Xác định thành phần hóa học tinh dầu và xác định cấu trúc một số hợp chất từ lá và cành nhỏ của cây vối ( cleistocalyx operculatus (roxb) mer et pery ) ở triệu sơn thanh hóa

Phân tích thành phần hoá học tinh dầu Lá và cành nhỏ của cây cây Vối cleistocalyx operculatus Roxb... Nhằm tìm kiếm nguồn nguyên liệu phục vụ cho công nghiệp dược liệu, hương liệu nên ch

Ở TRIỆU SƠN THANH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

THANH HÓA, NĂM 2022

Ở TRIỆU SƠN THANH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 844.01.14

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Ngô Xuân Lương

THANH HÓA, NĂM 2022

Danh sách Hội đồng chấm luận văn Thạc sỹ khoa học

(Theo Quyết định số 1502 / QĐ- ĐHHĐ ngày 05 tháng 07 năm 2022

của Hiệu trưởng Trường Đại học Hồng Đức)

Học hàm, học vị

Chức danh trong Hội đồng

TS Trịnh Thị Huấn Trường Đại học Hồng Đức Chủ tịch HĐ

TS Ngũ Trường Nhân Trường Đại học Tây Nguyên UV Phản biện 1

TS Lê Thị Hoa Trường Đại học Hồng Đức UV Phản biện 2

PGS.TS Trần Quốc Toản Viện HCTN – Viện Hàn lâm

KH&CN VN

Uỷ viên

TS Nguyễn Thị Ngọc Vinh Trường ĐH Hồng Đức Thư ký

Xác nhận của Người hướng dẫn

Học viên đã chỉnh sửa theo ý kiến của Hội đồng

Ngày tháng năm 2022

PGS.TS Đinh Ngọc Thức

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này không trùng lặp với các khóa luận, luận văn, luận án và các công trình nghiên cứu đã công bố

Người cam đoan

Lê Đình Lâm

em bạn bè động nghiệp Từ đáy lòng mình tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc

Chắc chắn luận văn sẽ không tránh khỏi những khiếm khuyết, rất mong nhận được sự đóng góp của những nhà khoa học, các thầy giáo, cô giáo và những người quan tâm

Tác giả

Lê Đình Lâm

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 0

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

DANH MỤC SƠ ĐỒ viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

3 Đối tượng nghiên cứu 2

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về cây họ Sim 3

1.1.1 Thực vật học 3

1.1.2 Thành phần hoá học 5

1.1.3 Cây Vối : 6

1.1.3.1 Mô tả thực vật 6

1.1.3.2 Thành phần hoá học chính của cây vối 6

1.1.3.3 Hoạt tính sinh học và sử dụng của cây vối 9

1.1.3.4 Thành phần hóa học cây vối 9

Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 Phương pháp lấy mẫu 10

2.2 Phương pháp xác định thành phần hóa học của tinh dầu 10

2.2.1 Thiết bị 10

2.2.2 Hóa chất 10

2.2.3 Nguyên liệu 10

2.2.4 Phương pháp chưng cất 11

iv

2.2.5 Phương pháp xác định thành phần hóa học 11

2.3 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các chất 11

2.3.1 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 11 2.3.2 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 12

2.4 Cơ sở lý thuyết của phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 12

2.4.1 Spin hạt nhân và cộng hưởng từ hạt nhân 13

2.4.2 Cơ sở vật lý của thực nghiệm NMR 14

2.4.3 Sự kích thích và hiện tượng hồi phục 15

2.4.4 Tác nhân phân giải 16

2.4.5 Hiệu ứng hạt nhân overhauser – phổ NOE 17

2.4.6 Từ trường mạnh – kĩ thuật đa xung 19

2.4.7 Phổ DEPT và INEPT 20

2.5 Các phương pháp sắc ký 22

2.6 Phương pháp vật lý 22

2.7 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn 24

2.8.Nghiên cứu các hợp chất từ cây Vối (cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry.) 24

2.8.1 Nguồn nguyên liệu: 24

2.8.2 Tách tinh dầu: 24

2.8.3 Phân tích tinh dầu 24

2.8.4 Phân lập các hợp chất : 25

2.8.5 Số liệu các hằng số vật lý và số liệu phổ của các chất LL1, LL2 và LL3 27

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Định lượng tinh dầu 29

3.2 Phân tích thành phần hoá học tinh dầu Lá và cành nhỏ của cây cây Vối (cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry.) 29

3.3.Biện luận xác định cấu trúc chất hợp chất LL1, LL2, LL3 31

3.3.1 Hợp chất LL1 31

3.3.2 Xác định cấu trúc hợp chất LL2 32

v

3.3.3 Hợp chất LL3 34

3.4 Kết quả thử hoạt tính sinh học của 3 chất tách được 36

KẾT LUẬN 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC P1

vi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tinh dầu lá vối ở Quảng Châu, Trung Quốc 7

