Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Trung tâm nghiên cứu ong và nuôi ong nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Gia Lâm – Hà Nội.
Thời gian nghiên cứu
Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Ong ký sinh kén trắng Apanteles sp (Hymenoptera: Braconidae)
+ Đàn ong nội Apis cerana và ong ngoại Apis mellifera + Bánh tổ cũ của ong Apis cerana và ong Apis mellifera
+ Sâu sáp nhỏ Achroia grisella F
+ Thùng ong + Ống nghiệm (17cm x ỉ 1,5cm) + Hộp nhựa lớn (24cm x ỉ14cm), hộp nhựa nhỏ (11 x 8 cm) + Đĩa petri ỉ= 10cm, ỉ= 5cm
+ Cồn 90 0 C + Giá để ống nghiệm, giá để hộp nuôi sâu
+ Kính lúp cầm tay, kính hiển vi soi nổi
+ Sổ theo dõi thực tập và nhiều dụng cụ khác như: panh, dao, kéo, bút lông, kim mổ ong, mật ong nguyên chất, nước cất…
Hình 3.1 Hộp nhân nuôi sâu sáp nhỏ Hình 3.2 Các ống nghiệm nuôi ong ký sinh
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và sinh vật học của loài ong kí sinh kén trắng Apanteles sp trên sâu sáp nhỏ ngoài tự nhiên
- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái và sinh vật học của loài ong kí sinh kén trắng Apanteles sp trên sâu sáp nhỏ trong phòng thí nghiệm
Phương pháp nghiên cứu
Tiến hành điều tra mật độ sâu sáp nhỏ trên các đàn ong tại Trung tâm nghiên cứu và nuôi ong nhiệt đới - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, chọn 10 đàn ong ngoại (5 đàn yếu và 5 đàn khỏe) và 10 đàn ong nội (5 đàn yếu và 5 đàn khỏe) Đàn ong khỏe có trên 5 cầu ong, số lượng quân lớn, khả năng kiếm và dự trữ thức ăn cao, trong khi đàn ong yếu có dưới 3 cầu ong, số lượng quân ít và khả năng kiếm thức ăn kém Điều tra được thực hiện 7 ngày một lần theo quy chuẩn QCVN 01-38:2010/BNNPTNT Sâu sáp nhỏ và kén ong ký sinh Apanteles sp được thu bắt ngẫu nhiên, sau đó đưa về phòng thí nghiệm và nuôi theo dõi trong các hộp riêng biệt, ghi rõ ngày tháng và số hiệu của từng đàn ong Sâu sáp nhỏ bị ký sinh ngoài tự nhiên cũng được thu thập và theo dõi cho đến khi ong vũ hóa trưởng thành.
Tỷ lệ sâu non sâu sáp nhỏ bị ký sinh
Tiến hành thu thập sâu non ở các tuổi khác nhau của sâu sáp nhỏ và kén ong trong các thùng ong trong suốt các tháng điều tra, sau đó mang về phòng thí nghiệm để theo dõi tỷ lệ ký sinh.
Tỷ lệ giới tính của ong
Thu thập sâu non từ tự nhiên và đưa về phòng thí nghiệm để theo dõi Sau khi ong hóa nhộng và vũ hóa, tiến hành đếm số lượng ong đực và ong cái trong suốt các tháng điều tra.
Tính thích hợp tuổi của sâu sáp nhỏ
Tiến hành thu thập các tuổi của sâu sáp nhỏ từ tự nhiên và mang về phòng thí nghiệm Mỗi đàn ong sẽ được chọn ngẫu nhiên các tuổi để tiếp xúc với một cặp ong trong ống nghiệm Theo dõi tỷ lệ ký sinh ở các tuổi của sâu sáp nhỏ để đánh giá sự ảnh hưởng của tuổi đến tỷ lệ ký sinh.
3.5.2 Phương pháp nhân nuôi ong ký sinh
*Nhân nuôi nguồn ký chủ
Tiến hành nhân nuôi sâu sáp nhỏ ngoài thùng tự nhiên bằng cách sử dụng bánh tổ cũ của ong Apis cerana và ong Apis mellifera Những bánh tổ này được đưa vào các thùng ong bỏ trống để làm thức ăn cho sâu sáp nhỏ Để hạn chế sự xâm nhập của kiến và thạch sùng, cần sử dụng lớp bóng kính hoặc tấm lưới có đường kính nhỏ cố định dưới nắp thùng.
+ Sau đó chuẩn bị các hộp nhựa phù hợp để nhân nuôi sâu sáp nhỏ và ong ký sinh
Thu bắt sâu non và nhộng sâu sáp nhỏ từ các cầu ong và thùng ong cũ Sâu non được cho vào hộp nhựa lớn, trong khi nhộng được để riêng cho đến khi vũ hóa Sau khi trưởng thành, tiến hành ghép đôi để giao phối và đẻ trứng, với thức ăn bổ sung là dung dịch mật ong 10% Khi trưởng thành cái đẻ trứng, tách ra và thu trứng vào hộp nhựa nhỏ để nuôi sâu sáp nhỏ trong điều kiện nhiệt độ phòng, đảm bảo có đủ các tuổi sâu non để đáp ứng nhu cầu trong quá trình thí nghiệm.
