Nghiên cứu, xây dựng và ứng dụng phương pháp xác định đồng thời các hoạt chất vitamin b1, b2 trong thuốc vitamin tổng hợp bằng phương pháp cực phổ xung vi phân

Trên cơ sở trên chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu, xây dựng và ứng dụng phương pháp xác định đồng thời các hoạt chất vitamin B 1 , B 2 trong thuốc vitamin tổng hợp bằng phương pháp cực ph

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Năm 1890, nhà bác học Nga N.I.Luin bằng thực nghiệm trên chuột bạch đã chứng minh rằng trong sữa, ngoài casein, chất béo, đường lactose và muối còn có những chất khác vô cùng quan trọng, cần thiết cho sự hoạt động của chuột Năm 1897, một bác sỹ người Hà Lan đã phát hiện ra rằng, cho gà

ăn gạo đã xay xát kỹ dẫn đến chúng bị viêm nhiễm dây thần kinh Để đề phòng và điều trị căn bệnh này phải dùng cám hoặc dịch tiết bằng nước từ cám thêm vào thức ăn Ngoài ra trong thời gian này các nhà khoa học rất quan tâm tới bệnh scorbut Biểu hiện của bệnh này là mao mạch dễ vỡ hay gây chảy máu răng lợi Trên cơ sở nghiên cứu, các bác sỹ đã rút ra kết luận, bệnh scorbut xuất hiện là do cơ thể thiếu một chất hữu cơ nào đó mà không tự tổng

hợp được, người ta gọi đó là ‘vitamin’

Như vậy vitamin là những hợp chất hữu cơ mà cơ thể cần một lượng nhỏ nhưng rất quan trọng trong việc duy trì các quá trình chuyển hóa đảm bảo

sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cơ thể Trong số đó nhóm các vitamin B: vitamin B1 (Vit.B1), vitamin B2 (Vit.B2) là những hợp chất rất quan trọng đối với con người

Vitamin B1 tham gia chủ yếu vào quá trình chuyển hóa gluxit, có tác dụng chống viêm dây thần kinh Vitamin B1 có nhiều trong ngũ cốc như gạo, các loại hạt, thịt nạc, mầm lúa mì…vitamin B1 cần thiết cho hệ tiêu hóa , giúp cơ thể hấp thụ chất dinh dưỡng tốt hơn, thiếu vitamin B1 gây ra bệnh beri-beri

Vitamin B2 khi vào trong cơ thể bị photphosryl chuyển hóa thành coenzim, chúng tham gia xúc tác các quá trình oxy hóa chuyển hóa các hydratcacbon, các acid amin cần thiết cho hoạt hóa pyridoxin, biến trytophan thành niamin và duy trì sự nguyên vẹn của hồng cầu Vì vậy, vitamin B2 đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp các tế bào hồng cầu trong cơ thể,

vitamin B2 có nhiều trong trứng, sữa, rau xanh, pho mát, hay còn gọi chung là các sản phẩm từ sữa

Với tất cả những tác dụng to lớn mà vitamin mang lại cho con người nên trong cuộc sống hằng ngày của con người không thể thiếu đi những nguồn thực phẩm giàu vitamin như rau, củ, quả, nước ép trái cây, sữa,thịt, cá…

Ngoài những vitamin có sẵn trong rau, quả tươi, nước ép trái cây Để nguồn sử dụng vitamin trở nên dồi dào, đa dạng và phong phú hơn người ta còn sản xuất các loại thuốc chứa các vitamin để phục vụ một cách hữu ích và thuận tiện với từng nhu cầu thiết yếu khác nhau của con người Thuốc về các vitamin được nghiên cứu một cách rộng rãi phối hợp với các thành phần khác

để tạo ra nhiều dạng bào chế khác nhau như viên nén, viên nang, bột pha hỗn hợp phù hợp và thuận tiện cho từng đối tượng để chăm sóc và bảo vệ tốt nhất cho sức khỏe của mọi công dân

Có thể thấy việc sử dụng các vitamin cho dù là với mục đích bổ dưỡng hay chữa bệnh cũng cần phải đúng cách, đúng liều, nếu không sẽ gây những hậu quả rất nghiêm trọng Vì vậy việc xác định hàm lượng của chúng trong dược phẩm đòi hỏi có độ chính xác và độ đúng cao

Ở Việt Nam việc xác định hàm lượng các hợp chất hữu cơ trong dược phẩm vẫn còn dựa vào nhiều phương pháp phân tích thể tích có độ chính xác không cao, các phương pháp hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao( HPLC); phương pháp điên di mao quản (CE); phương pháp huỳnh quang thì rất tốn kém Phương pháp cực phổ có nhiều ưu điểm, đây là phương pháp được Heyrovsky phát minh ra (năm 1922, được giải Nobel 1959) Đó là một phương pháp sâu sắc về mặt lí thuyết và rộng rãi về mặt ứng dụng Phương pháp cực phổ được áp dụng trước hết trong lĩnh vực hoá phân tích và nổi bật hơn cả đó là phương pháp cực phổ xung vi phân là một dạng cực phổ có độ nhạy cao, độ phân giải lớn và dễ dàng tự động hoá, thích hợp với nhiều đối

có nhiều máy móc cực phổ xung, hoàn thiện, rẻ tiền, có độ chính xác cao và

nó cũng đã được trang bị cho nhiều phòng thí nghiệm ở nước ta

Trên cơ sở trên chúng tôi tiến hành:

“Nghiên cứu, xây dựng và ứng dụng phương pháp xác định đồng thời các hoạt chất vitamin B 1 , B 2 trong thuốc vitamin tổng hợp bằng phương pháp cực phổ xung vi phân.”

