Lựa chọn, thiết kế, thử nghiệm và ứng dụng một số mồi nhằm khuếch đại các vùng trình tự tiềm năng để nhận diện các loài lan hài paphiopedilum việt nam

LỤA CHỌN, THIẾT KÉ, THỬ NGHIỆM VÀ ỨNG DỤNG MỘT SỐ MỒI NHẰM KHUẾCH ĐẠI CẤC VỪNG TRÌNH Tự TIÈM NĂNG ĐẾ NHẬN DIỆN CÁC LOÀI LAN HÀI Paphiopedỉlutn MỆT NAM ĐẶNG VÁN KHẢI Khóa luận được đệ t

TRƯỞNG BẬX HỘC NGUYỄN TẪT THẰNH

KHÓA LUẬN TỐT NGj

(Screenings designing, pilot evaluation and application of some

primers potential i for molecular discrimination

ũí Paphi&pedilum species in Vietnam)

rhành

viện

SVTH í ĐẶNG VẪN KHẢI NGẲNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA í 2015 • 2017

GVHD ỉ ThS NGUYỄN THỊ NHẴ

TM VÚ THỊ HUYỀN TRANG

LỤA CHỌN, THIẾT KÉ, THỬ NGHIỆM VÀ ỨNG DỤNG MỘT

SỐ MỒI NHẰM KHUẾCH ĐẠI CẤC VỪNG TRÌNH Tự TIÈM NĂNG ĐẾ NHẬN DIỆN CÁC LOÀI LAN HÀI

Paphiopedỉlutn MỆT NAM

ĐẶNG VÁN KHẢI

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêucầu cấp bàng

Kỹ sư ngành CôngNghệ Sinh Học

Giảngviên hướngdần:

ThS NGƯYẺN THỊ NHÀ

ThS vừ THỊ HUYỀN TRANG

TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH TRUNG TÀM THÔNG TIN-THƯ VIỆNL\/00|Z(H /

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin cảm ơn đến Ba Mẹ lơi cảmơn sáu sắc Cảm ơn gia đìnhđãluôn bên tôi, ủng hộ và cho tôi niềm tin, chăm lo, động viên hỏ trợ tôi mọi mặt từ vật chất đến tinh thần đểtôihoàn thành khóa luận

Tôi xin cảm ơn ThS Vũ Thị Huyền Trang ■ à ThS Nguyễn Thị Nhã là người hướng dẫn và tận tình chỉ dẫn, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận,

truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý bâu trong quátrình thực hiện

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn thầy cô anh chị trong khoa Nông nghiệp Côngnghệ

Caovà Công nghệ Sinh học đã hướng dẫn giúp đỡlõi trong thời gian qua

Đặng Văn Khải

TÓM TẮT

Đẻ tài “Lựa chọn, thiết ke, thử nghiệm đánh giá và ứng dụng một số mồi

nhằm khuếch đại các vùng trình tự tiém năng để nhận diện tan Hài

Paphiopedilum Việt Nam (Screening, designing, pilot evaluation and application

of some potential primers for molecular discrimination of Paphiopedilum species

in Vietnam)” được thực hiện trên chi lan Hài paphiopediliurì) Chúng tôi đã tiến hành chọn ra các cặp mồi từcác bài báo khoa học thực hiện trên họ lan (orchidaceae)

của 3 vùng trình tự matK, ACO, trnL. Sau khi iựa chọn chỉ có vùng matK có mồi phùhợp, vùng ACO và trnL không có mồi phù hợp r.ẻn lien hành thiết kế mồi cho vùngnày Thực hiện phản ứng khuếch đại cho 3 vìing trẽn vả tiến hành điện Chúng tôi đạt

được các kết quảsau:

Hiệu chỉnh cặp mồi F56-mo: 5'-GGCAACAAAACTTCCTATA-3’ và

R1326-mo: 5’-TCTAGCACACGAAAGTCGA-3' từ mồi 56F Khevv và ctv (2011) vàmồi 1326R (Xiang và ctv, 2012) để khuếch đại vùng matK

Khuếch đại thành công vùng trình tự maíK bàng cặp mồi 56F-mo/1326r-

mo, chiều dài khuếch đại đạt 1.200 bp,hiệu suất đạt 90%

- Thiết kế được cặp mồi F256: 5’- TCCCTGTTTCCAACATCTCC-3’ và

RI190: 5’-GAGGCGATTGACATCCTGTT-3’ đểkhuếch đạivùng ACO

Khuếch đại được trình tự ACO trên một sổ mẫu lan Hài {Paphỉopedilum)

Việt Nam bằng cặp mồi F256/R1190, chiềudài khuếch đại 1.000 bp hiệu suấtđạt 45%

Thiết kế được cặp mồi /77ĩL-F: 5’- GGTAGACGCTACGGACTTGATT-3’

vàz™L-R: 5’-CGGTATTGACATGTAAAATGGGACT-3'đẻ khuếch đại vùngtrriL.

Khuếch đại được vùng trình tự trnL trên 54 mẫu lan Hài (Paphiopedilum)

ViệtNambằng cặp mồi tmL-F/tmL-R chiềudàikhuếchđạiđạt500 bp, hiệu suất đạt 100%

Cặp mồi maiK 56F-mo/1326R-mo và ZrnL-F/irnL-R có hiệu suất khuếch

đại cao được đề xuất để nhận diện phàn tử các loài lan HàiPaphìopedỉlum Việt Nam

iii

Mực LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ẢNH ix

MỞ ĐẦU 1

Tính cấp thiếtđề tài 1

Mụcđích của đề tài 2

Chương 1 TỒNG QUAN 3

1.1 Giới thiệuchung về lan Hài 3

1.2 Nguồn gốc và họ hàng lan Hài 3

1.2.1 Tên khoa học và vịtrí của lan Hài trong hệ thống phân loại 4

1.2.2 Đặc điểm hình thái 4

1.2.3 Đặc điểm sinh thái 7

1.2.4 Phân bố lan Hài 7

1.3 Giá trị của lanHài 8

1.3.1 Giá trị kinh tể 8

1.3.2 Giátrị thẩm mỹ 8

1.3.3 Giá trị dược học 9

1.4 Các vùng trình tự được sử dụng trongnghiên cửu 9

1.4.1 VùngACO 9

1.4.2 Gen matK(mứMrase K) 10

1.4.3 VùngửTĩL 11

1.5 Kỹ thuật PCR 11

1.5.1 Khái niệm 11

1.5.2 Lịch sử 11

1.5.3 Nguyên tắc hoạt động PCR 12

1.5.4 Thành phần phàn ứngPCR 14

1.6 Thiết kế mồi 17

1.6.1 Khái niệm 17

1.6.2 Các loại mồi 18

1.6.3 Ý nghĩa lựa chọn mồi 18

1.6.4 Các tiêu chí thiết kế 18

1.6.5 Lưu ý trongthiếtkế mồi 20

1.7 Kỳ thuật điện di 20

1.8 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cãc vùng trình tự để sử dụng trong nhận diện chi lan Hài (Paphiopedilum) 20

1.8.1 Cácnghiên cứu trên thế giới 20

1.8.2 Các nghiên cửu trong nước 22

Chương 2 NỘI DƯNG VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨƯ 23

2.1 Nội dung nghiêncứu 23

2.2 Thời gian và địađiểmnghiên cứu 24

2.3 Đối tượng nghiên cứu 24

2.4 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 24

2.5 Phương pháp nghiên cứu 25

2.5.1 Phương pháp tìm kiếm dữliệu tài liệu 25

2.5.2 Phươngpháp tìmkiếm dữ liệu trình tự 25

2.5.3 Lựachọn mồi 26

2.5.4 Phươngpháp thiết kếmồi 27

2.5.5 Khuếch đạicác vùng trình tự bằng các mồi chọn lọc và thiết kế 30

2.5.6 Phương pháp điện di 32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 43

3.1 Ket quả tìm kiếm tài liệu 43

3.1.1 Kết quảtìm tài liệu vùng Wơ/K 43

3.1.2 Kết quảtìm tài liệu vùng ACO 48

3.1.3 Kết quảtìm tài liệuvùng 49

3.2 Kết quả tìm kiếm dữ liệu trình tự 49

3.2.1 Kétquả tìm kiếm dừliệu trình tự matK 49

3.2.2 Kết quả tìm kiểm dừ liệu ưình tự ACO 50

3.2.3 Kết quả tìm kiếm dữliệu ưình tự trnL 50

3.3 Kết quà lựa chọn mồi cho tùmg vùng trình tự 51

V

3.3.2 Kei quà lựa chọn mồi khuếch đại vùng /77Ớ/K 51

3.3.3 Kei quả lựa chọn mồi khuếch dại vùng ACO 53

Sử dụng cặp mồi của bài báo khi đưa lén trmh tự Seaview mồi chạy không khớp do mồi này không được sử dụng để nghiên cứu loáí 'an Hài (Paphiopedilum), nên chúng tôi tiến hành thiết kế mồi mới cho vùng ACO 53

3.3.4 Ket quả lựa chọn mồi khuếch đại vùng tmL 53

3.4 Kết quả thiết kế mồi 54

3.4.2 Kết quả thiết mồi khuếch đại vùng ACO 54

3.4.3 Kết quả thiết kế mồi khuếch đại vùngỉr?ỉL 56

3.5 Ket quả khuếch đại các vùng trình tự cho các loài lan Hài (Paphiopedilurn) Việt Nam 59

3.5.1 Kết quả khuếch đại vùng trình tựmưrK 59

3.5.2 Kết quảkhuếch đại vùng trình tự ACO 60

3.5.3 Kết quả khuếch đạivùng trình tựtmL 62

KẾT LUẬN VÀĐỀ NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC 72

DANH SÁCH CHỮ VIÉT TẤT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

NCBI National Center forBiotechnology Infonnflrion

TBE Tris-Borate- Ethylenediaminetetraaceticacid

vii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Danh mục dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.2: Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 24

Bảng 2.3: Bảng thốngkê các mẫu sử dụng 31

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng khuếch đại (PCR 32

Bảng 3.1: Kết quả tìm tài ỉiệu có sử dụng mồi trên họ Lan (Orchidaceae) 43

Bảng 3.2: Tổng hợp các mồi xuôi (F)vàmồi ngĩrọc R) cho vùng matK của lan Hài 47 Bảng 3.3: Tổng hợp bài báo sử dụngvùng trình lự ACO 48

