Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất và thử hoạt tính sinh học của chúng từ loài dây chân chim núi (desmos cochinchinensis vả fulvescens ban) ở sơn la, việt nam

Các loài trong chi Hoa giẻ là nguồn nguyên liệu để tách chiết các flavonoit có hoạt tính sinh học cao có khả năng diệt khuẩn, chống ung thư, HIV,… Ở Việt Nam mới chỉ có một số công trình

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố và có nguồn gốc

rõ ràng và được trích dẫn đầy đủ theo quy định

Thanh Hóa, ngày 01 tháng 7 năm 2020

Tác giả

Đỗ Trường Sơn

Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi đo phổ các mẫu chất sau thí nghiệm khi thực hiện đề tài nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè tôi - những người

đã luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này./

Tác giả

Đỗ Trường Sơn

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Họ Na (Annonaceae) 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Thành phần hoá học 3

1.2 Chi giẻ (Desmos) 4

1.2.1 Đặc điểm thực vật 4

1.2.2 Thành phần hóa học 4

1.2.3 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học 13

1.3 Cây dây chân chim núi 14

1.3.1 Đặc điểm thực vật 14

1.3.2 Thành phần hoá học 15

1.3.3 Sử dụng và hoạt tính sinh học 15

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 16

2.1 Phương pháp nghiên cứu 16

2.1.1 Phương pháp lấy mẫu 16

2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 16

2.2.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp chiết 16

2.2.2 Phương pháp thu hồi dung môi 18

2.2.3 Tách các chất từ các cao thu được 18

2.2.4 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 19

2.3 Hóa chất và thiết bị 21

2.3.1 Hoá chất 21

2.3.2 Thiết bị 21

2.3 Nghiên cứu các hợp chất 21

2.3.1 Phân lập các hợp chất 21

2.3.2 Một số dữ kiện về phổ tử ngoại, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất đã phân lập 24

iv

2.3.3 Thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được 26

Chương 3 KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Phân lập các hợp chất 27

3.2 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 27

3.3 Thử hoạt tính sinh học 63

KẾT LUẬN 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

v

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Số liệu phổ 13

C-NMR của hợp chất LS1 27 Bảng 3.2 Số liệu phổ 13

C- NMR của hợp chất LS2 34 Bảng 3.3 Số liệu phổ 13

C-NMR của hợp chất LS3 41 Bảng 3.4 Số liệu phổ 13

C-NMR của hợp chất LS4 51 Bảng 3.5 Số liệu Phổ 1

H-NMR hợp chất LS5 58 Bảng 3.6 Số liệu phổ 13

C-NMR của hợp chất LS5 59 Bảng 3.7 Giá trị EC50 của các hợp chất thử hoạt tính gây độc tế bào 63

vi

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ phân lập các phân đoạn cây dây chân chim núi 22

Sơ đồ 2.2 Phân lập các hợp chất từ cao etyl axetat của cây dây chân chim núi 23 Sơ đồ 3.3: Phân lập các hợp chất từ dịch chiết butanol của cây dây chân chim núi 24

Hình 3.1: Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS1 29

Hình 3.2: Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS1 (phổ dãn) 30

Hình 3.3: Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS1 (phổ dãn) 30

Hình 3.4: Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS1 31

Hình 3.5: Phổ DEPT của hợp chất LS1 (phổ dãn) 31

Hình 3.6 Phổ UV của LS2 32

Hình 3.7 Phổ khối lƣợng phun mù LS2 32

Hình 3.8 Phổ 1H-NMR của hợp chất LS2 33

Hình 3.9 Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS2 (Phổ giãn) 33

Hình 3.10 Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS2 (Phổ giãn) 34

Hình 3.11 Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS2 36

Hình 3.12 Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS2 (Phổ giãn) 36

Hình 3.13 Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS2 (Phổ giãn) 37

Hình: 3.14 Phổ DEPT của hợp chất LS2 37

Hình 3.15 Phổ HMBC của hợp chất LS2 38

Hình 3.16 Phổ HSQC của hợp chất LS2 39

Hình 3.17 Phổ UVcủa hợp chất LS3 42

Hình 3.18 Phổ IR của hợp chất LS3 43

Hình 3.19 Phổ EI-MS của hợp chất LS3 43

Hình 3.20 Phổ 1H-NMR của hợp chất LS3 44

Hình 3.21 Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS3 (Phổ giản) 44

Hình 3.22 Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS3 45

Hình 3.23 Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS3 (Phổ giãn) 45

Hình 3.24 Phổ DEPT của hợp chất LS3 46

vii

Hình 3.25 Phổ DEPT của hợp chất LS3 (Phổ giãn) 46

Hình 3.26 Phổ HMBC của hợp chất LS3 47

Hình 3.27 Phổ khối lƣợng (EI-MS) của hợp chất LS4 49

Hình 3.28 Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS4 50

Hình 3.29 Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS4 (phổ giãn) 50

Hình 3.30 Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS4 52

Hình 3.31 Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS4(Phổ giản) 52

Hình 3.32 Phổ DEPT của hợp chất LS4 53

Hình 3.33 Phổ HMBC của hợp chất LS4 54

Hình 3.34 Phổ HSQC của hợp chất LS4 55

Hình 3.35 Phổ tử ngoại (UV) của hợp chất LS5 56

Hình 3.36 Phổ khối lƣợng của hợp chất LS5 57

Hình 3.37 Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS5 58

Hình 3.38 Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS5 59

Hình 3.39 Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS5 (Phổ giãn) 60

Hình 3.40 Phổ DEPT của hợp chất LS5 60

Hình 3.41 Phổ HMBC của hợp chất LS5 61

Hình 3.42 Phổ HSQC của hợp chất LS5 62

1

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Tác dụng chữa bệnh của cây cỏ chính là do các hợp chất tự nhiên có chứa

