(Luận văn) phân lập và tuyển chọn chủng pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi

Mặt khác, vì các quan ngại và hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong nuôi thủy sản nên các nghiên cứu đang hướng sự quan tâm đến các chất thay thế có nguồn gốc thiên nhiên, do các chấ

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-NGUYỄN HUYỀN TRANG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG

PSEUDOMONAS SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG

VIBRIO SP GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2014 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG

PSEUDOMONAS SP SINH HOẠT CHẤT KHÁNG

VIBRIO SP GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN CHÍ THUẬN Học viên: NGUYỄN HUYỀN TRANG

Hà Nội – 2014 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nguyễn Chí Thuận - Trưởng phòng Công nghệ Phôi - Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn

và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoàng Uyên, người đã giúp đỡ và tận tình chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện luận án của mình

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới phòng Đào tạo - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2014

Học viên

Nguyễn Huyền Trang luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Bảng chữ viết tắt

PCR Polymerase Chain Reaction

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

TCA Trichloroacetic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β galactosidase luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

1

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 6

1.1.1 Phân loại 6

1.1.2 Đặc điểm 7

1.1.3 Cấu trúc gen 9

1.1.4 Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 10

1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống 10

1.1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn 10

1.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa 11

1.2 Hoạt chất pyocyanin 12

1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen 12

1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin 13

1.2.3 Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin 14

1.3.Tổng quan về Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi 15

1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tôm nuôi 15

1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm 15

1.3.2.1 Lịch sử phát triển bệnh: 15

1.1.2.2 Đặc điểm dịch tễ 17

1.3.3 Các phương pháp phòng ngừa và điều trị 18

1.3.2.1 Biện pháp phòng bệnh tổng hợp 18

1.3.2.2 Điều trị 19

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Vật liệu nghiên cứu 21 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

2

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Thiết bị 21

2.1.3 Hóa chất 22

2.1.3.1 Hóa chất sử dụng cho vi sinh: 22

2.1.3.2 Hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử: 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp vi sinh 25

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn trên môi trường King A 25

2.2.1.2 Phương pháp nhuộm tế bào quan sát hình thái của vi khuẩn 26

2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn 26

2.2.1.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ 27

2.2.1.5 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn: 27

2.2.1.6 Phương pháp tách chiết và xác định sắc tố pyocyanin - PCN [32] 28

2.2.1.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối và nồng độ hoạt chất của vi khuẩn 28

2.2.1.8 Phương pháp xác định khả năng kháng Vibrio sp: 28

2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 29

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 29

2.2.2.2 Phương pháp PRC khuếch đại gen 30

2.2.2.3 Phương pháp điện di 32

2.2.2.4 Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR 33

2.2.2.5 Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning) 34

2.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen 36

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Kết quả phân lập và xác định P aeruginosa bằng phương pháp vi sinh vật 38 3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P aeruginosa trên môi trường King A 38

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

3

3.1.2 Kết quả nhuộm Gram 39

3.1.3 Kết quả nghiên cứu hoạt tính enzyme 40

3.1.4 Kết quả thử hoạt tính kháng kháng sinh 41

3.2 Kết quả xác định P aeruginosa bằng phương pháp sinh học phân tử 42

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 42

3.2.2 Kết quả PCR gen đặc hiệu P aeruginosa (PA): 43

3.2.3 Kết quả PCR gen 16s rRNA 44

3.2.4 Kết quả tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA 45

3.2.5 Kết quả giải trình tự gen 16s rRNA và định tên vi khuẩn 47

3.3 Kết quả nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio sp của P.aeruginosa PS39 51

3.3.1 Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn và nồng độ hoạt chất 51

3.3.2 Kết quả xác định khả năng kháng Vibrio của dịch nuôi vi khuẩn và hoạt chất PCN 54

3.3.3.Xác định nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio sp 56

3.3.4 Kết quả xác định ảnh hưởng nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio in vitro 58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

Phụ lục 1 74

Phụ lục 2 75 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

4

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản nhằm phòng và hạn chế các bệnh do nhiễm khuẩn ngày càng trở nên phổ biến Vì vậy, đề kháng kháng sinh do vi sinh vật đã tăng lên rất nhiều, nhưng số kháng sinh mới được đưa vào sử dụng để khắc phục vấn đề lại rất giới hạn Hiện tượng đa kháng thuốc kháng sinh đang là mối lo không chỉ của người nuôi mà còn của cả các nhà quản lý sức khỏe cộng đồng bởi nó không chỉ làm giảm hiệu quả điều trị mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ đối với sức khỏe con người Mặt khác,

vì các quan ngại và hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong nuôi thủy sản nên các nghiên cứu đang hướng sự quan tâm đến các chất thay thế có nguồn gốc thiên nhiên, do các chất này không gây đề kháng khuẩn và tồn dư trong vật nuôi cũng như ảnh hưởng tới môi trường

Pseudomonas sp là vi khuẩn phổ biến được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi

sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới Chúng là một trong những vi sinh vật có giá trị thương mại và công nghệ sinh học Trong các chế

phẩm sinh học, Pseudomonas được sử dụng như probiotic kiểm soát sinh học đối

với nấm gây bệnh và vi khuẩn trong nông nghiệp, phẩy khuẩn trong nuôi trồng

thủy sản Các vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng tiết nhiều loại sắc tố là các hợp chất có tính kháng khuẩn Trong đó, các hợp chất phenazine do Pseudomonas

sp tiết ra môi trường là những hợp chất có phổ kháng khuẩn rộng

Phenazine là nhóm sắc tố do Pseudomonas sp tiết ra bao gồm: pyocyanin

PCN (5-N-methyl-1-hydroxyphenazine), 1-carboxylic (PCA) và

phenazine-1-carboxamide Sắc tố pyocyanin từ Pseudomonas aeruginosa, được chiết bằng

chloroform, là phenazine có sắc tố màu xanh Nghiên cứu tách chiết, tính chất và ứng dụng của pyocyanin đã được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới: luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

5

Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn

Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010) Sắc tố đã được xác

định là có phổ kháng khuẩn rộng [75], chống nấm [55], các Vibrio sp gây bệnh

trong nuôi trồng thủy sản [66] Phân lập và điều tra cho thấy pyocyanin có tính

kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio sp như V parahaemolyticus , V vulnificus , V alginolyticus , V fluvialis , V Proteolyticus, V harveyi và do đó nó có thể được

