(Luận văn) nghiên cứu ảnh hưởng của a mangostin từ vỏ quả măng cụt (garcinia mangostana l ) lên vi khuẩn streptococcus mutans trên biofilm và định hướng ứng dụng

sẽ là đối tượng tiềm năng để tinh sạch, nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng vi khuẩn sâu răng mới anticaries agents.Vớ i mong muốn có mô ̣t nghiên cứu đầy đủ về cơ chế tác du

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-***** -NGUYỄN VŨ ANH

-MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT

Garcinia mangostana L LÊN VI KHUẨN Streptococcus mutansTRÊN BIOFILM VÀ ĐỊNH

HƯỚNG ỨNG DỤNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN THỊ MAI PHƯƠNG

luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 2

HÀ NỘI - 2015

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

-

Trong quá trình thực hiê ̣n luận văn khoa học , tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, khích lệ và động viên của các Thầy, Cô giáo, các bạn đồng nghiệp, bạn bè và những người thân trong gia đình Qua đây, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình đến như ̃ng cá nhân và tập thể đã hết lòng giúp đỡ để tôi có th ể hoàn thành bản luận văn này

Trước hết , tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thi ̣ Mai Phương, phòng Sinh hóa Thực vật , Viê ̣n Công nghê ̣ sinh học , Viê ̣n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Viê ̣t Nam đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình học tập và thực hiê ̣n nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nghiên c ứu của phòng Sinh hóa thực vật, Viê ̣n Công nghê ̣ sinh học , Viê ̣n Hàn lâm Khoa h ọc và Công nghệ Viê ̣t Nam , ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh họcđã nhiê ̣t tình giúp đỡ và tạo điều kiê ̣n thuận lợi để tôi hoàn thành bản luận văn này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu , bạn bè, người thân và đ ồng nghiệp - như ̃ng người đã luôn luôn ở bên tôi, luôn động viên , khích lệ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Hà Nội, 18tháng 12 năm 2015

Học viên

Nguyễn Vũ Anh

Trang 4

CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

EPS GTF

exopolysaccharide glucosyltransferase HPLC high performance liquid chromatography NMR nuclear magnetic resonance

NSM PTS

nước súc miệng sugar-phosphotransferase system TLC thin layer chromatography

TSA tryptic soy agar luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 5

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococus mutans 4

1.1.1 Bệnh học sâu răng 4

1.1.1.1 Nguyên nhân gây sâu răng 4

1.1.1.2 Mảng bám răng (dental plaque) 5

1.1.1.3 Cơ chế gây sâu răng 6

1.1.1.4 Vi khuẩn Streptococcus mutans 7

1.1.2 Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam 9

1.1.3 Các biện pháp ngăn ngừa sâu răng 10

1.1.3.1 Sử dụng chất kháng khuẩn 10

1.1.3.2 Sử dụng chất thay thế đường 12

1.1.3.3 Liệu pháp thay thế (replacement therapy) 12

1.1.3.4 Vacxin 13

1.1.3.5 Kiểm soa ́ t sự hình thành biofilm 13

1.2 Một số cơ chế thích nghi acid của vi khuẩn xoang miệng 15

1.2.1 Bơm proton F-ATPase 16

1.2.2 Sự thay đổi của màng tế bào vi khuẩn khi thích nghi acid 17

1.2.3 Sự sinh các chất kiềm 18

1.2.3.1 Urease 18

1.2.3.2 Hệ thống arginin deiminase (ADS) 19

1.3 Giới thiệu về cây măng cụt 20

1.3.1 Đặc điểm sinh học 20

1.3.2 Các chất xathone trong măng cụt 20 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 6

1.3.3 Sinh tổng hợp các chất xanthone 21

1.3.4 Tác dụng sinh học của các chất xanthone trong cây măng cụt 23

1.3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn 23

1.3.4.2 Hoạt tính kháng nấm 23

1.3.4.3 Tác dụng chống oxi hóa 23

1.3.4.4 Tác dụng chống viêm (anti-inflamation) 24

1.3.4.5 Hoạt tính chống ung thư 24

Chương 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25

2.1 Chủng vi sinh vật và các điều kiện nuôi cấy 26

2.2 Nguyên liệu thực vật 26

2.3 Hóa chất và thiết bị 26

2.4 Phương pháp nghiên cứu 27

2.4.1 Các phương pháp nghiên cứu tế bào 27

2.4.1.1 Chuẩn bị dịch tế bào 27

2.4.1.2 Đo mức độ sinh acid của tế bào (pH drop) 27

2.4.2 Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme 28

2.4.2.1 Chuẩn bị tế bào thấm 28

2.4.2.2 Xác định hoạt độ enzyme phosphoryl hóa đường (PTS) 28

2.4.2.3 Xác định hoạt độ enzyme F – ATPase 29

2.4.2.4 Xác định hoạt độ enzyme glucosyltransferase (GTF) 29

2.4.3 Các phương pháp nghiên cứu về biofilm 30

2.4.3.1 Tạo biofilm 30

2.4.3.2 Xác đi ̣nh thành phần biofilm 31

2.4.3.3 Quan sát cấu trúc biofilm dưới kính hiển vi huỳnh quang quét lase 31

2.5 Đa ́ nh giá sự tích lũy của α-mangostin trên biofilm 32

2.6 Tinh sạch hoạt chất khoáng khuẩn S mutans từ vỏ quả măng cụt 32

2.6.1 Tách các hợp chất polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 32 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 7

2.6.2 Phân tích cấu trúc hóa học bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 33

2.7 Xử lý số liệu 33

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Nghiên cứu quy trình chiết xuất α-mangostin từ vỏ quả măng cụt 34

3.1.1 Tách chiết phân đoạn có chứa -mangostin từ vỏ quả măng cụt 34

3.1.2 Tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt 36

3.1.2.1 Lư ̣a chọn hê ̣ dung môi thích hợp để chạy cột sắc ký silica gel 36

3.1.2.2 Tinh sạch -mangostin trên cột sắc ký silica gel sử dụng hệ dung môi n-hexane: acetone (3:1) 37

3.2 Đánh giá tác dụng kháng khuẩn của α-mangostin lên S mutans trên biofilm 44

3.2.1 -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S mutans trên biofilm… 44

3.2.1.1 Ức chế sự giảm pH của môi trường 44

3.2.1.2 -mangostin ức chế hoạt tính enzyme liên quan đến quá trình sinh và chống chịu acid F-ATPase và PTS 45

3.2.2 Đánh giá tác dụng ức chế sự hình thành biofilm của vi khuẩn S mutans 48

3.2.2.1 -mangostin ức chế sự sinhtổng hợp EPS ngoại bào 48

3.2.2.2 -mangostin làm thay đổi cấu trúc biofilm của S mutans 49

3.2.2.3 -mangostin ức chế hoạt tính các enzyme GTF liên quan đ ến sự hình thành biofilm của vi khuẩn S mutans 51

3.3 Khả năng giết vi khuẩn trên biofilm của α-mangostin 52

3.4 Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm 53

3.4.1 Bướ c đầu đánh giá tác dụng chống sâu răng của dung dịch nước súc miệng có chứa α-mangostin 54

3.4.1.1 Khả năng ức chế sự sinh acid 54

3.4.1.2 Khả năng ức chế sư ̣ hình thành biofilm (mảng bám răng) 55

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

Trang 8

PHỤ LỤC 67

Trang 9

DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Trang

Bảng 1 Công thức hóa học một số xanthone có trong vỏ quả măng cụt 21

Bảng 2.Độ sạch của chế phẩm α-mangostin so với chất chuẩn 40

Bảng 3 Độ sống sót của S mutans trên biofilm được xử lý với -mangostin53

Bảng 4 Khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm của vi khuẩn S

mutans53

Bảng 5 Khả năng ức chế sự sinh a cid của S mutans trên biofilm của các dung

dịch nước súc miệng 55

Bảng 6 Ảnh hưởng của NSM chứa α-mangostin lên sự tích lũy sinh khối

biofilm của vi khuẩn S mutans56

Trang 10

DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN

Trang

Hình 1.2 Ba giai đoạn chính hình thành mảng bám răng 6

Hình 1.4 Quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) 20 Hình 1.5 Quá trình hình thành xanthone trong thực vật 22