Bảng 3.4: Tổng hợp bài báo sử dụngvùng trìnhtự trnL 49

Bảng 3.5: Bảng mồi matK đã chỉnhsửa 52

Bảng 3.6 Ketquả 5 cặp mồi đềxuất phần mềm Primer3Plus của vùngACO 55

Bảng 3.7: Bảng mồi thiết kế vùngACO 55

Bảng 3.8: Kết quà 5 cặp mồi đề xuất phần mềm Primer3Plus cùavùng trnL 58

Bảng 3.9 Bảng mồi thiết kế vùng trnL 58

Bảng 3.10: Chu trình nhiệt của phản ứngPCR vùng mat¥L 59

Bảng 3.11: Chu trình nhiệt của phản ứng PCRvùng ACO 61

Bảng 3.12: Chutrình nhiệt củaphản ứng PCR vùng trnL 62

Bảng 3.13: Bảng tổng hợp số liệu kết quả PCR 64

DANH SACK HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Hìnhthái cây và hoa của Paphiopedilwn f Averyanov và ctv, 2003) 5

Hình 1.2 Cấu trúc vùng ACO 9

Hình 1.3 Cấu tạogen matK 10

Hình 1.4 Cấu trúc vùngtrnL 11

Hình 1.5 Chutrình PCR dưới dạng sơ đồ 14

Hình 2.1 Các trình tự sau khi tối ưu hóa sáp gior.g cột thảng hàng 26

Hình 2.2 Cáctiêu chí thiết kế mồi 27

Hình 2.3 Vùng bảotồn của các trìnhtự 28

Hình 2.4 Khung nhập dữ liệu trình tự 28

Hình 2.5 Giao diện khaibáo mục Genral Settingsưong Primer3Plus 29

Hình 2.6 Giaodiện khai báo mục Advanced Settings ưong Primer3Plus 30

Hình 2.7 Các cặp mồi có độ tương thích cao 30

Hình 3.1 Dữ liệu trình tự gen maiK 50

Hình 3.2 Dữ liệu trình tự vùngACO 50

Hình 3.3 Dữ liệutrình tự vùng trnL 51

Hình 3.4 Cấu trúc kẹp tóc (hairpin) 51

Hình 3.5 Hai phân tử mồi xuôi vàmồi ngược tự bắtcặp nhau (dimer) 52

Hình 3.6 Khảo sát mồi mat'd 52

Hình 3.7 Kết quả lựa chọn mồi vùngACO 53

Hình 3.8 Kết quả lựa chọnmồi cho vùng trriL 53

Hình 3.9 Các cặp mồi Primer3Plus đề xuất cho vùngACO 54

Hình 3.10 Trình tự mồi xuôiF256 ở vị trí nucleotide 256 275 56

Hình 3.11 Trình tựmồi ngược RI 190 ởvị trí nucleotide 1202 - 1221 56

Hình 3.12 Các cặpmồi Primer3Plusđề xuất chovùng trnL 57

Hình 3.13 Trình tự thiết kể mồi xuôi rrnL ở vị trí nucleotide 61 - 82 58

Hình 3.14 Trình tự thiết kế mồi ngược vùng trriL ởvị trí nucleotide 589 - 613 59

Hình 3.15 Kết quả điện di vùng trinh tựmatd của 54 mẫu lanHài 60

Hình 3.16 Kết quả điện di vùng trinh tự ACO của 54 mẫu lan Hài 61

Hình 3.17 Kết quả điện di vùng trinh tựtrriL của 54 mẫu lan Hài 63

ix

MỞ ĐÁU

Tính cấp thiết đề tài

Lan Hài là một loài phong lan được biết đến với hình dạng vô cùng đặc biệt và

có giá trị cao về mặt nghệ thuật Hiện nay, Việt Nam đã ghi nhận tìm thấy khoảng 26

loài lan Hài (có 21 loài giống và 5 loài lai tự nhiên trong đó có rất nhiều loài được

ghi nhận là loài đặc hữu củaViệt Nam Trong đó mỏi sổ loài được ghi nhận là đặc hữu

của Việt Nam thì càng bị săn lùng mạnh hom V;ệc khai thác rừng bừa bãi, nạn cháyrừng, khai thác trái phép diễn ratrên diện rộng dln đến tinh trạng số lượngcây lan Hài

giảm sút nhanh chóng và có nguy cờ tuyệt chủng cao chẳng hạn như loài p

appletonianum, p delenatii, p hirsutissimum.

Lan Hài còn tồn tại trong tự nhiên rất ít Vì vậy việc bảo tồn và phát triển lan

Hài Việt Nam là nhiệm vụ vô cùng cấp bách Tuy nhiên, Lan Hài khi chưa có hoa rấtkhó để phân biệt giữa các loàivới nhau bằng hình thái dần đến việcbuôn bán trái phéplan tràn các cây lan Hài quý như các cây lan Hài phổ biến bình thườngvì vậy cần phải

có một công cụ nhận diện nhanh và chính xác các loài, ngay cà khi cây con không cóhoa Trong một nghiên cứu mớinăm 2003, Averyanov đã cảnh báo sựtuyệt chủngtiếp theo của một số loại lan Hài Việt Nam Một so loài hiện nay đang bị đe dọa nghiêm

trọng, trong đó có Hài Vân (ỊP callosum), Hài Hồng (P delenatii), Hài Tía (P

purpuraturn) và cả loài Hương lan (P emersonìi).

Ngày nay, với sự phát triển của ngành sinh học phân từ, chi thị mã vạch DNA

là phương pháp tốt nhất có thể giúp ta nhanh chóng nhận diện giữa cáccá thể cùng loàihoặckhác loài với độ chính xác cao DNA mã vạch là một trình tự DNA ngắn và duy

nhất của loài đểphân biệt với các loài khác Đã có các công trìnhnghiên cứu mã vạch

DNA lan Hài, trong đó các vùng trình tự thường được sử dụng là ITS và mư/K Tuynhiên theo một nghiên cứu mới nhất của nhóm chúng tôi sau khi thực hiện đánh giá

khả năng nhận diện chi lan Hài dựa vào tất cả trình tự của chi này thu từ ngânhàngdữ liệu gen thế giới, bèn cạnh vàITS có một số vùng tiềm năng mớinhư ACO, Ừ71L

có khả năngphân định loài cao hon cácvùng phố biến

Trong kỹ thuật barcoding, mói la rnột yếu tố quan trọng để đạt được sự khuếchđại dặc trưng và có hiệu suất cao, dẫn tới táng hiệu quả trinh tự mã vạch thu được Trong đê tài “Lựa chọn, thiết kế, thử nghiệm đánh giá và ứng dụng một số mồi

nhằm khuếch đại các vùng trình tự tiêm nâng để nhận diện lan Hài

Paphiopedilum Việt Nam (Screening, designing, pilot evaluation and application

of some potential primers for molecular discrimination of Paphiopedilum species

in Vietnam)”, chúng tôi lựa chọn 3 vùngtrình tự T ACO (thuộc hệ gen nhân), matK

và trnL (thuộc hệ gen lục lạp) để tiến hành kháo S31 vã thiết kế mồi phục vụ cho việc khuếch đại gen và nhận diện các loài thuộc chi lan Hải (Paphiopedilum) ViệtNam

Mục đích của đề tài

- Lựa chọn hoặc thiết kế mồi khuếch đại cho 3 ■•ĩmg /7ZữZK, ACO, trnL để phục vụ

nhận diện loài lan Hài {Paphiopedilum) Việt Nam

- ứng dụng khuếch đại các vùng trình tự warK, ACO, trnLtrên một số mẫu lan Hài

Việt Nam thu được và đánh giá khả năng khuếch đại các vùng chọn lọc

2

Chương 1

TỎNG QUAN

1.1 Giói thiệu chung về lan Hài

Trên thế giới hiện nay đã ghi nhận có khcing 80 loài lan Hài được phân bố ở

An Độ, Trung Quôc, ViệtNam, Thái Lan Người Pháp gọi loài lan này với tên gọi

là Sabot de Venus hay còn gọi là Hài Vệ Nữ Người Anh gọi với ý nghĩa tương tựLady's slippers Ở Việt Nam ghi nhận có khoảng 26 loài (21 loài giống, 5 loài giống lai

tự nhiên) loài lan Hài xuấthiện ở Việt Nam được coi lã rất phong phú và đa dang, cónhiều loài được ghi nhận là chỉ xuất hiện ờ Việt Nam như: Lan Hài Hồng, Hài Hằng,

Hài Hê Len, Hài Trần Liên, Hài Việt Nam

1.2 Nguồn gốc và họ hàng lan Hài

Đại diện của nhóm lan Hài nguyên thủy nhất có hai hoặc ba nhị đực trong hoa

Các loài này được gọi là Lan Apostasỉa, dưới họ Apostacioideace Đây là một nhóm nhỏ bao gồm các loài địa lan sống ở vùng nhiệt đới ChâuÁ vàBẳc Australia và có hai

chi Apostasia, Neuwiedia, với khoảng 16 loài

Nhóm thứ hai là lan Hài, dưới họ Cypripedioideae gồm có hai nhị đực còn tồn

tại trong hoa, nó đại diện cho một loài tiến hóa riêng Dưới họ này bao gồm 5 chi

Cyprpedium, Mexìpedium, Paphiopedilum, Phragmipedium Selenipedium và cókhoảng 150 loài phân bố rộng khắpvùng nhiệtđới Á - Âu Bắc Mỹ và Nam Mỹ.

Tên gọi chi Paphiopedỉlum được Ernst Hugo Heinrich Pfitzer đề xuất năm 1886; nó cónguồn gốc từ Paphos (một thành phố trên đào Síp) và từ trong tiếng Hy Lạp cổ

đại pedilon nghĩa là "Hài, dép" Một điều trớ trêu là không có loài lan Paphiopedilum nào sinh sống trèn đào Síp - ít nhất là theo phân bố hiện nay

Nhưng trong suốt một thời gian dài người ta đã trộn các loài trong chi này với các họhàng gần của chúng là chi Cypripedium, trên thực tế có loài sinh sống trong khu

vực Địa Trung Hài Paphìopedilumđược công nhận là chi hợp lệ vào năm 1959,nhưng việc sử dụngcác danh pháp khoa học chỉ hạn chế cho các loài ờ khuvực Đông

và Đông NamÁ

Lan rừng Từ A-Z ghi nhận Việt j.'arn có 26 loài trong đó có Paphiopedilutn delenatii nôi tiêngvà nhiêu loài chi gập tại Việt Nam như p.vietnamensis, p.dalatense, p.tranlienianum. Sách“Tra cứu TênCầy có Việt ? (an’ cùa GS Võ văn Chighi 18 loài.