trong chúng quyết định Nói đến nguồn tài nguyên thực vật làm thuốc phong phú trên đất nước ta cũng nói đến khả năng sinh tổng hợp, chuyển hoá và tích luỹ các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học của nguồn gen thực vật

Glochidion là một chi tương đối lớn thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae),

với gần 300 loài phân bố từ Madagascar đến các đảo thuộc Thái Bình Dương và phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á Hơn 20 loài thuộc chi này được tìm thấy ở Việt Nam và được dùng làm thuốc chữa bệnh cúm, lỵ, sốt rét, thấp khớp

và khó tiêu [1]

Chi Hoa giẻ (Desmos) thuộc họ Na (Annonaceae)với khoảng 20 loài phân

bố ở các khu vực có khí hậu nhiệt đới thuộc Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn

Độ [1] Ở nước ta, chi Hoa giẻ (Desmos) có 5 loài và 2 thứ (cả 2 thứ là đặc

hữu) Các loài trong chi Hoa giẻ là nguồn nguyên liệu để tách chiết các flavonoit

có hoạt tính sinh học cao có khả năng diệt khuẩn, chống ung thư, HIV,… Ở Việt Nam mới chỉ có một số công trình nghiên cứu về mặt hóa học của chi này Loài

dây chân chim núi (Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban) là loài cây

phổ biến ở các nước Việt Nam, Trung Quốc và được dùng làm thuốc chữa bệnh, theo đông y… nhưng chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần hoá học ứng

dụng trong Y học Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP , XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG TỪ LOÀI DÂY CHÂN CHIM NÚI

(DESMOS COCHINCHINENSIS VAR FULVESCENS BAN) Ở SƠN LA,

VIỆT NAM”

2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận văn là loài dây chân chim núi (Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban) ở Sơn La Việt Nam , có triển vọng cung

cấp các chất có hoạt tính sinh học phong phú và hấp dẫn

2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Nhiệm vụ nghiên cứu của luận văn bao gồm:

- Từ loài dây chân chim núi , chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các cao chất loài dây chân chim núi

- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ loài dây chân chim núi

- Thử hoạt tính sinh học của một số chất phân lập đƣợc từ loài dây chân chim núi ở Sơn la ,Việt Nam

3

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Họ Na (Annonaceae)

chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ôn

đới (Asimini …) Theo Leboeuf và cộng sự có khoảng 900 loài ở Trung và Nam

Mỹ, 450 loài ở Châu Phi và Madagascar, 950 loài ở Châu Á và Australia [2] Các loài thuộc họ Na (Annonaceae) có lá đơn, mọc so le (mọc cách), có cuống lá và mép lá nhẵn Lá mọc thành hai hàng dọc theo thân cây Vết sẹo nơi đính lá thường nhìn thấy rõ các mạch dẫn Cành thường ở dạng ziczăc Chúng không có các lá bẹ Hoa đối xứng xuyên tâm (hoa đều) và thường là lưỡng tính

Ở phần lớn các loài thì 3 đài hoa nối với nhau ở gốc hoa Hoa có 6 cánh có màu nâu hay vàng, nhiều nhị hoa mọc thành hình xoắn ốc Hoa có nhiều nhụy hoa, mỗi nhụy có bầu nhụy dạng một ngăn chứa một hay nhiều tiểu noãn Có đôi khi hoa mọc trực tiếp trên các cành lớn hoặc thân cây Qủa là nang, bế qủa hay đa qủa Ở Việt Nam đã xác định họ Na có 26 chi, 201 loài [1, 2]

1.1.2 Thành phần hoá học

Các nhà khoa học đã xác định cấu tạo hoá học và thử tác dụng sinh học của chúng (về tim mạch, độc tính và các hoạt tính dược lý khác) Một số hợp chất có tiềm năng ứng dụng rất lớn để sản xuất thuốc chữa bệnh

Mặc dù cây họ Na (Annonaceae) đã được khảo sát lần đầu tiên bởi Stehous năm

1855, nhưng trong 2 thập kỉ trước đây vẫn ít được tiến hành nghiên cứu, đến năm 1970, họ Na (Annonaceae) bắt đầu được nghiên cứu kỹ Trong đó, phần lớn các đề tài nghiên cứu về alkaloit nhưng cây họ Na (Annonaceae) cũng chứa một lượng lớn non- alkaloidal (không phải alkaloit) có nhiều hoạt tính kháng tế

