(Luận văn) nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện hòa vang thành phố đà nẵng

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG LÊ TRẦN DIỆU LINH NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ TẠO CHẾ PHẨM THÔ CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE TỪ ĐẤT THUỘC ĐỊA BÀN HUYỆN HÒA VANG – THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Trang 1

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

LÊ TRẦN DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ TẠO CHẾ PHẨM THÔ CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE TỪ ĐẤT THUỘC ĐỊA BÀN HUYỆN HÒA VANG – THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

Đà Nẵng - năm 2018

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 2

của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng” là kết quả nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu nghiên cứu, kết quả điều tra, kết quả phân tích trung thực, chƣa từng đƣợc công bố Các số liệu liên quan đƣợc trích dẫn có ghi chú nguồn gốc, đã công bố theo đúng quy định

Đà Nẵng, tháng 05 năm 2018

Lê Trần Diệu Linh

Trang 3

người đã luôn quan tâm và tận tình hướng dẫn, truyền đạt nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa -Môi trường - Đại học Sư Phạm- Đại học Đà Nẵng đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất có thể giúp cho em hoàn thành khóa luận

Cuối cùng, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và anh chị khóa trên đã luôn nhiệt tình hỗ trợ, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian làm khóa luận

Xin chân thành cảm ơn!

Lê Trần Diệu Linh

Trang 4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

DANH MỤC BẢNG viii

MỞ ĐẦU 1

1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE 3

1.2 ENZYME PHYTASE 4

1.2.1 Nguốc gốc enzyme phytase 6

1.2.2 Đặc điểm enzyme phytase 7

1.2.3 Ứng dụng của enzyme phytase 9

1.3 LÊN MEN XỐP 12

1.3.1 Khái niệm lên men xốp 12

1.3.2 Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật lên men xốp 12

1.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 13

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 14

1.5 ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ 15

1.6 ĐẶC ĐIỂM TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU 16

1.6.1 Địa hình và đất đai 16

1.6.2 Đặc điểm khí hậu và thổ nhưỡng 16

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 17

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

Trang 5

2.2.3 Thời gian nghiên cứu 18

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lí mẫu đất 18

2.3.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật có khả năng sinh phytase ngoại bào 19

2.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật (theo phương pháp Koch) 20

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme phytase 21

2.3.5 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái các chủng tuyển chọn 23

2.3.6 Giữ giống VSV 24

2.3.7 Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử 24

2.3.8 Phương pháp tạo chế phẩm enzyme phytase 27

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 32

3.1 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE 32

3.3 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ NUÔI CẤY CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE TUYỂN CHỌN 38

3.4 ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT SINH ENZYME PHYTASE ĐƯỢC TUYỂN CHỌN 44

3.4.1 Nhân trình tự gen 18S rRNA của các mẫu nấm NM1 và NM4 44

3.4.2 Giải trình tự và lập cây phân loại 45

3.5 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ENZYME PHYTASE TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN XỐP 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

1 KẾT LUẬN 57

2.KIẾN NGHỊ 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Trang 6

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CFU : Colony Foming Unit (Đơn vị khuẩn lạc)

CT : Công thức

KL : Khuẩn lạc KLTB : Khối lƣợng trung bình HSCC : Hệ sợi cơ chất

Trang 7

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Số hiệu

Hình 1.2 Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein 3

Hình 2.1 Mối tương quan giữa nồng độ K2HPO4 với OD 23 Hình 2.2 Chu trình gia nhiệt chương trình chạy PCR 25

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm enzyme

Hình 3.6 Khuẩn lạc và hình thái tế bào vi khuẩn VK-1 39

Hình 3.7 Chủng nấm mốc NM-1trên môi trường PDA và Cơ quan

sinh sản của chủng nấm mốc NM-1 dưới kính hiển vi 41

Hình 3.8 Chủng nấm mốc NM-4 trên môi trường và cơ quan sinh

sản của chủng nấm mốc NM-4 dưới kính hiển vi 42

Hình 3.9 Dịch nuôi cấy lỏng qua 120 giờ nuôi cấy 43

Hình 3.10 Thu dịch lỏng nuôi cấy các chủng tuyển chọn qua thời

Hình 3.11 Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của 44

Trang 8

Hình 3.12 Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme

Hình 3.19 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme

phytase trên môi trường xốp của chủng VK-1 53

Hình 3.20 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường

Trang 9

DANH MỤC BẢNG

Số hiệu

Bảng 1.1 Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng 4

Bảng 2.1 Tương quan giữa hàm lượng phốt pho vô cơ và OD 700 nm 22

Bảng 2.3 Mã số trình tự 18S rARN của một số loài nấm mốc 27

Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất lên men đến hoạt tính

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả

năng sinh enzyme phytase của chủng VSV tuyển chọn 29

Bảng 2.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme

phytase của VSV trên môi trường bán rắn 30

Bảng 2.7 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến hoạt

tính enzyme của chủng vi sinh vật tuyển chọn 31

Bảng 3.1

Số chủng vi sinh vật sinh trưởng trên môi trường sàng lọc được phân lập từ đất tại các xã thuộc H.Hòa Vang -TP.Đà Nẵng

33

Bảng 3.2

Khả năng sinh enzyme phytase của một số chủng nấm mốc

và vi khuẩn trên môi trường PSM có bổ sung CaCl2 36

Bảng 3.3 Đặc điểm nuôi cấy và hình thái chủng VK-2 sinh phytase

Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc NM-1, NM-4 40

Bảng 3.5 Hoạt độ enzyme của chủng MN-1, MN-4 và VK-2 qua các 42

Trang 10

gen mã hóa 18S rARN

Bảng 3.6

Kết quả ảnh hưởng của cơ chất lên men đến khả năng hoạt

Bảng 3.7

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzyme phytase

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme phytase

và sinh trưởng của VSV trên môi trường bán rắn 52

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của điều kiện pH đến khả năng sinh hoạt tính

Trang 11

MỞ ĐẦU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, việc ứng dụng công nghệ sinh học để nâng cao chất lượng, hiệu quả sản phẩm và chất lượng môi trường trong nuôi trồng đang là hướng đi chủ đạo, mang tính khoa học và có ý nghĩa rất lớn đến việc phát triển bền vững Công nghệ enzyme được xem như là phương án thích hợp, tham gia vào việc giải quyết, nâng cao hiệu quả thức ăn và giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ hoạt động chăn nuôi [17] Nhiều nghiên cứu về vai trò của enzyme tiêu hóa như lipase, protease, amylase

và phytase bổ sung vào thức ăn vật nuôi Đặc biệt trong các enzyme trên thì phytase

là một trong những enzyme có rất nhiều ứng dụng trong thực tiễn Sử dụng phytase vào thức ăn chăn nuôi, giúp vật nuôi tăng trọng lượng rất hiệu quả Do enzyme có tác dụng thủy phân chất kháng dinh dưỡng axit phytic (chiếm 50-80% phospho trong các loại hạt ngũ cốc), giúp vật nuôi tăng cường hấp thu hiệu quả các protein

và khoáng chất như: Ca, Zn, Fe… trong thức ăn chăn nuôi[15] Mặt khác sử dụng enzyme còn giúp làm giảm lượng phospho dư thừa thải qua phân của vật nuôi, hạn chế tình trạng ô nhiễm phân, góp phần quan trọng vào ngành chăn nuôi sạch và bền vững Ngoài ra, phytase bắt đầu được sử dụng trong thực phẩm của người, điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm, sử dụng trong công nghiệp giấy, ứng dụng cải tạo đất trồng [26]