Bảng 3.1: Thành phần hóa học tinh dầu lá và cành nhỏ của cây Vối (cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry.) ở Triệu Sơn, Thanh Hóa 30

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ DEPT của LL1 31

Bảng 3.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất 33

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR của LL3 34

vii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây vối ở Triệu Sơn Thanh Hóa 6

Hình 2.1 Sự định hướng của electron 13

Hình 2.2 Các moment từ hạt nhân trong từ trường Bo 15

Hình 2.3 Sự tách năng lượng giữa các trạng thái spin 16

Hình 2.4.a Phổ 1H NMR của n – hexanol đo bình thường 17

Hình 2.4.b Phổ 1H NMR của n – hexanol khi thêm tác nhân phân giải 17

Hình 2.5 Thực nghiệm NOE vi sai đối với dẫn xuất nitrobenzo diazepinon 18 Hình 2.6 Phổ 1H NMR của một dẫn xuất adamantan 19

Hình 2.7 Phổ 13C DEPT của 3- axetyl oleanolat metyl Khử bỏ hoàn toàn tương tác spin – spin hiệu của CH và CH3 dương, của CH2 21

Hình 2.8 a Phổ 13 C NMR của vanilin 21

Hình 2.8b Phổ INEPT với xung chiếu lên H5 được lựa chọn 21

viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Ngâm chiết cành và lá nhỏ và chiết với các dung môi cây Vối 25

Sơ đồ 2.2: Phân lập các hợp chất từ dịch chiết etyl axetat của Lá và cành nhỏ

của cây cây Vối (cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry.) 26

đó đã có trên 2000 loài thực vật đã được nhân dân ta sử dụng làm nguồn lương thực, thực phẩm, lấy gỗ, tinh dầu, thuốc chữa bệnh… Trong hệ thực vật Việt Nam, nhóm các cây có tinh dầu rất phong phú và đa dạng Đến nay

đã thống kê được khoảng 657 loài thuộc 357 chi và 114 họ (chiếm khoảng 6,3% tổng số loài; 15,8% tổng số chi và 37,8% số họ) [6] Các nhà nghiên cứu đã tổng hợp được rất nhiều hợp chất có tác dụng chữa bệnh, song các hợp chất này có một số hạn chế nhất định, như là gây những phản ứng phụ không mong muốn Mặt khác, Việt Nam là nước đang phát triển, thu nhập bình quân đầu người thấp, các loại thuốc chữa bệnh hầu hết nhập từ nước ngoài và có giá thành cao, gây nên khó khăn cho người sử dụng Do đó, nhà nước đã có chủ trương tăng cường sản xuất thuốc trong nước, hạn chế nhập khẩu, hạ giá thành sản phẩm Một trong các nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc được lấy ra

từ thiên nhiên Vì vậy, vấn đề đang được đặc biệt quan tâm là nghiên cứu các hợp chất được tách ra từ sản phẩm thiên nhiên Trong số các loài cây cần quan

tâm nghiên cứu có cây vối (Cleistocslyx Operculatus Roxb) Ở nước ta cây

vối mọc nhiều nơi, tập trung nhiều ở miền Trung , được nhân dân dùng nấu nước uống, kích thích tiêu hoá Lá vối và nụ vối làm thuốc chữa mụn nhọn, lở loét, ghẻ Mới đây viện Đông y cũng thử áp dụng vối làm thuốc chữa các bệnh đường ruột, viêm họng, bệnh ngoài da Từ năm 1991 trở lại đây, một số công trình trong nước và trên thế giới nghiên cứu cây vối cho thấy hàm lượng flavonoit chứa trong cây cao và một số chất có hoạt tính kháng HIV Đặc biệt một nghiên cứu gần đây nhất cho thấy nước chiết của nụ vối là thành phần của

2

thuốc trợ tim Nhằm tìm kiếm nguồn nguyên liệu phục vụ cho công nghiệp

dược liệu, hương liệu nên chúng tôi đã chọn đề tài "Xác định thành phần

hóa học tinh dầu và xác định cấu trúc một số hợp chất từ lá và cành nhỏ của cây vối cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry ở Triệu sơn – Thanh Hóa"

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

Trong luận văn này, chúng tôi có các nhiệm vụ:

- Chưng cất lôi cuốn hơi nước và chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được phần bay hơi và hỗn hợp các hợp chất không bay hơi của cây

Vối cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry

- Xác định thành phần hoá học của tinh dầu từ cây Vối cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry

- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây Vối cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry

3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây Vối cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr

et Perry ở Triệu Sơn- Thanh Hoá

3

Chương 1.TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về cây họ Sim

1.1.1 Thực vật học

Họ Sim (Myrtaceae) là họ lớn của bộ Sim (Myrptales) hay còn gọi là

bộ Đào kim nương thuộc phân lớp hoa hồng - lớp hoa lá mầm của ngành thực vật hạt kín Trên thế giới, họ Sim gồm 100 chi với gần 3000 loài phân bố ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, chủ yếu là Châu Mỹ và Châu Úc Ở Việt Nam, họ Sim gồm 13 chi với gần 100 loài được phân bố khắp 3 miền Bắc, Trung và Nam Các cây thuộc họ Sim có thể là cây gỗ lớn, cây nhỏ, hay cây bụi Lá mọc đối, đơn nguyên, không có lá kèm Hoa của chúng tập hợp thành cụm, hình chùm, đôi khi mọc đơn độc Các lá đài dính lại với nhau ở dưới thành hình chén, cánh hoa rời nhau và dính trên mép ống đài Nhị rất nhiều, bất định và xếp không theo một trật tự nào, nhị thường cuộn lại ở trong nụ, chỉ nhị rời hay dính nhau ở dưới thành ống ngắn Bộ nhị có số lá noãn thường bằng số cánh hoa hoặc ít hơn, dính lại với nhau thành bầu dưới hoặc bầu giữa với số ô tương ứng số lá noãn, đính noãn trụ giữa, một vòi, một đầu nhuỵ Quả mọng, thịt, thường do đế hoa phát triển thành, cũng có khi quả khô mở, quả mang đài tồn tại ở đỉnh Hạt không có nội nhũ [6]

Nhiều cây thuộc họ Sim có chứa tinh dầu như cây tràm (Melaleuca leucadendra Linn); cây chổi xuể (Baeckia frutescens Linn); cây bạch đàn chanh (Eucalyptus citriodora Hook F) Tinh dầu của các loại cây này đã

được khai thác và sử dụng trong công nghiệp hương liệu, dược phẩm Một số

cây khác thuộc họ Sim có nhiều công dụng chữa bệnh như: Cây ổi (psidium guajava Linn.); cây sim (rhodomyrtus tomentosa (Ait.), Hassk.); cây đơn tướng quân (syzygium formosum Var.); cây vối (cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry); cây sắn thuyền (syzygium resinosum (Gagnep) Merr

et Perry) [3] Họ sim được chia thành hai phân họ

+ Phân họ Myrtoideae có quả nhiều cùi thịt và lá đối mép trơn Phần lớn các

4

chi trong họ này có một trong ba dạng phôi dễ nhận ra Các chi của Myrtoideae có thể rất khó phân biệt khi không có quả đã chín Phân họ Myrtoideae được tìm thấy khắp thế giới trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, với các trung tâm đa dạng nằm ở Trung Mỹ, Nam Mỹ, đông bắc Australia và Malaysia

+ Phân họ Leptospermoideae có quả khô, không nứt (quả nang) và các

lá mọc so le hay theo vòng xoắn Phân họ Leptospermoideae chủ yếu được tìm thấy ở Australia Nhiều chi ở miền tây Australia có các lá bị suy thoái mạnh và các hoa mang đặc điểm điển hình cho vùng sinh trưởng khô cằn hơn

Sự phân chia Myrtaceae thành Leptospermoideae và Myrtoideae đã bị nhiều tác giả nghi ngờ trong đó có Jonson và Brigg (1984), các ông đã xác định 14 tông hay nhánh trong họ Myrtaceae và phát hiện ra trong họ Myrtaceae là đa ngành Phân tích ở mức độ phân tử của Wilson, O’Brien và những người khác (2001) đã phát hiện thấy 11 phân nhóm rõ nét trong phạm

vi họ này, bao gồm nhiều phân nhóm đã được Jonson và Brigg xác định Phân tích phân tử sau đó của Sytsma và Litt (2002) phát hiện phân nhóm Myrtoideae ở Trung - Nam Mỹ phù hợp với phân họ đa ngành Leptospermoideae [6]

Trong họ Sim, chi lớn nhất là Eugenia (trên thế giới có 600 loài, ở nước

ta có 26 loài được chuyển vào chi Syzygium) Những cây trong chi này phần lớn là cây gỗ trung bình và đa số là cây hoang dại Trong chi này có cây thuốc

quí là cây đinh hương (E caryophyllata Thunb hay syzygium aromaticum

Merr et Perry), có nụ dùng làm thuốc và làm gia vị Một số loài thuộc chi

Eugenia đã được tách ra và đặt vào chi mới như cây gioi (syzygium jambos (L.) Alston Eugenia jambos L) có quả ăn ngon, cây vối (cleislocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry) được trồng lấy lá và nụ để uống nước và