ứng dụng cho các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản

Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi” được thực hiện nhằm mục đích phân lập được chủng Pseudomonas sp có khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio gây

bệnh trên tôm nuôi, góp phần điều trị bệnh và giúp tăng năng suất tôm nuôi ở Việt Nam

Nhiệm vụ đặt ra cho đề tài là:

1.Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả năng kháng lại vi

khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi

2 Sàng lọc chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng khuẩn

3.Giải trình tự gen 16s rRNA, định danh vi khuẩn

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

6

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự

biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Vi khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường, mà còn có thể sống trong môi trường có ít khí oxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo Vi khuẩn này dinh dưỡng bằng rất nhiều các hợp

chất hữu cơ ở động vật Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học Một trong số đó là loài Pseudomonas aeruginosa

Hình 1.1: Khuẩn lạc P aeruginosa trên môi trường King A

7

Lớp (class) Gamma Proteobacteria

Họ (familia) Pseudomonadaceae

Chi (genus) Pseudomonas

Loài (species) Pseudomonas aeruginosa 1.1.2 Đặc điểm

Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình

que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen

P aeruginosa là loài điển hình thuộc giống Pseudomonas (Migula) [13] Tế bào của chúng có dạng hình que, dài 1-1,5µm, rộng 0,5-1µm P aeruginosa sử

dụng hô hấp hiếu khí (oxy) làm sự trao đổi chất tối ưu mặc dù chúng cũng có thể

hô hấp kị khí trên nitrat hoặc nhận điện tử khác thay thế P aeruginosa có thể

chuyển hóa một loạt các phân tử hữu cơ, bao gồm các hợp chất hữu cơ như

benzoate, điều này đã giúp P aeruginosa trở thành một vi sinh vật rất phổ biến vì

nó có thể được tìm thấy trong môi trường như đất, nước, con người, động vật, thực vật, nước thải và các bệnh viện [59] Trong tất cả các hệ sinh thái thủy vực có chứa

hàm lượng oxy hòa tan cao nhưng chất dinh dưỡng thực vật thấp, P aeruginosa là

sinh vật chiếm ưu thế và điều này biến nó trở thành loài sinh vật phong phú nhất trên trái đất

Pseudomonas sp có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố:

- Pyocyanin: là sắc tố phenazine, có màu xanh da trời, tan trong nước và tan

trong chloroform, 96% số chủng P aeruginosa có khả năng sinh sắc tố này

Pyocyanin sinh ra thuận lợi trong môi trường tiếp xúc nhiều với không khí, dễ dàng phát hiện khi nuôi vi khuẩn trên môi trường canh thang, thạch thường hoặc luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

agar King B) tạo điều kiện cho vi khuẩn tiết sắc tố fluorescein.[58]

P aeruginosa thường được xác định sơ bộ bởi vẻ ngoài óng ánh như hạt trai

và có mùi giống như nho hoặc bánh tortilla khi được nuôi cấy in vitro Các dấu

hiệu nhận biết sự có mặt của P aeruginosa trong lâm sàng thường bao gồm khả

năng sinh cả hai sắc tố pyocyanin và fluorescein, cũng như khả năng phát triển tại

nhiệt độ 42°C P aeruginosa có khả năng sinh trưởng trong diesel và nhiên liệu

máy bay, nơi mà vi khuẩn này được coi là vi sinh vật sử dụng hydrocarbon, và gây

ra sự ăn mòn vi thể.[14]

Mặc dù được phân loại là một vi sinh vật hiếu khí, P aeruginosa còn được

xem như là vi sinh vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong môi trường thiếu một phần hay toàn phần khí oxy Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng, và thậm chí khi thiếu nitrat luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

9

nó cũng có thể lên men arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ chất [23, 24, 41,

94, 95]

1.1.3 Cấu trúc gen

P aeruginosa có kích thước bộ gen khoảng 5,2 – 7.000.000 cặp bazơ với 65%

nucletide là loại Guanine và Cytosine, bao gồm một lõi chính được bảo tồn và các

phần phụ khác nhau Bộ gen lõi của các dòng P aeruginosa phần lớn là giống

nhau, biểu hiện sự đa dạng thấp, và chỉ chứa vài locus quy định những tính trạnh nổi bật, như locus pyoverdine, flagella, pilA, và locus sinh tổng hợp kháng thể O Những đoạn gen quy định các tính trạng nằm rải rác khắp bộ di truyền và khoảng một phần ba trong số chúng nằm kề sát các gen tRNA hay mRNA Tính đa dạng di truyền của vi khuẩn được hình thành bởi sự tương tác lẫn nhau giữa các họ đảo gen pKLC102/PAGI-2 vào các gen tRNALys hay tRNAGly Các đảo gen riêng lẻ khác nhau về thứ tự các gen trao đổi chất, nhưng giống nhau về các gen tương kề truyền lại trực tiếp cho các chủng và các loài [25, 93]

Hình1.2: Gen P aeruginosa PA01 [77]

P aeruginosa có một nhiễm sắc thể dạng vòng duy nhất và siêu xoắn trong tế

bào chất [33] Nó cũng mang rất nhiều plasmid nhiễm sắc thể huy động, điều này luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

10

rất quan trọng đối với tập tính sống của sinh vật Ví dụ như các plasmid, TEM, OXA, và PSE được mã hóa để sản xuất betalactamase, chất cần thiết cho sức đề kháng của vi khuẩn với thuốc kháng sinh [28]

1.1.4 Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống Đây là phương pháp thông dụng được các nhà nghiên cứu sử dụng để xác định các vi khuẩn nói chung Trong phương pháp vi sinh vật học, người ta nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các loài vi khuẩn Đặc điểm hình thái của một loài vi khuẩn bao gồm cả các đặc điểm về tế bào (hình dạng, nội bào tử, tiêm mao, nhuộm Gram) và các đặc điểm về khuẩn lạc (màu sắc, đường kính, hình dáng) Các đặc điểm về sinh lý và sinh hóa như sự phát triển của các vi sinh vật ở các nhiệt độ, giá trị pH, nồng độ muối, nguồn năng lượng, hay các điều kiện môi trường khác Tiếp đó là sự phát triển của chúng trên các kháng sinh khác nhau, hoạt động của các loại enzyme, và quá trình trao đổi chất…