Chính vì những lợi ích của enzyme phytase mang lại, mà trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về enzyme phytase và các nhà khoa học vẫn không ngừng nghiên cứu, tìm tòi enzyme phytase từ những chủng vi sinh vật sinh phytase chưa ai nghiên cứu tới Để tìm ra các ưu thế vượt trội hoặc tìm ra các giải pháp thay thế, vướng mắc trong việc mua bán bản quyền, vần đề cạnh tranh giữa các công ty Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về enzyme phytase vẫn còn nhiều hạn chế, việc sản xuất các chế phẩm phytase cũng chưa được quan tâm Vì vậy, phần lớn chế phẩm enzyme phytase trên thị trường hiện nay, chủ yếu là được nhập khẩu từ các nước Trung Quốc, Hoa kì, Nhật Bản…với giá thành rất cao[17]

Trong tự nhiên, enzyme phytase phân bố rất rộng rãi, có thể được tìm thấy trong mô thực vật, một số mô động vật và vi sinh vật Trong đó, phytase từ vi sinh

Trang 12

vật có tiềm năng lớn trong ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp Một số loài vi

khuẩn sinh phytase đã được nghiên cứu như Bacillus sp, Escherichia.coli,

Enterobacter, Lactobacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter… Và một số

chủng nấm mốc, đặc biệt là các chủng thuộc chi Aspergillus, Penicillium, Mucor và

Rhizopus[7],[15],[24]

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, đa dạng về địa hình và hệ sinh thái

đã tạo nên sự đa dạng về các loài vi sinh vật, cũng như do nhu cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên

cứu “Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng”

nhằm tìm kiếm các loài vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và an toàn, đáp ứng nhu cầu sử dụng chế phẩm enzyme trong nông nghiệp hiện nay

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase ngoại bào mạnh từ đất tại một số xã thuộc huyện Hòa Vang- thành phố Đà Nẵng, khảo sát và lựa chọn các điều kiện môi trường tối ưu cho quá trình lên men xốp tạo chế phẩm enzyme phytase thô

3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Tuyển chọn và lưu trữ một số chủng vi sinh vật sinh enzyme phytase ngoại bào có hoạt tính mạnh tại địa bàn huyện Hòa Vang – TP Đà Nẵng

- Xác định một số điều kiện và môi trường tối ưu cho quy trình lên men xốp tạo chế phẩm enzyme thô Góp phần tạo chế phẩm sinh học ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau của nghành nông nghiệp, đặc biệt là chăn nuôi

Trang 13

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE

Axit Phytic là este photphate của inositol, có công thức phân tử là inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphat ( IP6 ) là thành phần chính của phopho ( P ) trong thực vật được dự trữ chủ yếu ở các cây ngũ cốc, cây họ đậu và các loại hạt chứa dầu và được phát hiện năm 1903

myo-Hình 1.1 Cấu trúc của inositol

Axit phytic trong thực vật không tồn tại tự do mà thường tạo muối phytate với một số nguyên tố khoáng như Mg, K, Ca, cũng như tham gia liên kết với các protein Và tạo phức với protein thành hợp chất gọi là Phytin hay phytate Axit phytic được coi là một hợp chất kháng dinh dưỡng (an anti-nutritional compound)

do khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại và các hợp chất khác như tinh bột, protein làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất này

Hình 1.2 Muối phytate và các liên kết với ion kim loại và protein

Trang 14

Muối này gọi là phytate (hay phytin), thông thường chiếm khoảng 1 đến vài phần trăm trọng lượng khô của nhiều hạt và trong vài trường hợp nó chiếm khoảng 50-80% lượng photpho tổng của hạt Không có hạt trưởng thành nào mà không có phytate mặc dù nó có thể không có ở một số mô hạt nhất định nào đó như nội nhũ chứa tinh bột của những hạt ngũ cốc Phytate cũng có ở hạt phấn , bào tử túi và mô sinh dưỡng như rễ, cuống và lá Phytate hầu như không có mặt trong nội nhũ của lúa mỳ và lúa nước mà tập trung trong mầm và trong lớp vỏ Alơron của tế bào hạt

Ở đậu Hà Lan, 99% phytate của hạt tìm được trong lá mầm và 1% trong phôi mầm Ngô là loại ngũ cốc có hàm lượng phytate cao nhất (chiếm 0.83 – 2.22% khối lượng hạt) Trong số các cây họ đậu, đậu dolique (dolique beans) có hàm lượng phytate cao nhất (5.92 – 9.15% khối lượng hạt)[15]

Bảng 1.1 Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng

Axit phytic có hiệu ứng kháng dinh dưỡng rất mạnh đối với động vật Do cấu trúc phân tử đặc biệt (hình 1.1), axit phytic có thể liên kết chặt chẽ với protein, các nguyên tố khoáng và tạo thành phức hợp không tan trong đường tiêu hóa Hiệu ứng này dẫn đến ức chế quá trình tiêu hoá protein và hạn chế khả năng hấp thụ các ion khoáng như Ca, Mg, Zn…Kẽm là một nguyên tố vi lượng mà hoạt tính sinh học của

nó bị ảnh hưởng lớn nhất bởi axit phytic Thử nghiệm trên chuột cho thấy axit phytic bổ sung vào thức ăn làm giảm mạnh khả năng hấp thụ ion Zn2+ và trọng lượng của chuột [17]

1.2 ENZYME PHYTASE

Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme đặc biệt trong số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân từng bước acid phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (Pi) và các

Trang 15

myo-inositol phosphate trung gian (IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) [25] Trong một vài

trường hợp phản ứng có thể giải phóng myo-inositol tự do (hình 1.3)

Hình 1.3 Phản ứng xúc tác của enzyme phytase

Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại phytase thành hai dạng là:

Dạng 1: kí hiệu (EC 3.1.3.8)

Tên đề xuất: 3-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 3 phosphohydrolase Tên khác: phytase; phytate-3-phosphatase

Dạng 2: kí hiệu (EC 3.1.3.26)

Tên đề xuất: 6-phytase Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 6 phosphohydrolase Tên khác: phytase; phytate-6-phosphatase

Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphat đầu tiên bị phytase tấn công Enzyme 3-phytase (EC 3.1.3.8) tấn công vào nhóm phosphat ở vị trí thứ 3; đây là dạng phytase điển hình của vi sinh vật và enzyme 6-phytase (EC 3.1.3.26) tấn công đầu tiên vào nhóm phốt phát số 6; đây là dạng điển hình cho phytase từ thực vật [26]

Dựa trên pH hoạt động tối ưu, phytase được chia thành 3 loại: phytase ưa acid,

Trang 16

ưa kiềm và trung tính

Ngoài ra, dựa vào cấu hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase được phân thành 3 loại khác nhau là: histidine acid phosphatase (HAP) phytases, ß- propeller phytase (BPP) và purple acid phosphatase (PAP) phytase [21]