làm thuốc chữa bệnh

Dọc theo bờ biển ở miền Trung của nước ta có cây tràm hay còn gọi là

cây chè đồng (malaleuca leucadendron L) là cây to có vỏ xốp, bong từng

mảnh rất dễ bóc Lá có hình mác nhọn, cuống ngắn, gân hình cung, hoa có

5

màu vàng nhạt mọc thành bông Cây mọc thành rừng thuần loại đất phèn ở ven biển, còn gặp ở một số vùng biển phía Bắc Vỏ cây dùng để xảm thuyền,

lá dùng cất tinh dầu

Trên các đồi đất ở vùng trung du có cây chổi xuể (baeckea frutescens

L.), thường gặp mọc xen lẫn với các cây sim, mua Là cây bụi thấp, phân nhánh nhiều, có lá hình sợi dễ rụng, cây có lá dùng để chưng cất dầu thơm gọi

là dầu chổi để xoa bóp, khi pha với rượu thì thành rượu chổi

Trên các đồi trọc, trong các công viên, các vườn và đường cái có trồng nhiều loài thuộc chi Eucalyptus Chúng là cây nhập nội, trên thế giới có hơn

300 loài, phân bố chủ yếu ở châu Úc và Malaysia, sống trong những điều kiện sinh thái khác nhau Hầu hết là cây lớn, có thể cao tới 100 m Nhiều loài cho tinh dầu khác nhau Gỗ của chúng tốt có thể dùng vào nhiều việc khác nhau

Ở nước ta hiện có trồng nhiều loài như: bạch đàn trắng (E camaldulensis Dehahardt) có gỗ dùng làm tà vẹt và làm bột giấy Cây bạch đàn lá liễu hay long duyên (E exserta F v Muell) là cây trồng làm cảnh ở các công viên, có

gỗ nâu, cứng, dùng trong xây dựng hay làm gỗ trụ mỏ; dầu làm thuốc sát

trùng, trị cảm, giảm ho Cây bạch đàn chanh (E maculata H.K var citriodora (Hoof F)) trồng làm cảnh và gây rừng vệ sinh, có gỗ màu xám,

thơm cứng dùng đóng thuyền, rễ và lá cành dùng cất tinh dầu thơm, dùng làm thuốc bổ dạ dày, giải cảm, giảm đau đầu, giảm ho, sát trùng, chữa viêm phổi

Cây bạch đàn nhựa (E resinifera Sm.) có lá nhỏ dài hẹp, dùng làm thuốc ho long đờm Cây bạch đàn đỏ hay Bạch đàn lá mít (E robusta J E Smith) trồng

lấy bóng mát, có gỗ dùng làm trụ cầu, nền tầu, trụ mỏ, tà vẹt, bột giấy, còn

được dùng làm thuốc chữa cảm, sát trùng, giảm ho Cây bạch đàn lá nhỏ (E tercticornis J E Smith) có gỗ không bị mối mọt và chịu nước mặn, dùng làm

tà vẹt, đóng thành tàu và cũng được dùng làm thuốc long đờm, sát trùng [6]

1.1.2 Thành phần hoá học

Các cây thuộc họ Sim đều có chứa các hợp chất thuộc các khung flavonoit, tritecpenoit, steroit và ankanoit Ngoài ra còn có thể có một số axit béo và các hidrocacbon

6

1.1.3 Cây Vối

Tên gọi Cây vối còn gọi là chè vối, chè gội có tên khoa học là cleistocalyx

operculatus (Roxb) Merr et Perry Mọc hoang và được trồng ven bờ ao, bờ suối ở nhiều nơi đặc biệt là tại miền Bắc, miền Trung Còn thấy ở các vùng

nhiệt đới Châu Á, Trung Quốc

1.1.3.1 Mô tả thực vật : Cây vối thuộc loại cây thân mộc cỡ vừa, có thể cao tới 12 -15m Vỏ cây màu nâu đen, nứt dọc, cành cây tròn hay đôi khi có hình

4 cạnh, nhẵn Lá hình trái xoan ngược hay bầu dục, hình trứng rộng, giảm nhọn ở gốc, có mũi nhọn ngắn, hai mặt cùng màu nhạt có đốm màu nâu, phiến dày, dai, cứng, lá già có chấm đen ở mặt dưới

Cuống lá ngắn tầm 1-1,5 cm Hoa nhỏ, màu trắng lục, họp thành cụm 3-5 hoa ở nách lá Nụ hoa dài, 4 cánh, nhiều nhị Cụm hoa hình tháp, trải ra ở

kẽ các lá đã rụng Cây ra hoa tháng 5-7 Quả hình cầu hay hình trứng, nhăn nheo, đường kính 7-12mm, nháp, có dịch, khi chín màu tím Lá vối, cành non

và nụ có mùi thơm dễ chịu

Hình 1.1 Cây vối ở Triệu Sơn Thanh Hóa

1.1.3.2 Thành phần hoá học chính của cây vối

Trong lá vối có: tanin, một số chất khoáng, vitamin và khoảng 4% tinh

7

dầu với mùi thơm dễ chịu, có một chất kháng sinh diệt được nhiều loại vi khuẩn gây bệnh