Hình 2.1 Mô hình ta ̣o biofilm S mutans trên bề mă ̣t đĩa hydroxyapatite 31

Hình 3.1 Sắc ký đồ phân đoạn chiết vỏ quả măng cụt trong ethanol và n-hexane

sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng 36 Hình 3.2 Sắc ký đồ phân đoạn n-hexane sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng

37 Hình 3.3 Sắc ký cột silica gel phân đoạn chiết n-hexane của vỏ quả măng cụt với hệ dung môi rửa chiết n-hexane: acetone theo tỉ lệ (3:1) 38

Hình 3.4.A Sắc ký đồ α-mangostin tinh sa ̣ch từ v ỏ quả măng cụt với hệ dung

Hình 3.4.B Sắc ký đồ α-mangostin tinh sa ̣ch từ vỏ quả măng cụt với hệ dung

Hình 3.7 Cấu trúc hóa học của -mangostin (C24H26O6) 43

Hình 3.8 Sơ đồ qui trình tinh sạch -mangostin từ vỏ quả măng cụt 43 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 11

Hình 3.9 -mangostin ức chế sự sinh acid của vi khuẩn S mutanstrên bioflm

45

Hình 3.10 Ảnh hưởng của -mangostin lên hoạt độ F-ATPase và PTS củaS

Hình 3.11 Ảnh hưởng của -mangostin lên sinh khối biofilm củ a vi khuẩn S

Trang 12

1

MỞ ĐẦU

Sâu răng là một trong những bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và đang có xu hướng ngày một tăng lên ở các nước đang phát triển Tổ chức Y tế thế giới đã c ảnh báo về mức độ phổ bi ến của bê ̣nh này ch ỉ sau các bệnh tim mạch và ung thư [5] Theo số liệu mới nhất (2015) của Hội Răng Hàm Mặt Việt Nam, thực tế có tớ i hơn 90% dân số Việt Nam đang đối mặt với các vấn đề về răng miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng dẫn đến mất răng [59], [60] Đây

là tỷ lệ thuộc hàng cao nhất thế giới Ngay cả ở những nước phát triển như Hoa

Kỳ, tỷ lệ sâu răng hiện nay vẫn còn tới 84% ở lứa tuổi thanh niên Đi kèm với sâu răng là các bệnh về răng miệng Trong những năm qua, chi phí cho việc chăm sóc, sửa chữa răng ta ̣i Viê ̣t Nam đã lên t ới nhiều tỷ đồng Bệnh sâu răng là

do vi khuẩn trên mảng bám răng gây ra Những vi khuẩn trên mảng bám răng sử dụng carbonhydrate để lên men t ạo acid, trong đó chủ yếu là lactic Môi trường acid sẽ phá v ỡ sự cân b ằng của hệ vi khuẩn đường miệng, tạo điều kiện thích hợp cho những vi khuẩn có khả năng chịu được pH thấp tiếp tục sinh acid Khi lượng acid đủ lớn sẽ hòa tan các chất khoáng có trong men răng dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành các hố trên răng và gây ra sâu răng [38]

Sử dụng chất kháng khuẩn trong các sản phẩm vệ sinh răng miệng là một trong những biện pháp phòng chống sâu răng có hiệu quả nhất hiện nay Trong

số các chất kháng khuẩn đã được sử dụng vào mục đích này, fluor là chất có tiềm năng hơn cả Đây là chất có cơ chế tác động hai mặt Một mặt chất này có tác dụng kháng vi khuẩn sâu răng mạnh, mặt khác nó lại có vai trò giúp tái tạo lại men răng và vì vậy có tác dụng làm bền răng Chính vì thế, fluor vẫn được sử dụng rộng rãi và cho đến nay chưa có một chất kháng khuẩn nào có thể thay thế được [43]

Trang 13

2

Tuy nhiên, việc xuất hiện hiện tượng bệnh nhiễm fluor (fluorosis) do sử dụng lâu dài các sản phẩm vệ sinh răng miệng có chứa fluor đã khiến cho các nhà nghiên cứu và các công ty sản xuất các sản phẩm vệ sinh răng miệng phải tìm kiếm thêm những hợp chất mới để có thể thay thế fluor hay kết hợp với fluor, nhưng ở nồng độ thấp hơn mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao Hàng loạt các chất kháng khuẩn mới bao gồm những chất tổng hợp và tự nhiên như các acid yếu, dẫn xuất của các acid béo, triclosan, muối kim loại và cả những chất có nguồn gốc từ thực vật đã được nghiên cứu và thử nghiệm Việc tìm kiếm

và sử dụng những chất kháng khuẩn tự nhiên, đặc biệt là các chất có nguồn gốc thực vật (phytochemicals) đang rất được quan tâm Hướng nghiên cứu này còn được gọi là cuộc cách mạng xanh trong y học (green medicine) [9], [19], [43] Trong lĩnh vực bảo vệ răng miệng, đây cũng là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng do tính hiê ̣u quả và an toàn cao của các chất này

Những kết quả điều tra trước đây của chúng tôi cho thấy vỏ quả măng cụt

(Garcinia mangostanaL.) có chứa một số polyphenol thuộc nhóm chất xanthone, trong đó có α-mangostin, có khả năng ức chế sự sinh trưởng, sự sinh acid, sự hô hấp và diệt vi khuẩn gây sâu răng S mutans mạnh Ngoài ra, vỏ quả

măng cụt cũng là nguồn nguyên liê ̣u khá phong phú và rẻ tiền để tách chiết các

chất xanthone vì th ế, Garcinia mangostanaL sẽ là đối tượng tiềm năng để tinh

sạch, nghiên cứu và ứng dụng các chất kháng vi khuẩn sâu răng mới (anticaries agents).Vớ i mong muốn có mô ̣t nghiên cứu đầy đủ về cơ chế tác dụng kháng vi khuẩn sâu răng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt và ứng dụng chúng trong viê ̣c sản xuất mô ̣t loa ̣i sản phẩm vê ̣ sinh răng miê ̣ng mới , chúng tôi tiến hành

thực hiê ̣n đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn Streptococcu s mutans trên biofilm va ̀

đi ̣nh hướng ứng dụng ” nhằm mục đích đưa ra được qui trình tách chiết

α-mangostin hiê ̣u quả , đơn giản đồng thời kh ẳng định được tác dụng kháng khuẩn luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 14

3

sâu răng của chất này trênđối tượng vi khuẩnS mutans trên biofilmvà bước đầu

tạo được chế phẩm nước súc miệng mới có tác dụng phòng ch ống bệnh sâu răng

Đề tài khoá luận tập trung nghiên cứu các nội dung chính sau:

i Xây dựng qui trình tách chiết α-mangostinđơn giản, đạt hiệu suất cao

ii Nghiên cứu tác dụng của α-mangostinlên vi khuẩn S mutans trên biofilm

thông qua việc nghiên cứu ảnh hưởng của chất này lênquá trì nh sinh acid

và tạo biofilm c ủa vi khuẩn cũng như các enzyme liên quan đến các quá trình này

iii Nghiên cứu khả năng tích lũy của α-mangostin trên biofilm

iv Tạo dung dịch nước súc miệng có chứa xanthone cùng một số chất hoạt động khác và đánh giá khả năng chống sâu răng của chế phẩm thu được trên mô hình biofilm nhân tạo cóso sánh tác dụng với chế phẩm nước súc miệng thương mại thông qua các chỉ tiêu: i) Ảnh hưởng của chúng lên quá trình sinh acid của vi khuẩn; ii) Khả năng hạn chế sự tạo mảng bám răng (dental plaque)

Trang 15

4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh sâu răng và vi khuẩn Streptococus mutans

1.1.1 Bệnh học sâu răng

Bệnhsâu răng thực chất là sự tiêu hủy cấu trúc vôi hóa hữu cơ (tinh thể canxi) của men răng và ngà răng, tạo nên lỗ hổng trên bề mặt răng, do vi khuẩn gây ra Ban đầu chỉ là sự tạo thành các lỗ trên bề mặt răng, giai đoạn này không gây ra triệu chứng, có thể kéo dài vài tháng thậm chí vài năm Nếu không phát hiện và điều trị kịp thời thì “sâu răng” sẽ ăn sâu vào tủy, phá hủy tủy, gây chết tủy Từ bệnh sâu răng và viên tủy có thể phát sinh ra các biến chứng như viên quanh cuống răng, rụng răng, viêm xương, viêm hạch v.v nhiều trường hợp gây ra tử vong