Các nhà nghiên cứu về lan, dựa theo hinh dạng của cánh hoa, còn chia

Paphiopedỉlum thành năm chi phụ, và sau đó từ các chi phụ còn chia thêm thành những nhóm khác nhau Những chi phụ gom Parvisepalum, Brachypetalum, Polyantha, Sigmatopetalum và Cochlopetalum.

1.2.1 Tên khoa học và vị trí của lan Hài trong hệ thống phân loại

Lan Hài Paphiopedihim thuộc:

Lớp: Monocotyledones (Hànhtỏi)

Phân họ: Cypripedioideae (lanHài)

Trong phân họ Cypripedioideae được các nhà khoahọc nghiên cứu gồm có năm

chi: Cypripedilum, Mexipedilum, Pharagmipedilnm, Selenipedilum và Paphiopedilum

Các loài lan Hài của Việt Nam đều thuộc chi Paphiopediliưn.

1.2.2 Đặc điểm hình thái

Cây sống hầu hết trên các vách đá, núi, cây có thân rất ngắn, thườngmọc thành

từng chùm với nhau Dạng cây của loàiPaphỉopedilum là một loài thân cỏ, kích thướctrung bình Thân của giống Paphiopedilum cỏ cor cấu thực vật nhò nhất, được phân

chia thành 2 cấu trúc cũng như thành phần chức năng Thân chính là thân rễ năm ngang, ở vị trí gốc và thường bị che lấp bởi lớp đất nền Đày là thân chính, tạo ra rễ,

bộ rễ sẽ hình thànhcác nhánh, nhánh sè thành cày và mang lá Các đốt ân bị nénlại vì

thế các lá mới mọc ngay phía trèn dinh Thân đứng mang một so lá sau khi trưởng thành thì chồi hoa sẽ xuất hiện Trong một số loài đặc hữu lai tạochồi non xuất hiện ở

gốc của tần lá thấp Ở những cày như thế các chồi mới sẽ tăng trưởng nhanh và đến

một thời điểm nào đó thì sè tạo thành cụm (Averyanov và ctv, 2003)

4

a — flowering plant: b — Hower with eut petal and longitudinal section of the lip; c-a — column (gywouemnun) side view (c) view from above (d) and from below (e).

Hình 1.1 Hìnhthái cây và hoa cùa Paphiopedilum(Averyanov và ctv, 2003)

Lá mọcthành hai hàng xềp thành hình quạt, lá thường ở dạngdài, gấp đôi, hình

trứng ngược hay bầu dục thuôn và mở rộng Độ dài của lá ở các loài rất khác nhau

Mặt trên của lá có thể màu xanh lá cây cùng màu, hoặc khảm bởi các mảng đậm nhạt không đều với các gân màu xanh lá nổi rõ Mặt dưới lá cùa mộtsố loài có các đổm tím

dày đặc, ở các loài khác chi thấy vết tím xỉn ở gần gốc lá Lá của lan Hài phát triển

thành lững cặp từ gôc của cây Cáy giữ các lá náy trong nhiều năm và cây sinh trưởng thành một cụm lớn Chúng không có các gia hanh vì vậy không thể lưu trữ nước và

chât dinh dưỡng, vì lý do này mà lan Hái không có mũa nghi, hoặc bị quá khô, mặc dù với hâu hêt các loại hoa lan đều cần phải có sự thoát nước tốt Lan Hài có thể được

trông từ cây con đên trưởng thành hoặc dược chia Ách tứ các cây trưởng thành Cáccây sông trong vùng khí hậu lạnh thường không cớ bĩển dị về lá, chúng thường cómàu xanh, trong khi các cây sinh trưởng trong vùng ấmhơn ‘thường có lá van, điều đó khiếncho chúng hấp dẫn ngay cảkhi chúng chưa ra hoa A*.en anov và ctv,2003)

Rê của các giông lan Hài được bao bọc bỡ: —Ạ iớp vỏ lụa luôn luôn xanh, đó là lớp biểu bì bên ngoài của hầu hết các loại rễ lan Lóp vò lụa giúp rễ có khả năng hấp

thụ độ âm trong không khí cũng như nước Không những thê, rễ còn giúp cho các cây lan Hài đứng vững trên đất mà hút nước và khoáng chất dinh dưỡng Chức năng bám

vào đất hiển nhiên là quan trọng Rễ của các loài lan Hài khỏe và to đường kính đođược từ 2 đến 5 mm, chúng nhờ các nhánh mà trải rộng ra, chiều dài tổng cộng cùa

những cây khỏe mạnh lên đến 30 - 50 cm Đầu rễ của những cây Paphiopedilum có

màu be đến trắng ngà, trong khi đó những cây già dần dần ưở nên màu nâu tối và

giống da lông thú hơn Rễ hiện ra từ thân rễ, cũng là từ chàn cùa các lá hình quạt, ởmột số loàithì chúng xuấthiện ở trục của lá dưới cùng Điều quan ttọng cần nhớ rằng

cây con của loài lan xếp lá hình quạt thường từ rễ, do đó các cày con phải phụ thuộcvào cây cha mẹ trênmột năm, lúc đó bộ rễ của câycon mới hình thành đầy đủ, đó mới

là thời gian chúng ta có thể tách cây con ra khỏi cây cha mẹ(Averyanovvà ctv, 2003)

Hoa của lan Hài thường có nhiều màu sắc và một số có hương thơm để thu hút

ong và côntrùng Đa số lan Hài có hoa màu vàng,xanh vànàu đõ một sốcó màu hang.Cụm hoa của các loài Paphiopedihơn thường thẳng đứng hay cong, phần lớn các loài

chỉ mọc hoa riêng lẻ, một số loài như p dianthum thì thường mọc từ 2 - hoa Mỗi loài lan Hài khác nhau thì có những đặc điểm đặc trưng riêng của từng loài về kích

thước, màu sắc củalá, hoa và từng cánh hoa (Averyanov và ctv, 2003)

Quả của lan Hài dài nhò và sô lượng hạt rất ít không có nhiều dinh dưỡng dự trữ nên ảnh hưởng dền quá trinh nảy mầm của hạt Vì vậy, trongđiều kiện tự nhiên hạt

của Lan Hài rất khó này mầm và sinh trưởng Hơn nữa, việc nảy mầm nhanh hay chậm

6

phụ thuộc vào tình trạng của hạt gióng, cũng gióng như các nhóm lan khác để hạt nảy

mâm hạt cân phải có sự cộng sinh của các vi jfih vật(Averyanov và ctv, 2003)

1.2.3 Đặc điểm sinh thái

Lan Hài được phân chia thành 2 nhóm chính những cây có iá màu xanh dương thích sống ở nơi có nhiệt độ lạnh, ban đêm từ 13 - :6'C ban ngày 18 - 24°c Các loại

có lá vằn thích hợp ở nhiệt độ ấm, ban đêm 16 - Ì8°c, ban ngày 21 - 25°c Vì vậy ở

dông băng chúng ta có thể trồng Lan Hài được quanh Sải Gòn, Gia Định xưa lan Hài

mọc khăp mà sách vở còn ghi, như loài p concũ.or 2ỌĨ ’iã Hài Gia Định Hơn nữa các loài lan Hài chịu được khí hậu nóng ở đồng bảng đà được nuôi trồng khá phổ biến ở nhiều nơi Như vậy ngoại trừ ở cao nguyên như Đà Lạt, Buôn Mê Thuột là những

nơi lý tưởng để trồng lan Hài còn ở đồng bàng thi nên chọn những loài chịu khí hậu

nóng, thường là những loàicó vân ở lá (Phan Kế Long,2009)

Ánh sáng: lan Hàisốngtốt trong điều kiện ánh sángtốt, nhất là trong mùa đông

Nếu mức sáng quá thấp cây sẽ không ra hoa và mức sáng quá cao cây sẽ bị cháy vàvàng lá Ánh sáng thích hợp là từ 30 - 40%, lan Hài thích hợp ưồng trong bóng mát

(Phan Kế Long, 2009)

Độ ẩm không khí: Khôngkhí ẩm và lưu thông tổt làrất cần thiết, nhấtlà ưong

mùa hè, giúp giảm thiểu nguy cơ nhiễm nấm bệnh và giữ cho cày khôngbị khô quánhanh.Độ ẩm có thể được nâng lên bằng cách đặt chậucày lèn ưẽn các khay sỏi nhẹ

với 50% độ ẩm là lý tưởng

Độ pH: lan Hài sinh sống ở những nơi có độ pH từ 6,5 - 7, một số loài có thểsinh sống ở pH từ5 - 6, không khí ẩm và thoáng mátsẽ giúp giảm nguy cơ mắc mộtsố

loại nấm bệnh cho loài lanHài

1.2.4 Phân bố lan Hài

Các loài lan Hài ở Việt Nam phân bố tập trung ở các khu vựcphía Bắc và đồi

núi Chúng sống trong những đòi núi và vách đá, mặc dù khó cỏ thể hái được nhưng

do có giá trị cao nên chúng bị khai thác một cách triệt để và gần như bị tuyệt chùng

mộtsố loài ở tự nhiên

Một số loài có giá trị ờViệt Nam như p canhii được tìm thấy trên những vách

đá vôi có một ít chất mùn, trong những khu rìmg lá kim ở miền Bắc Việt Nam ở độ

cao 1.500 m, ngoài ra còn được phát hiện ở vùng thượng Lào, p Vietnamese được

tìm thây trên những vách dá trong nhưng khu rửng ở tinh Thái Nguyên, phía bắc ViệtNam vào từ cuôi mùa thu đên dầu xuân trong khi mói trường có độ ẩm cao nhưng khô

và có nhiêu mưa từ giữa mùa xuân dến đáu thu, mọcàđộcao từ 350 - 550 m

1.3 Giá trị của lan Hài

Lan Hài Việt Nam làchủng lan có giã trị thương mại cao nhất, được ưachuông

và sưu tầm nhiều nhất Việt Nam là một trung ĩãm sản xuất lan Hài lớn của thế giới

với hiện có hơn 20 loài lan Hài được tìm thấy Nhiều nhà nghiêm cứu thực vật nhậnđịnh lan Hài làmột kho báu của quốc gia p. Vietnamese là một loài lan Hài đặc biệt có