4

bào ung thư và chữa bệnh tim mạch rất quan trọng Các chất không phải alkaloit của họ Na (Annonaceae) bao gồm kauran, lignan, acetogenin, steroit và các hợp

chất thơm Thành phần hóa học bao gồm các loại hợp chất như : Các hợp chất

diterpenoit kauran Các hợp chất lignan Các hợp chất acetogenin Các hợp chất styrylpyron Các hợp chất flavonoit Hợp chất benzoit Các hợp chất steroit

Terpenoit (dạng non-kauran) Các hợp chất alkaloit [17]

1.2 Chi giẻ (Desmos)

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Hoa giẻ (Desmos) thuộc họ Na (Annonaceae) với khoảng 20 loài phân bố

ở các khu vực có khí hậu nhiệt đới thuộc Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn

Độ [1] Ở nước ta, chi Hoa giẻ (Desmos) có 5 loài và 2 thứ (cả 2 thứ là đặc

hữu) [1], [2]

1.2.2 Thành phần hóa học

1.2.2.1 Các hợp chất flavonoit

Những hợp chất flavonoit được phân lập từ các loài thuộc chi Desmos bao

gồm các flavon, flavan, flavonoit glucozit và các chalcon Đặc điểm chung của các flavonoit này là vòng A thường có các nhóm thế như hydroxy (-OH), metoxy (-OCH3), metyl (-CH3), focmyl (-CHO), C-benzyl (-CH2-C6H5), cacbonyl (C=O) và đặc biệt là có những hợp chất có hai nhóm metyl cùng gắn

vào một nguyên tử cacbon, tuy nhiên vòng B ít bị thế hơn [8]

Năm 1993, Hao X Y và cộng sự [9] đã phân lập được 4 hợp chất

flavonoit từ loài Hoa dẻ thơm (D chinensis) là lawinal , desmetoxymatteucinol,

5-hydroxy-6-fomyl-7-metoxy-8-metyl dihydroflavon và negletein

Lawinal Desmetoxymatteucinol

Unonal Isounonal

Desmosal Desmosflavon

Từ lá của loài cây này thu hái tại Băng La Đét, Rahman và cộng sự [11]

đã phân lập đƣợc ba chalcon có nhóm thế C-benzyl là

2’,4’-dihydroxy-3’-(2,6-dihydroxybenzyl)-6’-metoxychalcon , uvaretin và isouvaretin

2’,4’-dihydroxy-3’-(2,6-dihydroxybenzyl) Uvaretin

-6’-metoxychalcon

6

Isouvaretin Trong khi đó cũng từ lá của cây này Phan Văn Kiệm và cộng sự [12] đã phân lập đƣợc 5 hợp chất flavonoit là negletein , 2’,3’-dihydroxy-4’,6’-dimetoxy dihydrochalcon , 5,6-dihydroxy-7-metoxy dihydroflavon , astilbin và quercitrin

2’,3’-dihydroxy-4’,6’, 5,6-Dihyđroxy-7-metoxy -dimetoxy

dihydrochalcon dihydroflavon

Astilbin Quercitrin

Năm 2001, Jiu Hong Wu và cộng sự đã phân lập đƣợc ba hợp chất flavonoit mới là desmosdumotin A (một cặp đồng phân tautome), desmosdumotin B , desmosdumotin C và các flavonoit khác nhƣ lawinal , desmetoxymatteucinol , negletein , isolawinal , 5-hydroxy-7-metoxy-8-fomyl-3-

benzoyl-2,6-dimetyl chromon , mosloflavon , desmetoxymatteucinol-7-metyl ete

7

,

2-metoxy-3-metyl-4,6-dihydroxy-5(3’-hidroxy)cinnamoylbenzanđehit,5-hydroxy-7-one-6,8,8-trimetyl flavon từ rễ cây Gié bụi (D dumosus (Roxb.)

Saff.) thu hái tại Trung Quốc [13] [14], [15], [16]

Desmosdumotin A

Desmosdumotin B Desmosdumotin C

Isolawinal 5-hydroxy-7-metoxy-8-fomyl-3-benzoyl-2,6-dimetyl chromon

Mosloflavon Desmetoxymatteucinol-7-metyl ete

8

Tiếp tục hướng nghiên cứu hóa thực vật các loài thuộc chi Desmos Jiu

Hong Wu đã phân lập được 3 flavonoit là lawinal , desmetoxymatteucinol,

isolawinal từ rễ của loài D grangifolius (Finet & Gagnep.) C Y Wu & P T

2',4-dihydroxy-4',6'-

dimetoxy dihydrochalcon

2',4-dihydroxy-3',6'-dimetyl -4',5'-dimetoxy dihydrochalcon

9

2',4-dihydroxy-4',5',6'-trimetoxy

dihydrochalcon

dimetoxy dihydrochalcon

2',4-dihydroxy-5'-metyl-4',6'-Bốn hợp chất biflavon mới, saiyuton A–D đƣợc phân lập từ lá cây (Desmos chinensis) ở Thái Lan cùng với 16 hợp chất đã biết [20]

A'

B' C'

2 3 4

1 5

6

2 6

3 4

6

5

7 8 9

3 4 2 2 3 4

5

'' ''

'' '' ''

'' '' '' '''

''' ''' ''' '''