Phytase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật, động vật và các loài vi sinh vật Phytase có mặt ở nhiều loài vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn, nấm, nấm men và động vật nguyên sinh [11] Từ các nguồn thu enzyme khiến điều kiện hoạt động của phytase không giống nhau Các enzyme phytase từ thực vật thường hoạt động tốt ở nhiệt độ 45-60oC, trong khi phytase thu từ vi sinh vật hoạt động ở phạm vi nhiệt độ rộng hơn, từ 35oC đến 63oC [19]

Khối lượng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa (trừ phytase

từ Klebsiella aerogenes là có 2 dạng phân tử cảm ứng) Phytase từ eukaryote như

nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thường được glycosyl hóa và có khối lượng phân tử cao hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm mốc, khoảng 500 kDa đối với phytase của nấm men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và động vật [22]

1.2.1 Nguốc gốc enzyme phytase

Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã được tìm thấy từ mô thực vật, động vật và rất nhiều loài vi sinh vật

a Phytase từ vi sinh vật

Phytase được tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn như: Aerobacter aerogenes,

Pseudomonas sp, Bacillus subtilis, Klebsiella sp, B subtilis, Escherichia coli, Enterobacter sp và B amyloliquefaciens Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào

là những chủng thuộc về chi Bacillus và Enterobacter Còn phytase từ E coli lại là

enzyme nội bào (periplasmic enzyme) Ngoài ra, phytase còn có trong các chủng

nấm mốc đặc biệt ở các loài A.ficuum, A.carbonarius, A.oryzae, A.niger và

A.fumigatus thuộc chi Aspergillus và một số nấm men như Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii,

Trang 17

Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis và Schwanniomyces castelii,

cũng có khả năng sản sinh phytase [7], [18], [31]

Phytase được thu từ các loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus được sử dụng như

một chế phẩm vi sinh trong việc cải tạo đất trồng Sự tăng trưởng đáng kể về kích thước, chiều dài rễ cũng như chiều cao cây của các cây gieo trồng khi được bổ sung chế phẩm vi sinh chứa enzyme phytase cho thấy đây là một tiềm năng ứng dụng to lớn [7]

Trong một số loài khác của chi Aspergillus như A.rugulosus cho thấy việc sử

dụng hiệu quả enzyme phytase trong việc cải thiện hàm lượng chất chất khô và sản lượng các các loại ngũ cốc Ngoài ra phytase từ các nguồn vi sinh vật đã được bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm giúp vật nuôi có thể hấp thụ được phosphoric Việc bổ sung phytase từ nấm mốc trong chế độ ăn của heo đã giúp việc hấp thụ phospho tăng từ 52% đến 64% [43] Một nghiên cứu khác lại cho thấy, phytase từ nấm mốc bổ sung vào thức ăn của gà giúp chúng hấp thụ phospho tăng

từ 50 đến 60% [15]

Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp phát triển càng giúp cho chất lượng enzyme phytase thu từ nguồn này cải thiện đáng kể Việc bổ sung các đoạn gen giúp cho enzyme phytase tăng khả năng chống chịu với các điều kiện từ môi trường bên ngoài và chống lại sự phân hủy enzyme tiêu hóa trong dạ dày [34]

b Phytase từ động vật

Các nhà khoa học đã chứng minh có sự tồn tại phytase trong cơ thể động vật

dạ dày đơn Tuy nhiên, phytase này trong ruột non động vật dạ dày đơn không có vai trò rõ ràng trong việc phân giải muối phytate từ thức ăn Một enzyme giống như

phytase cũng đã được tìm thấy trong động vật nguyên sinh Paramecium [15]

1.2.2 Đặc điểm enzyme phytase

a Cấu tạo phân tử của enzyme phytase

Hầu hết các loại phytase được biết đều là enzyme monome, điển hình như

phytase từ nấm, từ E coli và K terrigena và từ B subtilis Tuy vậy, một số phytase

Trang 18

từ thực vật và động vật được tạo thành từ nhiều tiểu đơn vị Một loại phytase được tổng hợp ở hạt ngô trong giai đoạn nảy mầm là enzyme dime bao gồm hai tiểu đơn

vị kích cỡ 38 kDa Trong khi đó, phytase tinh sạch từ ruột non của chuột thể hiện hai băng (band) protein trên SDS-PAGE với trọng lượng phân tử ước tính là 70 và

90 kDa Tuy vậy, chỉ có tiểu đơn vị 90 kDa có hoạt tính thuỷ phân axit phytic, có thể hai băng protein là đại diện cho hai enzyme khác nhau (phosphatase kiềm và

phytase) Đặc biệt enzyme từ động vật nguyên sinh Paramecium có cấu trúc

hexame[15]

Phytase vi khuẩn thường nhỏ hơn phytase từ nấm Kết quả nghiên cứu cho thấy, phytase nấm có khối lượng khoảng 65 và 70 kDa và đã được glycosyl hóa

(glycosylation) Phytase từ A niger NRRL 3135 được glycosyl hóa 27% Nó có đầu

N liên kết với chuỗi manose và galactose nghiên cứu chỉ ra rằng mức độ glycosyl

của phytase tái tổ hợp là không ổn định Ở Hansenula polymorpha và S cerevisiae

quá trình glycosyl hóa rất hay thay đổi Ngược lại, quá trình này của enzyme trong

A niger khá ổn định Điểm đáng chú ý là, sự glycosyl hóa không chỉ khác nhau

giữa các loài mà còn khác nhau giữa những lần lên men khác nhau của cùng một chủng Nhìn chung, mức độ glycosyl hóa có thể có vài tác động lên đặc tính của enzyme Đầu tiên, nó có thể ảnh hưởng đến đặc tính xúc tác hoặc tác động đến sự

ổn định của enzyme Thứ hai, nó có thể ảnh hưởng đến điểm đẳng điện của protein (pI) Thứ ba, nó có thể làm giảm mức độ biểu hiện của protein thông qua sự chi phối năng lượng trao đổi[15]

b Đặc tính nhiệt độ và pH ảnh hưởng đến enzyme phytase

pH tối ưu của phytase dao động từ 2.2 đến 8 Hầu hết các phytase từ vi sinh vật, điển hình phytase có nguồn gốc từ nấm có pH tối ưu ở khoảng 4.5 – 5.6 Đặc

biệt, khác với hầu hết phytase từ nấm, phytase từ A fumigatus có dải pH tối thích từ

4.0 – 7.3 (còn giữ được ít nhất 80% hoạt tính) Một vài phytase từ vi khuẩn, đặc biệt

từ các loài Bacillus có pH tối ưu từ 6.5 – 7.5 pH tối thích của enzyme tách ra từ hạt

thực vật dao động từ 4.0 – 7.0, còn hầu hết có pH tối thích ở 4.0 – 5.6 Hai phytase

Trang 19

kiềm từ thực vật có pH tối ưu vào khoảng 8.0 đã được nghiên cứu từ hạt ngũ cốc và

ở hạt phấn hoa huệ tây [15]