*Nhân nuôi nguồn ký sinh
Để nuôi ong ký sinh, thu thập sâu sáp và nhộng ong ký sinh trong các cầu ong, sau đó cho vào hộp nhựa lớn và cho ăn sáp thường xuyên cho đến khi có kén ong Phân biệt và phân loại ong ký sinh kén trắng Khi ong vũ hóa, cho các cặp ong ký sinh (cả đực và cái) tiếp xúc với sâu sáp trong hộp nhựa tròn, đồng thời chấm thêm ít mật ong 10% làm thức ăn cho ong ký sinh và sáp để nuôi sâu sáp Sâu non sau khi bị ký sinh sẽ được nuôi cho đến khi ra kén, trong khi các sâu non chưa bị ký sinh sẽ tiếp tục tiếp xúc với ong ký sinh.
+ Bổ sung sâu non cho ong tới khi ong chết, nhân đủ vật chủ và ký chủ để bố trí thí nghiệm
3.5.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sinh học của ong ong ký sinh kén trắng Apanteles sp
3.5.3.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái ong ký sinh kén trắng Apanteles sp
Sau khi vũ hóa, ong được phân biệt đực cái và tiến hành ghép đôi trong ống nghiệm (17cm x 1,5cm) với 10-15 sâu non ở ký chủ (tuổi 3) Thời gian tiếp xúc là 24 giờ, có bổ sung thức ăn là mật ong 10% Thí nghiệm được lặp lại nhiều lần trong ngày để thu thập đủ số lượng ký chủ bị ký sinh, từ đó lấy 5-10 ký chủ mỗi ngày để tiến hành mổ soi dưới kính hiển vi soi nổi Quan sát hình thái và mô tả màu sắc của các pha như trứng, sâu non, nhộng, trưởng thành, đồng thời đo đếm kích thước của ít nhất 30 cá thể bằng thước đo đơn vị mm Sử dụng công thức thống kê sinh học để tính kích thước trung bình.
3.5.3.2 Vòng đời của ong ký sinh kén trắng Apanteles sp
Cho 10- 15 cặp ong Apanteles sp tiếp xúc với sâu non ký chủ tuổi 2-3 trong
Sau 24 giờ, ký chủ bị ký sinh sẽ được tách ra để nuôi riêng Thí nghiệm này được lặp lại nhiều lần trong ngày cho đến khi thu thập đủ dữ liệu Sau khi ký chủ bị ký sinh, quá trình mổ liên tục và quan sát thời gian phát dục của các pha sẽ được thực hiện hàng ngày, cho đến khi chúng vũ hóa trưởng thành và bắt đầu đẻ quả trứng đầu tiên.
3.5.3.3 Nghiên cứu tập tính vũ hóa và xác định thời gian vũ hóa trong ngày của ong ký sinh Apanteles sp Để theo dõi thời gian vũ hóa trong ngày của ong ký sinh Apanteles sp.Tiến hành thí nghiệm ngay sau khi ấu trùng ong hóa nhộng và tạo kén ngày đầu tiên, tách riêng 30 kén ong cho vào ống nghiệm Theo dõi thường thường xuyên cho tới khi ong đục thủng kén chui ra ngoài Trong các khoảng thời gian cứ 2 tiếng thì kiểm tra 1 lần từ 6h sáng (6- 8h; 8-10h; 10- 12h; 12- 14h; 14- 16h; 16- 18 h và từ 18- 06 giờ sáng ngày hôm sau Theo dõi thường xuyên cho tới khi ong đục thủng kén chui ra ngoài Thí nghiệm theo dõi trong 3 ngày
3.5.3.4 Nghiên cứu tính thích hợp tuổi của sâu sáp đối với ong kén trắng Apanteles sp
+Thí nghiệm không có lựa chọn tuổi ký chủ
Thí nghiệm được thực hiện với 1 cặp ong trưởng thành (1 cái và 1 đực) tiếp xúc với 15 ký chủ ở từng tuổi riêng biệt trong 24 giờ trong ống nghiệm có kích thước 17cm x 1,5cm Sau đó, từng loại tuổi được tách riêng để mổ ngay và theo dõi số lượng ký sinh ở từng tuổi Thí nghiệm được lặp lại 10 lần.