C

H3

CHO O

2

3

3 3

6 6

6

8 9 10 7

1 7

' ' ' ' ' '

'' '' ''

'' '' ''

''' '''

''' '''

'''

''' '''

O O

1 7

'' '' ''

'' '' ''

''' '''

''' '''

''' '''

6 5

7

7 8 9 2

1 2 3 4

5 6 3 4

' ' '

' '

Saiyuton C Saiyuton D

Hybrid flavan-chalcon desmosflavan A và B đã đƣợc phân lập từ lá cây Desmos cochinchinensis [21]

10

H O O H

OH O

O

OH O

O H

H O O H

OH O

O

OH O

O H

D

E

Desmosflavan A Desmosflavan A

Nguyễn Ngọc Tuấn và cộng sự [22] đã phân lập hợp chất

desmorostraton mới từ cây nhãn chày (Desmos rostrata) ở Việt Nam

Desmorostraton

1.2.2.2 Các hợp chất ancaloit

Các ancaloit đƣợc phân lập từ các loài thuộc chi Desmos chủ yếu có cấu

trúc thuộc khung apophin ancaloit và protoberberin ancaloit, ngoài ra còn có cấu trúc thuộc một số khung khác

Khi tiến hành nghiên cứu hóa thực vật của loài Gié bụi (D dumosus

(Roxb.) Saff.) Mazdida S và cộng sự [23] đã phân lập đƣợc 11 ancaloit từ lá và thân của cây này Trong đó có 9 hợp chất thuộc về kiểu apophin ancaloit là

asimilobin , nornuciferin, 3-hydroxynornuciferin , metylisopilin ,

O-metylmoschatolin , lisicamin , liriodenin , stephanin , norlirioferin , một chất kiểu tetrahydroisoquinolin ancaloit là dicretamin và một proapophin là pronuciferin

(+)-5,6-dimetoxy-2,2-dimetyl-1-(4-hydroxibenzyl)-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolin clorit từ loài D yunnanensis (Hu) P.T.Li

Theo một nghiên cứu trước đó, Lebeuf M và cộng sự [26] đã phân lập và nhận dạng được 13 ancaloit kiểu izoquinolin thuộc về năm loại khung khác nhau

từ phần cành của loài D tiebaghiensis (Daniker) R E Fr, trong đó có hai hợp

chất tetrahydroprotobecberin là (-)-discretamin và (-)-stepholidin, một hợp chất proapophin là (-)-glaziovin; bảy hợp chất apophin là (-)-asimilobin (46), (-)-

annonain, )-laurotetanin, (+)-N-metyllaurotetanin, (+)-boldin, (+)-isoboldin,

(-)-norushinsunin; một morphinandienon là (-)-pallidin cùng với hai hợp chất

benzyltetrahydroizoquinolin là (+)-reticulin và (+)-N-metylcoclaurin

Nguyễn Ngọc Tuấn và cộng sự [27] đã phân lập và xác định cấu trúc 2

hợp chất alkaloit mới từ cây nhãn chày (Desmos rostrata) ở Việt Nam

NH O

H OMe

OMe OMe

O

N

O H

H

OMe OMe

MeO

O

1.2.2.3 Các hợp chất khác

Từ kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của các loài thuộc chi Desmos

cho thấy ngoài các hợp chất chính là các flavonoit, các apophin ancaloit và

Ngoài ra, Wu J.H và cộng sự đã phát hiện sự có mặt của các chất axit

benzoic, β-sitosterol, stigmasterol trong rễ của cây D grandifolius [17]

1.2.3 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học

Phần lớn các hợp chất flavonoit phân lập được từ các loài thuộc chi Hoa

dẻ (Desmos) đã được khảo sát hoạt tính gây độc tế bào trên một số dòng ung thư

khác nhau ở người như: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư biểu mô và hoạt tính chống HIV Các kết quả nghiên cứu cho thấy một số hợp chất thể hiện hoạt tính sinh học khá lý thú [29], [30]

1.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào

Một số hợp chất flavonoit phân lập được từ cây Gié bụi (D dumosuơs) đã

được xác định là có khả năng gây độc tế bào đối với một số dòng tế bào ung thư

ở người Các phép thử in vitro của desmosdumotin C được tiến hành trên 6 dòng

tế bào ung thư khác nhau là ung thư vú (MCF), ung thư xương (HOS), ung thư buồng trứng (1A9), ung thư đại tràng (HCT-8), ung thư biểu mô (KB) và ung thư biểu mô kháng vincristin (KB-VIN) cho các giá trị ED50 (µg/ml) tương ứng

là 3,8; 2,5; 4,0; 5,0; 6,5 và 5,6 Ngoài ra, desmosdumotin B cũng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào với các dòng ung thư như phổi (A549), buồng trứng (1A9),

vú (MCF-7) và biểu mô (KB) với các giá trị ED50 (µg/ml) tương ứng như sau: 28,0; 36,0; >5 và >40 [31]

14

này đã được chọn để xác định hoạt tính kháng vi rút HIV-1 trên tế bào lympho H-9 [16]

1.3 Cây dây chân chim núi

Tên khoa học: Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban

Tên thông thường: Dây chân chim núi

Thuộc họ Na (Anonaceae)

