Nồng độ nước dừa (ml/l) ĐC 0
Môi trường nền: MS + 1 mg/l BA + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar, pH = 5,8
3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro Trầu bà cánh én
Công thức Nồng độ than hoạt tính (g/l) ĐC 0,0
Môi trường nền: MS + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar, pH = 5,8
3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ α-NAA đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro Trầu bà cánh én
Công thức Nồng độ α-NAA (mg/l) ĐC 0,0
Môi trường nền: MS + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar, pH = 5,8
3.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng dộ IAA đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro Trầu bà cánh én
Công thức Nồng độ IAA (mg/l) ĐC 0,0
Môi trường nền: MS + 30 g/l đường + 6,5 g/l agar, pH = 5,8
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô in vitro
Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962), với sự bổ sung đường và agar, pH = 5,8, và thể tích dung dịch trong mỗi bình nuôi cấy từ 40 đến 50 ml Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 oC trong 20 phút dưới áp suất 1 atm Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, với ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì ổn định.
- Cường độ ánh sáng: 1500 – 2500 lux
Lấy cây con giống in vitro của cây Trầu bà cánh én bằng cách tách từ cụm cây con cao 1 – 2 cm, sau đó cấy chuyển mẫu sang môi trường có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng với nồng độ khác nhau để xác định khả năng tái sinh chồi.
3.3.3 Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh
Cây con giống in vitro của cây Trầu bà cánh én phát triển tốt trong trạng thái bình thường, đã hình thành lá và rễ con Cần cắt bỏ phần rễ nếu có và chuyển sang môi trường ra rễ để tạo ra cây hoàn chỉnh Môi trường ra rễ được thiết kế với nền thích hợp và bổ sung chất điều tiết sinh trưởng với nồng độ khác nhau.
3.3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm
- Các thí nghiệm là độc lập với nhau Mỗi công thức gồm 10 mẫu và được nhắc lại 3 lần
- Thời gian theo dõi mẫu: đối với nhân nhanh theo dõi trong 4 tuần, đối với tạo rễ theo dõi trong 5 tuần
- Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát định kỳ 2 tuần/lần
3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu
Các chỉ tiêu theo dõi:
Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống
Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm
Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) = Tổng số mẫu tạo chồi
Hệ số nhân chồi = Tổng số chồi
Chiều cao chồi trung bình (cm) = Chiều dài chồi
Tỷ lệ ra rễ (%) = Tổng số mẫu ra rễ
Chiều dài rễ trung bình (cm) = Tổng chiều dài rễ
Số rễ trung bình = Tổng số rễ
- Kích thước: to, nhỏ, trung bình, cao, thấp
Số liệu được xử lý theo chương trình Microsoft Excel 2016 và phần mềm IRRISTAT 5.0
Các công thức so sánh được thực hiện bằng cách kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình thông qua phép ước lượng và tiêu chuẩn LSD với độ tin cậy 95% Độ biến động của thí nghiệm được thể hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%.