ở miền Bắc Việt Nam có giá trên thị trường khá cao 100 USD cho 1 cày (Averyanov

và ctv, 2003)

1.3.2 Giá trị thẩm mỹ

Nhịp sống hiện đại của nền văn minh đã khiến cho chúng ta luôn trong trạng

thái căng thẳng cho công việc hàng ngày Chính vì căng thẳng và mệt mòi con người

đã tìm đến những thú vui để giải tỏa sự căng thẳng có người thì vui chơi, cũng có

người lấyviệc ngắm cây trồng hoa để giải tỏa sự căng thăngcủa mình

Mặtkhác việc trồng hoa đãmang lại công ăn việc làm cho rất nhiều người và đã

trở thành một ngành kinh tế phát triển với lợi nhuận hàng tỳ USD, một doanh thu

không hề nhỏ đối với các nước đang phát trièn

Trên thế giới lan được trồng ở các cửa sổ, bồn hoa, chậu hoặc freo Loại lan Hài

có giá trị về mặt thẩm mĩrất lớn vì chúng có nét đăng trưng riêng biệt Chúng có màu

sắc rực rỡ và kiểu hoa khác thường so với các loài phong lan khác Hoa lan khi được

nâng niu và chăm sóc thìchúng sè càng ra hoava tươitothơn

Hiện nay, các loài lan Hài đang bị đe dọa nghiêm trọng gần nhưbị tuyệt chủng

bởi sự săn tìm và mua bản trái phép của những thương lái Loài lan Hài

Paphiopedilum đã được sách dô Việt Nam liệt kê vào danh mục nghiên cấm khai thác

và sử dụng vì mục đích thương mại (Sách đỏ Việt Nam năm 2007) Vì vậy, chúng ta

8

cân phai có các biện pháp mạnh tay hơn dơi với nạn săn lùng trái phép loài lan Hài

nay, vacũng cân có các biện pháp dê nhán giống loại lan đặc biệt này

1.3.3 Giá trị dược học

Dược học Trung Quốc từ ngàn xưa đã sừ dụng các loại cây dể làm dược liệu,

giúp diêu trị bệnh cho con người, loài Paphiopedd'.-'V: concolor có vị dắng/chua, tính bình có tác dụng “thanh nhiệt, tán ứ”, “tiêu thùng, giãi độc” Dùng dể trị rắn cắn, vết

thương lở loét, chân thương, té ngã Paphiopedd:^: insigne lại Án độ toàn cây được dung làm thuốc trịkiết lỵ

1.4 Các vùng trình tự được sử dụng trong nghiên cứu

-Ethylene điều chỉnhnhiều khía cạnh của vòng đời cày trong, bao gom này mầm

hạt, bắt đầu rễ, phát triển hoa, chín hoa quả, lão hoá Nó đóng một vai trò quan trọng trong việc ứng phó với môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đen khả năng thích ứng vàsinh sản Trong những năm gần đây, có những tiến bộ đáng kề trong sự hiểu biết của

chúngta về các cơ chế phântử điều chỉnh tổng hợp etylen Tính chất hoá học đơn giản của ethylene trái ngược với sự phức tạp của quy định Điều này được minh hoạ bởi tính đa dạng của các gen mã hoá các Enzym tổng hợp etylen chù chốt: acetase 1 - aminocyclopropane - 1 - carboxylic (ACC) và oxidase ACC các thụ thể ethylene nhiều và các thành phần chuyển tín hiệu và sự phức tạp của các bước điều chình liên

quan đến chuyển tiếp tín hiệu và kiểm soát mRNA và tổng hợp protein Ngoài ra, có

nhiều tương tác với các hormon khác(Wangvà ctv, 2016)

[1255532>

I - - -“7 - “ - 1

Hình 1.2 Cấutrúc vùng ACO

1.4.2 Gen niatK (matwrase K)

Wỡ/K là một gen nam trong lục lạp được lồng vào intron nhóm II, nằm ở giữa

intron 5' và 3' của ZrnK có chức năng mã hóa cho protein maturase K (Selvaraj và ctv, 2008) Hiện nay, rnữ/K là một trong những gen mã hóa nhanh nhất và mức độ phân định loài cao và được sử dụng trong các nghiên cữ hệ thống, sự tiến hóa của các loàithực vật (Johnson và ctv, 1994)

Trong một vùngcủa bộ gen lục lạp thực Ạt có khá năng phátsinh tiến hỏa loàinhanh hơn rbcL là gen matK (trước đây gọi là cụ thể gen trnALys (ƯƯU)

(Zrz?I<) có chứa một intron nhóm II, matK mã hóa cho khung đọc mở A/ữÂirase K (ORF) nằm trong intron gen chuyển RNA cho lysine OnK) (Neuhaus và ctv 1987),

trên thực tế hai exon của trnK sẽ bị đứt gãy để lại gen matK còn nguyên vẹn Toàn bộintron trríK có chiều dài khoảng 2.600 bp, trong đó 1.500 bp cấu tạo thành matK.,

tươngứng với khoảng500 amino acids trong protein (Johnson và ctv, 1994)

trnK exon 5 trn fr intron5' _ tmK introny _<■

Hình 1.3 Cấu tạo gen matK

Gen nổi bật lên trong số các gen lục lạp được dùng trong phân tích hệthống học thực vật theo kiểu riêng và nhịp tiến hóa của nó Tỳ lệ thay đổi nucleotide

tính trên mỗi vị trí trong matK. cao gấp 3 lần trong rbcL (tiểu phần lớn của

RUBISCO), và tốc độ thay thế amino acid cao gấp 6 lần của rbcL (Johnson và ctv,1994) Cùng với tốc độ thay thế amino acid cao trong maiK là tì lệ thay thè gần như bằng nhau giữa cả ba vị trí trong mồi codon Tốc độ thay thế cao làm gia tăng số điểm

parsimony và tín hiệu phát sinh chủng loài mạnh, nên nó có thể được sử dụng đê phânbiệt lịch sử tiến hóa ở các mức phàn loại khác nhau Giá trị về thông tin phát sinh

chủng loài tạo ra nhờ làm cho nó trờ thành gen cựckì có giá trị trong các nghiên

cứu hệ thống và tiến hóa (Barthet và ctv, 2007)

1.4.3 VùngỜTíL

Là một vùng nằm giữa trnL-trnĩ- cùa lục lạp đã chứng tỏ rất hữu ích trong các nghiên cứu phát sinh nhằm giải quyết cáccáu hói tiến hóa dã dạng từ lịchsử phát triển

các nhómthực vật, một đặc điểm của vùng đệm nã} có tinh bào thù cao và mức đột

biên thâp hơn so với hệ gen nhân vì thế cho phép tha}' đôi cấu trúc dưới dạng thay thếthêm bớt nucleotidevà chuỗi lặp lại, những thay đỉ i nay cung cấp các thông tin quan trọng về nghiên cứu sự tiến hóa của loài Vùng trinh Tự ỉrnL được coi là một vùng có

khả năng phân định cao giữa các loài PaphiopeditJTi Taberỉet và ctv, 2007)

của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhàn lèn nhiều lần một cách

nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi Enzym DNA polymerase

1.5.2 Lịch sử

Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải

Nobel về hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chì sau 7 năm khi ôngđưa ra ý tưởng Ý kiến của Mullis là phát ưiển một quy trìnhmà DNA có thể nhân lên

nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bời Enzym DNA polymerase

(Saiki và ctv, 1985)

DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sổng, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo

sợi bò sung Theo quy trình PCR gốc của Mullis Enzym phản ứng nhân bản DNA

được thực hiện trong ông nghiệm (in vitro) Sợi DNA đói bị tách thành 2 sợi đơn khiđun nóng ở 96°c Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậycần bổ sung Enzym sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ Quy trình PCR gốc của

Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thởi gian, cẩn một lượng lớn DNA polymerase, và phải liêntục lưuýsuốt trong quá trinh PCR

Sau đó, quy trình gốc này được phát triển ring cách dùng DNA - Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên

110°C DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và

khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khí hỗn hợp được nung nóng đế tách sợi DNA Tìr đó, không cần phải thêm DNA - polymerase vào mồi chu kỳ, quá trinh sao

chép DNA có thểđơn giản vàtự động hơn

Một trong những DNA - polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ

Thermus aquaticus và được gọi là Taq Taq polymerase được dùng rộngrãi ưong thựcnghiệm PCR (5/2004) Nhược điểm của Taq là thinh thoảng nó nhầm lẫn ưong quátrình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai

exonuclease 3’ - 5’ Các polymerase như Pwo hay Pfu được phàn lập từ Archaea có

cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột

biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép Ngày nay, sự kết hợp giữaTaqvà Pfu có

thể cung cấp cả độ tincậy cao lẫn sự nhânbản chínhxác của DNA

1.5.3 Nguyên tắc hoạt động PCR

Thông thường, PCR bao gồm một chuỗi khoảng 20 - 40 lằn biến đổi nhiệt độ

lặp đi lặp lại, gọi chu kỳ, mỗi chu kỳ thường gồm 2-3 giai đoạn nhiệt độ riêng biệt,

thường là ba Các chu kỳ thường bát đầu bằng giai đoạn nhiệt độ cao (> 90°C), và

sẽ dừng lại khi sảnphẩm cuối cùng được tổng hợp hoặcdừng lại ờ nhiệtđộthấp để lưu

trữsản phẩm PCR trong thời ngắn Nhiệt độ và thời gian thực hiệncủa mỗi chu kỳ phụthuộc vào nhiều yếu tổ Những yếu tổ này gồm Enzym tổng hợp ADN, nồng độ ionhóa trị hai, dNTPsdùng trong phân ửng, và nhiệt độ nóngchảy (Tm) của mồi

- Giai đoạn khởi đầu: (Chi cần đối với những Enzym ADN polymerase bắt

buộc phải kích hoạt bằng nhiệt độ) Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94 - 96°c (hay

98°c nếu sử dụng polymerases cực kỳ bền nhiệt)và được tiến hành ứong 1 - 9 phút

CJiai đoạn biên tính: Đáy la bước đáu tién của chu kỳ và là quá trình tăngnhiệt độ lẻn 94 - 98°c trong 20 - 30 giây ADN được biến tính bàng cách phá vỡ liênkêt hydro giữa các bazo, tạo thành phân tử ADN sợiđơn.

Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống còn 50 - 65 °C trong 20

- 40 giây đê môi gắn vào sợi ADN đon Nhiệi độ nảy cần phải dù thấp để cho phép

môi băt cặp với sợi ADN, nhung cũng đủ cao cho Ctrinh bắt cập đặc hiệu, nghĩa là, mồi chỉ nên gắn hoàn toàn với phần trình tự bồ trên mạch khuôn Nếu nhiệt độ

quá thấp, mồi sẽ gắn không đặc hiệu Nếu quá cao mồi có thể không gấn Thông

thường nhiệt độ gắn mồi thường thấp hon 3 - 5CC so với Tm của mồi dùng trong phảnứng Liên kết hydro bền giữa phân tử AND - ADN chi được hình thành khi mồi bổ

sung hoàn toàn với khuôn Polymerase liên kết với các phân tử lai ADN mổi - khuôn

vàbắt đầu tổng hợp ADN

Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ trong giai đoạn này phụ thuộc vào các

ADNpolymerase sử dụng; Taq polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75 - 80°C ,

và nhiệt độ 72°c thường được sử dụng với Enzym này Tại giai đoạn này ADN polymerase tổng hợp sợi ADNmới bổ sung với ADN khuôn bàng cách thêm dNTP

theo nguyên tắc bổ sung theo chiều5' đến 3', phản ứng trùng ngưng xảyra giữa nhóm5' - phosphate của dNTPvới nhóm 3' - hydroxyl phía cuối của sợi ADNvừa mới được

hình thành Thời gian của giai đoạn kéo dài phụ thuộcvào ADN polymerase và độ dàicủa đoạn DNA cần khuếch đại Thông thường, các ADN polymerase cỏ khả năngkhuếch đại được hàng nghìn bazo nito trên một phút Trong điều kiện tối ưu, tức là,nếu không có hạn chế do giới hạn của cơ chất hoặc chất phàn ứng thi sau mỗi giai

đoạn kéo dài, số lượngADN được khuếch đại sau mỗichu kì tuần theo hàm mũ

Giai đoạn kết thúcKéo dài: Giai đoạn này đòi khi được thực hiện ờ nhiệt độ

70 - 74°c (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các

Enzym polymerase dùng trong phản ứng PCR), với thời gian 5-15 phút sau chu kỳPCR cuối cùng để đảm bảorằng tất cả ADN sợi đơn còn lại đều được tồng hợp hoàn toàn

- Giai đoạn bào quàn: Giai đoạn này thực hiện ởnhiệt độ4 15°c trong một

thời gian đểbão quân ngăn hạnsànphâm của phản ứng

Hình 1.5 Chu trình PCR dưới dạng sơđồ.

(1) Nóng chảyở 96°c (2) Gắn mồi ở 68°c (3) Kéo dài ở 72°c (P=Polymerase) (4)

Chu trình đầu tiên hoàn thành Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trìnhkế

tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản saocho mỗi chu kỳ

1.5.4 Thành phần phản úng PCR

Để thử nghiệm PCR có thể chạy được, cầnphải có đầy đủ các thànhphần phản

ứng PCRsau đây:

- Nước: Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa

ion nào, khôngchứaDNAase, RNAase Enzym cắt giới hạn Nói cách khác là không

chứa bất kỳ mộtthành phần nào khác

- Dung dịch đệm cho phàn ứng PCR: Dung dịch đệm cho PCR là một trong

những yếu tố quan trọng ánh hườngđèn chàt lượng phản ứng PCR

Thảnh phần dung dịch đèm cùa phản ứng PCR thường phụ thuộc vào loại

Enzym DNA polymerase sử dụng trong PCR, thườngchứamuối đệm Tris HC1 10 mM,

KC1 50mM và MgCẸ l,5mM Trong các thành phần trên, có lẽ ảnh hường lên thử

nghiệm PCR nhiều nhất lànồng độ MgCl2, vì vậy để có được một thử nghiệm PCR có

14

đọ nhạy cao, phản ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng bàng cách thăm dò một nồng độ MgCl2 thíchhợpnhất.

Nong dọ MgCl2 có thê dao dộng tứ 0,5 - 5 m.M Chính ion Mg2hgắn liên kết

dNTP VỚI DNA polymerase, tăng khả năng bám nối cùa mồi Nồng dộ MgCl2 cao sẽ

tạonhiêu sản phâm khôngđặc hiệu, nông độ MgCI-C'_í thắp sẽ khôngtạo sản phẩm PCR

- dNTP (deoxy nucleoside triphosphates Là đơn vị dể có thể tổng hợp dược các bản sao của DNA đích dNTP có cấuĨỊO gồm một đường deoxyribose có gắn một base, có thể là Adenine (dATP) hay Thymine /dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay

Guanine (dGTP), Ở carbone số 1 (Cl) Ba phàn ĨỦ phosphate (triphosphate) được gắn tại carbone số 5 (C5) của phân tử deoxyribose rùy và đáy chính là nơi mà dNTP gắn

vào đầu 3’ của chuỗi bổ sung trên chuồi DNA đích Năng lượng để cho phàn ứng này

xảy ra được lấy từ các nối phosphate giàunăng lượng cũa triphosphate trên dNTP Đó

cũng chính là lý do tại sao phải làdNTP chứng không phải là dNDP (diphosphate)hay dNMP (monophosphate)

- Mồi: Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn dài khoảng 20 - 30 base có

trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứngdây chuyền tổng hợp DNA Chúng nhận ra phần DNA cần được nhàn lèn, bắt cặp bổ sung với một đầu của DNA mẫu vàtạo ra vị trí bắt đầu tái bản Các moi này có chiều ngược nhau, bao gồm một mồi xuôi (forward)và một mồi ngược (reverse)

Mồi là yếu tố quan trọng nhất của phản ứng PCR, quyết định tính đặc hiệu của phản ứng Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai ơò chính: (1) Quyết định nêntính đặc hiệu của thử nghiệm, vì nếu đoạn mồi được chọn càng đặc hiệu cho chuỗi

đích, nghĩa là chỉ có thể bắt cặp trên chuỗi đích mà không thể bắt cặp được trên các chuỗi DNA khác ngoài chuỗi đích, thì sàn phẩm PCR càng đặc hiệu và thử nghiệm PCR càng đặc hiệu (2) Khởi động men polymerase vì men polymerase chì có thể bắtđầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuồi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3’ (là

đầu mà nó xúc tác cho mộtdNTPdược gắn vào) đang ở tìnhtrạng sợi đôi

- Enzym DNA polymerase (7ơợ): Kết quả của phản ứng PCR phụthuộc vào

khả năng chịu nhiệt của Enzym polymerase Enzym DNA polymerase: LàEnzym xúc

táccho quátrình lắp ráp cácnucleotide A, T, G, c vao mạch DNA mơi tong hợp

Vao thạp niên 1960, nhà vi sinh vật học íhomas Brock đã đến Công viên Quốcgia Yellowstone (Bang Wyoming, Mỹ) dé nghiên cứu các vi sinh vật ưa nhiệt sống

trong suôi nước nóng 80 - 90°C ông dã phát hiện một loài vi khuẩn phát triển mạnh ờ

nhiệt độ cao, có tên là Thermits aquaticus. Hai mươi năm sau, các nhà khoa học của tập đoàn Cetus (Tập đoàn Công nghệ Sinh học California) đã nhận thấy ràng DNA

polymerase từ Thermits aquations (Taq - polymeraseI có khả năng giải quyết vấn đềcủa Enzym biên tính sau mỗi chu kỳ DNA polymerase chịu nhiệt sử dụng cho phản

ứng PCR lân đâu tiên được bán trên thị trường ’ĩ Taq - polymerase Từ đó đến nay,một số vi sinh vật chịu nhiệt khác đã dược khám phá vả người ta đã tách chiết thêm

dược các DNA polymerase chịu nhiệt để sử dụng cho phản ứng PCR như Vent -

polymerase (Tli-polymerase), Pfu- polymerase,rTĩh.

- DNA mẫu (DNA template): Là mầu DNA mà chúng ta sẽ khuếch đại Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cửu DNAkhuôn có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất Phản ứng PCR tối ưu xảy ra khi mẫu DNA không được dài quá, thường khuếch đại tốt nhất đối với đoạn DNA dài khoảng

1.000- 1.200 bp

1.5.5 Tối ưu hóa PCR

- DNA mẫu

Sử dụng DNA khuôn có chất lượngtinh sạch cao Ngoài ra sử dụng quá nhiều

DNA sẽ làm giảm độ đặc hiệu của phản ứng và khuếch đại những đoạn DNA khôngmong muốn Phản ứng PCR xảy ra rất nhạy dễ bị xảy rasai sót sử dụng DNA ờ các mức từ 1 - pl thực hiện 3 lần mỗi lần phản ứng để kiềm tra hàm lượng DNA ở

phản ứng nào là tốt nhât

- Tối ưu nhiệt độ gắn mồi

Khi đặt mồi nhà cungcầp sẽ cung cấp nhiệt độ gắn mồi nhưng ở mỗi công ty sẽcho nhiệt độ gắnmồi khác nhau dựa vào công thức tính củanhà cung cấp Tacũng có

thể tựtính nhiệt độgắn mồi:

Tra=2ộ4+ 7) + 4(G+q

Tm là nhiệt độ nóng chảy( melting);

Ta là nhiệt độ gắn mồiTrong đó: A T, G, A'bằng với số lượng của mỗi bazơ nitơ nàyưong trình tự mồi

Nhiẹt dộ nóng chảy chịu ánh hưởng hời các yếu tố nồng độ muối đệm, pH,

nong đọ moi nhưng những điêu này không đáng lo ngại Tối ưu nhiệt độ gẳn mồi ở các

mức 34 c, 56 c, 57°c, 58°c thực hiện 3 lán mỗi lẳn 4 phản ứng để kiểm tra nhiệt độ gắn mồi