Để thực hiện được đề tài khóa luận này bằng thực nghiệm chúng tôi tiến hành các bước sau:

+ Nghiên cứu tìm điều kiện tối ưu của máy và dung dịch đo

+ Nghiên cứu tìm khoảng nồng độ thích hợp của các hoạt chất vitamin

B1, vitamin + B2 trong hỗn hợp vitamin phụ thuộc vào diện tích pic, từ đó xây dựng đường chuẩn

+ Kiểm tra đường chuẩn bằng các mẫu tự tạo để biết có thể ứng dụng đường chuẩn vào xác định hàm lượng các chất được hay không

+ Nghiên cứu, khảo sát tính thích hợp, độ lặp lại, độ đúng của hệ thống

2 Mục đích của đề tài

Xây dựng phương pháp định tính và định lượng các hoạt chất vitamin

B1, B2 có trong thuốc bổ chứa các vitamin bằng phương pháp cực phổ xung

3 Nhiệm vụ của đề tài:

Khảo sát tính thích hợp của thiết bị cực phổ xung vi phân trong quá trình phân tích đồng thời các hoạt chất vitamin có trong thuốc bổ vitamin

Khảo sát tìm nồng độ tuyến tính của các vitamin trong thuốc bổ chứa vitamin Từ đó xây dựng phương trình đường chuẩn của các vitamin với độ

chính xác và tin cậy cao

Ứng dụng mua thuốc bổ chứa vitamin đang bán rộng rãi trên thị trường

để phân tích và đánh giá bằng phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất vitamin B1, vitamin B2 có trong thuốc bổ chứa vitamin, so sánh hàm lượng tìm được với hàm lượng hoạt chất ghi trên nhãn mác của nhà sản xuất

4 Phương pháp nghiên cứu

Chúng tôi áp dụng phương pháp thực nghiệm vào nghiên cứu gồm hai nội dung là nghiên cứu cơ bản và ứng dụng lấy mẫu thật để phân tích đánh giá

Xây dựng chương trình cực phổ định tính và định lượng các vitamin

B1, B2 trong thuốc bổ chứa vitamin Để xây dựng chương trình cực phổ thích hợp, chúng tôi tiến hành khảo sát lựa chọn các điều kiện sau:

- Chọn nền

- Ảnh hưởng của oxi hòa tan

- Ảnh hưởng của pH nền đệm

- Ảnh hưởng của nồng độ nền đệm

- Ảnh hưởng của tốc độ quét thế

Để đánh giá chương trình cực phổ đã xây dựng được, chúng tôi tiến hành:

Khảo sát tính thích hợp của hệ thống cực phổ xung vi phân

Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các hoạt chất Khảo sát độ chính xác của phương pháp

Khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn

Thông qua việc xử lý thống kê các kết quả thực nghiệm để đánh giá chương trình cực phổ đã xây dựng

Ứng dụng chương trình cực phổ đã xây dựng, định tính và định lượng bằng phương pháp đường chuẩn

5 Kết quả đạt được

lượng vitamin B1, B2 có trong thuốc bổ chứa vitamin

Khảo sát tìm khoảng nồng độ tối ưu từ đó xây dựng được phương trình đường chuẩn với độ chính xác và tin cậy

Áp dụng phương pháp cực phổ xung vi phân trong định lượng các vitamin trong thuốc bổ chứa vitamin Kết quả thu được nằm trong khoảng độ tin cậy cho phép và hàm lượng các hoạt chất vitamin phân tích phù hợp với số liệu ghi trên bao bì của thuốc

6 Những điểm mới của đề tài:

Đã ứng dụng phương pháp cực phổ xung vi phân là một trong những phương pháp hiện đại nhất hiện nay trong phân tích và kiểm nghiệm dược

Xây dựng được phương pháp định lượng ổn định, chính xác cho hỗn hợp các vitamin B1 và vitamin B2 trong thuốc bổ chứa vitamin này bằng phương pháp cực phổ xung vi phân, ứng dụng phương pháp định lượng đã xây dựng vào việc kiểm tra chất lượng của thuốc bổ đang bán trôi nổi trên thị trường

NỘI DUNG CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Vitamin B1 (Thiamin hoặc thiamine) [1, 3, 4, 5, 6, 27]

1.1.1 Cấu trúc hóa học

Hình 1.1: Cấu tạo vitamin B 1

Công thức phân tử: C12H17N4OS.NO3 ( C12H17N5O4S )

Khối lượng phân tử: 327,4

Tên khoa

1.1.3 Nguồn gốc

Thức ăn hằng ngày cung cấp đủ vitamin B1 hay còn gọi là thiamin Thiamin có trong thức ăn nguồn gốc thực vật cũng như động vật, nó có nhiều trong men bia, trong các hạt ngũ cốc, chủ yếu là ở cám và trong các mầm hạt cây họ đậu, trong khoai tây, cà chua, hoa quả, thịt, gan, trứng, sữa…

1.1.4 Hóa tính

Cấu trúc hóa học của vitamin B1 gồm dẫn xuất của pyrimidin gắn với

dẫn chất của thiazol qua nhóm methylen

Dẫn xuất pyrimidin: vì có 3 nitơ nên mang lại cho vitamin B1 tính base Tuy nhiên, 2 nitơ trong nhân pyrimidin có tính base yếu, nhóm amin thơm có tính base yếu

Dẫn xuất thiazol: vòng thiazol là 1 dị vòng thơm vững bền, song vòng thiazoli có nitơ bậc bốn nên kém vững bền, đặc biệt trong môi trường kiềm và trung tính Trong các môi trường này vòng dễ bị thủy phân, mở vòng và lúc

đó rất dễ bị oxy hóa thành các sản phẩm không có hoạt tính vitamin

Nhóm 2-hydroxylethyl: nhóm này dễ bị ether hóa hoặc ester hóa tạo thành một số các hợp chất khác có tác dụng vô cùng quan trọng trong việc chuyển hóa các hydratcacbon

1.1.5 Tác dụng dược lý

Dùng để đề phòng và điều trị bệnh thiếu vitanin B1

Thiếu vitamin B1 có thể do trong thức ăn thiếu, do nhu cầu cao, do mất vitamin B1 khỏi cơ thể như do thẩm tích máu ở người suy thận, do ăn các thực phẩm chứa nhiều chất kháng vitamin B1 hoặc do các yếu tố trên kết hợp.Khi thiếu vitamin B1 nặng sẽ gây ra bệnh beri-beri, bệnh này ảnh hưởng tới hệ tim mạch, thần kinh, cơ và hệ thống tiêu hóa Tùy cơ quan bị ảnh hưởng, người ta phân bệnh beri-beri khô, ướt, não

Dạng bào chế: Cồn thuốc (0,25mg/ml), viên nén (5,10,25,50,100,250,500mg), dạng dung dịch tiêm (100mg/ml)…