1.3.1 Đặc điểm thực vật

Cây bụi trườn hoặc dây leo thân gỗ, dài 4-10 m Cành non thường có lông

tơ màu vàng nâu Lá phần lớn hình thuôn hoặc bầu dục thuôn, cỡ (8)11-15(18) x (3)4-5(6,6) cm, chóp lá hình mũi ngắn, gốc lá thường hình tim; mặt trên (trừ gân chính) nhẵn, mặt dưới có lông; gân bên 8-11 đôi, rõ ở mặt dưới hơi cong hình cung và gần tận mép; mạng lưới, không đều; cuống lá dài 4-6 mm, có lông như cành non Hoa mọc đơn độc, ở ngoài nách lá và so le với lá, cuống hoa dài 2,5-4

cm, có lông tơ, mang 1 lá bắc nhỏ ở cách gốc chừng 1 cm Lá đài hình trứng nhọn, dài 6-8 mm, rộng 4-5 mm có lông ở cả hai mặt (nhưng mặt ngoài rậm hơn) Cánh hoa khi tươi màu vàng, không thơm, mỏng, có lông hình mác dài, hơi không đều nhau: những chiếc ngoài dài 3-5,5 cm, rộng 10-15 mm; cánh hoa trong dài 2,5-4 cm, rộng 6-8 mm Nhị nhiều, dài chừng 1 mm, chỉ nhị không rõ, mào trung đới lồi Lá noãn 10-15, dài chừng 2 mm; bầu có lông rậm, vòi rất ngắn; núm nhụy gần hình đầu, không có lông Noãn 4-6 Phân quả 2-5 hạt, hình chuỗi hạt, ở trên cuống ngắn 3-7 mm, khi chín màu vàng, đốt phân quả gần hình cầu hay hình trứng, thường có lông (khi già lông rụng) Hạt màu vàng nâu, nhẵn

và láng [1,3]

Cây dây chân chim núi (Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban) là

thứ đặc hữu ở Việt Nam, phân bố ở Thanh hóa, Nghệ An, Thừa Thiên-Huế, Quảng Nam, Khánh Hòa, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Đắc Nông, Lâm Đồng, Đồng Nai và Sơn la Cây mọc rãi rác ở ven rừng, nơi sáng, ra hoa tháng 4-7, mang quả 9-12 [1], [3]

15

1.3.2 Thành phần hoá học

Cho đến nay mới có các công trình nghiên cứu thành phần hóa học của

tinh dầu lá cây dây chân chim núi (Desmos cochinchinensis var fulvescens Ban)

ở Hà Tĩnh bằng phương pháp sắc ký khí (GC) và sắc ký khí khối phổ (GC/MS), hơn 70 hợp chất đã được tách ra từ tinh dầu, trong đó có 53 hợp chất được xác định (chiếm đến 89,7% của tổng hàm lượng tinh dầu) Thành phần chính của tinh dầu là β-elemen (16,1%), -cadinen (13,8%) và β-caryophyllen (13,7%) Tiếp theo là germaren B (7,7%), germacren A (5,7%), epizonaren (3,9%), elemol (3,6%), α-humulen (2,7%), -pinen (2,3%), β-selinen (2,3%), -terpinen (1,8%), -elemen (1,7%), β-cubenen (1,5%), eudesma-4 (15), 11-dien-9-on (1,3%), α-selinen (1,3%), -elemen (1,1%) (xem bảng) Các chất còn lại phần lớn có hàm lượng nhỏ hơn 1,0% [7]

1.3.3 Sử dụng và hoạt tính sinh học

Các loài trong chi Hoa giẻ là nguồn nguyên liệu để tách chiết các flavonoit có hoạt tính sinh học cao có khả năng diệt khuẩn, chống ung thư,

HIV,…[31]

16

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu thực vật được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C Mẫu được

xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm

2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

2.2.1 Cơ sở lý thuyết của phương pháp chiết

+ Trong cây các hợp chất hữu cơ tồn tại ở dạng:

- Hoà tan trong nước (dịch tế bào) là các cacbonhydrat phân tử bé (monosacarit, oligosacarit), một số polysacarit (pectin, gôm), glycosit (saponin, flavonoit, iridoit…), alkaloit…

- Hoà tan trong dầu béo và tinh dầu là các hydrocacbon, monoterpenoit, sesquiterpenoit, sterol, carotenoit và các dẫn xuất phenyl propanoit

* Glycosit là những chất phân cực mạnh do phần đường có nhiều nhóm

OH, mach đường càng dài thì độ phân cực cang cao Nếu bị thuỷ phân thị phần dường bị cắt tính phân cực giảm

* Các enzym luôn có mặt ở trong cây và tác động đến quá trình chiết tách

+ Dung môi : Bao gồm dung môi phân cực và không phân cực

- Dung môi không phân cực: ete dầu hoả, benzen, toluen, hexan, heptan…

- Dung môi phân cực vừa: etyl axetat, clorofom, axeton, dietyl clorua…

- Dung môi phân cực: nước, metanol, etanol, butanol…

- Các chất điện ly như các muối vô cơ đều tan trong dung môi phân cực

- Các chất phân cực: Các hợp chất hữu cơ nói chung không ion hoá nhưng nếu chúng có chứa các nhóm hoặc nguyên tử mang điện âm có thể hình thành liên kết hydro với nuớc thì sẽ dễ tan trong nước