Hình 1.1 Cấu trúc của răng

1.1.1.1 Nguyên nhân gây sâu răng

Thương tổn sâu răng là kết quả của sự phân huỷ khoáng (mineral dissolution) ở tổ chức cứng của răng [4],[6] Sâu răng xảy ra do nhiều nguyên nhân nhưng có 3 yếu tố chủ yếu cùng tác động để gây sâu răng:

Trang 16

5

 Vi khuẩn trong hốc miệng

 Chất bột, đường, dính vào răng bị lên men do vi khuẩn tạo thành acid

 Acid phá huỷ men răng, tạo điều kiện để hình thành lỗ sâu răng [2]

1.1.1.2 Mảng bám răng (dental plaque)

Mảng bám răng, được xem là mô ̣t biofilm sinh ho ̣c điển hình , chính là một quần thể các vi sinh vật đa dạng về chủng loại tồn tại trên bề mặt răng [27],[43] Đó là một lưới polymer sinh học chứa các vi sinh vật và nước bọt Thuật ngữ biofilm mô tả quần thể các vi sinh vật bám vào bề mặt giá thể Sử dụng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử trong đó có kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đã phát hiện tới hơn 500 loài vi khuẩn khác nhau

có mặt trong mảng bám răng [22] Nhìn chung biofilm có các tính chất sau:

i Bảo vệ cơ thể vi sinh vật khỏi hệ thống phòng thủ của chính vật chủ hay của vi sinh vật kẻ thù

ii Chống lại sự mất nước

iii Chống lại các chất kháng khuẩn thông qua việc tạo kiểu hình mới có tốc

độ sinh trưởng giảm, hạn chế sự tiếp xúc và có khả năng bất hoạt hay trung hoà các chất kháng khuẩn

iv Nồng độ các chất dinh dưỡng trong biofilm tăng cao hơn so với môi

trường xung quanh

Chính vì những đặc điểm này mà các vi sinh vật sống trên biofilm thường

có khả năng chống chịu cao với các chất kháng khuẩn so với các tế bào sống tự

do trong môi trường nuôi cấy (độ chống chịu có thể cao hơn tới khoảng 1000

lần) [57] Sự hình thành biofilm bao gồm ba giai đoạn chính Giai đoạn mở đầu:

vi khuẩn bắt đầu bám vào bề mặt răng Các mối tương tác đặc hiệu và không đặc hiệu giữa bề mặt răng và tế bào xuất hiện dẫn đến sự tạo liên kết và sự xâm

chiếm dần dần Giai đoạn bùng nổtăng trưởng: hình thành biofilm đồng thời với

sự sinh tổng hợp polymer ngoại bào Giai đoạn mất đi các tế bào trên mảng bám

Trang 17

6

răngvào nước bọt: thúc đẩy sự xâm nhập của các cơ thể vi sinh vật mới vào các

vị trí vừa được giải phóng trên mảng bám răng [43]

A Vi khuẩn được vận

chuyển đến bề mặt của răng

và bám vào răng nhờ các lực tĩnh điện yếu

B.Các liên kết không thuận

nghịch hình thành do mối tương tác phân tử hoá lập thể giữa tế bào vi khuẩn và các receptor trên bề mặt răng

C.Sự đồng gắn kết của các cơ

thể vi khuẩn vào các tế bào đã định cư trước Sự bùng nổ tăng trưởng để hình thành biofilm đồng thời với sự sinh tổng hợp polymer ngoại bào

Hình 1.2 Ba giai đoạn chính hình thành mảng bám răng [43]

1.1.1.3 Cơ chế gây sâu răng

Bệnh sâu răng được khởi đầu bằng sự hình thành mảng bám răng (dental plaque) Hydrat cacbon trong thức ăn được chuyển hoá thành glucose Glucose sau đó được polymer hoá thành dextran bởi enzyme dextranase và glucosyltransferase Dextran có tính dính bám nên tạo điều kiện để các vi khuẩn khác và các mảnh thức ăn bám thêm vào Sự dính bám còn được gia tăng bởi những protein trên bề mặt vi khuẩn đang sinh sống tại đó và các polysaccharide

do chúng chuyển hoá tạo ra như là các glucan [38],[43] Việc hình thành nhiều lớp vi khuẩn cộng với thức ăn còn tạo ra môi trường cho cả các vi khuẩn kỵ khí sinh sống Quá trình tiêu thụ đường thông qua con đường glycolysis với sự sinh acid bởi vi khuẩn làm cho pH trong mảng bám rănggiảm xuống thấp, thậm chí luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 18

1.1.1.4.Vi khuẩn Streptococcus mutans

Streptococcus là các vi khuẩn Gram (+), gồm một lượng lớn các loài,

phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Một số là các nhân tố gây ra những bệnh nguy hiểm như viêm phổi (pneumonia), sốt phát ban (scarlet fever), viêm màng não (meningitis)… Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN mã hoá cho ARN

ribosome 16S, sơ đồ phả hệ của streptococci đã được xây dựng [43] Trong sơ

đồ đó, ngoài thành viên của hai nhóm Pyrogenic và Bovis cùng với

Streptococcus pneumoniae (nhóm mitis),Streptococcus thermophilus (nhóm salivarius),Streptococcus suis,Streptococcus acidominimus, là các streptococci không sinh sống trong miệng động vật, còn lại đều là streptococci xoang miệng (oral streptococci) Ở xoang miệng của người chỉ thấy hai thành viên của nhóm mutans là Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus [43]

Streptococcus mutans lần đầu tiên được Clark mô tả năm 1924 sau khi

phân lập được nó từ vùng răng bị tổn thương Tuy vậy phải đến thập niên 60, khi các nhà khoa học tập trung nghiên cứu bệnh sâu răng từ giai đoạn sớm, vi khuẩn này mới được chú ý đến nhiều Cũng từ đó, rất nhiều dòng mang những đặc tính hoá sinh tương tự nhau nhưng hoàn toàn phân biệt bởi chỉ thị kháng nguyên đã được phân lập Tổng cộng có 7 kiểu chỉ thị kháng nguyên đã được mô tả là a, b,

c, d, e, và f[43] Những nghiên cứu về sau trên protein, cấu trúc màng, ADN luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 19

8

tổng số cũng khẳng định có rất nhiều các biến thể ở những vi khuẩn vốn vẫn

được coi là S mutans Dựa trên tất cả các nghiên cứu, S mutans được chia nhỏ

thành rất nhiều dưới loài riêng biệt Từ đó, đã ra đời cụm từ "mutans

streptococci" và tên gọi S mutans không còn thực sự chính xác về mặt phân

loại, tuy nhiên, nó vẫn còn được dùng như một thói quen để gọi tên dòng

Streptococcus xoang miệng phổ biến nhất ở người [43]

Hình 1.3 Vi khuẩn Streptococcus mutans

S mutans được phát hiện ở tất cả các mảng bám răng và có tỉ lệ rất cao ở

những vùng răng sâu Các nghiên cứu khác nhau [38], [43] cũng đã chỉ ra đây

chính là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến bệnh sâu răng Sở dĩ như vậy là vì S mutans có những đặc điểm đặc biệt, đó là: i) có khả năng chuyển hoá được

nhiều loại hydrat cacbon khác nhau, ii) chuyển hoá đường bằng con đường lên men sinh ra rất nhiều acid lactic, iii) chống chịu được pH rất thấp của môi trường, iv) có khả năng sinh polysaccharide ngoại bào (EPS) mạnh.Do vậy, vi khuẩn này thường được sử dụng như là đối tượng điển hình cho các nghiên cứu

về sâu răng

Trang 20

9

1.1.2 Tình hình bệnh sâu răng trên thế giới và Việt Nam

Từ những năm 1940 cho đến những năm 1960, tình hình sâu răng ở các nước công nghiệp hoá rất nghiêm trọng Trung bình mỗi trẻ em 12 tuổi có tới 8-

10 răng sâu hoặc răng đã bị mất do sâu Chỉ số DMFT ( Decayed Mising, Filling Teeths, phản ánh số răng sâu, số răng mất do sâu hoặc số răng đã trám) ở tuổi 12 của Na Uy năm 1940 cao tới mức 12,0 [2] Tới những năm 1980, chỉ số DMFT