1.1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác cao Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử, quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [1]

Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật vì rRNA có mặt ở tất cả các loài vi sinh vật, có khả năng xác định,

có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

11

Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn có 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16s rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít, do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng Gen

mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn

Cấu trúc của gen mã hóa 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ

và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài Đây là một thuận lợi lớn cho nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [50]

1.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

Vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng làm suy giảm các hydrocacbon thơm

như methylbenzene - những sản phẩm của ngành công nghiệp dầu khí và thường được sử dụng làm dung môi cho sơn men và sơn cũng như trong sản xuất thuốc và hóa chất Methylbenzene được coi là chất gây ô nhiễm môi trường đang hiện diện

trong không khí, đất và trên bề mặt nước [70] P aeruginosa có thể phá vỡ toluene, hình thức đơn giản nhất của methylbenzene P aeruginosa thoái hóa toluene thông

qua quá trình oxy hóa của các nhóm methyl cho aldehyde, rượu và một acid, sau

đó được chuyển đổi sang catechol (1,2-dihydroxybenzene) Do đó, P aeruginosa

có thể được sử dụng trong kiểm soát ô nhiễm [51]

P aeruginosa cũng được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản Vi khuẩn P aeruginosa giúp gia tăng sức

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

12

khỏe và hệ miễn dịch của tôm bạc gân Penaeus latisulcatus khi cho tôm ăn với liều

lượng 105 CFU/ml Vi khuẩn P aeruginosa YC58 cũng liên kết hoạt động với hệ

vi sinh của ấu trùng hàu Cortez, C Corteziensis, giúp gia tăng tỷ lệ sống và tăng trưởng của hàu ngọc Pinctada mazatlanica Ngoài ra, khi kết hợp vi khuẩn P aeruginosa và B cepacia cũng có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng và tỷ lệ sống của điệp N subnodosus[97]

1.2 Hoạt chất pyocyanin

1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen

Hợp chất phenazine gồm 6,000 loại là các hợp chất thứ cấp của quá trình nuôi

cấy chủng Pseudomonas sp như: pyocyanin - sắc tố xanh, pyorubrin - sắc tố nâu,

Phenazine-1-carboxylic acid - sắc tố nâu đỏ, những hợp chất này đều có khả năng kháng khuẩn Phenazine là một hợp chất dị vòng được sản xuất một cách tự nhiên như màu đỏ 5-methly-7-amino-1-carboxyphenazium betaine, sau đó được chuyển đổi thành các phenazine-1carboxylic acid (PCA) màu vàng chanh , và cuối cùng đến 1-hydroxy-5-methyl phenazine màu xanh (pyocyanin) [37] Việc sinh tổng hợp

phenazine đã được nghiên cứu rộng rãi ở vi khuẩn Pseudomonas [42, 43, 45, 46]

Shikimic acid được phát hiện là con đường chuyển hóa chính thành phenazine Shikimic acid là tiền thân cho tổng hợp phenazine, cung cấp một điểm phân nhánh cho chorismic acid để tổng hợp phenazine [43, 45, 62]

Pyocyanin là một hoạt chất thứ cấp có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu xanh Các sắc tố pyocyanin gồm 2 tiểu đơn vị của Nmethyl -1- hydroxyphenazine Pyocyanin được kết tinh ở dạng tinh khiết và được phân loại như một phenazine Trong quá trình

tổng hợp pyocyanin, bảy gen của P aeruginosa đã được xác định, cụ thể là phzC,

D, E , F, G , M và S Locus sinh tổng hợp phenazine đã được tìm thấy trong tất cả loài, phzM và phzS là các gen chịu trách nhiệm chính để chuyển đổi phenazine -1-

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

13

carboxylic acid thành pyocyanin Có hai bước được cho là tham gia vào quá trình

tổng hợp pyocyanin từ PCA Bước đầu tiên được xúc tác bởi các enzyme phzM,

S-Adenosylmethionine (SAM) methyltransferase, trong đó PCA được chuyển thành 5-methyl phenazine-1-carboxylic acid betaine bằng cách chuyển một nhóm methyl vào các nguyên tử nitơ của phenazine vòng phân nửa Bước thứ hai được xúc tác

bởi các enzyme phzS, FAD-monooxygenase tham gia vào phản ứng khử carboxyl

hydroxylative 5-methylphenazine-1-carboxylic acid betaine để tạo thành pyocyanin [67]

1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin

Pyocyanin là một chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng vi khuẩn của pyocyanin đã được báo cáo kể từ năm 1940 [92] Các sắc

tố ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Escherichia coli và được đặt tên là Colicin

Các phần protein được giải phóng khi chiết dịch của các vi khuẩn có tính chất của pyocyanin [96] Hình thức tinh khiết của pyocyanin cho thấy tùy thuộc vào nồng

độ của pyocyanin mà chúng cho tác dụng diệt khuẩn khác nhau [18] Cơ chế ức chế vi khuẩn phát triển của pyocyanin đã được nghiên cứu và kết luận rằng pyocyanin tương tác với chuỗi hô hấp màng tế bào dẫn đến ức chế việc thực hiện

hoạt động trao đổi chất của các tế bào vi khuẩn [19] Đối với E coli, pyocyanin là

nguyên nhân gây cạn kiệt nguồn cung cấp oxy cho các tế bào, sản xuất H2O2 và

cũng chuyển hướng dòng chảy điện tử, gây ra độc tính đối với tế bào E Coli [38]

Pyocyanin ảnh hưởng tiêu cực đến cơ chế vận chuyển tích cực của một số sinh vật

[19] P aeruginosa có trong đờm của bệnh nhân xơ nang (CF) ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus

Tính kháng sinh của pyocyanin từ P aeruginosa phân lập từ môi trường biển

đã được nghiên cứu bởi Angell và cộng sự [12] P aeruginosa đã được phân lập từ

trầm tích đại dương thu thập từ quần đảo Hawaii và sàng lọc hoạt tính kháng luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