1.2 Vitamin B2 (Riboflavin hoặc Lactoflavin) [1,2,3,6, 24,27,28]

1.2.3 Nguồn gốc

Vitamin B2 có nhiều trong trứng, sữa, phó mát, rau xanh, đặc biệt là trong gan và thận, ngũ cốc, bánh mì, men bia Rất nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin B2, trong đó có vi khuẩn sống ở đường ruột của người

1.2.4 Hóa tính

Hóa tính của vitamin B2 là hóa tính của đường riboso và của nhân benzopteridin-2,4 dion

- Đường ribose: Có thể ether hóa hoặc ester hóa

Tác dụng với acid sulfuric tạo màu đỏ, ứng dụng để định tính

Tác dụng với acid đa chức (acid photphoric…) tạo erter và dạng muối của kim loại kiềm của các ester đó dễ tan trong nước

Do có 3 nguyên tử cacbon bất đối nên vitamin B2 có các đồng phân quang học

- Nhân benzopteridin-2,4-dion:

- Hệ dây nối đôi luân phiên:

Do có hệ dây nối luân phiên tương đối dài nên vitamin B2 hấp thụ mạnh bức xạ vùng tử ngoại và cả bức xạ vùng trông thấy nên vitamin B2 có màu vàng và có các bước sóng cực đại hấp thị ở 445, 372, 269, 225nm

Dễ bị khử hóa thành một loại chất có tên leucoflavin không màu Đây

là phản ứng thuận nghịch xảy ra khi có mặt các chất khử như: H hoạt tính, NaHSO3, TiCl2

Phản ứng này dùng để giải thích vai trò của vitamin B2 trong cơ thể là tham gia xúc tác các phản ứng oxy hóa khử

1.2.5 Tác dụng dược lý

Khi vào trong cơ thể, vitamin B2 bị photphoryl hóa thành các coenzim, chúng tham gia xúc tác các quá trình oxy hóa chuyển hóa các hydrat cacbon, các acid amin

Vitamin B2 có tác dụng to lớn trong việc duy trì sự nguyên vẹn của hồng cầu

Vitamin B2 dùng để đề phòng và điều trị bệnh thiếu vitamin B2 Triệu chứng đầu tiên khi thiếu vitamin B2 là đau họng, viêm các góc miệng, sau đó

là viêm lưỡi, khô nứt môi, viêm da tiết bã nhờn ở mặt, viêm da toàn thân và chân tay, sau đó là bị thiếu máu và bệnh thần kinh Một số trường hợp gây đục thủy tinh thể Ngoài ra vitamin B2 được dùng điều trị thiếu máu tiểu hồng cầu, đề phòng bệnh đau nửa cầu

Dạng bào chế: Viên nén, dung dịch tiêm 0,1%, dung dịch thuốc nhỏ mắt…

1.3 Các phương pháp hóa lý trong kiểm nghiệm thuốc

1.3.1 Phương pháp quang phổ phân tử [8,9,10,15,14,23]

1.3.1.1 Quang phổ hấp phụ UV.VIS

a Phương pháp đo phổ trực tiếp:

Đo độ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ C của nó dựa vào giá trị

độ hấp thụ riêng (có trong các bảng tra cứu)

Trong đó:

AS : Là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn có nồng độ CS

AX: Là độ hấp thụ của dung dịch mẫu thử nồng độ CX

AX/As = CX/CS → CX = CS (AX/AS) (1.4) Chú ý: Nồng độ của dung dịch thử CX và dung dịch chuẩn CS không được chênh lệch nhau quá nhiều Các nồng độ này càng gần nhau, kết quả càng chính xác

c Phương pháp thêm chuẩn so sánh:

Trong phương pháp quang phổ, để loại trừ các yếu tố ảnh hưởng gây sai số cho quá trình định lượng: Xử lý mẫu (chiết xuất), sai lệch do thiết bị và hóa chất thuốc thử…, người ta áp dụng phương pháp thêm

d Phương pháp đường chuẩn:

Đây là phương pháp hay dùng trong phân tích quang phổ Chuẩn bị một dãy mẫu chuẩn khoảng 5 dung dịch có các nồng độ chất chuẩn CS khác nhau

Đo độ hấp thụ AS của dãy chuẩn và lập đồ thị của A theo C Đo độ hấp thụ AXcủa dung dịch mẫu thử và dựa vào đường chuẩn ta xác định được nồng độ mẫu thử CX

e Phương pháp thêm đường chuẩn:

Thêm những thể tích giống nhau của dung dịch thử vào dãy chuẩn chứa những lượng khác nhau và chính xác của chất chuẩn Đo độ hấp thụ của cả dãy rồi vẽ đường chuẩn quan hệ giữa mật độ quang với lượng chất chuẩn thêm vào Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành (nồng độ) cho ta nồng

độ của chất cần định lượng

f Kỹ thuật đo quang vi sai theo bước sóng:

Trong kiểm nghiệm các dạng thuốc bào chế, trước tiên phải qua công đoạn chiết hoạt chất ra khỏi tá dược Dịch chiết khó tránh khỏi mang theo tạp chất Tạp chất này có thể gây sai số cho quá trình định lượng bằng phương

quang vi sai: trên phổ của chất nghiên cứu, chọn 2 bước sóng 1 và 2, ở đó hiệu số độ hấp thụ ∆A là lớn nhất

∆A max = A  1 - A 2 (1.5) Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn với các nồng độ khác nhau và đo độ hấp thụ A ở 2 bước sóng 1 và 2 Khảo sát khoảng nồng độ tuân theo định luật Buger – Lambert - Beer của ∆A và vẽ đồ thị quan hệ ∆A - C Đo độ hấp thụ A của chất thử ở 2 bước sóng trên Sau đó dựa vào đồ thị ∆A – C suy ra nồng độ chất thử trong mẫu

g Phương pháp định lượng hỗn hợp

Do độ hấp thụ có tính cộng nên nếu có một dung dịch hỗn hợp gồm n chất thì độ hấp thụ của hỗn hợp bằng tổng độ hấp thụ của n chất riêng rẽ có cùng nồng độ như trong hỗn hợp Tại một bước sóng xác định ta có: Ahh = A1 + A2 + A3 +…+ An Để thực hiện phương pháp này, cần phải biết hệ số hấp thụ riêng của từng chất ở các bước sóng khác nhau