Các bộ phận khác chứa sterol, chất béo… Các nhà hóa học Trung Quốc

đã xác định được trong lá vối có 0,08% tinh dầu, còn trong nụ hoa vối có 0,18% tinh dầu Thành phần hóa học có trong tinh dầu của lá vối và nụ vối được trình bày ở bảng 4 và bảng 5

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của tinh dầu lá vối ở Quảng Châu,

Tác giả Zhang Fengxion và các cộng sự [27] đã tách được 9 hợp chất từ

nụ vối sau khi đã loại bỏ tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, 8 hợp chất từ chúng đã được xác định gồm:

2, 4 - dihydroxy - 6 - metoxy 5, 7 - dihydroxy - 6, 8 -

- 3, 5 - dimetyl chalcon dimethyl - flavanon

CH = CH - COOH

OH

OH HO

COOH

OH

OH HO

7 - hydroxy - 5 - metoxy - 2, 4 - dihydroxy - 6 - metoxy -

6, 8 - dimethyl - flavanon 3, 5 - dimetyl chalcon

OH

OH

Axit oleanolic 3,5,7,4 - tetrahydroxy flavon

1.1.3.3 Hoạt tính sinh học và sử dụng của cây vối

Từ thời xa xưa con người đã biết dùng lá vối, nụ vối để đun, hãm làm nước uống hàng ngày và sử dụng để chữa bệnh… Cây vối có rất nhiều tác dụng cho sức khỏe, tuy nhiên khi sử dụng cần dựa trên tính năng của từng bộ phận trên cây để đạt kết quả tốt nhất

Đối với sức khỏe đã được chứng minh trong cả Tây Y và Đông Y, cũng như được sử dụng nhiều hàng ngàn năm nay ở Việt Nam và trên thế giới Các

tác dụng chung của cây vối như thanh nhiệt giải biểu, sát trùng, chỉ dương, Tiêu trệ Các bộ phận của cây vối được sử dụng như: Nụ hoa có thể sử dụng tươi nhưng thường phơi khô trước khi sử dụng, vỏ thường sử dụng dạng thái lát phơi khô, thân ít được sử dụng hơn, lá thường sử dụng dạng tươi pha trà,

có tác dụng Giải khát Giúp ăn ngon miệng Chống đầy bụng dự phòng các bệnh viêm nhiễm đường hô hấp và tiêu hóa

1.1.3.4 Thành phần hóa học cây vối

Các nhà hóa học Trung Quốc đã xác định được trong lá vối có 0,08% tinh dầu, còn trong nụ hoa vối có 0,18% tinh dầu Thành phần hóa học có trong tinh dầu của lá vối và nụ vối được trình bày ở bảng 4 và bảng 5

2.2 Phương pháp xác định thành phần hóa học của tinh dầu

2.2.1 Thiết bị

Bộ chưng cất Clevenger nhẹ, hệ thống máy phân tích GC-MS của hãng

Thermo Trace GC Ultra – ITQ900

2.2.2 Hóa chất

Na2SO4 khan, dietyl erther

2.2.3 Nguyên liệu

Lá và cành nhỏ của cây cây Vối (cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr

et Perry.)) được thu hái ở huyện Triệu sơn, Tỉnh Thanh Hóa, Việt Nam vào

tháng 6 năm 2021

11

2.2.4 Phương pháp chưng cất

Mẫu sau khi thu hái, được lựa chọn sơ bộ, rửa sạch để héo 2 giờ, cắt nhỏ Cho vào bình cầu của hệ thống chưng cất Clevenger 150 g Lá và cành

nhỏ của cây cây Vối (cleistocalyx operculatus (Roxb) Merr et Perry.) cắt nhỏ

với 500 ml nước Chưng cất trong 2,5 giờ Hỗn hợp được gia nhiệt bằng bếp điện, khi hỗn hợp sôi hơi nước tạo thành sẽ lôi cuốn tinh dầu đi lên và vào hệ thống ngưng tụ Sau khi ngưng tụ thu được hỗn hợp nước và tinh dầu không tan lẫn vào nhau, ly trích tinh dầu ra khỏi hỗn hợp bằng đietyl eter, làm khan dung dịch trích bằng muối Na2SO4 khan, thu được tinh dầu thành phẩm

2.2.5 Phương pháp xác định thành phần hóa học

Thành phần hóa học của tinh dầu được xác định bằng phương pháp sắc

ký khí ghép khối phổ GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) Sử dụng máy GC/MS của hãng Thermo Trace GC Ultra – ITQ900 Cột sắc ký TG-SQC với chiều dài 30 m, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp phim mỏng 0,25m Khí mang He Nhiệt độ buồng bơm mẫu (Kĩ thuật chương trình nhiệt độ-PTV) 250oC Nhiệt độ Detectơ 260oC Chương trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: 60oC (2min), tăng 4oC/phút cho đến 200oC, dừng ở nhiệt độ này trong 5 phút, tăng 10oC/phút cho đến 260oC, dừng ở nhiệt độ này trong 10 phút