14

khuẩn Gần 90-95% khả năng ức chế vi khuẩn của các chủng P aeruginosa là do

pyocyanin Nó cho thấy khả năng kháng lại các loài vi khuẩn gây bệnh như

Salmonella paratyphi, E coli và Klebsiella gây bệnh viêm phổi [81] Pyocyanin phân lập từ P aeruginosa 4B cho thấy khả năng kháng sinh chống lại tác nhân gây bệnh khác nhau và vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm như Bacillus cereus

Các sinh vật sản xuất các chất chuyển hóa pyocyanin trong môi trường đã

được chọn lọc và chứng minh tác dụng kháng khuẩn trên các sinh vật như S aureus, Staphylococcus lớp biểu bì, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus và Saccharomyces cerevisiae Các sắc tố được sản xuất cho thấy khả năng chống lại các sinh vật như vi khuẩn E coli, Acinetobacter , S aureus và Streptococcus gây

bệnh viêm phổi rất hiệu quả (Thụy Điển năm 2010)

1.2.3 Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin

Nghiên cứu tách chiết, tính chất và ứng dụng của pyocyanin được tiến hành ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới: Mĩ (Scott Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ (Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010) Sắc tố đã được xác định là có phổ kháng khuẩn rộng [75],

chống nấm [55] và các Vibrio sp gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản [66] Tác giả

Prabhakaran Priyaja [74] đã thông báo khi khảo sát tính kháng của PCN với

Vibrio sp cho thấy khả năng ức chế 7 loại Vibrio: V harveyi, V parahaemolyticus,

V vulnificus, V alginolyticus, V.fluvialis, V mediterrani và V nereis với vòng kháng khuẩn từ 13,5 đến 31,0mm Khi dùng dịch nuôi của P aeruginosa có hàm

lượng PCN là 30mg/l cho vòng ức chế đạt 17,50 – 38,06mm Nồng độ ức chế tối thiểu của pyocyanin chống lại các vi khuẩn và nấm dao động ở 20-120 µg /ml PCN

[15, 31, 39, 40, 63] Khả năng kháng E ictalluri kém hơn Mức dộ ảnh hưởng đối với một số chủng không gây bệnh như LA5, B clausii tương tự như khi sử dụng

kháng sinh TE

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

15

1.3.Tổng quan về Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi 1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tôm nuôi Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là những loài vi khuẩn Gram (-), hình

que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm Chúng không sinh bào tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn

Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy tiện,

vi khuẩn không phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129

Về cơ bản, các loài vi khuẩn này đều có mặt trong môi trường nước, đặc biệt

là nước biển và cửa sông, Na+ kích thích sự phát triển của tất cả các loài Vibrio và

là nhu cầu tuyệt đối với nhiều loài Hầu hết các mẫu phân lập từ bệnh vỏ và viêm

ruột của tôm trưởng thành đều gặp loài V alginolyticus, V parahaemolyticus, V anguillarum

Hình 1.3: Khuẩn lạc của V alginolyticus và V parahaemolyticus 1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm

1.3.2.1 Lịch sử phát triển bệnh:

Bệnh do vi khuẩn Vibrio đã được phát hiện rất sớm từ năm 1970 bởi Tukiash

khi bệnh xảy ra và gây chết với tỷ lệ >50% trên đối tượng nuôi thủy sản là cua luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

16

xanh (Callinectes sapidus) Đến năm 1977, Fisher đã thông báo các loài tôm hùm châu Mỹ như: Homarus americarus, H gammarus… hay tôm hùm châu Á (Panulirus homarus, P ornatus ) đều có thể bị nhiễm bệnh do vi khuẩn Vibrio

Kết quả này cũng được thông báo bởi Roald và Bowser, 1981

Ngoài ra, Lioo và các ctv của ông đã thông báo hiện tượng tôm sú bị bệnh đỏ thân có liên quan đến thức ăn thối rữa Nhưng có một số quan điểm khi nghiên cứu

và hiện bệnh đỏ thân trong các ao nuôi tôm Sú ở Philippines với thức ăn tổng hợp (công nghiệp) cho rằng: bệnh đỏ thân xảy ra có liên quan đến khí độc trong ao Năm 1990, ông Hassawai cho rằng tác nhân gây ra bệnh đỏ thân ở Thái Lan là do

tôm ăn Artemia và tảo giả Tuy nhiên theo nghiên cứu của viện nuôi trồng thủy sản

3 thì bệnh đỏ thân do một giống vi khuẩn Vibrio alginolyticus gây ra trên tôm sú

Cho đến nay bệnh này được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt

Nam Nghiên cứu của Newman và Feng, 1982 cho biết loài cua đá (Callinectes irroratus) cũng có thể bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở 20oC sau 24h [3]

Ở Việt Nam, ngay từ những năm 1989 – 1990, các nhà nghiên cứu đã phát

hiện rằng bệnh Vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất phổ biến trong cá trại sản

xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm [2] Những năm gần đây khi mà

nghề nuôi các động vật thân mềm nước mặn phát triển thì bệnh Vibriosis đã trở

thành bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản

Vi khuẩn thuộc giống Vibrio sống ký sinh trên cơ thể động vật thủy sản đều

gây ra một số dấu hiện bệnh lý nhất định Cho đến nay, một số tác giả cho rằng

Vibrio là tác nhân đầu tiên gây ra các bệnh cho tôm Ngược lại một số tác giả lại cho rằng: Vibrio là tác nhân thứ hai Bệnh này xảy ra như là kết quả của các điều

kiện khác: tôm bị bệnh truyền nhiễm hay các bệnh về dinh dưỡng, tôm bị thương hoặc điều kiện môi trường khắc nghiệt Trong nghiên cứu bệnh động vật thủy sản

phân lập Vibrio từ mẫu bệnh không khó nhưng xác định vai trò của chúng trong

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

- Địa lý : Bệnh Vibriosis có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi

động vật thủy sản nước lợ và nước lặn Sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ Từ mẫu bệnh phát sáng của ấu trùng và hậu ấu trùng, các tác giả đã phân lập được những loại khác nhau của

giống Vibrio Như ở Philippine, C L Pilogo, M.C.L Baticados, E.R Crus và L de Lapena đã phân lập được 2 loài V harveyi và V splendidus Trong khi đó ở Thái Lan, người ta lại cho rằng tác nhân là V parahaemolyticus Ở Việt Nam, một số

cán bộ của trường Đại học Thủy sản đã phân lập từ tôm bệnh được hai loài vi

khuẩn V alginolyticus và V parahaemolyticus

- Ký chủ : Hầu như các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ, mặn đều có thể bị

nhiễm và chịu tác hại của bệnh Vibriosis như : các loài tôm he (Penaeus spp) và tôm thẻ (Metapenaeus spp), các loài tôm hùm châu Mỹ (Homarus spp) và tôm hùm châu Á (Panulirus spp), các loài cua biển như cua xanh, cua đá…