Việc xác định được sự có mặt của nhóm chức trong phân tử giúp chúng

ta có thể sử dụng phổ IR để định tính một chất

Trong kiểm nghiệm thuốc hầu hết các dược điển chủ yếu chỉ sử dụng

IR vào việc định tính, ít được dùng trong định lượng

1.3.2 Sơ lược về các phương pháp phổ và vonampe

a Nguyªn t¾c cña ph-¬ng ph¸p

Nhóm các phương pháp phân tích cực phổ và von-ampe là những phương pháp quan trọng nhất trong số các phương pháp phân tích điện hóa Các phương pháp này đều dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, phụ thuộc chủ yếu vào việc đưa chất điện hoạt từ trong lòng dung dịch đến bề mặt điện cực làm việc và ghi đường von-ampe (đường biểu diễn sự phụ thuộc cường

độ dòng Faraday vào giá trị thế của điện cực làm việc so với điện cực so sánh)

SP: nguồn điện SW: cầu chia thế W: điện cực làm việc R: điện cực so sánh A: điện cực phù trợ V: von kế

Phương pháp phân tích cực phổ sử dụng điện cực giọt Hg, hay dùng là điện cực giọt treo (HMDE), điện cực giọt rơi (DME), và điện cực giọt tĩnh (SMDE) Điện cực là giọt Hg lỏng hình cầu có đường kính khá nhỏ ( ≤ 1mm), được rơi ra từ một mao quản có chiều dài khoảng 10 - 15 cm, với đường kính trong khoảng 30 - 50 µm, mao quản được nối với bình chứa Hg bằng một ống

Trong điện cực giọt rơi, giọt Hg liên tục được hình thành ở đầu ống mao quản và rơi ra do lực hấp dẫn, kích thước và chu kì (hay tốc độ chảy) của giọt Hg được điều khiển bởi kích thước mao quản và chiều cao của bình chứa

Hg Tốc độ đó được quy ước tính bằng khối lượng Hg rơi ra khỏi mao quản trong một đơn vị thời gian (theo mg/s) Thông thường người ta chọn kích thước mao quản và chiều cao bình chứa sao cho tốc độ chảy khoảng 1,5 ÷ 4,0 mg/s Chu kì mỗi giọt khoảng từ 2 – 6 s

Trong điện cực giọt treo (thường dùng trong phân tích von-ampe hoà tan và von-ampe vòng), giọt Hg có kích thước nhỏ, có thể thay đổi được tùy theo yêu cầu thực nghiệm Giọt được hình thành rất nhanh và được giữ ở đầu mao quản trong quá trình đo

c Ưu điểm của điện cực giọt Hg

- Khoảng thế phân tích rộng, quá thế H2 trên điện cực giọt Hg lớn, vì vậy mở rộng khoảng thế phân tích đến -1V (so với điện cực calomen bão hòa) trong môi trường axit và đến -2V trong môi trường bazơ Tuy nhiên do có quá trình oxi hóa của Hg lỏng nên điện cực chỉ được sử dụng đến -0,3V hoặc 0,4V (so với điện cực calomen bão hòa) tuỳ môi trường

- Bề mặt giọt luôn được đổi mới và không bị làm bẩn bởi sản phẩm của phản ứng điện cực

- Với các điện cực hiện đại, giọt Hg được điều khiển bởi hệ thống van khí, do vậy độ lặp lại của giọt cao, tăng độ lặp, độ đúng và độ chính xác khi phân tích

- Kích thước giọt nhỏ nên lượng chất tiêu tốn khi phân tích là không đáng kể, do đó sự giảm nồng độ trong quá trình phân tích do sự oxi hóa khử trên điện cực thực tế là không xảy ra

d Điện cực so sánh

Thường hay sử dụng điện cực Ag/AgCl hay điện cực calomen bão hòa Điện cực so sánh phải có thế ổn định

e Sóng cực phổ khuếch tán

- Sóng cực phổ cổ điển có dạng bậc thang, dòng cực đại id tỷ lệ tuyến tính với nồng độ chất phân tích trong dung dịch id=f(C), người ta lợi dụng tính chất này để phân tích định lượng Tuy nhiên sóng cực phổ cổ điển có độ phân giải không cao cũng như có dòng dư lớn Do đó hạn chế độ nhạy của phương pháp chỉ xác định được 10-5M, và khả năng xác định nhiều chất cùng trong một hỗn hợp là khó khăn, độ chọn lọc kém

- Với kỹ thuât quét thế, kỹ thuật ghi dòng hiện đại đã khắc phục được nhược điểm đó, đồng nghĩa với tăng độ nhạy lên rất nhiều Có thể kể đến :

+ Cực phổ sóng vuông (SqW)

+ Cực phổ dòng xoay chiều hình sin (AC)

+ Cực phổ xung thường và xung vi phân (NP và DP)

+ Các phương pháp von ampe trên điện cực đĩa quay

+ Phân tích điện hóa hòa tan

Với độ nhạy đối với

+ Cực phổ sóng vuông và xung vi phân 10–6 – 10–8 M

+ Von ampe hòa tan anot điện cực giọt Hg treo 10–6 – 10–9 M

+ Von ampe hòa tan anot dùng cực màng Hg

trên cực rắn đĩa

10–8 – 10–10 M

Có thể thấy các phương pháp phân tích điện hóa rất phong phú và đa dạng Phạm vi đối tượng nghiên cứu rộng, cả hợp chất vô cơ và hàng nghìn hợp chất hữu cơ các loại

Phương pháp cực phổ xung vi phân là phương pháp phân tích điện hóa hiện đại, được cải tiến cả về kỹ thuật quét thế và kỹ thuât ghi dòng, khắc phục được đa số nhược điểm của phương pháp cực phổ cổ điển và phương pháp xung thường

điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm Ghi dòng tại hai thời điểm trước khi nạp xung và trước khi ngắt xung Đường biểu diễn sự khác nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng píc, rất dễ xác định, có độ phân giải cao Do vậy mà phương pháp xung vi phân giảm tối đa dòng dư, một hạn chế của cực phổ cổ điển

Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông

số của quá trình đo cực phổ được tính toán lý thuyết cho hệ thức sau:

i = nFSC (D/πtx)1/2 P (σ2 - 1)/[(σ+P)(1+Pσ)] (1.6) Trong đó

n: số e trao đổi trong phản ứng điện cực

W1/2 = 2RT/(nF) cosh–1[2 + cosh(nFE/(2RT))] (1.11)

Do vậy khi tăng biên độ xung thì theo phương trình (1.9) dòng i tăng

lên, nhưng đồng thời bán chiều rộng píc cũng tăng theo (1.10), do đó giảm độ phân giải của phương pháp Trong trường hợp biên độ xung đủ nhỏ ( E < 20/n mV) thì bán chiều rộng được tính bởi công thức (1.11)

Giät

r¬i

Giät r¬i

E

2-5mV E= 10-100 mV

2-5mV 1-50 ms

40

DP

0 50 100 150

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0

NP DC

(c)

(a): Thế biến thiên trong thời gian đo cực phổ

(b): Thế biến thiên trong 1 chu kì giọt (thời điểm ghi dòng)

(c): Sóng cực phổ

DC: Cực phổ cổ điển NP: Cực phổ xung thường

DP: Cực phổ xung vi phân

1.4 Yêu cầu của định lượng thuốc trong kiểm nghiệm dược phẩm

1.4.1.Tính đặc hiệu của phương pháp

Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng đánh giá chất cần phân tích khi có mặt các chất khác có thể là tạp chất, hoặc các thành phần cản trở khác Phương pháp phân tích có khả năng nhận diện chất cần phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác

Trong phân tích dịch sinh học phương pháp phải chứng minh được chất phân tích là dược chất hay chất chuyển hóa có tác dụng Phân tích mẫu không

bị ảnh hưởng bởi chất nội sinh và chất chuyển hóa liên quan

1.4.2.Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của phương pháp đo (diện tích hay chiều cao pic trong sắc kí hay điện di, mật độ quang trong quang phổ…) với nồng độ của chất cần phân tích trong dịch sinh học Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được bằng phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương tối thiểu)

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Trong khoảng này phép phân tích phải đáp ứng yêu cầu về độ chính xác và độ đúng theo quy định

Đường chuẩn nên có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu sinh học Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ nồng độ của các mẫu cần phân tích Không xác định nồng độ mẫu thử dựa trên điểm ngoại suy của khoảng tuyến tính Nồng độ thấp nhất là giới hạn định lượng, thông

thường phải bằng 1/20-1/10 giá trị Cmax Trong khoảng nồng độ khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ số tuyến tính r ≥ 0,99

Đường chuẩn phải đáp ứng các điều kiện sau:

- Độ lệch so với các giá trị thực của các nồng độ phải ≤ 15%, trừ điểm gần LOQ được chấp nhận ≤ 20%

- Có ít nhất 4/6 điểm đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả LOQ và nồng độ cao nhất

1.4.3 Độ đúng

Giá trị đánh giá sự phù hợp của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết Điều đó có thể được hiển thị bởi hệ số thu hồi, thường cho phép trong khoảng 85 – 115 %, nhưng có thể chấp nhận 80 – 120 % đối với điểm gần giới hạn định lượng

Độ đúng cũng cần xác định ở ít nhất 2 khoảng nồng độ thấp nhất và cao nhất

1.4.4 Độ chính xác

Đánh giá mức độ phân tán của các phép thử song song Độ chính xác được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 3 nồng độ của mẫu cần kiểm tra, một nồng độ gần với giới hạn nhỏ nhất của đường chuẩn (LOQ), một nồng độ gần với giới hạn trên của đường chuẩn và một nồng độ ở gần giữa đường chuẩn Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu

Độ chính xác có thể được biểu thị là độ lệch chuẩn tương đối giữa các mẫu (RSD%) trong ngày và giữa các ngày, được xác định dựa trên các mẫu đối chứng Cho phép RSD tới 15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép ≤ 20%

1.4.5 Giới hạn phát hiện(LOD), giới hạn định lượng dưới(LOQ)

a Giới hạn phát hiện(LOD)

Giới hạn phát hiện của phương pháp được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích ( xL) mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích ( yL)

khác có nghĩa với tín hiệu của máy trắng hay tín hiệu nền

Tức là yL = yB + k.sB

YB là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau n thí nghiệm n ≥ 20

SB là độ lệch chuẩn tín hiệu mẫu trắng

K là đại lượng số học phụ thuộc độ tin cậy thống kê được chọn

Do đó xL = . B

B

k s X a



Mẫu trắng có xB = 0 nên . B

L

k s X a



(1.13)Trong trường hợp không phân tích mẫu trắng có thể xem độ lệch chuẩn mẫu trắng sB = sy, sy là độ lệch chuẩn của tín hiệ y trên đường chuẩn Khi đó:

yl = b + 3.sy

Theo phương trình hồi quy yL = b + a.xL nên 3. y

L

s X a



(1.14)

b giới hạn định lượng dưới(LOQ)

Từ biểu thức (1.13) cho k = 10 ta có giá trị LOQ 10.s B

Trong [12] tác giả đã xây dựng được quy trình xác định được riêng rẽ các vitamin bằng phương pháp cực phổ xung vi phân và cũng đã tìm được các điều kiện tối ưu để xác định vitamin B1, và B2 như sau:

a Vitamin B 1

+ Đệm photphat pH = 6,7

+ Nồng độ đệm 0.1M

+ Thời gian đuổi khí trước khi quét thế 60s

+ Thời gian cân bằng trước khi quét thế: 10s

+ Thời gian khuấy: 3s

+ Thời gian đuổi khí trước khi quét thế 60s

+ Thời gian cân bằng trước khi quét thế: 10s

+ Thời gian khuấy: 3s

+ Biên độ xung 50mV

+ Tốc độ quét thế 5mV/s

+ Khoảng quét thế từ -0,15V đến -0.5V

Có một số nhà nghiên cứu đã xây dựng được quy trình xác định riêng

rẽ các vitamin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [13] và cũng đã tìm được các điều kiện tối ưu để xác định vitamin B1 như sau:

+ Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao

+ Cột ODS C18

+ Detector UV: bước sóng 248nm

+ Pha động: methanol- dung dịch đệm H3PO4 (20:80)

dụng vào việc định lượng các hoạt chất trong thuốc vitamin bán trên thị trường Tuy nhiên các tài liệu trên chỉ dừng lại ở việc xác định một cách riêng

rẽ, điều này dẫn đến việc xác định hàm lượng các hoạt chất trong vitamin tổng hợp là khó khăn và tốn nhiều thời gian Chính vì vậy mà chúng tôi đã nghiên cứu để tìm qui trình phương pháp xác định đồng thời từ 2,3 Vitamin trong 1 lần phá mẫu và phân tích mẫu

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

+ Thuốc vitamin tổng hợp của công ty dược phẩm Traphaco, CTCP dược

phẩm Hà Nội, CTCP dược phẩm Hà Tây, CTCP dược và VTYT Bình Thuận

+ Pha hỗn hợp dung dịch gốc chuẩn chứa đồng thời các hoạt chất vitamin B1 và vitamin

+ Natriaxetat, kaliclorua, NaH2PO4.2H2O, K2HPO4.3H2O, Na2B2O7.10H2O + Axit axetic đậm đặc Axit xitric, natri hidroxit

2.1.2 Dụng cụ

+ Các dụng cụ thủy tinh, buret, pipet, bình định mức của Đức có độ chính xác cao, được ngâm rửa thường xuyên bằng hỗn hợp kali ddicrommat

và axit sunfuric đặc 98%

+ Máy phân tích điện hóa đa chức năng 797 VA Computrace, Metrohm

- Điện cực làm việc: điện cực giọt Hg

- Điện cực so sánh: điện cực Ag/AgCl

2.1.3 Pha hóa chất

2.1.3.1 Pha dung dịch B2

Cân chính xác 10mg B chuẩn cho vào cốc, thêm 5 ml axit axetic đặc và 100ml nước cất 2 lần, đem đun cách thuỷ vừa đun vừa lắc trong 1 giờ Để nguội thêm 30 ml NaOH 0,1 M, chuyển toàn bộ vào bình định mức 1 lít, sau

đó định mức bằng nước cất 2 lần đến vạch định mức được dung dịch B2: 10 mg/lít tương đương: 2,6567.10-5

M

2.1.3.2 Pha dung dịch B1

Cân chính xác 10 mg B1 cho vào cốc, khuấy tan sau đó chuyển vào bình định mức 1lít thêm nước cất đến vạch ta được dung dịch B1 10mg/l tương đương: 3,05401.10-5

Tỡm đường chuẩn dạng: y=ax+b (2.1)

i i i

i

x x

n

y x y

x n

a (2.2)

n

x a y

b  i   i

 (2.3) Tính độ lệch chuẩn s:

Thay xi vào ph-ơng trình (2.1) vừa tìm, đ-ợc yˆ i tính theo lý thuyết

Độ lệch chuẩn  

2

ˆ 1

x x

s x

x n

ns s

i i

i a

2 2

2 2

x x n

x s x

x n

x s s

i i

i i

i b

n

i i

(2.8)

Trong đú : Xi là kết quả của lần xỏc định thứ i

n là số lần xỏc định

Đ-ờng chuẩn y=(a± t.sa)x + (b±t.sb) (2.9)

t là thừa số studen lý thuyết với độ tin cậy thống kê là 95%, hệ số tự do f=n-2 (2.10)

Đánh giá tính có ý nghĩa của hệ số b

- Nếu t.sb > b thì b là giá trị không có nghĩa, chấp nhận b=0, tính lại ph-ơng trình đ-ờng chuẩn theo dạng y=ax

- Nếu t.sb < b thì b có nghĩa, đúng là b  0

2.4.2 Kiểm tra đường chuẩn

Pha dung dịch cú nồng độ àX coi như chưa biết, ghi đường cực phổ, thay giỏ trị Yj vào phương trỡnh đường chuẩn được nồng độ Xj, lặp lại m lần,

j = 1 ữ m

a

b Y

Giả thuyết thống kê

Chúng tôi phân tích các thuốc vitamin tổng hợp, thuốc dạng viên nén

có chứa nhiều loại vitamin như B1, B2, B6, B12,…, tá dược khác Vitamin B2

và vitamin B1 tan được trong nước với một lượng nhỏ nên chúng tôi hòa tan 2 vitamin này trong nước cất hai lần và khuấy đều tay

2.4.3.2 Phương pháp xử lý kết quả [11]

Các số liệu thực nghiệm được kiểm tra sai số thô và xử lý tính toán theo công thức của các đại lượng thống kê Xử lý đường chuẩn theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm exel

Để loại trừ ảnh hưởng của sai số nền, các mẫu thuốc sau khi xử lý đưa

về dạng dung dịch và được đem đo trên máy đo cực phổ xung vi phân theo chế độ tối ưu đã khảo sát và xác định bằng phương pháp đường chuẩn chuẩn

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Điều kiện tối ưu xác định các vitamin B bằng phương pháp cực phổ xung vi phân

Trong luận văn này chúng tôi tập chung nghiên cứu điều kiện tối ưu để xác định các vitamin B1, B2 và xác định đồng thời hỗn hợp vitamin B1 và vitamin B2 trên cơ sở máy móc, hóa chất, môi trường phòng thí nghiệm ở Việt Nam Mục đích nghiên cứu để tìm ra qui trình, phương pháp xác định đồng thời vitamin B1, vitamin B2 trong mẫu thực tế thuốc vitamin tổng hợp đang thịnh hành trên thị trường Việt Nam

Chúng tôi đã nghiên cứu tìm được các điều kiện đo dòng khuếch tán xung trên thiết bị cực phổ đa năng 797 VA computrace được ghi trong bảng (3.1.1)

Bảng 3.1.1 Chương trình ghi sóng cực phổ xung vi phân của các vitamin B

Thời gian đuổi khí ban đầu 180s

Thời gian khuấy sau khi cho mẫu 3s

Thời gian cân bằng trước khi quét thế 10s

3.1.1 VitaminB 2

3.1.1.1 Khảo sát chọn dung dịch đệm làm nền

Để chọn một nền đệm thích hợp cho phép phân tích cực phổ xung vi phân Vit B2, chúng tôi tiến hành thăm dò tính chất cực phổ của Vit B2 trong các nền: dung dịch đệm photphat, dung dịch đệm axetat