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của các phytase dao động từ 45 đến 75°C Nghiên cứu sự ổn định nhiệt độ của ba phosphatase có nguồn gốc từ nấm và đã kết

luận rằng phytase từ A niger không bền với nhiệt độ hoặc không có khả năng hồi

lại hoạt tính sau khi đun nóng gây biến tính Tại nhiệt độ 50 và 55 °C nó mất

khoảng 70-80% hoạt tính Phytase từ A fumigatus cũng không bền với nhiệt độ

nhưng có một đặc tính đáng quý là có khả năng hồi lại hoạt tính ban đầu sau 20 phút

làm biến tính ở 90°C So với hai phytase trên thì axit phosphatase từ A niger pH 2.5

có khả năng ổn định với nhiệt độ rất cao; ở nhiệt độ tới 80°C enzyme chưa bị biến

tính Tuy nhiên khi ở 90°C, nó mất hoàn toàn hoạt tính Phytase từ chủng Bacillus

sp DS11 có nhiệt độ tối ưu ở 70°C, cao hơn nhiệt độ tối ưu của những phytase

thông thường Phytase này cũng rất bền với nhiệt: 100% hoạt tính còn lại sau 10 phút ủ tại 70°C (với sự có mặt của CaCl2) Khi không có CaCl2 khả năng bền với

nhiệt của phytase từ Bacillus sp DS11 giảm mạnh, hoạt tính bị mất khi nhiệt độ

trên 60°C Ngược lại khi có mặt của CaCl2 nó có thể bền với nhiệt độ lên tới 90°C, sau 10 phút lượng enzyme mất đi khoảng 50% hoạt tính Nghiên cứu này chỉ ra rằng ion Ca2+ có khả năng giúp phytase ổn định chống chịu với nhiệt độ cao [15]

1.2.3 Ứng dụng của enzyme phytase

a Ứng dụng trong chăn nuôi

Động vật nhai lại tiêu hóa được muối phytate là nhờ phytase do hệ vi sinh vật sống trong dạ cỏ tiết ra Phốt phát vô cơ giải phóng trong dạ cỏ sẽ được khu hệ vi sinh vật ở đó và bản thân động vật chủ sử dụng Tuy nhiên, động vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không có khả năng tiêu hóa axit phytic vì chúng không có hoặc có rất ít phytase trong đường tiêu hóa Do đó, để đáp ứng nhu cầu phốt pho cho cơ thể vật nuôi, người ta đã bổ sung phốt pho vô cơ vào thức ăn Điều này sẽ làm tăng chi phí thức ăn và gây ra môi trường bị ô nhiễm phốt phát, đặc biệt đối với ngành nuôi trồng thủy sản Phospho dư thừa trong thức ăn dành cho tôm cá sẽ nhanh chóng hòa tan vào môi trường nước, cộng với muối phytate không được tiêu

Trang 20

hoá thải qua phân động vật sẽ bị vi sinh vật sống trong đất phân giải thành phốt phát

vô cơ Đây là điều kiện hết sức thuận lợi cho các loài tảo vì phốt pho là nhân tố rất phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật này Tảo phát triển quá mức

sẽ gây hiện tượng "nước nở hoa", khi đó tảo sử dụng hầu hết oxy hòa tan trong nước khiến các sinh vật thủy sinh (động vật và thực vật) chết hàng loạt [15] Khi bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, phytase làm tăng khả năng đồng hóa phốt phát ngay trong chính thành phần của thức ăn, đồng thời làm giảm lượng phốt phát thải qua phân từ

đó sẽ có những đóng góp tích cực cho môi trường sinh thái Đáng chú ý, ở Việt Nam đã bắt đầu có những công trình nghiên cứu ảnh hưởng của phytase đến sinh trưởng của vật nuôi Trần Quốc Việt và Ninh Thị Len (Viện Chăn nuôi) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm phytase thương mại (Natuphos, BASF) đến năng suất và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa và lợn nuôi thịt Theo các tác giả, sử dụng phytase giúp lợn tăng trọng 16.4% và giúp giảm chi phí thức ăn được 8% so với lô đối chứng Tương tự như vậy, năm 2002, Nguyễn Thị Hoài Trâm và CS (Viện Công nghiệp Thực phẩm) đã khảo sát khả năng ứng dụng enzyme phytase thương phẩm trong chăn nuôi gà và cho thấy việc sử dụng phytase làm tăng 2% tỷ

lệ đẻ trứng, làm giảm 8.4 -11.6% chi phí thức ăn cho gà con [17]

Người ta dự tính, nếu phytase được sử dụng cho chăn nuôi động vật dạ dày đơn ở Mỹ thì enzyme này sẽ giải phóng lượng phốt phát có trong thức ăn với giá trị tương đương 168 triệu USD và tránh được 8.23×104 tấn phốt phát dư thừa thải ra môi trường hàng năm Việc ứng dụng phytase trong chăn nuôi đã được 22 quốc gia thực hiện Tổ chức FDA (The Food and Drug Administration) đã coi phytase là enzyme an toàn GRAS (Generally Regarded As Safe) Enzyme Finase® phytase đã được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi lợn có thành phần là ngô và đậu tương đã giúp cải thiện 1/3 lượng phốt phát khó tiêu trong thức ăn thành lượng phốt phát dễ tiêu Thí nghiệm tương tự với Allzyme Phytase® và Natuphos® phytase bổ sung vào khẩu phẩn ăn cho lợn và gà, kết quả thu được cũng chỉ ra rằng phytase cải thiện được giá trị sinh học của muối phytate đối với lợn và gà thịt Một vài thí nghiệm

Trang 21

khác cũng khẳng định rằng có thể thay thế phốt phát vô cơ bằng cách bổ sung phytase từ vi sinh vật vào thành phần của thức ăn cho động vật dạ dày đơn Ở Hà

Lan, phytase từ A niger đã được thử nghiệm thành công vào thức ăn chăn nuôi và

làm giảm từ 30 - 40% lượng phốt phát thải qua phân ra môi trường Thị trường phytase vào những năm cuối thế kỷ 20 ước tính đạt 500 triệu USD [17]

b Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm

Khẩu phần ăn hàng ngày của người chứa nhiều thành phần có nguồn gốc từ các cây ngũ cốc và cây họ đậu Những người ăn chay thường gặp phải vấn đề mất cân bằng dinh dưỡng do ăn quá nhiều ngũ cốc Những cư dân ở các quốc gia kém phát triển thường ăn bánh mỳ chay (loại bánh mỳ không được bổ sung nấm men) và trẻ em thường hay sử dụng nhiều sản phẩm từ đậu nành Những thức phẩm này đều

có chứa một lượng lớn muối phytate Muối phytate không những không thể tiêu hóa được trong đường tiêu hoá của người mà còn gây cản trở sự hấp thụ các nguyên tố khoáng như: kẽm, caxi, magiê và sắt Nó cũng làm giảm khả năng tiêu hóa protein trong khẩu phần cũng như ức chế các enzyme tiêu hóa khác

Anno và CS (1985) đã loại bỏ muối phytate trong sữa đậu nành bằng cách sử

dụng phytase từ lúa mỳ Bổ sung phytase từ nấm mốc A niger vào bột mỳ có chứa

cám lúa mỳ đã làm tăng khả năng hấp thụ sắt ở người[15] Như vậy, vai trò quan trọng của phytase với thực phẩm dành cho con người đã khá rõ ràng Phytase không những làm tăng khả năng tiêu hóa protein mà còn tăng hấp thụ khoáng Có lẽ trong tương lai không xa enzyme này sẽ được dùng phổ biến như một chất phụ gia cho thực phẩm [15]

c Ứng dụng trong cải tạo đất

Ở một số vùng, axit phytic và dẫn xuất của nó chiếm tới 50% tổng lượng phốt pho hữu cơ trong đất Nghiên cứu của Findenegg và Nelemans (1993) cho thấy khả năng sinh trưởng của ngô tỷ lệ thuận với mức độ phân giải axit phytic khi bổ sung phytase vào đất trồng Nghiên cứu này cũng mở ra một hướng trong tương lai