Tối ưu nồng độ MgCl2

Nông độ MgCl2 giúp cho phản ứng PCR hiệu quà và chính xác khi ở nồng độ của nó Tối ưu hóa nồngđộ MgCl2 ở cácmức nồng độ từ 1.5 _uM, 2 pM, 2,5 pM, 3 (1M

khi điêu chỉnh nông độ nàycân điều chỉnh ở mức độ nhỏ ( khoảng 0,5 uM), thực hiện

3 lần mỗi lần 4phản ứng để kiểm tra tối ưu nồng đệ MgCl2

- Tối ưu nồng độ

rối ưu nồng độ mồi trong PCRrất quan trọng Neu bạn thêmquá nhiều mồi, sẽ

làm tăng khả năng liên kết không đặc hiệu hoặc thậm chí bắt cặp lẫn nhau Quy luật

chung, nồng độ mồi tổng số thường ờ mức 1 pM Để tăng độ đặc hiệu, có thể giảm xuống thấp ở mức 0,1 Ị-iM, tuy nhiên điều này có thể làmgiảm hiệusuất PCR

- Tối ưu nồng độ dNTPs

Nồng độ của cac deoxynucleotides (dNTPs) ảnh hường tới cà độ đặc hiệu và năng

suất của PCR Nồng độ dNTP quácao sẽ làm giảm độ đặc hiệu, trong khi quá thấp sẽlàm giảm hiệu suất Đểtối ưu nồng độ dNTP, tiến hành lặp lại 3 lan mồi lần thực hiện

3 phản ứng multiplex PCR giống nhau về thành phần, chi khác nhau về nồng độ

nó chỉ gắn nucleotide vào mồi có sẵn theo nguyên tắc bổ sung Trong sao chép DNA

tự nhiên, mồi là các đoạn RNA ngắn, RNA này được tạo ra bởi RNA polymerase, nó

được loại bỏ đi và thay thế bằng DNA bời DNA polymerase Trong sinh học phân tử

để xác định một đoạn DNA cần phãi cỏ mồi, các đoạn mồi này thường được thiết kếngắn khoảng 18-25 base, cấu ưúc thật sự của các mồi này bắt đầu bằng các 3' -

hydroxyl nucleoside găn với một cái gọi là CPG (controlled-pore glass) Đâu 5 -

hydroxyl của nucleosideđượcdimethoxyưityl (DMT) bao phủnhăm ngăn sự thành lập

TRƯỜNG ĐH NGUYỄN TẤT THÀNH

chuồi nucleotide Để thêm vào I nucleotide thi phái loại bỏ DMT theo cách hóa học,

va 1 nucleotide được thêm vào Đầu 5'-hydroxyl cùa nucleotide mới bị khóa lại bởi

DM I nham ngăn chặn sự găn thêm vào 1 hay nhiều nucleotide trên 1 chuỗi Sau đó, chutrinh dược lặp lại đôi với môi nucleotide bans ỉ mơi

1.6.3 Ý nghĩa lựa chọn mồi

Việc chọn lựa một cặp mồi có một ý nghĩa quan trọng khi muốn ứng dụng PCR

có hiệu quả và độ chính xác cao Vì thế, chúng ta phải có một thiết kế chính xác về

oligonucleotide Trình tự của mồi được chọn xác định kích thước và vị trí của sànphẩm PCR, nhiệt độ Tm và nhiệt độ Ta của vùng được khuếch đại được thiết kế đúng

có thể giúp chúng ta tránh tạo ra những sản phâm PCR không đặc hiệu

chu kỳ PCR, một cặp mồi có thể khuếch đại ra một sản phẩm Với một trình tự DNA

đã đươc cung câp người ta có thê phân tích moi tren may tinh đe co mọt ket qua can

bằnggiữa hai mục tiêu nói trên

Sau khi lựa chọn và thiếtkế các mồi mới để đảm bảo tínhhiệu quảcần chạy thử kiểm tra trước một số cặp mồi đế tìm ra phương trình nào giúp các cặp mồi đạt đượchiệu quả cao nhất trong quá trình khuếch đại vùng trình tự mong muốn Kiểm tra và

đánh giá hiệu quảcủa tất cả cặp mòi đã thử nghiệm và đưa ra đượccác cặp mồi có khả

năng sẽ phân định được loài lan Hài tại ViệtNam

1.6.4 Các tiêu chí thiết kê

Độ dài của môi: Độ dài cùa mồi thường dài từ 15 - 30 nucleotide, nếu như mồi dải hơn 30 nucleotide sẽ tạo được độ đặc hiệu của mồi cao tuy nhiên mồi sẽ khó

băt cặp với khuôn Nêu như mồi ngắn hơn )5 nucleotide thi độ đặc hiệu của mồi thấp nhưng môi sẽ dê dàng bắt cặp với khuôn hơn Vi vậy dể mồi có thể gắn dễ dàng với DNA khuôn ta nên lựa chọnmồi ở khoảng tữ 18- 24 nucleotide.

- Chiêu của mồi: Mồi xuôi (Forward ) tiếp hợp với mạch 3’ - 5’ ở đầu 3’ vàquá trình kéo dài diễn ra bắt đầu từ 3’ - OH cùa mồi Kết quả sẽ nhân bản được mạch

có chiều 5’ - 3’ Mồi ngược (Reverse ) tiếp hợp vỡ’’ mạch có chiều 5’- 3’ ởđầu 3’, mồi

ngược nhân bản đượcmạch có chiều 3’ -5’

- Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm): Trong PCR việc thiết kế một đoạn mồithì 2 yếu tố: chiều dài đoạn mồi và% GC dều inh hường dến nhiệt độ nóng chảy củamồi Tm là điểm nhiệt độ mà tại thời điểm dó 5 ': các sợi đôi DNA tách nhau thành

các sợi đơn DNA Nhiệt độ Tm nên nằm trong khoảng từ 55 - 65°c thi khả năng cao

sẽ tạo ra được sản phẩm mong muốn , độ dao động nhiệt giữa 2 mồi 2 - 5°c , khôngđược vượtquá 5°c nếu không sẽ khôngtạo ra được sảnphẩm

Công thứcđơn giản (Tm):

Tm=4°c X(G+ C) + 2°c X (A +T)

- Nhiệt độ gan mồi (Ta): Nhiệt độ gắn mồi (Ta) được chọn cho phàn ứng PCR dựa trực tiếp trên chiều dài và thành phần của mồi nói chung ta có thể chọn nhiệt độ

Tadưới khoảng 5°c sovới nhiệt độ của mồi Công thức tính(Ta):

Ta = 0,3 X (Tm của mồi) + 0,7 X (Tm củasản phẩm) - 25Nếu như nhiệt độ Ta quá thấp thì một hoặc cả hai mồi sẽ bám vào một trình tựkhác so với mục tiêu dự định Điều này có thể dẫn đến sự khuếch đại PCRkhông đặc

hiệu và do đó sẽ làmgiảm năng suất của sản phẩm mong muon Ngược lại, nhiệt độ Taquá cao có thể làm giảm hiệu quả phản ứng, khả năng bám của mồi giảm đáng kể.Nhiệt độ ủ tối ưu sẽ dẫn đến sản lượng sàn phẩm mong muốnnhất

- Mật độ GC: Số lượng GC ành hưởng đến nhiệt độ Tm, không nên quá nhiều

G hoặc c nối tiếp nhau, phần trăm GC nên nằm trong khoảng 30% < G + c < 70%,tốt nhất là nên nằm trong khoảng từ 50 - 60% G nổi với c bằng 3 lièn kếthydro sẽ tạo

ra được lực mạnh hơn so với A nối với T, vì vậy đầu 3’ của mồi nên có ít nhất mộtc

hoặc c sẽ tạo ra được mối liên kểt bền vừng hơn Tuy nhiên nên tránh việc thiêt kế 5 base đầu 3’ có nhiều hơn 3 G hoặcc khiến đầu liên kết 3’ quá mạnh khiến mồi bắt cặp

không hiệu quả

1.6.5 Lưu ý trong thiết kế mồi

- Hình thành hiện tượng kết cập (dimer): Các mồi được thiết kế nên được

kiêm tra xem chúng có hình thành dimer không Dimer (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau), tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhờ vả lam 2Ĩảm lượng mồi bắt cặp vớikhuôn Do đó cần tránh tạo ra hiện tượng kết cặp

- Câu trúc kẹp tóc: Câu trúckẹp tóc là cấ_ trúc thứ cấp phổ biến rất dễ xảy ra, kẹp tóc hình thành khi hai trình tự bổ sung trong mội đơn phản tửgặp nhau và kết nốivới nhau, vòng kẹp tóc cũng có thể hình thành các phản từ DNA và rạo ra sản phẩm không mong muốn Có thể được hình thành bới sự tương tác bên trong chính đoạnmồi Cầntránh điều này vì làm giảm hiệu quá CÚ2 phán ứng PCR

- Lặp: Là hiện tượng lặp lại nhiều lần của trinh tự đôi hoặc dơn, điều này có thể dẫn đến sự bắt cặp nhầm, vì vậy độ lặp tối đa cùamột mồi có thể là 4

- Tương đồng chéo: Là hiện tượng cặp mồi khuếch đại một gen khác trong hỗn hợp tạo ra sản phẩm không đúng chủ đích Đe tránh hiện tượng này, mồi sau khithiết ké cần được đưa lên BLAST để so sánh và kiểm ưađộ đặchiệu

1.7 Kỹ thuật điện di

Điện di là kỹ thuật dùng để phân tích các đại phân tử tích điện Trong sinh học phân tửngười ta sử dụng phương pháp điện di để tách ly, phát hiện phàn tử DNA Axitnucleic mang phân tử điện tích âm, chúng có thể dịch chuyên qua báng gel từ cực âm