Lấy 7 bình định mức dung tích 25ml dùng pipet lấy chính xác cho vào mỗi bình 10ml dung dịch B2 (10mg/l), thêm tiếp 10ml đệm chuẩn đến pH phù hợp sau đó thêm nước cất 2 lần đến 25ml, rót lần lượt từng dung dịch có pH (4,9 ÷ 7,7) vào cốc đo cực phổ, cho máy VA Computrace 797 chạy sau khi đặt các thông số đo tối ưu như trong bảng (3.1.1) máy đo xong vào signal chọn peak search rồi search ta được kết quả trên màn hình vi tính ghi chiều cao sóng cực phổ xung vi phân phụ thuộc vào pH và vào nền đệm đưa ra ở bảng (3.1.2) và thể hiện ở hình (3.1.1), hình (3.1.2)

Bảng 3.1.2: Sự phụ thuộc I p , E p của sóng cực phổ xung vi phân Vit.B 2

vào các nền đệm khác nhau

Đệm photphat

pH 4,9 5,8 6,1 6,5 6,7 7,1 7,7 Ep(V) 0,297 0,342 0,363 0,378 0,388 0,393 0,398 Ip(nA) 98,4 112,8 93,5 73,2 48,7 63,1 43

Đệm axetat

pH 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 Ep(V) 0,217 0,242 0,277 0,342 0,358 0,378 0,398 Ip(nA) 446 530 523 373 256 190 189

(2) (3)

Hình 3.1.1: Sóng cực phổ của Vit.B2 trong nền đệm axetat pH khác nhau

Với: (1) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH = 4,0 (3) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH = 5,0 (2) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH = 4,5 (4) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH = 5,5

(4)

(3) (1) (2)

Hình 3.1.2 : Sóng cực phổ của Vit.B2 trong nền đệm photphat pH khác nhau

Với: (1) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH =4,9 (2) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH = 5,8 (3) Sóng cực phổ Vit.B tại pH = 5,0 (4) Sóng cực phổ Vit.B tại pH = 6,5

Nhận xét: Khi phân tích các hợp chất hữu cơ bằng phương pháp cực

phổ, các dung dịch cần duy trì một pH thích hợp và ổn định Thực nghiệm khảo sát sóng cực phổ xung vi phân của Vit.B2 trong hai loại nền: đệm photphat và đệm axetat ta thấy rằng Trong nền đệm axetat thi cho phổ có pic cao và cân đối hơn so với trong nền đệm phophat Trong các thí nghiệm tiếp theo trong luận văn này chúng tôi sử dụng dung dịch đệm axetat làm nền

3.1.1.2 Khảo sát tìm pH nền đệm axetat tối ưu

Với các hợp chất hữu cơ thì pH nền đệm thường có ảnh hưởng rất lớn tới sóng cực phổ của chúng Do phản ứng điện trên điện cực thường có sự tham gia của proton H+ Chúng tôi đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của pH đến sóng cực phổ xung vi phân của Vit.B2 tại các pH khác nhau

Kết quả đưa ra ở bảng (3.1.3) và thể hiện ở hình (3.1.3)

Bảng 3.1.3: Khảo sát sóng cực phổ xung vi phân của VitB 2 trong

Hình 3.1.3 : Sóng cực phổ của Vit.B 2 trong nền đệm axetat pH từ 4,0 ÷ 6,0

Với: (1) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH = 4,0 (3) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH = 5,0 (2) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH = 4,5 (4) Sóng cực phổ Vit.B 2 tại pH = 5,5

Nhận xét: Kết quả thu được ở bảng trên cho ta thấy, thế đỉnh pic của

VitB2 chuyển dịch về phía âm hơn khi tăng pH, tại các vị trí pH=4,0, pH

=4,5, pH=5,0 pic của Vit.B2 cao và cân đối tuy nhiên tại pH= 4,5 là cao và tốt hơn cả vì thế chúng tôi đã chọn nền đệm axetat có pH = 4,5 làm điều kiện cho các lần đo sau

3.1.1.3 Khảo sát tìm nồng độ nền đệm axetat tối ưu

Nồng độ nền đệm có ảnh hưởng tới phép phân tích cực phổ do quá trình vận chuyển chất đến bề mặt điện cực có sự cạnh tranh của 3 quá trình khác nhau: khuếch tán, điện chuyển và đối lưu Nhưng chỉ có dòng khuếch tán tỷ lệ với nồng độ chất cần nghiên cứu Vì thế cần chọn nồng độ thích hợp

để loại trừ dòng điện chuyển

Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sóng cực phổ xung vi phân của Vit.B2

1

4

trong nền đệm axetat tại các nồng độ đệm axetat:

Từ dung dịch đệm axetat có tổng nồng độ CH3COONa + CH3COOH = 0,1M Ta lấy chính xác lần lượt thể tích đệm như sau: 4ml, 6ml, 8ml, 10ml, 12ml vào 5 bình định mức 25ml, sau đó thêm 10ml dung dịch Vit.B2 rồi định mức bằng nước cất 2 lần đến 25ml lắc đều, khi đó tổng nồng độ đệm tương ứng sẽ là 0,016M, 0,024M, 0,032M, 0,04M, 0,048M, rót từng dung dịch vào cốc đo cực phổ cho máy cực phổ đa năng VA Computrace 797 chạy sau khi đã đặt các thông số đo tối ưu như trong bảng (3.1.1) máy đo xong vào signal chọn peak search rồi search ta được kết quả trên màn hình vi tính, ghi chiều cao sóng cực phổ xung vi phân phụ thuộc vào nồng độ nền đệm đưa ra ở bảng (3.1.4)

Bảng 3.1.4 : Sự phụ thuộc I p của sóng cực phổ xung vi phân của Vit.B 2

Nhận xét: Thực nghiệm cho ta thấy rằng tại nồng độ của đệm từ

0,016M đến 0,048M thì pic có chiều cao tốt nhưng tại nồng độ 0,032M thì píc đẹp và cân đối hơn cả do đó chúng tôi đã chọn nồng độ đệm là 0.032M cho các lần phân tích sau