2.3 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các chất

Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sẽ sử dụng các phương pháp sắc ký như sau:

- Các phương pháp kết tinh phân đoạn

2.3.1 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sẽ sử dụng

12

các phương pháp sắc ký như sau:

- Sắc ký cột thường (CC), sử dụng silicagel cỡ hạt 230 – 400/mesh

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm

- Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254 nm

- Các phương pháp kết tinh phân đoạn

2.3.2 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:

2.4 Cơ sở lý thuyết của phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Hiện nay ở nước ta việc ứng dụng các phương pháp phổ đã trở nên phổ biến và rất cần thiết trong giảng dạy, học tập, trong nghiên cứu khoa học, trong đời sống và sản xuất Phương pháp phổ không chỉ áp dụng ở phạm vi ngành hoá học mà còn ở nhiều ngành khác như hoá sinh, y dược, nông nghiệp, dầu khí, vật liệu, môi trường…

Trong các phương pháp phổ thì phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân

là không thể thiếu trong quá trình nghiên cứu cấu trúc hợp chất vô cơ, hữu cơ

và phức chất Trong đề tài này em sẽ giới thiệu một số kĩ thuật hiện đại của cộng hưởng từ hạt nhân Đây là những kĩ thuật giúp cho việc nghiên cứu được chính xác và tiện lợi hơn.[3]

13

2.4.1 Spin hạt nhân và cộng hưởng từ hạt nhân

Hạt nhân của các đồng vị có số proton lẽ và số nơtron lẻ hoặc cả hai đều lẻ thể hiện hiện tượng spin cơ học, là sự quay xung quanh hạt nhân Sự quay xung quanh trục của hạt nhân mang điện tích tạo ra dòng điện và do đó sinh ra một từ trường xác định, với lưỡng cực là , phụ thuộc và nguyên tố Điều đó có thể xem hạt nhân như là một nam châm nhỏ Sự quay này kết hợp với moment góc Moment góc được đặt trương bằng số lượng tử từ spin hạt nhân I Moment hạt nhân I = ½ n, với n là các số nguyên 0,1,2,3,…các hạt nhân có I = 0 không có moment góc và do vậy không thể hiện hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân Các hạt nhân 12C và 16O thuộc loại này Các hạt nhân

2.4.2 Cơ sở vật lý của thực nghiệm NMR

Tính chất từ của hạt nhân nguyên tử tạo cơ sở cho phổ NMR Rất nhiều hạt nhân, trong số đó có proton, có moment góc P, thẻ hiện dưới dạng moment từ  Hai giá trị này liên hệ với nhau qua biểu thức:

Theo điều kiện lượng tử mI = I, I-1, I-2, …, -I

Các số lượng tử này liên hệ với số lượng tử spin I của hạt nhân tương ứng Toàn bộ số trạng thái riêng có thể có các mức năng lượng bằng (2I + 1)

Proton có số lượng tử spin I = ½ và hợp phần z của moment góc của nó, thường được gọi là spin hạt nhân, tương ứng với phương trình được cho bởi:

Pz= hI Kết quả proton chỉ có thể tồn tại trong hai trạng thái spin đặc trưng bởi các số lượng tử từ mI=+1/2 và mI=-1/2 Hơn nữa, độ lớn của moment từ theo

Hình 2.2 Các moment từ hạt nhân trong từ trường Bo

2.4.3 Sự kích thích và hiện tượng hồi phục

Các hàm sóng hạt nhân tương ứng với mI= +1/2 và mI = - ½ được kí hiệu như các hàm riêng  và  Các trạng thái  và  của các hạt nhân với spin = ½ có cùng mức năng lượng nghĩa là chúng bị suy biến Chỉ trong từ trường đều Bo trạng thái suy biến này bị phá vở do sự tương tác của moment hạt nhân  và Bo Khi hướng của Bo trùng với hướng của trục z, như trong hình 2b một sự khác biệt về năng lượng E =2zBo=hv cho hai trạng thái spin thu được, vì thế năng của lưỡng cực từ trong từ trường Bo là zBo hoặc -zBo , phụ thuộc và sự định hướng của nó (hình 2.3) Sự tách năng lượng giữa các trạng thái tạo ra theo cách này tỉ lệ với cường độ từ trường Bo Nó cung cấp những điều kiện cần thiết cho việc quan sát các đường phổ và tạo thành cơ sở của NMR

16

Hình 2.3 Sự tách năng lượng giữa các trạng thái spin

Do năng lượng thấp, trạng thái  sẽ ưu tiên được chiếm và theo điều kiện tần số Bohr, E= hv, cần một lượng tử năng lượng