- Giai đoạn phát triển : bệnh có thể xảy ra ở các giai đoạn ấu trùng, hậu ấu trùng, ấu niên, cơ thể trưởng thành, ở đàn bố mẹ của các loài tôm, cua… Tuy vậy,

tùy theo từng loại bệnh mà vi khuẩn Vibrio có thể gây nặng ở giai đoạn này và nhẹ hơn ở giai đoạn kia Ví dụ : Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi có thể xảy ra ở nhiều

giai đoạn khác nhau, nhưng tác hại nặng nhất là giai đoạn ấu trùng Zoae và Mysis

- Con đường lan truyền : Trong hệ thống nuôi thủy sản, vi khuẩn Vibrio xâm

nhập vào ao theo một số con đường: nguồn nước, dụng cụ dùng, tôm mẹ hoặc tôm

giống, thức ăn, đặc biệt là thức ăn tươi sống Artemia và chúng có thể nằm sẵn ở

thành bể hay dưới đáy ao

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

18

b, Mùa vụ xuất hiện bệnh Mùa vụ xuất hiện bệnh do vi khuẩn Vibrio tùy thuộc theo loài và địa điểm nuôi Theo nghiên cứu của một số tác giả nước ngoài và Việt Nam, Vibrio sp, tìm

thấy phổ biến trong nước biển và vùng ven bờ, trong bể ương ấu trùng, bể ương tảo

và bể ương Artemia

Nhìn chung, vi khuẩn Vibrio phân chia cơ thể rất nhanh ở độ mặn 10 – 40ppt

(phát triển tốt nhất ở độ mặn 20 – 30ppt), lây lan nhanh ở nhiệt độ cao (mùa nóng), phát triển nhanh ở nơi có nhiều chất hữu cơ, oxy thấp và pH 7-9

Trong bể ương lượng vi khuẩn Vibrio tăng theo thời gian nuôi, tầng đáy cao hơn tầng mặt Mật độ vi khuẩn Vibrio tăng nhanh rõ rệt khi thời tiết thay đổi, vào

các thời điểm biến động do bão, gió mùa hay áp thấp nhiệt đới hoặc theo con nước của thủy triều (nước cường, nước ròng) [2]

c, Tác hại của bệnh Bệnh do Vibrio sp gây ra ở tôm có thể xảy ra ở dạng cấp tính hoặc mãn tính,

trong trường hợp cấp tính, tỷ lệ chết có thể là 100%

1.3.3 Các phương pháp phòng ngừa và điều trị

1.3.2.1 Biện pháp phòng bệnh tổng hợp

a,Cải tạo và vệ sinh môi trường nuôi

Cải tạo ao trước khi ương nuôi: tháo cạn, vét bùn (rửa đáy ao), phơi khô (hoặc rửa chua) và khử trùng ao nuôi với mục đích là:

- Diệt địch hại và sinh vật là vật nuôi trung gian sinh vật canh tranh thức ăn của tôm như các loài cá dữ, cá tạp, giáp xác, côn trùng, nòng nọc, sinh vật đáy…

- Diệt sinh vật gây bệnh cho tôm như các giống loài vi sinh vật: Vi khuẩn, nấm và các loài ký sinh trùng

- Cải tạo chất đáy làm tăng các muối dinh dưỡng, giảm chất độc tích tụ ở đáy

ao

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

b, Tiêu diệt nguồn gốc gây bệnh

- Khử trùng cơ thể con giống trước khi thả nuôi

- Khử trùng thức ăn

- Làm sạch nơi tôm đến ăn có thể dùng thuốc nào hay số lượng nhiều ít còn tùy thuộc vào chất nước, độ sâu, nhiệt độ nước, diện tích nơi cho ăn và tình hình phát sinh bệnh

- Khử trùng dụng cụ

c, Tăng sức đề kháng bệnh

Nguyên nhân gây bệnh xâm nhập vào những cơ thể có phát sinh ra bệnh hay không còn tùy thuộc vào yếu tố môi trường và bản thân cơ thể vật nuôi Nếu vật nuôi có sức đề kháng tốt có khả năng chống đỡ lại yếu tố gây bệnh thì sẽ không mặc bệnh hoặc bệnh nhẹ, còn ngược lại thì khả năng chống đỡ yếu, dễ dàng nhiễm bệnh Do đó một trong những khâu quan trọng để phòng bệnh cho vật nuôi là phải tăng cường sức đề kháng cho vật nuôi bằng cách cho ăn theo phương pháp “4 định”: định chất lượng, số lượng thức ăn, vị trí và thời gian cho ăn

21

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Các chủng Pseudomonas aeruginosa là đối tượng nghiên cứu, được phân lập

từ môi trường nuôi thủy sản thu từ bể thí nghiệm tại phòng Công nghệ Phôi – Viện Công nghệ Sinh học

- Mẫu vi khuẩn Vibrio sp dùng trong nghiên cứu này do phòng Công nghệ

Phôi – Viện Công nghệ Sinh học cung cấp Chúng tôi sử dụng các vi khuẩn này như những vi sinh vật kiểm định để kiểm tra, đánh giá khả năng kháng khuẩn của

các chủng Pseudomonas sp phân lập được

2.1.2 Thiết bị

- Máy PCR (Eppendorrf hoặc Techne)

- Máy khuấy trộn Vortex (IKA)

- Tủ cấy vô trùng (Sanyo, Bio Clean Bench)

- Máy ly tâm lạnh Eppendorf (Sorvall R Biofege Freco)

- Bể ổn nhiệt (OSI)

- Bộ điện di DNA (Mupid R 2plus)

- Máy soi gel và chụp ảnh điện di GEL-DOC (pharmacia Biotech)

- Cân phân tích, cân điện (Precisa XT 220A)