ở tuổi 12 của các nước công nghiệp đã giảm xuống đáng kể (nằm trong khoảng

từ 2-4) và chỉ còn từ 1 - 2 vào năm 1993 Tuy vậy, tại thời điểm 1997, chỉ số DMFT ở lứa tuổi trung niên (35 – 44 tuổi) tại các nước công nghiệp phát triển vẫn còn ở mức rất cao Ví dụ như Canada, Nhật Bản, Úc và Bắc Âu là 13,9, Hoa

Kỳ là 9,0 - 13,9 Theo những thông báo gần đây, tình trạng sâu răng tuổi thanh niên của Hoa Kỳ vẫn còn ở mức cao Cụ thể là 84% thanh niên lứa tuổi 17 có răng sâu và trung bình mỗi người có 11 mặt răng bị phá huỷ do sâu Người từ 40 tuổi trở lên có trung bình 30 mặt răng bị sâu và 41% người từ 65 tuổi trở lên không còn răng

Ở các nước đang phát triển như Thailand, Uganda, Zaire chỉ số DMFT tuổi 12 cuối những năm 1960 chỉ từ 1,0 đến 3,0, nhưng lại tăng lên mức 3,0 - 5,0

và thậm chí cao hơn vào những năm 1970-1980 Nhìn chung, tình trạng sâu răng

có xu hướng tăng lên ở các nước này Tới 1997, chỉ số DMFT ở lứa tuổi 12 lớn hơn 4,4 còn gặp ở nhiều nước như Ba Lan (châu Âu), Philipin (châu Á), và Trung Mỹ Còn ở lứa tuổi trung niên, mức độ sâu răng cũng rất cao, trung bình mỗi người có trên 13,9 răng sâu [5]

Ở Việt Nam, các kết quả điều tra răng miệng năm 1991 của Võ Thế Quang cho thấy sâu răng ở Việt Nam tăng dần theo tuổi, cả về tỉ lệ sâu răng và chỉ số DMFT Trần Văn Trường và cs [5] công bố tỉ lệ sâu răng ở Việt Nam sau điều tra sức khoẻ răng miệng toàn quốc lần thứ 2 năm 2001 là 84,9% ở lứa tuổi

6 - 7; 56,6% ở lứa tuổi 12 và 67,6% ở lứa tuổi 15 Ở người lớn, tỉ lệ này là luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 21

10

75,2% ở lứa tuổi 18 - 34 và 89,7% ở lứa tuổi trên 45 Kèm theo đó, tỉ lệ bệnh viêm quanh răng cũng rất cao ở cả trẻ em và người lớn Tỉ lệ người có răng khoẻ mạnh chỉ đạt mức dưới 10% Theo số liệu mới nhất (2015) của Hội Răng Hàm Mặt Việt Nam, thực tế có tớ i hơn 90% dân số Việt Nam đang đối mặt với các vấn đề về răng miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng dẫn đến mất răng [59], [60]

Đứng trước tình hình đó, ngay từ năm 1908, liên đoàn Nha khoa Quốc tế (FDI) đã rất quan tâm đến vấn đề dự phòng sâu răng, tuyên bố ủng hộ nguyên tắc phòng bệnh hơn chữa bệnh, và từ đó liên tục nghiên cứu, tìm kiếm các biện pháp phòng bệnh sâu răng Các khuyến cáo về dự phòng sâu răng luôn được đưa

ra nhằm duy trì thành tựu ở các nước công nghiệp phát triển và ngăn chặn gia tăng bệnh răng miệng ở các nước đang phát triển WHO đã đưa ra mục tiêu cho toàn cầu năm 2010 là chỉ số DMFT phải dưới1 Tại Việt Nam, mục tiêu phấn đấu đến năm 2010 ở độ tuổi 5-6 có 50% trẻ em không bị sâu răng, ở độ tuổi 18

có 85% người giữ được toàn bộ răng, ở tuổi từ 35-44 tuổi giảm 50% số người không còn răng và trên 65 tuổi giảm 25% số người không còn răng

1.1.3 Các biện pháp ngăn ngừa sâu răng

Việc loại bỏ bằng cơ học có thể ngăn chặn hoàn toàn sự tạo mảng bám răng [43].Điều này sẽ có hiệu quả hơn nếu kết hợp với việc giảm bớt thói quen

ăn các sản phẩm có đường Tuy vậy, việc thay đổi thói quen ăn uống và duy trì

vệ sinh răng miệng tốt rất khó thực hiện Vì vậy hàng loạt các biện pháp khác nhau nhằm ngăn chặn sâu răng đã được nghiên cứu và ứng dụng

1.1.3.1 Sử dụng chất kháng khuẩn

Việc sử dụng chất kháng khuẩn để kiểm soát mảng bám răng đã được thực hiện trong nhiều năm qua, chủ yếu là những chất chống tạo mảng bám Sử dụng nước súc miệng là cách rất có hiệu quả để đưa các chất kháng khuẩn như là các bisbiguanides, enzyme, muối kim loại, tinh dầu tiếp xúc với các vi khuẩn luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 22

11

trong mảng bám răng [43] Khi hấp phụ vào mảng bám răng, các chất này sẽ xâm nhập dần vào bên trong mảng bám, ức chế sự phát triển hoặc quá trình trao đổi chất của vi khuẩn, làm giảm sự gắn kết của vi khuẩn với bề mặt răng vì vậy ngăn ngừa sự tạo mảng bám, hạn chế quá trình tích tụ hay liên kết bắc cầu vì vậy ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn Các đặc tính quan trọng nhất của chất kháng khuẩn là ngăn ngừa sự gắn kết, sự xâm nhiễm của vi khuẩn và tác động đến quá trình trao đổi chất của chúng Các chất kháng khuẩn thường không tác động lớn đến các quá trình sinh học, không làm tổn thương lớp màng nhày ở miệng và ít độc Vì thế, có thể nói sử dụng chất kháng khuẩn là biện pháp hữu hiệu nhất hiện nay để kiểm soát sâu răng Scheie [53] đã phân loại 6 nhóm chất kháng khuẩn chính là:

1 Cation : các ion tích điện dương có khả năng làm thay đổi chức năng của

màng, sự gắn kết và sử dụng glucose của vi khuẩn

2 Anion : các ion tích điện âm có khả năng làm thay đổi chức năng của

màng tế bào hay quá trình trao đổi chất trong quá trình đường phân và sử dụng glucose

3 Các tác nhân không phải ion: các ion không tích điện có khả năng ức

chế các enzyme trên màng tế bào, dẫn đến làm giảm sử dụng glucose

4 Enzyme: một số enzyme có khả năng ngăn chặn sự gắn kết của vi khuẩn

hay làm tăng hoạt tính lysozyme

5 Các đường đa (polyol): có khả năng làm thay đổi quá trình đường phân

hoá của vi khuẩn

6 Các chất khác: bao gồm các dịch chiết thực vật, các tác nhân tạo phức

càng cua, các acid béo, các tác nhân gây tổn thương oxi hoá damaging agents) Cơ chế tác động của các chất này rất phức tạp và vẫn còn đang được nghiên cứu

(oxidative-luan van tot nghiep download (oxidative-luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 23

12

1.1.3.2 Sử dụng chất thay thế đường

Do thói quen sử dụng đường trong cuộc sống hàng ngày nên vi khuẩn trên mảng bám răng có điều kiện lên men, sinh acid và kết quả là làm mòn men răng, gây sâu răng Vì vậy, người ta đã nghĩ đến việc sử dụng những chất làm ngọt mà

vi khuẩn không thể tiêu thụ được để thay thế đường Những chất này không gây

ra sự sinh acid nên không gây sâu răng

Các loại đường nhân tạo này có khả năng kháng khuẩn nhất định thông qua việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn Các đường như manitol, sorbitol không ngọt như sucrose nên được dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm Các đường này không bị vi khuẩn tiêu thụ Tuy nhiên, việc sử dụng thường xuyên các loại đường này sẽ dẫn đến sự hình thành các chủng vi khuẩn có khả

năng đồng hoá chúng, đặc biệt là các loài S mutans Cơ chế tác động của xylitol lên vi khuẩn S mutans cũng đã được tìm hiểu Khi xylitol đi vào tế bào S mutans sẽ can thiệp vào quá trình lên men đường của vi khuẩn bằng cáchtiêu thụ

dụng các chất thay thế đường có tác dụng khá hiệu quả vì chúng làm mất đi hay

hạn chế tối đa cơ hội phát triển của các vi khuẩn có khả năng sinh và chịu acid

1.1.3.3 Liệu pháp thay thế (replacement therapy)

Việc sử dụng các vi khuẩn đối kháng để kiểm soát sâu răng đã được sử dụng từ nhiều năm nay [43].Lợi ích của liệu pháp này là có tác dụng bảo vệ răng lâu dài và ít tốn kém Tuy nhiên, liệu pháp này chưa được thử nghiệm nhiều ở người vì tính an toàn của các chủng vi khuẩn đối với người sử dụng chưa được nghiên cứu kỹ Liệu pháp này có hai hướng chính là :

i Hướng tiền nhiễm: Cấy vào mảng bám răng những vi khuẩn có lợi hay

không gây hại trước khi các chủng không mong muốn xâm nhập và định luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 24