(cathode) sang cực dương (anode) dưới tác dụng của điện trường Trèn cùng bảng gel cùng một dòng điện những DNA khác nhau về trọng lượng nên khác nhau về điện tích

và chạy được những quãng đường khác nhau Kĩ thuật này sử dụngmột dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo dòng điện ổn định Một bản gel đóng vai ưò là thể nền đểphân tách các phân tử, và các chất nhuộm khác nhau (ethumdromide, xanh coomassie,

bạc ) để phát hiện vị trí các phân tử gel sau khi điện di Trong điện di người ta sử dụng một thang DNA chuẩn, khi cho chạy cùng các mẫu ưong nghiên cứu qua đó cóthể so sánh DNA mẫu với DNA chuẩn đểbiết chiều dài cùa DNA nghiên cứu

1.8 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nưóc về các vùng trình tự để sử dụng trong nhận diện chi lan Hài (Paphiopedilum)

1.8.1 Các nghiên cứu trên thế giói

20

Ngây nay, sinh học phân tứ dã phát triền nhanh chóng giúp các nhà nghiên cứu

xác định dược các loài nhờ sử dụng trinh tự D; -A nhờ xác định được trình tự của các vùng đã giúp các nhà khoa học phân định dược loài vã suy luận mối quan hệ phát sinhchủng loài giữa cácsinh vật, đặc biệt là loài lan

Hemant Kumar Singh, Parveen và ctv cúng -d cộng sự dã nghiên cứu mã vạch

vê loài lan Denrobinm, trong nghiên cứu tác già đã nhận thấy vùng ITS có độ phânbiệt loài lên đên 100%, matK 80,56% Sự kết hợp hai vùng trình tự của matK + rbcL

86,11% trong 36 loài Trong số các kết hợp được khuyến nghị, mã vạch dựa trên ba

vùng matK, rpoB và rpơCl đãgiải quyết số lượng tối đa các loài (Singh và ctv, 2012)

Các mối quan hệ nhân sinh học trong chi PaphiOpedilum được nghiên cứu bàng cách sử dụng dữ liệu chuỗi trình tựvùng ITS và dữ liệu trình tự plastid Các kết quà xác nhận rằng chi Paphiopedilntn là đơn bào, vả sự phân chia của chi này thành ba

dưới chi là Parvisepalum, Brachypetalum và Paphiopedilum. (Sun và ctv, 2011)

Cùng năm ay, Xiang và ctv đã đánh giá orchidaceae là một trongnhững họthựcvật có hoalớn nhất Nhiều loài lan đang bị đe dọa nghiên trọng vàtất cả đều được đưavào Công ước về buôn bán quốc tế các loài nguy cap (CITES) I và II nhưng rất khó để

có thể xác định các loài lan với nhau Chi Holcoglossum (Orchidaceae: Aeridinae) rất

khó trong phân biệtgiữa các loài với nhau Tác già đã sử dụng các vùng rỏcL, matK,

atpĩ-atpỉỉ, psbK-psbỉ, trnỉỉ-psbA và vùngITS để phân biệt các loài trong chi này Kết quả thu được vùngpsbKrpsbỉ và cho kết quả thấp còn các vùng còn lại chokết quả cao trong phản ứng khuếch đại Các vùng ITS và mưtK có độ đột biển cao

nhất Trong số 6 vùng nghiên cứu maiK. đã phân định được 8 trên 12 loài

Hoỉcoglossum và có khả năng phân biệt cao nhất Tuy nhièn sự kết hợp giữa vùng

matK và ITS cho thấy khả năng xác định các loài cao hơn matK Trong nghiên cứunày, matK đã chứng minh là vùngquan trọng trong nghiên cửu mã vạch DNA(Xiang

và ctv, 2011)

Đến năm 2012, Parveen đà nghiên cứu mã vạch DNA của các loài

Paphiopedilum và 3 loài lai ờ Ấn Độ Năm locus được dùng để nghiên cứu là rpóB,

rpoCỈ, rbcL, maf&, nrlTS Kèt quả tính toán cho thấy phân biệt rõ 8 loài

Paphiopedilum bằng vùng m«ưK là 100%, vùng nrlTS chỉ phân định được 50%

(Parveen và ctv, 2012)

o đây, tác giả chọn 8 mã vạch lục lap va nến để đánh giá sự phù hợp của chúng trong loài Paphiopedilum Két quà cho thấy tất cả các mã vạch thử nghiệm không có khoảng trông mã vạch và mã vạch của cáy cơ sờ có độ phán giải thấp để xác định loài

Paphiopedilum (18,86%) Trong mã vạch đơn locus, nrỉTS là hiệu quà nhất cho việc xác định loài của chi (52,27%), trong khi matK - G'pĩ - aípH là sự kết hợp đa địaphương hiệu quả nhất (28,97%) Do đó, tác già đẻ xuất nên kết hợp matK + atpF -

a/pH + I rs làm mã vạch choloài Paphiopediliiir G-ũ á ctv 2016)

1,8.2 Các nghiên cứu trong nưóc

Năm 2012, nhóm nghiên cứu của Phan Ke Long đã dựa nghiên cứu vùng ITS, kết quả cho thấy 5 loài lan Hài ở Việt Nam vùng ITS có dao động từ 659 bp đến 700

bp kết quả cho thấy chiều dài đoạn ITS - rDNA của các mẫu lan Hài ở Việt Namkhá giống với trình tự đã công bố trên Genbank Sự sai khác thể hiện giữa loài P

micranthiưn, p hangiamim, p malipoense cả ở chiều dài đoạn ITS và cả nucleotide ờmột số vị trí Tuy nhiên sự sai khác này là không lớn lẳm có thể do tính đa dạng di

truyền trong cùng 1 loài làkhá cao (Phan Kế Long, 2009)

Nhóm nghiên cứu của Khuất Hữu Trung đã giải trình tự cho vùng ITS (ITS1,5,8S, và ITS2) cho 16 loài và hai giống hoa phong lan Paphìopedilum ở Việt Nam.Xác định mối quan hệ giữa các loài này ở mức độ phàn tử Kết quả cho thấy các khu vực có đột biến cao trongvùng ITS rấthữu ích cho việc phàn tích phátsinhloài như là

bộ dữ liệu tốt hơn cho việc xác định mối quan hệ giữa các loài Paphiopedilum(Khuất

Hữu Trung và ctv, 2013)

Theo một công trình nghiên cứu do nhóm chúng tôi thực hiện để khảo sát tấtcả

các vùng trình tự của loài lan Hài Paphiopedìlum từ cơ sờ dữ liệu GenBank và tìmkiếm các vùng có tiềm năngphân định loài lan Hài cao có nhiều vùng tiềm năng mới được đề xuất như: ACO, LFY, atpĐ-rbcL rpoCl, mơtK. Vùng matK. có kết quả phân định loài cao hơn khi phân tích đoạn trình tự dài hơn Vì vậy nghiên cứu cũng khuyếnkhích sử dụng đoạnmatK dàihơn đề phàntích định dạng loài (Tài liệuchưa công bố)

22

Chương 2

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CƯU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Lựa chọn môi có săn từ các nghiên cứu đã cõng bố trước đó có tiềm năng cao khuếch đại các vùng matK, ACO, trnLcho lan Hài Paphiopedilum)

1 hiêtkê môi mới đặc hiệu cho chiPaphìopỉ^Piiưn để khuếch đạicác vùng ACO

vả trnL.

- Khuêch đại 3 vùng trình tự matK ACO ^’.'L dựa trên các mồi đã chọn lọc vàthiếtkế

- Đánh giá hiệu quảcác mồi sửdụngtrong nghiên cứu

S o- đồ 2.1: Nội dung nghiên cứu

2.2 I hời gian và địa điếm nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 02/20ỉ 7 - 08 2017

Địa diêm: Phòng thí nghiệm Sinh học Phán từ Thực vật, Khoa Nông nghiệp

Công nghệ cao và Công nghệ Sinh học trường Đại Học Nguyễn Tất Thành Địa chỉ:

2374, Quốc lộ 1A, Phường Trung Mỹ Tây, Quận 12.Tp Hồ ChíMinh

2.3 Đối tượng nghiên cứu

- 54 mâu DNA lan Hài (Paphìopedìlum)CL3 nhóm nghiên cứu sinh học phân tử lan Hài Khoa Nông nghiệp Công nghệ Cao và C ng nghệ Sinh học trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

- Các trìnhtựACO, trnL, maiK của chi lan Hả: Paphiopedilum thu được từ cơ sở

dữ liệu GenBank

2.4 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất

Bảng 2.1: Danhmụcdụng cụ sửdụng trong nghiên cứu

Bảng 2.2: Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

5 Bình duran 250 ml, 500 ml 12 Micropipette (pipetteman) các loại

1,5 ml; 2 ml

1 Nước cất 2 lần khử ion CTCP Hài Dương 02081

24

7 MyTaq™ Mix Bioline BIO-25042

Bảng 2.3: Danh mục thiết bị dung ìrcng nghiên cứu

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp tìm kiếm dữ liệu tài liệu

Tìm kiếm các dữ liệu từ trên mạngvề Paphiopedỉlum bàng các từ khóa ACO,

trnL, mai¥L, identification of Paphiopedilutn, authentication of Paphiopedilum, classification of Paphiopedilum, discrimination of Paphiopedilum. Trong so các bàibáo tìm được ưu tiên chọn lựa các bài xuất bản gần nhất Đồng thời, lựa chọn các bàibáo khoa học nghiên cứu về3 vùng trình tự /nưíK, ACO, trnL. do sổ lượng bài bào nói

về loài lan Hài Paphiopedihim không nhiều nên chúng tôi tìm kiếm thêm bằng mở rộngtừ khóa là Orchidaceae (họ lan) Sau khi lựa chọn các bài báo được tải về, tôi tìm

thông tin các mồi trongtừngbài báo khoa học trên 3 vùng matK, ACO,trnL.