22

2.1.3 Hóa chất

2.1.3.1 Hóa chất sử dụng cho vi sinh:

Môi trường APW, 2216E, NB, LB, King A, King B và các môi trường xác định hoạt tính enzyme, thuốc nhuộm vi khuẩn, các chất chỉ thị màu

* Môi trường lỏng dùng để làm giàu vi khuẩn Vibrio: APW (Alkaline Pepton Water)

- Pepton: 1g

- NaCl: 3g

- Nước cất: dẫn tới 100ml Chỉnh pH = 8,6 bằng dung dịch NaOH

* Môi trường 2216E:

23

- Yeast Extract: 5g

- Nước cất dẫn tới 1 lít Chỉnh pH 7 bằng NaOH

* Môi trường xác định hoạt tính enzyme:

 Môi trường thử hoạt tính protease (g/l)

- NB: 8g

- Casein: 10g

- Agar: 17g

- Nước dẫn tới 1 lít Chỉnh pH = 7,6 bằng NaOH

 Môi trường thử hoạt tính amylase (g/l)

- NB: 8g

- Tinh bột tan: 2g

- Agar: 17g

- Nước dẫn tới 1 lít luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

 Môi trường thử hoạt tính Lipase

- NB: 8g

- Agar: 17g

- Nước: 1 lít Chỉnh pH 7,6 bằng NaOH Sau khi khử trùng để nguội 50oC rồi bổ sung Tween-80 với tỷ lệ 1%

2.1.3.2 Hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử:

- Taq DNA polymerase

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn trên môi trường King A Nước nuôi thủy sản được pha loãng tới các đậm độ từ 10-1 tới 10-3, sau đó cấy trải 0,1ml dung dịch pha loãng lên môi trường thạch King A và ủ ở 30oC Sau 24 giờ tiến hành nhặt những khuẩn lạc màu xanh và làm môi trường chuyển sang màu xanh để thực hiện tiếp các thí nghiệm sau

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

26

2.2.1.2 Phương pháp nhuộm tế bào quan sát hình thái của vi khuẩn Nhuộm Gram là phương pháp quan trọng và phổ biến để phân loại vi khuẩn, dựa vào khả năng bắt màu của tế bào vi khuẩn với thuốc nhuộm Do đặc điểm cấu tạo của thành tế bào vi khuẩn Gram âm và Gram dương là khác nhau nên khả năng bắt màu của chúng cũng khác nhau Phương pháp này do Gram đề xuất năm 1884

đã được Hucker cải tiến để phát hiện vi khuản theo các bước sau:

Bước 1: Làm một vết bệnh phẩm hoặc vi khuẩn trên một lam sạch Để khô tự nhiên và cố định bằng cách hơ nóng qua ngọn lửa đẩn cồn

Bước 2: Nhỏ vài giọt Crystal Violet cho phủ đều lên trên bề mặt phết nhuộm

và để yên trong 1 phút Sau đó rửa nhanh bằng nước

Bước 3: Nhỏ vài giọt Lugol cho phủ đều trên bề mặt phết nhuộm và để yên trong 1 phút rồi rửa nhanh bằng nước

Bước 4: Tẩy màu bằng cách nghiêng lame và nhỏ từ từ cồn lên phết nhuộm, khi giọt cồn rời khỏi lame không có màu tím thì ngừng ngay Rửa nhanh bằng nước

Bước 5: Nhỏ vài giọt Safranin cho phủ đều trên bề mặt phết nhuộm và để yên trong 1 phút Rửa nhanh bằng nước

Bước 6: Thấm khô phết nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu

độ phóng đại 1000 lần

Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím và vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng

2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme của vi khuẩn

- Chuẩn bị các môi trường xác định hoạt tính enzyme

- Cấy vi khuẩn đã được làm giàu lên các môi trường đó, ủ các vi khuẩn ở

30oC qua đêm và quan sát kết quả thí nghiệm

- Kiểm tra hoạt tính amylase (cơ chất là tinh bột tan) bằng cách nhuộm dung dịch Lugol vào đĩa thạch Quan sát kết quả nếu thấy xuất hiện vùng phân giải luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

- Kiểm tra hoạt tính Lipase (cơ chất là Tween 80), nếu ta thấy xung quanh khuẩn lạc đục lên thì ta kết luận chủng vi khuẩn đó có hoạt tính enzyme Lipase 2.2.1.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ

Vi khuẩn được nuôi trên môi trường NB lỏng ở 30oC trong 24 giờ, có lắc Sau

24 giờ, hút 100µl dịch vi khuẩn chang đều lên đĩa thạch NB và để khô tự nhiên trong 5-10 phút Sau đó dùng kẹp khử trùng gắp khoanh giấy có tẩm kháng sinh đặt lên đĩa thạch rồi ủ đĩa ở tủ ấm 30oC trong 24 giờ Tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn (D-d, mm) (trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính khoanh giấy) để xác định khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn

Kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu gồm: Tetracyclin (TE), Ampicillin (AM), Penicillin (PG), Kanamicun (KM), Gentamicin (GM) và Microcin

2.2.1.5 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn:

Pha loãng mẫu với các đậm độ pha loãng khác nhau: 10-3, 10-4,10-5 Hút 100µl dung dịch pha loãng cho vào đĩa petri chứa môi trường thạch NB (mỗi nồng độ 3 đĩa), chang đều và để khô tự nhiên trong 5-10 phút, ủ ở 30oC trong 24 giờ Sau 24 giờ, chọn những đĩa có số khuẩn lạc khoảng 15 – 300 khuẩn lạc ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp Tính mật độ vi khuẩn có trong 1 ml mẫu bằng cách tính trung bình cộng tổng số khuẩn lạc của các đĩa trên theo công thức sau:

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

28

d n n

C N

)

.1,0





Trong đó: N: mật độ vi khuẩn có trong 1ml mẫu (CFU/ml)

C: số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn

n1, n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2 d: Hệ số pha loãng của đậm độ pha loãng đã chọn thứ 1