Chất tan ete và dung môi không phân cực

- Các hợp chất hữu có không chứa nhóm phân cực gọi là các chất không phân cực

- Nói chúng chất không phân cực đều tan tan trong dung môi không phân cực và ngược lại không tan trong nước và dung môi phân cực khác

- Hầu hết các chất hữu cơ tan trong nước đều không tan trong ete

Khi chiết các hợp chất hữu cơ phải lựa chọn dung môi

- Chọn dung môi (phân cực hay không phân cực)

- Dụng cụ chiết (chiết hồi lưu, soxhlet), chiết siêu âm, vi sóng, lỏng siêu tới hạn

- Phương pháp chiết (chiết nhiệt độ thường, chiết nóng)

Dựa vào tính chất phân cực của dung môi và các nhóm hợp chất, có thể

dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết:

- Ete dầu hoả hoặc n- hexan: hydrocabon béo hoặc thơm, các thành phần của tinh dầu như monoterpenoit, chất béo, caroten, sterol, clorophyl

- Clorofoc hoặc etyl axetat: sesquiterpenoit, diterpenoit, coumarin, quinon, alkaloit, các aglycon do glycosit thuỷ phân…

- Metanol hoặc etanol: glycosit, alkaloit, flavonoit, các hợp chất phenol khác, nhựa, axit hữu cơ, tanin…

- Nước: glycosit, tanin, cacbonhydrat, pectin, gôm, protein và muối vô cơ Khi chiết lấy cao tổng thì dùng dung môi metanol hoặc etanol

- Khi cần tách lấy phân đoạn cac hợp chất thì dùng dung môi không hoà lẫn với nước và có dộ phân cực từ yếu đến mạnh:

Ví dụ: n-hexan etyl axetat n-butanol

18

Hoà tan cao vào một lượng nước, cho vào bình chiết, chiết lần lượt với n- hexan, etyl axetat và cuối cùng là n-butanol Dịch chiết mỗi phân đoạn cất thu hồi dung môi và phân tích riêng

Phương pháp chiết: - Chiết ở nhiệt độ thường (chiết từ 3 đến 5 lần để thu hết chất từ nguyên liệu.[4], [5]

- Chiết nóng:

+ Chiết hồi lưu (chiết 2 lần) + Chiết Soxhlet (chiết liên tục) + Chiết siêu âm

+ Chiết vi sóng + Chiết siêu tới hạn

2.2.2 Phương pháp thu hồi dung môi

- Áp suất thường

- Áp suất giảm

- Cất quay chân không

2.2.3 Tách các chất từ các cao thu được

Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp sắc ký như:

- Sắc ký cột (CC)

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích

- Các phương pháp kết tinh phân đoạn

* Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký: Sắc ký là một phương pháp vật

lý dùng để tách riêng các thành phần ra khỏi một hỗn hợp bằng cách phân bố chúng ra 2 pha:

+ Một pha bề rộng gọi là pha cố định

+ Pha kia là một chất lỏng hoặc khí, di chuyển qua pha cố định

Phân loại:

+ Sắc ký lỏng: là phương pháp dùng chất lỏng làm pha động:

+ Sắc ký giấy: pha tĩnh là giấy

19

+ Sắc ký lớp mỏng (TLC-Thin Layer Chromatography): pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ được trải bằng phẳng và đều đặn trên một tấm kính hoặc kim loại + Sắc ký cột (CC-Column Chromatography): pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành cột

+ Sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography) + Sắc ký khí: (GC- Gas Chromatography) là phương pháp dùng chất khí làm pha động

+ Sắc ký lớp mỏng :

+ Chất hấp phu: silicagel

+ Dung môi

2.2.4 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ: Muốn xác định được cấu trúc của các chất phân lập được cần dựa vào dữ liệu vật lý cung cấp từ các phương pháp phổ hiện đại, phải biết kết hợp phân tích

dữ liệu mới cho ta một kết quả chính xác

Các phương pháp vật lý hiện đại thường dùng để xác định cấu trúc các hợp chất gồm: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (EI-MS, ESI-MS, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, HMQC, COSY, NOESY)

+ Phổ UV-vis : để xác định sự có mặt hay vắng mặt các nhóm riêng biệt

trong vùng trên 200 nm (xác định nhóm chức, phân biệt, giải thích hệ liên hợp

• Độ chuyển dịch hóa học của proton trong khoảng 0-14 ppm

• Độ chuyển dịch của proton cho biết proton gắn vào nguyên tử nào (C, O, H…)

20

• Sự tách mũi tín hiệu cho biết có bao nhiêu proton hiện diện kề bên proton khảo sát

• Hằng số ghép được tính bằng khoảng cách giữa các pic doublet, triplet và

quartet rồi nhân với tần số máy Công thức sau: J (Hz) = (δ1- δ2) máy

+ Phổ C13- NMR: Cung cấp thông tin trực tiếp bộ khung cacbon của phân tử, số nguyên tử cacbon, nhóm chức trong phân tử