Trang 22

có thể chuyển và biểu hiện gene phytase vào rễ cây thực vật nhằm làm tăng giá trị phốt pho dễ tan trong đất

1.3 LÊN MEN XỐP

1.3.1 Khái niệm lên men xốp

Lên men xốp (Solid-state fermentation) là quá trình lên men của vi sinh vật trên cơ chất không tan ở độ ẩm nhất định, cơ chất này vừa đóng vai trò là chất hỗ trợ cơ học (giá thể) và vừa là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật Với đặc điểm độ

ẩm thấp, lên men xốp chỉ thích hợp với một lượng giới hạn các loại vi sinh vật, chủ yếu là nấm, nấm men và một số vi khuẩn [1]

Lên men xốp có 2 lĩnh vực ứng dụng rất quan trọng, đầu tiên đó là ứng dụng trong quá trình xử lý sinh học môi trường như phân hủy sinh học các hợp chất nguy hại, các hợp chất độc từ chất thải của công nghiệp chế biến, sản xuất phân bón, thức

ăn động vật từ các chất thải rắn…Một ứng dụng khác của lên men xốp đó là sản xuất các hợp chất làm phụ gia rất có giá trị như enzyme, nấm, aminoaxit, thuốc trừ sâu sinh học, nhiên liệu sinh học, chất hoạt động bề mặt sinh học, hương liệu, chất tạo màu, tạo mùi, chất chuyển hóa thứ sinh có hoạt tính sinh học, và các loại cơ chất khác cần thiết cho công nghiệp thực phẩm

1.3.2 Ưu điểm và nhược điểm của kỹ thuật lên men xốp

Các ưu điểm chính của kỹ thuật lên men xốp:

- Môi trường nuôi cấy đơn giản Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp làm môi trường xốp hoặc được cho thêm một số dưỡng chất trước khi sử dụng

- Sản phẩm enzyme thu được ở dạng đậm đặc

- Độ ẩm tối ưu thấp và phần lớn giống cấy được sử dụng trong lên men xốp giảm được tối đa nguy cơ nhiễm độc vi sinh vật

- Lượng chất thải sinh ra trong lên men xốp ít hơn so với lên men dịch thể

- Enzyme tạo ra ít nhạy cảm với các chất kìm hãm hoặc ức chế trao đổi chất Mặc dù có nhiều ưu điểm vượt trội nhưng kỹ thuật lên men xốp cũng vẫn tồn tại một số nhược điểm như sau:

Trang 23

- Vi sinh vật được dùng trong nghiên cứu bị giới hạn khả năng sinh trưởng vì

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới, một số chủng nấm mốc sinh thuộc các chi Aspergillus,

Penicillium, Mucor và Rhizopus có khả năng sinh enzyme phytase mạnh đã được

nghiên cứu Đối với các chủng vi khuẩn như Bacillus sp, Escherichia coli,

Enterobacte, Lactobacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter đều có khả năng

tổng hợp enzyme phytase ngoại bào [26], [31], [43]

Trong những giai đoạn đầu nghiên cứu, hầu hết kết quả của các tác giả tập trung vào việc phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase

Vào năm 2000, J Kerovuo đã tiến hành nghiên cứu 21 chủng Bacillus về khả

năng sinh enzyme phytase trên môi trường LB và môi trường có bột bắp Kết quả cho thấy không có chủng nào tổng hợp phytase trên môi trường LB, tuy nhiên trong

môi trường bột bắp thì có 2 chủng B.amyloliquefaciens và B subtilis VTT E68013

sự thay đổi đáng kể sau khi bổ sung chế phẩm [22]

Trang 24

Các nghiên cứu những năm tiếp theo bổ sung cho việc tìm ra thành phần dinh dưỡng phù hợp nhằm tăng hiệu quả tổng hợp enzyme phytase [27]

Năm 2007, nghiên cứu của Baharak đã chỉ ra hàm lượng cacbon và nitơ tốt nhất để sản xuất phytase tối đa là 1,5% glucose và 0,5% dịch chiết malt, pH ổn định của các enzyme từ 4-10 nhưng pH tối ưu được tìm thấy là 6 [21]

Cùng với các nghiên cứu về thành phần dinh dưỡng, nuôi cấy thích hợp thì việc đánh giá các yếu tố ảnh hưởng từ môi trường bên ngoài đến hoạt động của enzyme cũng dần được quan tâm

Năm 2012, nghiên cứu của B Sasirekha đã bổ sung khoảng nhiệt độ hoạt động từ 30ºC đến 50ºC, trong đó 37ºC là nhiệt độ enzyme hoạt động mạnh nhất [24]

Năm 2013, Nabil et al đã tiến hành thu enzyme phytase sau 4 ngày nuôi cấy

từ 3 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase cao, lượng phytase

tổng hợp thu được đánh giá cao với 720 U/ml tại pH = 7 [27]

Vào những năm gần đây, các nghiên cứu enzyme phytase có xu hướng tinh sạch, nâng cao phẩm chất enzyme tái tổ hợp và mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng

Năm 2014, Moushree Pal Roy đã tinh sạch và đánh giá khả năng hoạt động của phytase từ 2 loài vi khuẩn được phân lập từ phân bò, kết quả đã chỉ ra enzyme thu được có thể giữ được 80% hoạt tính tại nhiệt độ lên đến 75ºC [41]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam

Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu bước đầu về nghiên cứu tổng hợp

enzyme phytase từ các chủng nấm mốc Aspergillus và vi khuẩn thuộc chi Bacillus

Các nghiên cứu đầu tiên thường tập trung vào việc tuyển chọn những chủng nấm mốc và vi khuẩn có khả năng sinh enzyme phytase cao

Năm 2013, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Giang đã phân lập 6 chủng

vi khuẩn thuộc chi Bacillus subtilis có khả năng sinh phytase ngoại bào với hoạt độ

phytase mạnh nhất là 19U/ml [6]

Trang 25

Vào năm 2014, nghiên cứu của Mạch Trần Phương Thảo đã tiến hành khảo sát các yếu tố về nhiệt độ, độ ẩm, tỉ lệ nước và tỉ lệ bổ sung đậu nành để tăng hiệu suất quá trình thủy phân phytate [16]

Đến năm 2015, nghiên cứu của Võ Đức Tuấn đã bổ sung thêm các dữ liệu khoa học về ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại đến hoạt tính phytase [19]

Năm 2015, chủng nấm mốc Aspergillus fumigatus có khả năng tổng hợp

phytase cao đã được Nguyễn Thị Hà phân lập và tiến hành nghiên cứu khảo sát môi trường thích hợp để đạt hiệu suất cao nhất [7]

Các kĩ thuật sinh học hiện đại đã được áp dụng trong các nghiên cứu ở những năm gần đây

Năm 2015, nghiên cứu của Đỗ Thị Ngọc Huyền về việc tinh sạch và xác định tính chất của phytase tái tổ hợp đã cho thấy gen mã hóa cho phytase từ vi khuẩn