2.5.2 Phuong pháp tìm kiếm dữ liệu trình tự

Các từ khóa dùng để tìm kiềm là: ACO Paphìopedilum, matKPaphiopedilum,

trnL Paphiopedỉlum, tấtcà trình tự tài liệu đều được tải về từ trang web cơ sở dữ liệuNCBI(https ://wwv ncbi nbn nih.gov/nuccore ) với định dạngfasta

liêu chí chọn các trinh

và phải đảm b.ảo:

tự cua chi Paphỉopedilum tải về theo từng vùng riêng lẻ

- Có tên loài đặc hiệu cụ thể

- Chiều dài của đoạn gen phải từ 300 bp trờ lén

Cách lấy dừ liệu:

Nhan chọn cáctrình tự-» Sendto - File - Forma/- chọn Fasta- Create File

1 rinh tự tai vê máy tính đêu được đôi tèc r.gẩn lại đề dễ quản lí và phân tíchbằng các phần mềm tiếp theo

Cac trinh tụ đượcsăp gióng cột thăng hảng ĩự động bangphần mềm Seaviewvà hiệuchỉnh bằng tay để tối ưuhóa việc sẳp gióng CỘL

Các cặp mồitìm được từ các nguồn tài liệu tham khảo, được sắpgióng cột cùng

với vùng trình tự matK, ACO, trnL của chi lan Hài (Paphiopedilum) thu được từGenBank, từ đó cho phép xác định vị tri các môi XU01, moi ngược tương ưng tren cac vùng trình tự, và trình tự mồi có trùng khớp với trình tự của chi lan Hài

(Paphiopedilum).

Tiêu chi để chọn lọc những mồi có độ trùng khớp (Identity) cao so với tình tự cùa chi lan Hài (Paphiopedilm) nhữngmồi cóđộ sai lệch từ0 - 2 nu sẽ đuợc giữ lại

và tiếp tục kiềm tra bàng phần mềm PrimeứPlus, những mồi sai khác từ 3 nu trở lên

hoặc không trùng với tình tựcùa chi lan Hài (Paphiopedilum) thisẽ loại bỏ

Lựa chọn các môi xuôi và mói ngược đe khuếch đại đoạn mong muốn có chiềudài khoảng 1.200 bp, những cặpmồi khôngphu hợp hoặc nẩm quá gần nhau sẽ loại bỏ.

Do các cặp mồi của các tác giả dã sử dụng không khuếch đại được đoạn trình tự

mong muôn nên chúng tôi chọn mồi xuôi cùa tác giã nảy và mồi ngược của tác giảkhác Chúng tôi tiên hành kiểm tra mồi với các: cấu ưức kẹp lóc (hairpin) chỉ số này ở

từ 0.0 đên 30.0 là tôt nhât nêu quá cao phân mém sẽ hiện cành báo đỏ, mồi tự bắt cặp (selt-dimer) tốt nhất từ 0,00 đến 3,00, nhiệt độ Tm giữa 2 mồi không cách nhau quá 5°c, phần trăm GC tốtnhất làtừ 40 - 60 %

Các môi được Primer3Plus đánhgiá tôt sẽ được đưatrở lại Seaview đê kiểm tra lại

trình tự với 3 vùng maiK, ACO, Zr«L có trũng với trình tự của lan Hài

Right Primer 1: CCACTCTGTGCATCACAC

LSend to Pnm«3.‘.lanjgw Rer«t Forni

101

GTGAA7GCTG 2ACCTCA7GT GAGCTCA7GG

G2TCGATAAA ACAGGGTGGA CGG27CAAGG CAGCGACAAC TZ7CCAACA2 7CCAAACA7A TCAgTGCG?

GG7GGAGCTG AC77GGGG7T GGGAAGCCGA GCCGGAGC7C 7TC2GCTCTĨ GGAAAC7GGG CGGCGACCAG

GAGAAGCCGG GGA.GAAGGGG

TACGATGACT ATGCAGCTTC GGCCGCCACC

CC2T2GGGAC A7CAACGGGC CCAGGA7GAZ TCGACG7CCC

AA77CGCCGC CTCGACTGGG C7CCGACG7C

7GAACCACGG AAGGAGCAC2 CAAGGCCCT?

AAAGCACCTT CCTGACCTCG

Hình 2.2 Các tiêu chí thiêt kê môi

2.5.4 Phưong pháp thiết kế mồi

Sử dụng file Seaview cùa các trình tự đã sắp gióng cột ở ưên đề xác định các

vùng bảo tồncủa chi lan Hài (Paphiopedilum).

Phân mêm Primer3Plus lúc này được dùng đế thiết kế mồi mới cho lan Hài

Các bước thiết kế mồi

Bước 1: Để mục Load server settings ở chế độ mặc định (default) Lấy 1 trình

tự đại diệncủa mỗi vùng matK, ACO, trnL đểdán (paste) vào khungnhập liệu

Main General Settings Advanced Settings Internal Oligo Penalty Wetgilts Advanced Sequence

Load server settings: Default _ * j pActivate Settings 1

Task: 1 generic _ * 1 ttạtpĩữĩiĩiiỊỉitttđ Ũ??:3ĨÌ£Ì> mcludid txíỉadcd Vfu-x: -7».'r-.d

PKt Renew 1 Reset Form ,

theo tiêu chuẩn của thiếtkemoi

28

Chiêu dài cùa sàn phẩm (Product size ranges): >= 250 bp để dễ quan sát trên gelagarose, bạncó thểtùy chỉnh theo nhu cẩu cùa minh.

- Chiều dài của mồi (size): 18-22 bp

- Khoảng nhiệt độ bắt cặp (Tm): 57 - 63°c vớ: nhiệt độ chênh nhau (Max Tm

pick primers from a DNA sequence About

Main General Settings Advanced Settings Internal Oỉi‘4: Peaair Weights Advanced Sequence

Product Sue Ranges 501-4500 601-700 401-600 701-S5O 851-1000 1001-1500 y.y-ẽ.'.:: 301-MM) 201-30

Primer Till Min: 57 0 Opt 60 0 Max 63 0 Max ~m Difference 3

Primer GC°O Min: 40 Opt 50 0 Mas-Sd

Concentration of monovalent cations- 500 Annealing Oligo Cor.cer.mncr 60 0

Concentration of divalent cations 15 Concentration of dXTPs 06

Misprinting Repeat Library NONE »

Load and Save

To upload or save a settings tile from your local computer, choose here:

Hình 2.5 Giao diện khai báo mục Genral Settings trongPrimer3Plus

Bước 3: Khai báo mục điều chỉnh bằng cách Điểu chình các thông số ở

mụcAdvanced Settings

- Max Poly-X: (trình tự mồi không nên cỏ quá 4 nucleotides liên tiếp giống

hệtnhau)

- Max #N’s: 0 (các nucleotide bị lỗi do giải trìnhtự ở dạng N phải được loại bỏ)

- Number To Return: 1 (Số cặp mồi tôi muốn nhận được) Các thông số còn lại

có thể đểở chếđộ mặc định

pad: fcuaen t«ũ a DNA sequence

~-e ^ - er er sen-.iực Default • Actứate Swires

Task: jenertc '

ĩ íí»r«r' •«£•/■? Ễ1 'ẽ ■■< , ',y -r Pick Prunm I Reset Ferm

•■’ ■ • ftri r • ■ »< i r« : 4 íỹ^e 'li ~ - - t

Internal Gliq.-a e"jir- Adi anted Sequence Main General Settinjs Advanced Seninv

MaxPolv-X If J Table of theraiod- namie canri

CG Clamo 0 v$e Thermodynamic •* A ct - axr> Starting -Airfa TH

Max End GC ,5 Vse ThemiQdvnanuc fetSw - : T-ir.e^:.- ActreMet TH SeninfvVERY SLOW

«8

>~ụmt>eĩ Ĩĩ Rtnirn EZZ Max End

Siabtltr-5 Prime Junction Overlap- 7 ? Prime Junction Q-'j!aạ «

Min Left primer End PiUAvce EZ Mui Ricin Pnmer End re-

-Max Self Complementarity a 00 Max Pair Complementary i&i

TH M ax Self ConiDlementantv* 47 00 TH Max Patt Camretneinrr

Max End Self Complementarity: 3 00 MaxPaa End Coniplegieryi 3«

TH Max End SelfComul 47 00 TH Max Pair End c.-me.y-a —

TH M ax Hairpin

Max Template Mimnmine

-7 CO

12 00 Pair Max Template Mi-rrn r ur.

TH Max Template Mnnnmine 47 00 TH Pau Max Temp-re:', -rar ÃTÍO

Max Library Miwnnnne- Pau Max Library M;a;y .- ĩĩ;

Internal Mun March •

Peun-Hình 2.6 Giao diện khai báo mục AdvancedSettings trong Primer3Plus

Bước4: Nhấnnút Pick Primers, chương trình sẽ chạy và cho ra các cặp mồi phù

Start: 630 Length 20 bp Tin: 60.0 c OC: 55.0% AaỵiO O End 0.0 12 s o a2_ 0 0 ? ỹỹ? 3 2 ?T2eú~v 0 034

Right Pnmer 1 ĂTÕCTGTTGCCGTCACTCTG

Swr 1131 Length 20 bp Tin 60.0 c oc 55.0 *0 Anv 0.0 Emi 0 0 TB s o H? 0 0 3' So’b 3 * 0 03*

Pain Product Size: 502 bp Anv 0.0 End: 3.9 TB' 16 0 0-070

Í Send to Prime<3Manag<f 1I R m *( Foon j

1 GTGAATGCZG CC77C7C27T TACGA7GACT AXTCGT2ATA 2ATTCAZGAG

SI TACCTCATGT GT7CGAI2AAA A2GCAGC2TC 7GAACCACGG GATC7CGCAC

101 GAGC7CA7GG ACAGGGTGGA GGCCGCCKCC AAGGAG2ACT ACAGGCGC77

151 CCGTGAGCAA CGG7TCAAGG AAT2CGCCGC CAAGGCOC2T SAA3-CAGGGG

201 AGAAGG7CGA CAGCGA2ẦAC CXGACTGGG AAAGOkỌCST CTTCCTOCGC

251 CACggCCCZG TTTCCAACA7 OTCMACGTC CCTGACCTCG ATGACTCCTA

OẠ1 z>z»zN*»rkrs/*/»5r> rv«^* * *•** wxx •»-»

Hình 2.7 Các cặp mồi cỏ độtương thích caoKết quả xuất ra các trình tự cùa mồi cỏkhà năng cùng với các thôngsố phù hợp như các tiêu chí đã nhập trong mục thiết kế mồi Sau đó đưa các mồi lên phần mềm

Seaview để kiểm tra độ đặc hiệu của các mồi thiết kế

2.5.5 Khuếch đại các vùng trình tự bằng các mồi chọn lọc và thiết kế

Sử dụng 54 mầu thuộc 22 loài lan Hài để tiến hành khuếch đại 3 vùng trình tự

matK, ACO, trnL đà lựa chọn và thiết kế

30