+Thí nghiệm có lựa chọn tuổi ký chủ
Thí nghiệm được thực hiện với 1 cặp ong (1 cái và 1 đực) tiếp xúc với các ký chủ ở mỗi độ tuổi, mỗi độ tuổi gồm 3 cá thể, trong thời gian 24 giờ Sau khi bị ký sinh, các ký chủ được nuôi tiếp cho đến khi ong vũ hóa để xác định số lượng ong mới được tạo ra (hiệu quả ký sinh) cho từng độ tuổi ký chủ Các ký chủ chết sẽ được mổ ra để kiểm tra nguyên nhân tử vong có phải do ký sinh hay không.
3.5.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ ký chủ đến khả năng ký sinh của ong Apanteles sp
Bố trí thí nghiệm với 7 công thức tương ứng với 7 mức độ số lượng vật chủ khác nhau (Khuất Đăng Long, 1998)
Công thức I sử dụng 1 sâu non, trong khi Công thức II, III, IV, V, VI và VII lần lượt sử dụng 4, 7, 10, 13, 16 và 19 sâu non Mỗi công thức được thực hiện với 10 lần nhắc lại cho mỗi cặp ong (2 ngày tuổi) tiếp xúc với sâu non ở ký chủ (tuổi 3) trong ống nghiệm có kích thước 17cm x 1,5cm Thời gian tiếp xúc là 24 giờ và kéo dài trong 3 ngày Ghi chép số lượng vật chủ bị ký sinh bởi ong ký sinh theo từng công thức.
3.5.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc ký chủ đến tỷ lệ ký sinh và hiệu quả ký sinh ong Apanteles sp
Mỗi công thức bố trí một cặp ong tiếp xúc với 10 sâu non ký chủ ở tuổi 3 trong ống nghiệm có kích thước 17cm x 1,5cm, được bịt miệng bằng vải voan Sau thời gian tiếp xúc, ong sẽ được chuyển ra khỏi ống nghiệm, và sâu non ký chủ sau khi bị ký sinh sẽ được nuôi theo dõi cho đến khi vũ hóa trưởng thành Thí nghiệm này được lặp lại 10 lần.
Công thức I: Thời gian tiếp xúc là 6 giờ
Công thức II: Thời gian tiếp xúc là 12 giờ
Công thức III: Thời gian tiếp xúc là 24 giờ
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ ký sinh (%) ở các thời gian tiếp xúc, Hiệu quả ký sinh (%)
3.5.3.7 Nghiên cứu ảnh hưởng thức ăn đến thời gian sống của ong Apanteles sp + Ong không có hoạt động ký sinh
Cho một cặp ong vào ống nghiệm cho mỗi công thức cho ăn thêm và công thức đối chứng (ăn nước lã) Ong không tiếp xúc với ký chủ và thí nghiệm được lặp lại 10 lần cho mỗi công thức Theo dõi thời gian sống của ong trưởng thành cái và đực thông qua việc ghi nhận khi ong chết sinh lý.
Công thức đối chứng: Nước lã
Công thức I: Mật ong nguyên chất Công thức II: Mật ong 50%
Công thức IV: Mật ong 30%
+ Ong có hoạt động ký sinh
Công thức tính toán và xử lý thống kê
Tổng số cá thể bị ký sinh
- Tỷ lệ ký sinh(%) = x 100 Tổng số cá thể theo dõi
Số cá thể đực (cái)
- Tỷ lệ đực cái(%) = x 100 Tổng số cá thể theo dõi
Tổng số cá thể vũ hoá
Tổng số cá thể theo dõi
Tỷ lệ ký sinh ở mỗi độ tuổi được tính bằng công thức: Tỷ lệ bị ký sinh = (Số cá thể bị ký sinh / Tổng số cá thể mỗi tuổi thí nghiệm) x 100 (%) Thời gian phát triển của từng pha được ghi nhận theo đơn vị ngày và giờ.
X: Thời gian phát triển trung bình
Xi: Thời gian phát dục của n cá thể trong ngày thứ i ni: Số cá thể lột xác trong ngày thứ i N: Tổng số cá thể theo dõi
- Kích thước từng pha phát triển (mm) X N
Xi: Giá trị kích thước cá thể thứ i N: Tổng số cá thể thí nghiệm
Thời gian sống của ong trưởng thành được xác định qua số cá thể sống đến ngày thứ i (N ni) và thời gian sống của các cá thể đến ngày thứ i (a i) Tổng số cá thể trong thí nghiệm là N.
Trong đó: Ri: tỷ lệ ký sinh ở từng tuổi thứ i; ni: số tuổi kýchủ thí nghiệm
- Hiệu quả ký sinh của từng loài ong
HQ (%) Tổng số ký chủ có ký sinh vũ hoá ra ong x100 Tổng số ký chủ thí nghiệm
Tất cả dữ liệu sẽ được xử lý bằng phần mềm Excel để thực hiện thống kê sinh học Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn sẽ được tính toán thông qua phân tích phương sai Anova.
Các số liệu tỷ lệ % được chuyển dổi sang dạng Arcsin square.