2.4.4 Tác nhân phân giải

Các chất được thêm vào làm tăng sự khác biệt về chuyển dịch hóa học giửa các vân phổ, tức là làm tăng sự phân giải giữa chúng được gọi là các tác nhân phân giải

Trong quá trình đo phổ NMR người ta thêm vào dung dịch nghiên cứu một chất có thể cung cấp từ trường tại chỗ ảnh hưởng đến chuyển dịch hóa học của các proton của hợp chất nghiên cứu Các phức này là các acid lewis Khi thêm vào dung dịch mẫu chúng sẽ tiếp cận đầu bazơ của chất nghiên cứu (ví dụ nhóm OH hoặc C=O)

Phổ 1H-NMR của n- hexanol trong CCl4 do máy 100MHz, có tín hiệu

17

của 4 nhóm metylen giữa mạch là không phân giải (hình 2.4.a) Khi thêm vào dung dịch nghiên cứu phức Eu(dpm)3 người ta thu được phổ như hình 2.4.b Phổ mới này có các tín hiệu của các nhóm metylen không tương đều được phân giải rõ ràng

Hình 2.4.a Phổ 1H NMR của n – hexanol đo bình thường

2.4.b Phổ 1H NMR của n – hexanol khi thêm tác nhân

phân giải

2.4.5 Hiệu ứng hạt nhân overhauser – phổ NOE

Sự làm nổi bật tín hiệu của hạt nhân khi một hạt nhân bị chiếu ở tần số cộng hưởng còn hạt nhân tương tác với nó được ghi nhận bởi tín hiệu mạnh hơn hoặc yếu hơn so với bình thường gọi là hiệu ứng hạt nhân overhauser(Nuclear overhauser enhancement hoặc Nuclear overhauserefect, viết tắt NOE )

Hiệu ứng NOE sẽ cung cấp các thông tin về sự gần nhau trong không gian của hai hạt nhân trong phân tử Điều này rất có lợi khi nghiên cứu hóa học lập thể

Việc đo hiệu ứng NOE bằng may phổ NMR với phương pháp sóng liên tục dựa trên sự so sánh cường độ trong hai trường hợp khử lựa chọn và không

18

khử tương tác spin – spin Phương pháp này bị hạn chế nếu hiệu ứng NOE là quá nhỏ Từ 1980 kỹ thuật NOE vi sai (NOE diference technique) đã được sử dụng trên máy phổ NMR xung với biến đổi fourier Phổ NOE vi sai chỉ chứa những tín hiệu của những hạt nhân nào bị thay đổi cường độ do hiệu ứng NOE Còn các tín hiệu khác thì bị loại bỏ (nhờ sử dụng máy vi tính) Nhờ vậy ngay cả những sự khác biệt rất nhỏ về cường độ cũng có thể được ghi nhận

mà không bị che lấp bởi các tín hiệu khác

Ví dụ việc xác định vị trí nhóm nitro ở dẩn xuất nitro của benzodiazepinon Chỉ dựa vào 1H- NMR (hình 2.5a) người ta không thể xác định được nhóm nitro đính vào vị trí 7 hay 8 Việc chiếu các proton nhóm

CH3CO đã làm thay đổi rõ rệt cường độ H4 và của một proton thơm (hình 8b)

Vì tín hiệu của một proton thơm này là một vân đơn nên nó phải ở vị trí không có proton – ortho Căn cứ vào khoảng cách trong không gian thì proton thơm ở gần các proton nhóm CH3O chính là proton H6 Từ các dữ kiện đó rút

ra rằng nhóm nito phải ở vị trí 7

Trong thực nghiệm NOE vi sai cũng có thể qua sát thấy những tín hiệu giả Nhiệt độ thấp hoặc sự thay đổi của từ trường trong khi đo cũng có thể dẫn đến các tín hiệu thừa ngay cả khi không có hiệu ứng NOE, ví dụ như tín hiệu

ở 7,33ppm trên hình 2.5b

Hình 2.5 Thực nghiệm NOE vi sai đối với dẫn xuất nitrobenzo diazepinon

a Phổ 1H NMR b Phổ NOE vi sai chiếu ở vị trí tín hiệu nhóm CH3CO

19

Có trường hợp cường độ của các hợp phần trong vân bội thay đổi rất mạnh đến mức trở thành âm (người ta gọi là hiệu ứng NOE âm ) Trường hợp này xảy ra khi hạt nhân bị chiếu và hạt nhân quan sát có chung tương tác dáng kể, chẳng hạn khi hai proton dia ở nhóm metylen Hiện tượng đó được

sử dụng thành công trong kĩ thuật SPT, INEPT hoặc DEPT Nếu cường độ tổng cộng các vân bội được chỉ ra bở các đường cong tích phân (đường bậc thang) là khác không đáng kể thì tín hiệu được xem là tín hiệu NOE dương