• Độ chuyển dịch của cacbon trong khoảng 1- 220ppm

• Chiều cao của pic tỷ lệ thuận với số nguyên tử cacbon tương đương

giúp ta gán được độ dịch chuyển hóa học của cacbon với proton tương ứng

Phổ HMBC: Sự tương quan thông qua sự kết nối độ dịch chuyển hóa học 1

H và 13C- NMR qua hai, ba liên kết giúp xác định gián tiếp tương quan cacbon- cacbon và các tương quan giữa cacbon bậc 4 với proton xung quanh

Phổ COSY: Các nguyên tử H ghép cặp với nhau dựa trên kết quả phổ 1

NMR giúp xác định các nguyên tử H ghép cặp này của một cacbon hay các H ghép cặp này của hai cacbon ở gần nhau

H-Cấu trúc của hợp chất được xác định chính xác khi ta kết hợp phân tích dữ liệu từ các phổ khác nhau

+ Phổ MS: Trong lĩnh vực rộng của khối phổ, khối phổ phân giải cao thu

hút sự chú ý vì sự kết hợp của tính chính xác khối lượng cao với độ phân giải siêu cao và khối lượng rất cao Kỹ thuật đa năng này không chỉ áp dụng trong hóa học hữu cơ, vô cơ, cơ học, môi trường, mà còn trong nghiên cứu về công

nghệ sinh học

Xác định trực tiếp công thức phân tử và những vấn đề liên quan tới khung cấu trúc của các hợp chất hữu cơ tổng hợp, hợp chất thiên nhiên, các hợp chất nguồn sinh vật không quá phức tạp dạng đơn chất.[6]

Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3

Phổ tử ngoại UV được ghi trên máy Hitachi UV - 3210

Phổ khối lượng phun mù electron ESI-MS được ghi trên máy Trap-00127 và phổ khối lượng EI-MS được ghi trên máy HP 5989 B-MS với

Phần thân cây và lá của cây dây chân chim núi được phơi khô ở nhiệt độ phòng

10 kg, cắt nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng 30 ngày Dịch chiết được cất thu hồi dung môi thu được cao metanol 757 g Phân bố cao metanol trong nước, sau đó chiết lần lượt với n hexan, etylaxetat, butanol và cất thu hồi dung môi thu được các cao tương ứng là 35, 74 và 56 g và dịch nước

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ phân lập các phân đoạn cây dây chân chim núi

Cao etylaxetat đƣợc phân tách bằng sắc ký cột silica gel ( cỡ hạt 60) dung môi giải hấp là cloroform : etyaxetat (19 :1) và tăng dần nồng độ của etylaxetat) thu đƣợc 9 phân đoạn chính Phân đoạn 2 tinh chế lại bằng sắc ký cột (dung môi

rửa giải (n hexan/clorofom 19;1) thu đƣợc chất LS1 (122 mg) Phân đoạn 4 tách

tiếp bằng sắc ký cột nhỏ silica gel, dung môi giải hấp là cloroform : etylaxetat

(30 : 1) thu đƣợc chất LS2 (79mg) Phân đoạn 9 tinh chế lại bằng sắc ký cột

nhồi silicagel với dung môi rửa giải Clorofom/etyaxetat/metanol 50:1:0,05 thu

Cao etyl axetat (74g)

- Ngâm với metanol

- Cất thu hồi metanol

23

Sơ đồ 2.2 Phân lập các hợp chất từ cao etyl axetat của cây dây chân chim núi

Cao n-butanol (57g) được tách trên sắc ký nhồi silicagel, hệ dung môi giải hấp là cloroform:metanol (98:2) thu được 05 phân đoạn chính Phân đoạn 2 tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột trên silicagel, hệ dung môi rửa giải là

cloroform:metanol với tỷ lệ 19:1 thu được hợp chất LS4 (124 mg), phân đoạn 5

tiếp tục phân tách bằng sắc ký cột với dung môi rửa giải Clorofom/metanol/nước

24

Sơ đồ 3.3: Phân lập các hợp chất từ dịch chiết butanol của cây dây

chân chim núi 2.3.2 Một số dữ kiện về phổ tử ngoại, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất đã phân lập

Hợp chất LS1: Tinh thể hình kim, đ.n.c: 155o

-157oC IR (KBr) max (cm-1):

3400, 3025, 1410, 1250, 820, 690 Phổ EI-MS m/z: 412 [M+

] (7), 300 (7), 255 (11), 231 (4), 213 (8), 173 (7), 145 (20), 133 (20), 83 (49,3), 55 (100), 43 (90) 1

H-NMR (500MHz, CDCl3) ( ppm) ; 13C-NMR (125MHz, CDCl3) (

ppm)(bảng 3.2.1)

Hợp chất LS2: Tinh thể hình kim màu trắng, ®.n.c 281-283OC

Phổ UV(CH3OH) max nm (log ): 240, 258, 319, 366 nm

25

Phổ 1

H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 5,53 (1H, dd, J=7,6, 3,6 Hz, H-15), 3,19 (1H, dd, J=11,2, 4,4 Hz, H-3), 1,09 (3H, s, CH3), 0,98 (3H, s, CH3), 0,91 (6H, s, 2xCH3), 0,95 (3H, s, CH3), 0,93 (3H, s, CH3), 0,82 (3H, s, CH3), 0,80 (3H, s, CH3)