13

cư trên mảng bám Những vi khuẩn tiền nhiễm sẽ loại bỏ những tác nhân

gây bệnh không mong muốn Các chủng đột biến của streptococci đã bị

làm mất khả năng tạo glucosyltransferase (GTF), hoặc polysaccharide nội bào, hoặc không có lactate dehydrogenase là những đối tượng thường được sử dụng trong liệu pháp này

ii Hướng thay thế các cơ thể tiền nhiễm có mặt trong mảng bám răng:

Cách này có ưu điểm là không phải xử lý loại bỏ những chủng không

mong muốn trước khi gây nhiễm mới Ví dụ, S salivarius thay thế cho S mutans trên mảng bám răng của chuột đã làm giảm tỉ lệ sâu răng vì nó

thay thế chủng S mutans có khả năng sinh acid mạnh

1.1.3.4 Vacxin

Các nghiên cứu cho thấy có thể tạo được các đáp ứng miễn dịch chống lại

vi khuẩn sâu răng Vì các đột biến của streptococci là tác nhân chính gây sâu

răng nên người ta nghĩ đến khả năng tạo ra các vacxin bằng việc sử dụng chính các vi khuẩn này (vacxin) hay các phân tử của các vi khuẩn này (sub-unit vacxin) để gây miễn dịch [43] Trên thực tế, hướng nghiên cứu này đã xuất hiện

ở Anh từ hơn 20 năm trước đây Mặc dù đã thu được một số kết quả khả quan

như làm giảm mật độ tế bào streptococci, giảm tỉ lệ sâu răng, nhưng lại xuất

hiện các phản ứng phụ cũng như xuất hiện các tổn thương mô

Các nhà nghiên cứu Mỹ lại sử dụng S sobrinus trên mảng bám răng chuột

để tạo vacxin Các vacxin sản xuất theo hướng này nhằm mục đích chống lại enzyme glucosyltransferase, nhờ đó làm giảm khả năng tạo mảng bám răng Hướng nghiên cứu này tỏ ra rất có hiệu quả ở chuột nhưng lại không có hiệu quả

ở các loài linh trưởng Vì vậy người ta nghi ngờ khả năng ứng dụng của nó cho người

1.1.3.5 Kiểm soa ́ t sự hình thành biofilm

S mutans được xác định là tác nhân gây sâu răng chính tồn tại trên mảng

bám răng với 2 đặc tính gây bệnh quan trọng là: i) khả năng sinh acid cao; và ii)

Trang 25

14

khả năng sinh biofilm mạnh do nó có khả năng sản xuất các EPS, bộ khung

chính của biofilm [38] Trong đó, khả năng sinh EPS của S mutans gần đây

được xem là nhân tố gây bệnh quan trọng cần được quan tâm nghiên cứu [36], [37] Như vậy, có thể nói rằng kiểm soát sâu răng là kiểm soát các đặc tính gây bệnh của vi khuẩn , hay nói một cách khác là tìm kiếm các chất kháng khuẩn có khả năng ức chế sự sinh acid (anti-acidogeneic agents) và ức chế sự tạo biofilm (anti-biofilm agents) của vi khuẩn

Các nghiên cứu hiện nay tập trung nhiều vào việc làm giảm khả năng biểu

hiện của các yếu tố gây bệnh của S mutans mà không nhất thiết phải diệt vi

khuẩn đích này Làm mất khả năng gây bệnh của vi khuẩn nhưng không đe dọa

sự tồn tại của chúng có thể sẽ làm giảm khả năng kháng thuốc và tránh được sự xáo trộn lớn trong quần thể vi khuẩn cư ngụ Ví dụ, các chiến lược kiểm soát sự tạo biofilm thông qua việc ức chế sự hình thành EPS trên bề mặt có thể là biện pháp thay thế (hay kết hợp) hữu hiệu [37] Lý do là vì các EPS có thể đóng vai trò như là một chất hấp thụ phản ứng, vì vậy sẽ làm giảm sự xâm nhập của chất kháng khuẩn với các tế bào trên biofilm [54] Như vậy, các chất có khả năng làm giảm EPS có thể làm tăng tính hiệu quả của chất kháng khuẩn với các tế bào biofilm Nhìn chung, các chất kháng khuẩn mới nên có một hay nhiều đặc tính sau: (1) ức chế sự gắn kết của các glucosyltransferase (GTF) vào bề mặt film; (2) ức chế sự sinh tổng hợp các EPS trên bề mặt; (3) ảnh hưởng đến cấu trúc của lưới EPS; (4) ức chế sự dính kết và xâm chiếm của vi khuẩn; (5) làm mất khả năng sinh acid và các cơ chế thích nghi acid; (6) làm giảm khả năng sinh trưởng của các vi khuẩn gây bệnh xoang miệng; (7) làm thay đổi hệ sinh thái và hóa sinh của biofilm [21], [37]

Các chất kháng khuẩn tự nhiên, đặc biệt là các chất kháng khuẩn từ thực vật (phytochemicals) có thể là những chất thay thế an toàn và hiệu quả Thực vật

là nguồn cung cấp các chất kháng khuẩn sâu răng mới vì chúng rất giàu các chất thứ cấp và rất nhiều trong số chúng là những chất kháng khuẩn mạnh [1],[7], luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 26

15

[36], [41] Theo hướng nghiên cứu này, một số dịch chiết thực vật đã được phát hiện có hoạt tính chống sâu răng khá tốt, ví dụ như dịch chiết chè xanh, ca cao, chè ôlong, tỏi, licorice, cranberry Đi sâu nghiên cứu, Makimura và cs[41] cho thấy epicatechin galat và epigalocatechin galat của chè xanh có khả năng ức chế colagenease, do đó được xem là có thể có tác dụng làm giảm bệnh viêm quanh răng Đặc biệt, Hamada và cs[34] đã phát hiện thấy dịch chiết chè xanh ôlong

người Nhật thường dùng có tác dụng ức chế hoạt tính enzyme GTF của S mutans, enzyme có vai trò sản xuất các EPS, do vậy có khả năng ức chế sự hình

thành mảng bám răng Nghiên cứu của Koo và cs với một số chất polyphenol trong dịch chiết quả cranberry đã chứng minh chúng có tác dụng ức chế sự sinh

acid của S mutans [35] Kết quả này gợi ý rằng việc sử dụng các sản phẩm nước

ép quả cranberry hiện nay trên thị trường không chỉ mang lại lợi ích về dinh dưỡng mà còn góp phần nâng cao sức khoẻ răng miệng cho cộng đồng dân cư nói chung Công bố gần đây của Murata và cs[44] với chất 7-epiclusianone từ

thực vật Rheedia brasiliensis đã cho thấy chất này ức chế mạnh sự sinh acid của

vi khuẩn S mutans thông qua việc ức chế hai enzyme chịu trách nhiệm cho quá

trình sinh và chịu acid là F-ATPase và phosphotransferase system (PTS) cũng như ức chế các enzyme GTFB và GTFC, sản xuất các EPS không tan Nghiên

cứu trên mô hình in vivo của nhóm tác giả này cũng cho kết quả khả quan về tác

dụng ức chế sự tạo mảng bám, qua đó làm giảm tỷ lệ sâu răng trên chuột nghiên cứu của 7-epiclusianone

1.2 Một số cơ chế thích nghi acid của vi khuẩn xoang miệng

Các vi khuẩn trong mảng bám răng luôn phải đối mặt với các stress trong

đó có stress acid sinh ra khi vi khuẩn tiêu thụ đường Vậy các vi khuẩn đã sử dụng những cơ chế gì để chống chọi và thích nghi với điều kiện khắc nghiệt này?