2.2.1.6 Phương pháp tách chiết và xác định sắc tố pyocyanin - PCN [32]

Vi khuẩn được làm giàu trên môi trường NB lỏng ở 30oC, lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ Sau đó, vi khuẩn được cấy chuyển sang 20ml môi trường King A lỏng với tỷ lệ giống 1%, lắc 200 vòng/phút ở 30oC Dịch nuôi vi khuẩn được ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi, loại bỏ tế bào, thêm chloroform theo tỷ lệ 1:2, lắc đều, loại bỏ phần dịch trên, thu lớp chloroform Sau đó sử dụng 0,2M HCl để acid hóa, dung dịch chuyển sang màu đỏ được đo OD bước sóng 520

nm để xác định nồng độ hoạt chất Trung hòa dịch chiết acid bằng NaOH và thu được dung dịch PCN có màu xanh dương

2.2.1.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối và nồng độ hoạt chất của vi khuẩn

Vi khuẩn được làm giàu trên môi trường NB lỏng ở 30oC, lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ Sau đó, vi khuẩn được cấy chuyển sang 20ml môi trường King A lỏng với tỷ lệ giống 1%, lắc 200 vòng/phút ở 30oC Sau thời gian: 1, 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8 ngày tiến hành xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc và tách chiết, xác định nồng độ hoạt chất PCN bằng phương pháp đo OD

2.2.1.8 Phương pháp xác định khả năng kháng Vibrio sp:

a, Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch:

Các chủng vi khuẩn Vibrio sp được làm giàu trên môi trường APW, sau đó

cho vào trong tủ lắc 30ºC, thời gian 24 giờ để hoạt hóa chủng Dùng Micropipet luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

29

hút dịch sinh khối vi khuẩn Vibrio sp đã được hoạt hóa lên đĩa petri chứa môi

trường thạch 2216E, sau đó chang đều cho đến khi khô hết Đặt khoanh giấy có

tẩm sẵn dịch nuôi, dịch chiết theo thời gian nuôi cấy chủng Pseudomonas sp và

khoanh giấy có tẩm kháng sinh Tetracyclin làm đối chứng để xác định khả năng kháng khuẩn; các khoanh giấy có nồng độ PCN khác nhau 0,5µg, 1µg và 2µg để

xác định nồng độ tối thiểu ức chế Vibrio sp của hoạt chất PCN Đĩa được nuôi ở

nhiệt độ thích hợp với từng chủng Sau 24 giờ tiến hành xác định khả năng ức chế

Vibrio sp bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn (D-d, mm); trong đó D là

đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính khoanh giấy

b, Phương pháp nuôi lỏng:

Các chủng vi khuẩn Vibrio sp được làm giàu trên môi trường APW, sau đó

cho vào trong tủ lắc 30ºC, thời gian 24h để hoạt hóa chủng Sau 24 giờ tiến hành thu sinh khối, xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch Pha loãng dung dịch vi khuẩn với đậm độ pha loãng là 10-3, xác định mật độ vi khuẩn ban đầu bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch , sau

đó bổ sung hoạt chất với các nồng độ 0,5µg/ml, 1µg/ml và 2µg/ml và một mẫu đối chứng không bổ sung hoạt chất, nuôi lắc ở 30oC Sau 6 giờ và 24 giờ thu mẫu, xác định mật độ vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, so sánh với

mẫu đối chứng để xác định khả năng ức chế Vibrio sp

2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử

2.2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số DNA trong hệ gen của chủng vi khuẩn phân lập được được tách chiết để làm nguyên liệu cho quá trình giải trình tự gen và làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen cần nghiên cứu DNA được tách theo kit Genomic DNA Purification Kit của hãng Fermentas

Trình tự tiến hành (Theo quy trình chỉ dẫn của hãng):

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

30

Bước 1: Trộn đều 100µl mẫu (30mg mẫu thêm 100µl TE 1X) đã chuẩn bị với 500µl dung dịch 1, ủ hỗn hợp ở 70oC trong 5 phút, làm nguội đến nhiệt độ phòng Bước 2: Thêm 600µl dung dịch chloroform, votex hỗn hợp cho tới khi chuyển màu trắng sữa và li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 3: Chuẩn bị dung dịch kết tủa DNA 800µl (theo tỷ lệ 1/10: hòa 80µl dung dịch 2 với 720µl nước khử ion đã khử trùng)

Bước 4: Dùng pipet hút 300µl dung dịch pha trên cùng sang ống chứa 800µl dung dịch kết tủa DNA ở trên Trộn đều hỗn hợp, để 1-2 phút ở nhiệt độ phòng, li tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút

Bước 5: Bỏ dịch nổi, hòa tan tủa trong 150µl dung dịch 3, votex trong 10 giây đến khi hòa tan hoàn toàn tủa dưới đáy ống

Bước 6: Thêm 450 µl cồn tuyệt đối, trộn đều, để hỗn hợp ở -20oC trong 10 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút Bỏ dịch nổi, thêm 500µl cồn 75%, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút Loại hết cồn và làm khô DNA, hòa tan DNA trong 50µl dung dịch TE 1X, kiểm tra độ sạch và xác định hàm lượng DNA bằng

đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 280nm và 260nm và điện di trên gel agarose 1%

2.2.2.2 Phương pháp PRC khuếch đại gen Được phát minh vào năm 1985 và được thừa nhận chính thức năm 1993 qua giải thưởng Nobel y dược và sinh lý cho Kary Mullis – người phát minh ra nó PCR hiện đang được ứng dụng rộng rãi ở Việt Nam

a, Phản ứng PCR khuếch đại gen 16s rRNA để định danh vi khuẩn:

- Trình tự mồi: sử dụng cặp mồi 27F và 1525R để định danh vi khuẩn bằng gen16s rRNA Trình tự của mồi như sau:

27F: 5’ –CGGTTACCTTGTTACGACTT – 3’

1525R: 5’–AGGAGGTGATCCAGCC – 3’

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

- Chu trình phản ứng: biến tính 94o C: 3 phút; lặp lại 35 chu kỳ: 94oC-20 giây;

55oC-30 giây và 72oC-45 giây Ở chu kỳ cuối cùng bước tổng hợp kéo dài 5 phút, sau đó giữ mẫu ở 4oC

b, Phản ứng PCR khuếch đại gen PA phát hiện P aeruginosa

- Trình tự mồi: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu trên gen 16S rRNA có độ đặc hiệu

và độ nhạy 100% với chủng P aeruginosa khuyếch đại đoạn gen 956bp [86]

32

- Chu trình phản ứng: biến tính 94o C: 5 phút; lặp lại 35 chu kỳ: 94oC-30 giây;