2.4.6 Từ trường mạnh – kĩ thuật đa xung

Những tiến bộ trong việc chế tạo các nam châm siêu dẫn đã cho phép các máy NMR đạt được từ trường kỉ lục Những nam châm được chế tạo đặc biệt này có nhiều ưu điểm Trước hết dưới ảnh hưởng của từ trường mạnh sự chênh lệch trong phân bố các hạt nhân ở các trạng thấy spin khác nhau được tăng lên dẫn tới làm nhăn độ nhạy Điều đó cũng làm rút nhắn thời gian cấn thiết đề đạt được một tỉ lệ S/N ( tín hiệu/ nhiễu ) thích hợp Hơn thế, độ phân giải giữa các tín hiệu của các hạt nhân có cdhh gần nhau để được tăng lên, còn tần số tương tác spin-spin thì vẫn giữ được không đổi Ví dụ ở máy 80MHz tỉ

số /J=3 khi sang máy 400MHz tỉ số đó sẽ là 3 ( 400 : 80 ) = 15 Do đó một phần AB khó phân giải ở trường yếu sẽ chuyển thành phổ phân giải được

ở trường mạnh Hình 2.6 minh họa rõ điều đó

Hình 2.6 Phổ 1H NMR của một dẫn xuất adamantan

a ở 400 MHz b ở 80MHz (cả hai cùng trên một thang  )

Tuy nhiên đối với những phân tử phức tạp như các steroit, hoặc

20

tritecpenoit, peptit… thì phương pháp dùng từ trường mạnh không phải lúc nào cũng tỏ ra hữu hiệu Hướng pháp triển thứ hai của NMR hiện đại là thay đổi các chuổi xung kích thích, cải tiến việc thu nhận và xử lý tín hiệu Nếu như việc tăng cường độ từ trường là có giới hạn, thì khuynh hướng sử dụng

kỹ thuật đa xung đã và đang chứng tỏ khả năng vô cùng phong phú của mình

Từ những năm 1980 phương pháp NMR hiện đại đặt biệt là phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR ) đã trở thành một vũ khí lợi hại trong việc nghiêm cứu cấu trúc các hợp chất Ngày nay thế hệ mới nhất các máy phổ NMR với các xung cực mạnh, với computer và các bộ lưu trữ số liệu

có thể cho phép hoàn thành những thực nghiệm đa xung với khoảng thời gian không lâu hơn các kĩ thuật do truyền thống Hơn thế từ kĩ thuật đa xung người

ta khai thác được rất nhiều thông tin mà kĩ thuật đo thông thường không có được

2.4.7 Phổ DEPT và INEPT

Ở các nhóm CH3, CH2, CH, C bậc 4, cường độ của tín hiệu 13C tuân theo những hàm cosin khác nhau do đó xuất hiện khả năng phân biệt các nhóm đó bằng cách làm cho cường đọ của chúng trở nên khác nhau Kỹ thuật modul hóa – J đôi khi còn được gọi tắt là phép xác định số proton đính với nguyên tử cacbon (Attched proton test viết tắt ATP) Tiến bộ lớn nhất của phương pháp ATP là kĩ thuật DEPT Ở kỹ thuật DEPT thông thường, các nhóm CH, CH2,CH3 được phân biệt nhò ba lần đo khác nhau (mỗi nhóm được ghi riêng lẽ ở một lần đo) Những thông tin về các nhóm đó cũng có thẻ được ghi nhận được nhờ phương pháp kinh tế hơn: chỉ với hai lần đo (nhóm CH2

không đo tách riêng mà cùng xuất hiện với nhóm CH và CH3 nhưng có cường

độ âm) xem hình 4.43b khi so sánh phổ DEPT với phổ 13C NMR khử toàn bộ tương tác spin – spin người ta sẽ tìm được cacbon bậc 4 Ví dụ việc xác định các nguyên tử cacbon no các bậc ở 3- axetyl oleanolat metyl được chỉ ra trên hình 2.7

21

Hình 2.7 Phổ 13C DEPT của 3- axetyl oleanolat metyl

a Khử bỏ hoàn toàn tương tác spin – spin

b Tín hiệu của CH và CH3 dương, của CH2

c Chỉ có tín hiệu của CH

Có một kỹ thuật quan trọng khác gọi là INEPT Kĩ thuật INEPT có thể lựa chọn xung chiếu vào một proton đơn sao cho chỉ thu được tín hiệu của 13C nào tương tác với chính proton bị chiếu đó Phương pháp này đặc biệt có lợi nếu xung được chọn sao cho xác định được cacbon bậc bốn Hình 2.8 trình bày việc áp dụng kĩ thuật này đối với vanilin

Hình 2.8 a Phổ 13 C NMR của vanilin

b Phổ INEPT với xung chiếu lên H5 được lựa chọn