Trang 27

16

1.2.1 Bơm proton F-ATPase

F-ATPase là enzyme liên kết màng, có vai trò vận chuyển proton tạo ra

sự cân bằng pH cho tế bào Enzyme này có chứa các tiểu đơn vị liên quan đến việc cung cấp ATP cho hệ thống bơm proton qua màng và trực tiếp tạo ra ATP thông qua quá trình hô hấp của tế bào Hệ thống bơm proton qua màng nhờ lực đẩy proton (proton-motive force) giúp thúc đẩy quá trình bơm proton từ tế bào chất ra ngoài, nhờ đó duy trì sự ổn định của pH nội bào (pHi) [16], [17], [18]

F-ATPase bao gồm 8 tiểu đơn vị, tồn tại như một tổ hợp protein liên kết với màng, có khả năng kết hợp giữa việc sản xuất ATP và vận chuyển proton [18] Tổ hợp F0 nằm trên màng tế bào có hoạt tính vận chuyển proton bao gồm các tiểu đơn vị a, c, b Các tổ hợp F1 liên kết với nhau theo kiểu vòng tròn bao gồm các tiểu đơn vị α, β, γ, δ và ε.F-ATPase có hoạt tính khi F1 được giải phóng khỏi màng, lúc này nó xúc tác cho quá trình vận chuyển proton kết hợp với sự sinh tổng hợp hay phân huỷ ATP Một điều thú vị là pH tối thích của các tiểu đơn vị F1 là giống nhau, chỉ khác nhau đáng kể ở phần liên kết với F0 [14]

Không giống các vi khuẩn đường ruột có pH nội sinh (pHi) ổn định,

streptococcus có pHi thay đổi theo môi trường bên ngoài và phụ thuộc vào ATPase để bơm proton ra khỏi tế bào [17] Sự khác nhau về khả năng chịu acid của các loài vi khuẩn sinh acid xoang miệng liên quan đến khả năng thấm proton Quivey và cs [49] đã chứng minh được khả năng thực hiện đường phân

F-và chống chịu acid của các chủng S mutans, S salivarius F-và S sanguis phụ

thuộc chủ yếu vào việc loại proton khỏi tế bào chất nhờ F-ATPase Các thí nghiệm với các chất kìm hãm ATPase như dicycloaxylcarbodiamide (DCCD) cho thấy sự giảm hoạt tính enzyme F-ATPase đã làm tăng tính thấm proton [54] Như vậy, dòng proton đi vào tế bào ở pH thấp bị loại trừ nhờ bơm proton phụ thuộc ATP nằm trên màng Giá trị pH mà tại đó khả năng thấm proton là thấp

nhất khác nhau ở các loài, ví dụ S mutans (pH 5,0); S salivarius (pH 6,0) và loài nhạy cảm acid S sanguis (pH 7,0), tương ứng với hoạt động của ATPase

Trang 28

17

cho các loài này là 6,0; 7,0; và 8,0 Điều này phản ánh tính chống chịu acid của các vi khuẩn này và cho thấy tầm quan trọng của F-ATPase trong việc chống lại stress ở pH thấp

Vi khuẩn Streptococcus không có chuỗi hô hấp nên không có khả năng sử

dụng phức hệ F1-F0 để tổng hợp ATP thông qua con đuờng phosphoryl hoá-oxy hóa [37] Do đó, vai trò duy nhất của phức hệ trong các vi khuẩn này là bơm H+

ra ngoài để thiết lập trạng thái cân bằng pH Tầm quan trọng của phức hệ F1-F0

đã được chứng minh bằng việc tạo ra các đột biến nhạy cảm acid ở pH 6,0 do bị thiếu hụt phức hợp này [37] Rõ ràng khả năng tạo ATP nhờ F-ATPase ở pH thấp có ý nghĩa cơ bản cho sự sống sót của vi khuẩn ở pH thấp cho đến khi pH môi trường tăng lên [28]

1.2.2 Sự thay đổi của màng tế bào vi khuẩn khi thích nghi acid

Các nghiên cứu về sinh lý của vi khuẩn xoang miệng đã chứng minh rằng màng tế bào đóng một vai trò quan trọng trong quá trình điều hoà acid-base [15],[22] Vai trò này bao gồm việc bơm proton ra khỏi tế bào và loại bỏ proton khỏi môi trường Nhờ vậy khi các vi khuẩn sản xuất nhiều acid hay ở trong môi trường acid thì pHi ở tế bào chất luôn cao hơn pH ở môi trường bên ngoài Sự chênh lệch pH qua màng là điều kiện sống còn cho hoạt động của các hệ thống nhạy cảm acid của tế bào như hệ thống đường phân

Các nghiên cứu của Bender và cs [18], Chang và Cronan [25] và sau đó

của Ma và cs [39] đều cho thấy tính thấm proton của màng tế bào streptococci

giảm đi khi tế bào thích nghi với điều kiện pH thấp Như vậy, trong quá trình thích nghi này, màng tế bào đã có những điều chỉnh nhằm đáp ứng lại những tác động bất lợi của stress acid Sự điều chỉnh này đã được Fozo và Quivey phát hiện khi nghiên cứu thành phần acid béo trên màng tế bào sinh trưởng trong điều

kiện pH thấp [48] Chủng S mutans sinh trưởng ở pH 5,0 có thành phần acid

béo bão hoà tăng lên và các chuỗi acid béo cũng dài hơn so với khi sinh trưởng

ở pH 7,0 Trái lại, chủng S mutans không thích nghi tốt với stress acid thì ít có

Trang 29

18

khả năng thay đổi thành phần màng tế bào Điều này gợi ý rằng việc tạo ra những acid béo mạch thẳng C14:0 và C16:0 cũng như sự giảm C18:0 liên quan đến sự thích nghi acid và có thể có vai trò làm tăng khả năng chống chịu với các chất diệt khuẩn cũng như ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn ở pH thấp

Các protein trên màng cũng góp phần vào việc duy trì tính ổn định của

màng tế bào ở pH thấp Đột biến S mutans AS17 nhạy cảm acid được tạo ra nhờ

đưa vào bộ gen vi khuẩn đoạn gen Tn917 Kiểu hình này nhạy cảm với acid là

do gen ffh (fifty-four homologue) bị thay đổi [33] Gen này mã hoá protein Ffh,

có trọng lượng phân tử 54 kDa và giống với tiểu phần nhận biết tín hiệu SRP (signal recognition particle) của sinh vật nhân chuẩn Protein này tham gia vào quá trình vận chuyển protein và sinh tổng hợp màng Chủng đột biến ffh bị giảm đáng kể khả năng sinh tổng hợp enzyme F-ATPase, không có khả năng lên men sorbitol và không thể sinh trưởng ở pH 5,0 [33] Kết quả này chứng tỏ các protein trên màng có vai trò bảo vệ tế bào ở điều kiện pH thấp

1.2.3 Sự sinh các chất kiềm

Một trong các cơ chế giúp vi khuẩn xoang miệng có thể sống sót trong điều kiện stress acid là khả năng sinh amoniac để trung hoà acid trong tế bào chất và môi trường bên ngoài [23] Ba con đường chính mà các vi khuẩn sử dụng để tạo amoniac là: urease, arginin deiminase (ADS) và agmatin deiminase (AgDS) NH3 được tạo ra thông qua các con đường này ngay lập tức kết hợp với các proton có trong tế bào chất hay được vận chuyển qua màng tế bào và kết hợp với các proton ở môi trường bên ngoài để hình thành NH4+, nhờ đó làm tăng pHinội bào hay pH của môi trường bên ngoài Điều này làm tăng tính chống chịu acid của vi khuẩn

1.2.3.1 Urease

Urease là enzyme có cấu trúc bậc 4 chứa Ni trong trung tâm hoạt động Enzyme này thủy phân ure thành 2 phân tử amoniac và một phân tử CO2 Ở nước bọt của người khoẻ mạnh, hàm lượng urease đạt từ 3 – 10 mM [34] luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 30

1.2.3.2 Hệ thống arginin deiminase (ADS)

Arginin deiminase được mã hoá bởi arc, nằm trong con đường đa enzyme xúc tác sự chuyển hoá arginin thành ornitin, amoniac, CO2 đồng thời tạo ra ATP Arginin deiminase phổ biến rộng rãi ở các vi khuẩn nhân sơ và cấu trúc bậc một của enzyme này cũng có tính bảo thủ cao [24], [29]