Bacillus subtilis đã được biểu hiện thành công trong E.coli BL21[17]

Hiện nay việc khai thác tiềm năng của enzyme phytase trong lĩnh vực nông nghiệp và nuôi trồng thủy hải sản là một trong những hướng mở rộng nghiên cứu enzyme phytase

1.5 ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI SINH VẬT BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ

Mã vạch ADN là công cụ đánh giá sự đa dạng di truyền, lập cây chủng loại phát sinh dựa trên việc phân tích và so sánh các một số trình tự gen bảo thủ nên có thể cho phép nhận diện, phân loại các mẫu vi sinh vật, dưới loài địa lý và loài dễ gây nhầm lẫn ở cấp độ gen với mức độ chính xác rất cao Gần đây, việc áp dụng kỹ thuật này đã đạt được nhiều tiến bộ, được sử dụng phổ biến ở nhiều nước trên thế giới trong đó có Việt Nam

Nhóm các gen bảo thủ thường được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở vi nấm bao gồm trình tự 18S, 28S rADN, gen mã hóa calmodulin (CaM)

và các gen phiên mã nội (Internal transcribed spacer, ITS) [46] Ví dụ, nhóm nghiên

Trang 26

cứu của Vũ Duy Thanh và cs (2015) đã định danh được chủng Aspergillus niger

HN18 dựa trên so sánh trình tự của gen 28S Radn [18] Tác giả Liễu Như Ý và cs (2012) đã sử dụng trình tự gen ITS1 + 5,8S+ ITS2 trong việc đánh giá 16 dòng nấm

1.6.2 Đặc điểm khí hậu và thổ nhưỡng

Hoà Vang nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa điển hình, nhiệt độ cao

và ít biến động Mỗi năm có hai mùa rõ rệt: mùa mưa kéo dài từ tháng 8 đến tháng

12 và mùa khô từ tháng 01 đến tháng 07, thỉnh thoảng có những đợt rét mùa đông nhưng không đậm và không kéo dài Nhiệt độ trung bình hàng năm là 25,8ºC cao nhất vào các tháng 6, 7, 8 với nhiệt độ trung bình 28-30°C; thấp nhất vào các tháng

12, 1, 2 trung bình 18-23°C Riêng vùng rừng núi Bà Nà ở độ cao gần 1.500m, nhiệt

độ trung bình khoảng 20°C

Độ ẩm không khí trung bình hàng năm là 82%, cao nhất vào các tháng 10,

11, trung bình khoảng 85-87%; thấp nhất vào các tháng 6, 7, trung bình khoảng 77%

76-Nhìn chung, các điều kiện khí hậu và thuỷ văn của huyện Hoà Vang có nhiều thuận lợi, song cũng có nhiều khó khăn như hạn hán, lũ lụt gây ảnh hưởng không nhỏ đối với sản xuất, đời sống của nhân dân; gây hư hại các công trình kết cấu hạ tầng kinh tế – xã hội

Trang 27

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phytase được phân lập ở các địa điểm trồng nông nghiệp và chăn nuôi tại địa bàn thành phố Đà Nẵng

2.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase ngoại bào mạnh từ đất tại một số xã thuộc huyện Hòa Vang – TP

2.2 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2.2.1 Địa điểm thu mẫu ngoài thực địa

Lấy mẫu đất trồng đậu, trồng lúa và chăn nuôi gia súc gia,cầm tại các địa điểm: xã Hòa Châu, xã Hòa Tiến, xã Hòa Phước, xã Hòa Phong và xã Hòa Khương thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

2.2.2 Địa điểm và phạm vi nghiên cứu thí nghiệm

* Địa điểm nghiên cứu thí nghiệm

- Phòng thí nghiệm Vi sinh - sinh lý - hóa sinh, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng

- Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, khoa Sinh - Môi trường, trường Đại

Trang 28

+ Lấy mẫu đất trồng đậu, trồng lúa, chuồng trại, chăn nuôi tại các địa điểm:

xã Hòa Châu, xã Hòa Tiến, xã Hòa Phước, xã Hòa Phong và xã Hòa Khương thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

+ Nghiên cứu phân lập, đánh giá hoạt độ enzyme và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt độ enzyme mạnh

+ Định danh một số chủng vi sinh vật sinh phytase mạnh bằng kỹ thuật sinh học phân tử

+ Nghiên cứu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme phytase trong quá trình lên men xốp

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

Thời gian thực hiện : Từ tháng 7/2017 đến tháng 4/2018

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lí mẫu đất

Mẫu đất được lấy ở độ sâu 0-20 cm xung quanh các khu chuồng trại chăn nuôi, đất trồng đậu, trồng lúa

Dùng dao, kéo vô trùng lấy khoảng 20g mẫu cho vào túi nilon tiệt trùng, buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng lạnh 4oC nếu thời gian vận chuyển lâu [2]

Mẫu đất được làm khô tự nhiên trong không khí, tránh ánh nắng trực tiếp Đất sau khi phơi khô được nghiền nhỏ, rây qua sàng 2 mm [2]

Trang 29

Các mẫu đất tại các vị trí được thu mẫu lặp lại 3 lần

2.3.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật có khả năng sinh phytase ngoại bào

Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorow [15]

- Chọn khuẩn lạc riêng lẽ và cấy chuyền vào các ống nghiệm thạch nghiêng

để bảo quản giống

* Cách tiến hành:

+ Cân 1 gam mẫu đem nghiền, cho vào bình tam giác 250ml có chứa 99ml nước cất vô trùng, lắc mẫu trên máy lắc ngang với tốc độ 100 vòng/phút trong thời gian 15 phút Dịch mẫu thu được có độ pha loãng 10-2

+ Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch trên cho sang ống nghiệm chứa sẵn 9ml nước vô trùng, lắc đều ta được độ pha loãng 10-3 Tiếp tục pha loãng như vậy đến độ pha loãng 10-4, 10-5 Dùng pipet vô trùng hút ở mỗi độ pha loãng 0,1ml dịch mẫu và nhỏ hộp petri có chứa môi trường PSM vô trùng Sau đó dùng que trang đều giọt dịch trên mặt thạch Mỗi độ pha loãng cấy trên 3 đĩa petri, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 28-30℃ trong 3-5 ngày để tạo thành các khuẩn lạc riêng lẽ Chọn những khuẩn lạc riêng lẽ, mọc tốt, cấy chuyền sang ống thạch nghiêng chứa cùng môi trường phân lập cho đến khi thuần chủng Bảo quản giống ở nhiệt độ 4-6℃

+ Môi trường sàng lọc chủng phytase (PSM – phytase screening media) (g/l): PSM [23]

Trang 30

Tuyển chọn các chủng có khả năng sinh tổng hợp mạnh

2.3.3 Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật (theo phương pháp Koch)

Mật độ vi sinh vật được xác định dựa trên phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, tính số lượng vi sinh vật trên ml hoặc trên gam mẫu thông qua số khuẩn lạc phát triển trong các đĩa môi trường Công thức xác định mật độ tế bào vi sinh vật:

N =

Trong đó:

N: là số vi sinh vật trong một đơn vị kiểm tra (CFU/g /ml);

: là tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa Petri được giữ lại; n: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất;

n’: là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d : là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất

Trang 31

2.3.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme phytase

Xác định hoạt tính phân giải phytate của enzyme phytase từ những chủng tuyển chọn bằng dung dịch màu amonium molypdate

- Cân 1 g trichloroaxetic acid (TCA) đưa vào 10 ml nước cất (d = 10%)

- Cân 0.2472 g amonium molypdate cho vào 20 ml nước cất (CM = 10 mM)

- Cân 0.384 g tinh thể acid citric đưa vào 10 ml nước cất (CM = 0.2 M)

- Lấy 1 ít dung dịch acid sunfuric (98%) từ lọ ra dùng dần

- Cân 0.54 g FeSO4 cho vào 20 ml nước cất (2.7%)

- Lấy 100 µl dịch nổi để im 5 phút ở nhiệt độ phòng

- Lấy 200 µl dd natri axetate 0.1 M + 200 µl natri phytate 3.6 mM, trộn đều

- Ủ hỗn hợp ở 370C trong 15 phút để phản ứng thủy phân xảy ra

- Sau 15 phút, dừng phản ứng bằng 500 µl trichloroaxetic acid (TCA) 10% hoặc 42 µl TCA 200% để tránh làm loãng dịch, để im trong 5 phút

- Sau 5 phút, đem dịch đi ly tâm lạnh 5000 v/p, thu dịch nổi chuyển sang ống mới, giữ im trong 10 phút

Đối với dịch đối chứng:

- Hút 1000 µl nước cất đưa vào ống effendorf

Trang 32

- Dựa vào đường chuẩn photphate tự do xác định hoạt tính phytase

- Cứ 1 U ứng với 1 µmol photphate tự do sản sinh ra trong 1ml dịch trong thời gian 1 phút

Xây dựng đường chuẩn

Sử dụng 5 nồng độ 0µM, 100µM, 200µM, 300µM, 500µM chất chuẩn

K2HPO4 lần lượt đem phản ứng với các dung dịch đã chuẩn bị ở bước trên

Đo độ hấp thụ của các dung dịch bằng phản ứng màu ở bước sóng 700 nm trên máy so màu Ema Kết quả được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Mối tương quan giữa nồng độ K2HPO4 với OD

Trang 33

Hình 2.1 Đồ thị đường chuẩn K2HPO4

Từ kết quả trên ta xác định được phương trình đường chuẩn :

- Nuôi cấy ở nhiệt độ 400C, thời gian nuôi cấy đối với nấm mốc là 3-5 ngày,

vi khuẩn từ 2-3 ngày Sau đó đem ra quan sát:

- Đối với nấm mốc quan sát khả năng sinh trưởng, màu sắc khuẩn lạc, hệ sợi khí sinh, hệ sợi cơ chất, sắc tố tan, hình dạng bào tử

- Đối với vi khuẩn quan sát khả năng sinh trưởng, màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, hình dạng tế bào, nhuộm Gram tế bào

Trang 34

- Sử dụng khóa phân loại của Bùi Xuân Đồng (1978), Nguyễn Đức Lượng, Bergey (1989), Gause và cộng sự (1983), Katshuiko Ando (2002), Robert A.Samson (1984),

2.3.6 Giữ giống VSV

Để bảo quản chủng giống cho những nghiên cứu tiếp theo, cấy truyền định

kỳ trên môi trường thạch nghiêng LB đối với vi khuẩn; Môi trường czapek đối với nấm mốc để tủ ấm 28-30ºC Thời gian nuôi cấy đối với vi khuẩn 2 - 3 ngày, nấm mốc là 3 - 5 ngày Sau đó để vào tủ lạnh mỗi tháng cấy truyền một lần

2.3.7 Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử

a Tách chiết ADN tổng số

ADN tổng số của mẫu nấm được tách theo phương pháp hóa học sử dụng Cetyl trimethylammonium bromide (CTAB) và kết hợp với ly tâm tốc độ cao [49] Đệm CTAB được chuẩn bị bao gồm:

- 0.1M Tris-HCl (pH 8)

- 10mM EDTA (pH 8)

- 200mM NaCl

- 3.5% CTAB

- Bổ sung 10 μl protein K tương đương với 1ml hỗn hợp trên

b Thực hiện phản ứng PCR nhân gen mã hóa cho 18S rARN và điện di kiểm tra kết quả

- Water none ARN

Trang 35

- Cặp mồi tương ứng bao gồm mồi xuôi: 5' GTA GTC ATA TGC TTG TCT C 3' và mồi ngược: 5' CTT CCG TCA ATT CCT TTA AC 3'

Tiến hành: ADN tổng số được tách chiết sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng khuếch đại đoạn gene 18S rARN

Taq polymerase ( 1 UI/µl) 0,1

C / 10 phút

Hình 2.2 Chu trình gia nhiệt chương trình chạy PCR

Trang 36

+ Sau đó đem mẫu đi điện di để kiểm tra, chụp lại kết quả theo quy trình sau đây:

* Chuẩn bị dung dịch đệm chạy:

- Dung dịch TBE 1X Buffer làm đệm chạy bao gồm: 89 mM Tris (pH 7.6), 89

mM boric acid, 2 mM EDTA

- Pha Agarose M 0.6% trong dung môi TBE 1X + Cân 0.6 g Agarose M pha trong 100ml dung dịch TBE 1X + Hòa tan và đun nóng trong lò vi sóng cho đến khi tan hoàn toàn, dung dịch trở nên trong suốt

* Các bước tiến hành điện di và kiểm tra kết quả:

- Đun Agarose M 0.6% trong lò vi sóng từ 1-2 phút cho tan chảy

- Để nguội đến khoảng 50-60ºC sau đó hút 18-20 ml cho vào ống falcol 50 ml

- Bổ sung thêm 2ml thuốc nhuộm ADN và mix đều

- Sau đó đổ vào khuôn đã cắm lược sẵn để tạo giếng

- Chờ khoảng 15 phút cho đến khi agarose đông lại

- Sau đó rút lược ra khỏi khuôn và cho khuôn vào máy chạy điện di đã được

bổ sung dung dịch đệm chạy TBE 1X

- Dùng pipet hút 3μl mẫu ADN đã tách trộn đều với 3μl Loading dye 10X

- Sau đó cho hỗn hợp này vào các giếng đã được tạo sẵn

- Đặt điện thế 120 V, thời gian chạy khoảng 20-30 phút (khoảng 2/3 bản gel)

- Đem soi kết quả dưới đèn UV

- Chụp ảnh và lưu kết quả

c Đọc trình tự và lập cây phân loại

Giải trình tự là phương pháp để xác định thứ tự sắp xếp của 4 nucleotide (adenine, guanine, cytosine và thymine) trên một phân tử ADN Với sự phát triển của phương pháp giải trình tự và phân tích tự động việc xác định trình tự ADN đã trở nên dễ dàng hơn Các thông tin về trình tự ADN hệ gene của sinh vật đã trở nên

Trang 37

không thể thiếu cho các quá trình nghiên cứu sinh học cơ bản, cũng như trong các lĩnh vực chẩn đoán hoặc pháp y Mẫu được gửi đi phân tích trình tự tại công ty Integrated ADN Technologies (IDT, Iowa, Mỹ)