58oC-30 giây và 72oC-45 giây Ở chu kỳ cuối cùng bước tổng hợp kéo dài 5 phút, sau đó giữ mẫu ở 4oC

2.2.2.3 Phương pháp điện di

 Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị thạch agarose 1%: cân 1g agarose cho vào 100ml đệm điện di TAE 1X Đun nóng cho tới khi gel chảy hoàn toàn trong suốt (không có bọt khí) Để nguội tới nhiệt độ 50o sau đó đổ gel vào khuôn có gài sẵn lược để tạo giếng (gel có

độ dày 2-3mm) Sau khi gel đông (khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng) cẩn thận rút lược ra và có thể điện di (lưu ý: không để gel ở nhiệt độ phòng quá 4 giờ) Gel sau khi chuẩn bị phải ngâm chìm trong dung dịch đệm điện di TAE 1X

- Trộn đều 4µl sản phẩm PCR với 1µl đệm tải điện di (loading dye) rồi tra vào các giếng trên gel

- Tra 4,5µl DNA Marker vào giếng thạch khác để tạo thang chuẩn

- Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 25-30 phút

- Nhuộm bản gel bằng Ethidium bromide (5-10 phút), rửa lại bằng nước rồi cho gel vào máy tử ngoại để đọc kết quả

33

2.2.2.4 Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR Trước khi tách dòng và giải trình tự, sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ Kit Bioneer Các bước làm sạch như sau:

Bước 1: Điện di các mẫu cần làm sạch trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X Bước 2: Cắt gel tại vị trí có băng DNA cho vào ống eppendorf và cân trọng lượng miếng gel

Bước 3: Bổ sung dung dịch Buffer 1 với tỉ lệ 3:1 (VD: nếu trọng lượng miếng gel là 200mg thì ta phải thêm 600µl Buffer 1)

Bước 4: Tiến hành ủ ống eppendorf có chứa đoạn gel trên ở 60oC trong vòng

10 phút và trộn đều trong khi ủ cho gel tan hoàn toàn

Bước 5: Sau khi gel đã tan hết, kiểm tra màu sắc của dung dịch có màu vàng

là đạt yêu cầu Nếu hỗn hợp có màu cam hoặc đỏ, bổ sung thêm 10µl sodium acetate 3M (CH3COONa), pH 5 và trộn đều thì dung dịch sẽ chuyển thành màu vàng

Bước 6: Chuyển dung dịch sang cột và li tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 7: Chuyển cột sang ống mới, bổ sung 500µl dung dịch Buffer 2, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 8: Lặp lại bước 7

Bước 9: Làm khô bằng cách ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn cồn còn sót lại Sau đó chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml mới

Bước 10: Thêm 30µl dung dịch 3 vào cột để thôi DNA, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút

Bước 11: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu DNA (Có thể thôi DNA lần thứ 2 để đạt hiệu suất cao nhất)

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

34

Sau khi làm sạch, sản phẩm PCR được điện di để kiểm tra độ tinh khiết trên gel agarose 1%, đệm TAE 1X

2.2.2.5 Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning)

Để tách dòng và xác định trình tự gen, người ta thường sử dụng vectơ pCR TOPO 2.1 có kích thước 3,9 Kb

Quá trình tách dòng bao gồm các bước cơ bản như sau:

+ Chọn và xử lý vectơ

+ Gắn DNA cần tạo dòng vào vectơ (insert)

+ Tạo vectơ tái tổ hợp

+ Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ (E coli)

+ Sàng lọc và chọn dòng tế bào mang DNA tái tổ hợp

 Biến nạp vectơ tái tổ hợp bằng phương pháp sốc nhiệt

Bước 1: Cho 10 μl dịch vector pCR®2.1 đã gắn sản phẩm PCR vào ống chứa

50 μl tế bào khả biến Escherichia coli INVαF’, ủ trong đá 45 phút

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Bước 4: Cấy trải sản phẩm trên lên đĩa chứa môi trường chọn lọc (môi trường

LB có bổ sung Kanamycine 50µg/ml và X-Gal 100µg/ml) Nuôi ở 37oC qua đêm Bước 5: Bảo quản ở 4oC để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

Trên môi trường LB có bổ sung X-gal, những khuẩn lạc có màu trắng là những dòng có thể được đính đoạn DNA ngoại lai, còn những khuẩn lạc màu xanh

có thể là những cá thể không được đính đoạn DNA ngoại lai

 Kiểm tra chọn lọc dòng tế bào tái tổ hợp

Để chọn lọc dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen tái tổ hợp cần tách dòng, chọn khuẩn lạc trắng cấy vào ống chứa 5ml môi trường LB lỏng có

bổ sung Kanamycin và X-gal, nuôi qua đêm ở 37oC có lắc, tiến hành tách chiết DNA plasmid

Bước 1: Cho 1,5ml dịch nuôi cấy của dòng vi khuẩn được chọn vào eppendorf, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút, đổ dịch thu sinh khối

Bước 2: Thêm 250µl Buffer 1 (có bổ sung 25µl RNase A), vortex cho đến khi sinh khối tan hết

Bước 3: Bổ sung 250µl Buffer 2 và đảo nhẹ 3 - 4 lần cho tới khi dịch trở nên trong

Bước 4: Bổ sung 350µl Buffer 3 và đảo nhẹ 3 - 4 lần

Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

Bước 6: Chuyển dịch sang ống gắn cột lọc DNA và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển cột sang eppendorf mới

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

36

Bước 7: Thêm 700µl Buffer 4 (đã bổ sung ethanol) vào cột và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển cột sang eppendorf mới

Bước 8: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút để loại bỏ hết ethanol

Bước 9: Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml

Bước 10: Thêm 50 - 100µl Buffer 5 vào cột và để 1 phút ở nhiệt độ phòng Bước 11: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Bỏ cột và giữ lại eppendorf chứa DNA plasmid

 Cắt kiểm tra DNA plasmid bằng EcoRI

Để khẳng định chắc chắn đoạn gen mong muốn có được gắn vào vectơ hay không cần cắt kiểm tra Plasmid thu được bằng EcoRI

Phản ứng cắt EcoRI gồm những thành phần như sau:

Plasmid sau khi tách được sử dụng để đọc trình tự trực tiếp

2.2.2.6 Phương pháp giải trình tự gen luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si