ADS được phát hiện ở nhiều vi khuẩn xoang miệng như S gordonii, S rattus, S sanguis và nhiều loài lactobacillus [12],[30], [31], [32] Các vi khuẩn

này có thể sử dụng Arg ở trạng thái tự do, trong các liên kết peptit hay trong protein của nước bọt [51] ADS có vai trò quan trọng trong chống chịu acid của các vi khuẩn, đặc biệt là những loài ít có khả năng chịu acid ADS có thể tạo

NH3 ở pH dưới ngưỡng cần cho sự phát triển hay cần thiết để tiến hành đường phân NH3 hình thành trong tế bào chất sẽ lập tức kết hợp với proton để tạo thành NH4

+

làm tăng pHi, vì vậy có tác dụng bảo vệ các cấu trúc nhạy cảm với acid trong tế bào chất [29] Chính điều này giúp các vi khuẩn có thể sống sót được trong mảng bám răng, nơi có nhiều chủng vi khuẩn khác có khả năng chịu

acid cao hơn Trong số các vi khuẩn xoang miệng có ADS thì S gordonii là một

trong số vi khuẩn có mặt phổ biến nhất, xuất hiện sớm trên mảng bám răng và là thành viên chủ yếu trong mảng bám quanh lợi ở người khoẻ mạnh Sự định cư luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 31

20

của nó có lẽ đã ngăn cản sự xâm chiếm của những loài vi khuẩn chịu acid gây sâu răng khác [30]

Mức độ cảm ứng của hệ thống ADS tăng lên ở pH acid đã phản ánh tầm

quan trọng của nó Ví dụ mức độ này tăng tới 48 lần ở S rattus, 1467 lần ở S sanguis và hơn 300 lần ở S gordonii Ở phần lớn vi khuẩn, ADS được cảm ứng

bởi arginine và bị kìm hãm bởi glucose [50]

1.3 Giới thiệu về cây măng cụt 1.3.1 Đặc điểm sinh học

Măng cụt có tên khoa học là Garcinia mangostana L.thuộc họ Clusiaceae (Guttiferae) Măng cụt là loại cây gỗ to, có thể cao tới 20 m, lá dày, màu lục

sẫm, hình thuôn dài 15-20 cm, rộng 7-10

cm Quả măng cụt hình cầu, to bằng quả cam trung bình, vỏ ngoài màu đỏ sẫm, dày, phía dưới có lá dài, phía đỉnh có đầu nhụy Trong quả có từ 6 đến 18 hạt, quanh hạt có áo hạt ăn được (hình 1.4 ) Măng cụt được trồng rộng rãi ở Nam Bộ Ở nhiều nước như Malaysia, Indonesia, Philipin và Campuchia, nước sắc vỏ quả măng cụt thường được dùng để chữa bệnh đi ngoài hay bệnh lỵ [8]

1.3.2 Các chất xathone trong măng cụt

Măng cụt có chứa nhiều chất hóa học khác nhau và thành phần của chúng thay đổi tùy theo từng bộ phận của cây Ví dụ, hàm lượng tannin ở vỏ cây là khoảng 9-13% nhưng ở vỏ quả chỉ khoảng 5,5% Các chất hóa học chính được tìm thấy trong đối tượng này là tannin, chất nhựa (resin), pectin và các dẫn xuất xanthone

Măng cụt là thực vật giàu các chất xanthone nhất được phát hiện cho đến nay Trong số hơn 200 dẫn xuất xanthone được phát hiện ở thực vật thì có đến

Hình 1.4 Quả măng cụt (Garcinia

mangostana L.)

Trang 32

21

hơn 60 dẫn xuất được tìm thấy ở măng cụt và tập trung nhiều ở phần vỏ quả Với những tính chất sinh học đặc biệt quý, các chất xanthone, đặc biệt là xanthone từ măng cụt đang được các nhà khoa học hết sức quan tâm Bảng 1 giới thiệu một số xanthone chính có trong vỏ quả măng cụt

Bảng 1 Công thức hóa học một số xanthone có trong vỏ quả măng cụt [47]

Trang 33

Hình 1.5 Quá trình hình thành xanthone trong thực vật [47]

Trang 34

23

tetrahydroxyxanthone từ 3-hydroxybenzoate và benzoate trong Centaurium

erythraea và Hypericum androsaemum được trình bày ở hình 1.5

1.3.4 Tác dụng sinh học của các chất xanthone trong cây măng cụt

Các chất xanthone trong cây măng cụt có nhiều đặc tính dược lý và các hoạt tính sinh học quý Chính vì thế, việc tìm thấy các xanthone trong măng cụt được coi là một trong những phát hiện lớn của y học Những hoạt tính sinh học chủ yếu đã được phát hiện bao gồm:

1.3.4.1 Hoạt tính kháng khuẩn

Các xanthone trong măng cụt có tác dụng diệt khuẩn mạnh Hàng loạt các nghiên cứu đã chỉ ra rằng xanthone của măng cụt trong đó có mangostin có khả

năng kháng nấm và ức chế sự phát triển của vi khuẩn Staphylococcus aureus

kháng methicilin ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) khoảng 0,3 – 1,2 µg/ml, thấp hơn nhiều so với giá trị MIC của chất kháng sinh vancomycin với vi khuẩn này (3,13 – 6,25 µg/ml) [47] Không những thế, α-mangostin của vỏ quả măng cụt còn có tác dụng ức chế hoạt tính enzyme HIV-1 protease với nồng độ ức chế 50% hoạt độ enzyme (IC50) là 5,1 µM

1.3.4.2 Hoạt tính kháng nấm

Mangostin của măng cụt có khả năng kháng được một số loài vi khuẩn

gây bệnh ngoài da như Trichophyton mentagrophytes, Microsporum gypseum và Epidermophyton floccosum ở nồng độ 1µg/ml, nhưng không có tác dụng trên nấm Candida albicans [7] Ngoài ra, một số xanthone tách từ vỏ măng cụt còn

có hoạt tính chống các loại nấm gây bệnh cho lúa mì và các cây nông nghiệp

như Fusarium oxysporum, Alternaria tenuis và Dreschlera oryzae

1.3.4.3 Tác dụng chống oxi hóa

Mangostin trong măng cụt được chứng minh là có khả năng chống oxi hóa, thậm chí còn mạnh hơn gấp nhiều lần so với các vitamin nhóm C và nhóm

E Các nghiên cứu in vitro của Williams và cs [58] và tiếp theo là của

Mahabusarakam và cs [40] đã cho thấy mangostin trong măng cụt có tác dụng luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 35

24

làm ức chế sự oxi hóa các lipoprotein có tỷ trọng thấp (low density lipoprotein – LDL) Chúng đóng vai trò như là các chất săn lùng gốc tự do để bảo vệ các LDL khỏi bị tổn thương oxi hóa, vì thế ngăn ngừa được hội chứng xơ vữa động mạch

và có tác dụng làm chậm sự lão hóa

1.3.4.4 Tác dụng chống viêm (anti-inflamation)

Nakatami và cs [45] đã chứng minh được γ-mangostin trong măng cụt là chất ức chế mạnh của COX (cyclooxgenase)-2 Enzyme COX-2 là tác nhân gây viêm trong cơ thể người Các enzyme này thường có mặt ở các bệnh nhân bị đau khớp hay bị viêm khớp Các tác giả đã phát hiện thấy chất này làm giảm rõ rệt

sự hình thành enzyme COX-2 Hội chứng viêm kinh niên là một trong những căn nguyên hàng đầu dẫn đến bệnh tiểu đường tuýp 2, các chất xanthone có thể giúp ngăn ngừa bệnh này thông qua việc làm giảm và điều hòa lượng đường trong máu, tăng sinh lực cho cơ thể người bệnh