Cây phân loại được lập dựa trên so sánh trình tự nucleotide của 18S rARN từ hai mẫu nấm NM1, NM4 với dữ liệu các loài tương tự có trong ngân hàng gen (GeneBank) thuộc Viện Nghiên cứu Y học quốc gia Mỹ (National Health Institute,

NHI) Phần mềm được sử dụng để lập cây phân loại là MEGA7 [29], [36]

Bảng 2.3 Mã số trình tự 18S rARN của một số loài nấm mốc

STT Mã số trình tự

1 AF272574.1 Aspergillus pseudotamarii NRRL 25517

2 KX664376.1 Aspergillus fumigatus

3 KP686456.1 Aspergillus sp BAB-4649

4 EF652478.1 Aspergillus tabacinus

5 KF830076.1 Deconica sp PBM3781

6 KU058587.1 Tricholoma flavovirens

7 AY771609.1 Clitocybe candicans isolate AFTOL-ID

541

8 AY771607.1 Clitopilus prunulus isolate AFTOL-ID

522

2.3.8 Phương pháp tạo chế phẩm enzyme phytase

Các chủng vi sinh vật tuyển chọn được nuôi cấy lắc 200 vòng/ phút ở nhiệt

độ 30ºC ở môi trường dịch thể, sau 2 ngày thu được giống cấp 1 Nhân tiếp trên môi trường dịch thể với 1% giống cấp 1, sau 2 ngày được giống cấp 2 Tiếp tục, tiến hành lên men rắn xốp trên môi trường giàu phytate là: ngô vỡ và cám gạo với tỷ lệ cấp giống 10-20% giống cấp 2 Sau 3-5 ngày, đem sấy khô và nghiền bột, tạo thành chế phẩm enzyme phytase thô

Trang 38

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình lên men xốp tạo chế phẩm enzyme phytase

a Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất phytate đến khả năng sinh enzyme phytase của các chủng VSV tuyển chọn

*Cách tiến hành:

Tiến hành lên men xốp các chủng VSV tuyển chọn trên 3 công thức môi trường bán rắn cơ bản, giàu phytate nhằm kích thích khả năng sinh enzyme phytase của các chủng VSV tuyển chọn :

CT1: 100% ngô vỡ CT2: 50% ngô vỡ: 50% bột cám gạo

CT3: 100%bột cám gạo

Cân thành phần cơ chất theo đúng tỷ lệ Tiếp tục, làm ẩm cơ chất bằng dịch thể Jorquera (không bổ sung cơ chất Na-phytate), đến khi đạt độ ẩm 50-60% Hấp khử trùng các công thức cơ chất ở nhiệt độ 120ºC, áp suất 1 atm, trong thời gian 30 phút Sử dụng bình tam giác 250ml để chứa sản phẩm lên men

Sau đó, tiến hành tiếp giống cấp 2 với tỷ lệ 15% vào cơ chất Thực hiện quá trình lên men xốp ở nhiệt độ 35ºC, trong 3 ngày Thu sinh khối và đo hoạt độ enzyme phytase của các chủng vi sinh vật tuyển trên các công thức môi trường khác nhau, từ đó chọn ra cơ chất tốt nhất Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất lên men đến hoạt tính enzyme của chủng vi sinh vật tuyển chọn được bố trí thí nghiệm theo bảng 2.4:

Trang 39

Bảng 2.4 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất lên men đến hoạt tính enzyme

của chủng VSV tuyển chọn

Cơ chất Ngô vỡ Ngô vỡ + cám gạo Bột cám gạo

Hoạt tính enzyme (U/g)

b Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ quá trình lên men xốp đến khả năng sinh enzyme phytase của các chủng VSV tuyển chọn

Cân thành phần cơ chất được chọn ở thí nghiệm 1 theo đúng tỷ lệ Làm ẩm

cơ chất bằng môi trường dịch thể Jorquera (không bổ sung cơ chất Na-phytate) với

độ ẩm 50-60% Khử trùng cơ chất ở nhiệt độ 120ºC, áp suất 1 atm, trong thời gian

30 phút Sử dụng bình tam giác 250ml để chứa sản phẩm lên men

Sau đó, cho lên men với tỷ lệ cấp giống 15% và ủ ở nhiệt độ 5 bình cơ chất ở

5 mốc nhiệt độ khác nhau: 30℃; 35ºC; 40℃; 45℃; 50℃ Sau 3 ngày, tiến hành đánh giá hoạt độ enzyme lên men của chủng VSV tuyển chọn ở các mốc nhiệt độ Khảo sát bố trí thí nghiệm theo bảng 2.5:

Bảng 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh

enzyme phytase của chủng VSV tuyển chọn

Nhiệt độ 30 o C 35 o C 40 o C 45 o C 50 ℃

Hoạt tính enzyme (U/g)

c Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme phytase trên môi trường xốp của chủng VSV tuyển chọn

Trang 40

Tiến hành lên men xốp chủng VSV tuyển chọn trên cơ chất tốt nhất được chọn ở thí nghiệm 1, làm ẩm bằng môi trường trường dịch thể Jorquera (không bổ sung cơ chất Na-phytate) cho đạt độ ẩm 50- 60% Cơ chất được đem hấp khử trùng

ở nhiệt độ 120ºC, áp suất 1 atm, trong thời gian 30 phút Sau đó, tiến hành lên men với tỷ lệ cấp giống 15%, ở nhiệt độ tôi ưu cho VSV tuyển chọn sinh hoạt tính cao nhất, được chọn ở thí nghiệm 2 Khảo sát đồng thời hoạt tính enzyme phytase và mật độ tế bào của các chủng VSV tuyển chọn tại các mốc thời gian: 24giờ; 48giờ;

72 giờ; 96 giờ; 120 giờ Khảo sát được bố trí thí nghiệm theo bảng 2.6:

Bảng 2.6 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình sinh enzyme phytase

của VSV trên môi trường bán rắn

Cân thành phần cơ chất được chọn ở thí nghiệm 1 theo đúng tỷ lệ Làm ẩm

cơ chất bằng môi trường dịch thể Jorquera (không bổ sung cơ chất Na-phytate) với nồng độ pH lần lượt là 4;5;6;7 với độ ẩm 50-60% Hấp khử trùng cơ chất ở nhiệt độ 120ºC, áp suất 1 atm, trong thời gian 30 phút Sử dụng bình tam giác 250ml để chứa sản phẩm lên men

Sau đó, cho lên men với tỷ lệ cấp giống 15% và ủ ở nhiệt độ và khoảng thời gian sinh enzyme phytase với hoạt độ cao nhất, được lựa chọn từ các thí nghiệm trên Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường được bố trí thí nghiệm theo bảng 2.6:

Tiêu đề	Nghiên cứu phân lập, tuyển chọn và tạo chế phẩm thô của vi sinh vật sinh enzyme phytase từ đất thuộc địa bàn huyện Hòa Vang – Thành phố Đà Nẵng
Tác giả	Lê Trần Diệu Linh
Người hướng dẫn	PGS.TS Đỗ Thu Hà
Trường học	Trường Đại Học Sư Phạm - Đại Học Đà Nẵng
Chuyên ngành	Khoa sinh – Môi trường
Thể loại	Luận văn
Năm xuất bản	2018
Thành phố	Đà Nẵng

Định dạng
Số trang	85
Dung lượng	2,73 MB