H-NMR 500 MHz (DMSO-d 6) ( ppm): 12,76 (1H, s), 8,12 (2H, dd,

J =1,0, 6,0 Hz), 7,63 (3H, m), 7,04 (1H, s), 6,99 (1H, s), 3,94 (1H, s) và 3,74 (3H, s)

Phổ 13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6) ( ppm): xem bảng 3.2.3

Hợp chất: LS4: chất rắn màu vàng, nhiệt độ nóng chảy: 195-1960C

Phổ khối lƣợng va chạm electron (EI-MS) m/z: 284 [M]+

Phổ 1H-NMR 500 MHz (DMSO-d 6) ( ppm): 13,48 (1H, s), 8,76 (1H, s), 8,09 (2H, dd, J =1,5, 5,5 Hz), 7,61 (3H, m), 6,97 (1H, s), 6,94 (1H, s) và 3,93 (3H, s)

H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6) ( ppm): 11,62 (s, OH-5), 8,12 (s, OH-6), 7,56 (dd, J=8,0, 1,6Hz, H-2’ và H-6’), 6,23 (s, H-8), 7,35 (m, H-3’, H-4’

và H-5’) và 3,81 (3H, s, OCH3-7), 3,33 (1H, m, Ha-3) và 2,80 (1H, m, Hb-3)]

11,72 (s, OH-5), 8,21 (s, OH-6), 7,54 (dd, J=8,0, 1,6Hz, H-2’ và H-6’), 6,28 (s, H-8), 7,45 (m, H-3’, H-4’ và H-5’) và 3,82 (3H, s, OCH3-7), 3,34 (1H,

m, Ha-3) và 2,82 (1H, m, Hb-3)]

cụ đọc microplate sau khi được hòa tan để loại bỏ lượng thuốc nhuộm màu còn thừa Ý nghĩa của EC50 là nồng độ của tác nhân làm hạn chế sự phát triển của 50% tế bào trong điều kiện tiến hành thí nghiệm và lấy trung bình ít nhất 3 lần tiến hành thử nghiệm độc lập sau khi được tái sinh và thống kê cẩn thận Bốn dòng tế bào ung thư ở người được tiến hành thử nghiệm gồm: u nguyên tủy bào (Daoy), ung thư biểu mô thanh quản (Hep-2), (ung thư tuyến vú (MCF-7), ung thư biểu mô tiết ở cổ (HeLa) Mitomycin C với nồng độ 5M và DMSO với nồng độ 0,3% được dùng làm chất chuẩn chứng dương tính Kết quả được thể hiện qua % giá trị tế bào phát triển trong chất đối chứng DMSO [39]

27

Chương 3 KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập các hợp chất

Phần thân cây và lá của cây dây chân chim núi được phơi khô ở nhiệt độ phòng 10 kg, cắt nhỏ và ngâm chiết với metanol ở nhiệt độ phòng 30 ngày Dịch chiết được cất thu hồi dung môi thu được cao metanol 757 g Phân bố cao metanol trong nước, sau đó chiết lần lượt với n hexan, etylaxetat, butanol và cất thu hồi dung môi thu được các cao tương ứng là 35, 74 và 56 g và dịch nước Tiến hành phân tách các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân

đoạn ta thu được lần lượt các chất sạch LS1; LS2; LS3; LS4; LS5 với khối lượng tương ứng là :122 mg, 79mg, 92mg, 124mg và 327mg

3.2 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

3.2.1 Xác định cấu trúc hợp chất LS1

Hợp chất LS1 là tinh thể hình kim không màu, đ.n.c 155-157oC Phổ IR, 1

NMR và 13C-NMR của hợp chất khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxyl gắn với C-3 tương ứng với các tín hiệu Ha-3 3,28 ppm, C-3 71,2 ppm và max=3400

H-cm-1, ngoài ra còn có tín hiệu của 3 proton thuộc nhóm metin của 2 nối đôi không liên hợp với các tín hiệu đặc trưng H-6 5,35 ppm; H-22 5,14 ppm và H-23 5,03

ppm Phổ EI-MS hợp chất LS1 có thể thấy pic ion phân tử m/z 412 [M]+ tương ứng với công thức phân tử C29H48O So sánh các số liệu phổ của hợp chất LS1 hoàn toàn phù hợp với hợp chất stigmasterol [32]

29

2

9 10

13 1

15 16 17 18

24 25

26 27

30

Hình 3.2: Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS1 (phổ dãn)

Hình 3.3: Phổ 1 H-NMR của hợp chất LS1 (phổ dãn)

31

Hình 3.4: Phổ 13 C-NMR của hợp chất LS1

Hình 3.5: Phổ DEPT của hợp chất LS1 (phổ dãn)

3.2.2 Xác định cấu trúc của LS2

Tinh thể màu trắng Phổ tử ngoại UV Phổ tử ngoại UV của hơp chất

LS2 cho hấp thụ cức đại tại 240, 258, 319, 366 nm, chứng tỏa LS2 có vòng

thơm