1.3.4.5 Hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của các dẫn xuất xanthone trong măng cụt được đặc biệt quan tâm trong thời gian gần đây do chúng có khả năng ức chế sự phát triển của các dòng tế bào ung thư khác nhau Sato và cs [52] khi nghiên cứu tác dụng gây apoptosis của 8 dẫn xuất xanthone khác nhau trên tế bào ung thư ưa crôm (pheochromocytoma) ở chuột đã phát hiện thấy các dẫn xuất này đều có tác dụng gây ra hiện tượng apoptosis nhưng α-mangostin có tác dụng mạnh nhất Nhóm nghiên cứu của Ho [33] lại phát hiện thấy garcinone-E có hoạt tính diệt mạnh các tế bào ung thư người thuộc các dòng ung thư dạ dày, phổi và gan Đặc biệt, Matsumoto và cs [42] khi nghiên cứu tác dụng của 6 xanthone khác nhau từ

vỏ quả măng cụt lên sự phát triển của dòng tế bào ung thư bạch cầu HL-60 ở người đã thu được một kết quả hết sức thú vị là tất cả các dẫn xuất xanthone nghiên cứu đều có tác dụng ức chế, trong đó α-mangostin có hoạt tính ức chế hoàn toàn ở nồng độ 10µM thông qua con đường apoptosis

Trang 36

25

Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy rằng các dẫn xuất xanthone từ măng cụt có tác dụng ức chế có hiệu quả sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư người khác nhau và có thể nói các chất này có rất nhiều tiềm năng ứng dụng trong điều trị bệnh ung thư

Việt Nam là nước trồng măng cụt nhiều Đây chính là nguồn nguyên liệu phong phú để tinh sạch, nghiên cứu tác dụng sinh học và khả năng ứng dụng của các chất xanthone, đặc biệt là hoạt tính kháng biofilm Cơ chế sâu về tác dụng kháng biofilm của chất này cũng như tiềm năng ứng dụng của nó là vấn đề rất hấp dẫn, cần phải được làm sáng tỏ

Chương 2 : NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Trang 37

26

2.1 Chủng vi sinh vật và các điều kiện nuôi cấy

Chủng vi khuẩn Streptococcus mutans UA159 là quà tặng của GS Robert E Marquis, Khoa Vi sinh và Miễn dịch học, Trường Đại học Rochester, Hoa Kỳ Đây là chủng vi khuẩn có lý lịch rõ ràng, thường được các phòng thí nghiệm quốc tế sử dụng trong các nghiên cứu về sâu răng Chủng này được giữ

và cấy chuyển hàng tuần trên môi trường tryptic soy agar (TSA) của hãng Difco (Hoa Kỳ) Vi khuẩn được nuôi cấy ở 37oC trong môi trường chứa 3% tryptone, 0,5% dịch chiết nấm men và 1% glucose (TYG)

2.2 Nguyên liệu thực vật

Vỏ quả măng cụt được thu mua từ các chợ ở Hà Nội và được GS.TS

Phan Kế Lộc giúp định tên khoa học là Garcinia mangostanaL Nguyên liệu

được sấy khô trong tủ ấm ở 60o

C, nghiền thành bột mịn và sau đó được ngâm chiết trong ethanol 96% theo tỉ lệ 1 nguyên liệu : 3 thể tích dung môi Dịch chiết rút sau đó được cô chân không và sử dụng như nguyên liệu khởi đầu cho các bước tinh sạch tiếp theo

2.3 Hóa chấtvà thiết bị Hóa chất

- Các thành phần môi trường được sử dụng trong việc nuôi cấy vi sinh vật bao gồm tryptone, dịch chiết nấm men, cao thịt bò, peptone (Difco, Mỹ)

-Bản silica gel tráng sẵn 60 F254 25 , tấm nhôm (20 x 20 cm) của hãng Merk (Đức)

- Silica gel (Grade 7734, 63-200 μm 70-230 mesh)

- Các chất nhuộm huỳnh quang Alexa Fluor® 647-và SYTO®9 green đươ ̣c mua từ hãng Invitrogen (Mỹ)

- Các dung môi dùng trong sắc ký có độ sạch phân tích và có nguồn gốc từ Trung Quốc

Trang 38

- Máy soi bản gel sắc ký lớp mỏng

- Box cấy laminare

- Máy quay cất khô chân không

- Kính hi ển vi huỳnh quang quét laser

2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Các phương pháp nghiên cứu tế bào

2.4.1.1 Chuẩn bị dịch tế bào

Dung dịch tế bào được chuẩn bị trong dung dịch muối có chứa KCl 50

mM và MgCl2 1 mM pH 7,0 với mật độ khoảng 109 tế bào/ml Dịch tế bào được pha loãng trong dung dịch peptone 1% ở các mật độ nhỏ dần 10 lần và được cấy trải trên đĩa thạch TSA, nuôi ở 37C cho đến khi các khuẩn lạc hình thành rõ rệt

và có thể đếm bằng mắt thường [10]

2.4.1.2 Đo mức độ sinh acid của tế bào (pH drop)

Khả năng sinh acid của tế bào được đánh giá thông qua việc làm giảm pH của môi trường bên ngoài dẫn đến sự tụt pH (pH drop) Các giá trị pH tại mỗi thời điểm nghiên cứu nhất định được đo bằng máy đo pH

Sau khi thu tế bào từ biofilm bằng cách ly tâm 6000 gở 40C trong 15 phút,

tế bào được rửa 2 lần với dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM.Sau đó, tế bào được hòa trở lại trong dung dịch muối này ở mật độ khoảng

5 x 109 CFU/ml, tương đương 2 mg trọng lượng khô tế bào/ml pH của dịch tế bào được chỉnh đến 7,2 bằng KOH 1M Glucose được bổ sung vào để đạt nồng luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Trang 39

28

độ cuối cùng là 0,04%, đảm bảo môi trường dư thừa cơ chất cho quá trình đường phân Sự giảm pH môi trường do sự sinh acid trong quá trình đường phân được theo dõi sử dụng máy đo pH MP225 Mettler Toledo, Đức [10]

2.4.2 Các phương pháp xác định hoạt đô ̣ enzyme

2.4.2.1 Chuẩn bị tế bào thấm

Tế bào S.mutans được thu hoạch từ biofilm sau 68 giờ nuôi cấy Tiến

hành ly tâm với tốc độ 6000 g ở 40C trong 15 phút Cặn tế bào được rửa 2 lần với dung dịch muối có chứa KCl 50 mM và MgCl2 1 mM, sau đó tế bào được hòa trở lại trong đệm Tris – HCl 75 mM, pH 7,0 có chứa MgSO4 10 mM Sau khi thêm toluene (tỉ lệ 1 : 10 thể tích), dịch tế bào được trộn đều và ủ ở 370

C trong 5 phút Tế bào nhanh chóng đươ ̣c làm đông lạnh trong hỗn hợp đá khô với ethanol trong 1 phút Ngay sau đó, dịch tế bào được làm tan ở 370C trong 5 phút Chu kỳ này được lặp lại 2 lần Toluene được loại bỏ bằng cách ly tâm với tốc độ

6000 g ở 40C trong 15 phút Tế bào thấm được hòa trở lại trong đệm Tris – HCl

75 mM, pH 7,0 có chứa MgSO4 10 mM và được cất giữ ở -700C đến khi dùng [10]

2.4.2.2 Xác định hoạt độ enzyme phosphoryl hóa đường (PTS)

Hoạt động của hệ thống ezyme chuyển hóa đường (PTS) được xác định theo phương pháp của Belli và Marquirs [16] Phản ứng được thực hiện với tế bào thấm Hoạt độ của enzyme được xác định dựa trên sản phẩm tạo thành là pyruvate từ phosphoenolpyruvate, là sản phẩm trung gian khi tế bào tiêu thụ glucose Pyruvate tạo thành được xác định bằng enzyme lactate dehydrogenase trong sự có mặt của NADH Hỗn hợp phản ứng bao gồm đệm Tris – malate 50

mM (có chứa MgCl2 20 mM, NAF 1 mM và glucose 40 mM, pH 7,0), MgCl2 10

mM, KCl 100 mM, EDTA 0,5 mM, ADP và tế bào thấm Phản ứng được bắt đầu bằng việc thêm vào hỗn hợp phản ứng phosphoenolpyruvate (PEP) 10 mM

Đo độ hấp thụ tại A340 luan van tot nghiep download luanvanfull moi nhat z z @gmail.com Luan van thac si

Tiêu đề	Nghiên cứu ảnh hưởng của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn Streptococcus mutans trên biofilm và định hướng ứng dụng
Tác giả	Nguyễn Vũ Anh An
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Thị Mai Phương
Trường học	Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam
Chuyên ngành	Sinh học thực nghiệm
Thể loại	Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học
Năm xuất bản	2015
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	2,37 MB