3.1.1.4 Ảnh hưởng của oxi hòa tan

Nồng độ oxi hòa tan trong dung dịch phân tích thường từ 10-4 đến 2.10

-đó hidro peoxit lại bị khử thành nước, theo hai bán phản ứng sau:

O2 + 2H+ + 2e → H2O2

H2O2 + 2H+ + 2e → 2H2O

Thế bán sóng tương ứng của hai quá trình trên đối với điện cực calomen bão hòa lần lượt là – 0,1V và – 0,9V Do đó lượng oxi hòa tan trong dunh dịch có thể ảnh hưởng đến sóng cực phổ của Vit.B2

Để khảo sát ảnh hưởng của oxi hòa tan đến quá trình phân tích cực phổ của Vit.B2, chúng tôi tiến hành đo chiều cao sóng cực phổ của Vit.B2 sau 0 giây, 30 giây, 45 giây, 60 giây, 75 giây, 90 giây, 120 giây, 150 giây, 180 giây, 300 giây với dung dịch Vit.B2 nồng độ 1,6mg/l Kết quả đưa ra ở bảng (3.1.5) và thể hiện

ở hình (3.1.4)

Bảng 3.1.5 : Sự phụ thuộc chiều cao sóng vi phân của Vit.B 2

theo thời gian đuổi khí

TT Thời gian

(giây)

Ip(nA)

Itb(nA) Lần 1 Lần 2

Hình 3.1.4: Sóng cực phổ của Vit B 2 theo thời gian đuổi khí khác nhau

Với: (1) Sóng cực phổ của Vit.B 2 khi thời gian đuổi khí là 0 giây

(2) Sóng cực phổ của Vit.B 2 khi thời gian đuổi khí là 90 giây

Nhận xét: Sau khi đuổi khí ở thời gian 30 giây đã có pic của Vit.B2xuất hiện nhưng chưa cân đối, khi thời gian đuổi khí là 60 giây thì pic cân đối hơn và có chiều cao cũng ổn định hơn, tuy nhiên ở 90 giây là ổn định hơn cả

Do đó, có thể nói sau 90 giây ở nồng độ 4mg/l thì oxi hòa tan đã không còn ảnh hưởng đến sóng cực phổ của Vit.B2 nữa

Vì vậy, chúng tôi đã chọn thời gian đuổi khí oxi trước khi quét thế là 90s cho các thí nghiệm nghiên cứu Vit.B2 tiếp theo

3.1.1.5 Khảo sát tìm khoảng nồng độ Vit.B 2 tối ưu

a Xây dựng đường chuẩn

1

2

Để tìm khoảng nồng độ tối ưu xác định Vit.B2 bằng phương pháp cực phổ xung vi phân, chúng tôi tiến hành khảo sát khoảng nồng độ mà chiều cao sóng cực phổ phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ Vit.B2

Tiến hành thí nghiệm từ dung dịch B2 chuẩn ban đầu có nồng độ 10mg/l ta lấy lần lượt các thể tích tương ứng là 0,25ml, 0,5ml, 0,75ml, 1,25ml, 1,75ml, 2,5ml, 5ml cho vào 7 bình định mức 25ml, thêm tiếp 10ml đệm axetat pH = 4,5 rồi thêm nước cất đến vạch định mức (khi đó các nồng

độ Vit.B2 lần lượt là: 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,5mg/l; 0,7mg/l; 1mg/l; 2mg/l) lắc đều rót vào cốc đo cực phổ rồi tiến hành đo lặp lại 3 lần với mỗi nồng độ, sau đó lấy kết quả trung bình (cách ghi pic như các thí nghiệm trên mục (3.1.1.3) Kết quả đưa ra ở bảng (3.1.6) và thể hiện ở hình (3.1.5), (3.1.6)

Bảng 3.1.6: Sự phụ thuộc chiếu cao sóng cực phổ xung vi phân vào

Đường chuẩn của VitB2

y = 69.973x + 61.776 R2 = 0.9996

0 50

Hình 3.1.5: Sự phụ thuộc chiếu cao sóng cực phổ xung vi phân

b Kiểm tra đường chuẩn khi phân tích các mẫu tự tạo

Để kiểm tra tính chính xác của đường chuẩn chúng tôi tiến hành pha dung dịch Vit.B2 có nồng độ 25mg/l Từ dung dịch Vit.B2 trên ta lấy lần lượt 0,25ml và 1,15ml vào 2 bình định mwcsdung tích 25ml rồi thêm 10ml đệm axetat có pH = 4,5 sau đó thêm nước cất 2 lần vào từng bình định mức đến vạch lắc ( khi đó nồng độ Vit.B2 tương ứng là 0,25mg/l và 1,15mg/l) rồi tiến hành đo sóng cực phổ của Vit.B2 của từng bình theo các điều kiện tối ưu đã khảo sát Đo lặp lại 7 lần Thay các giá trị ip vào phương trình đường chuẩn Vit.B2 (3.1), tính được các giá trị C1, C2 được trình bày trong bảng (3.1.7)

Bảng 3.1.7: Đánh giá độ chính xác của đường chuẩn Vit.B 2

Nhận xét: Độ chính xác của đường chuẩn được đánh giá qua giá trị độ

lệch chuẩn S và độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) Kết quả thu được cho thấy RSD thấp dưới 2% phù hợp với tiêu chuẩn kiểm nghiệm của bộ y tế [1],điều này chứng tỏ đường chuẩn có độ chính xác cao giữa các lần phân tích, xác định Mặt khác trong cả hai trường hợp, ttính đều nhỏ hơn tbảng (0,05;6) = 2,45 nên

có thể kết luận sự khác nhau giữa giá trị nồng độ Cx tính theo đường chuẩn và giá trị µx đã pha là do ngẫu nhiên với độ tin cậy 95% Do vậy có thể kết luận việc xác định nồng độ trong khoảng 0.1 ÷ 2mg/l theo đường chuẩn cho độ đúng tốt và phép đo không mắc sai số hệ thống

c Giới hạn phát hiện(LOD), định lượng(LOQ) của phương pháp

Dựa vào kết quả sử lý thống kê theo phương pháp bình phương tối thiểu ta có Sy và a thay (1.14), (1.15) ta có:

(LOD)B2 = 3.s y

a = 0,034mg/l, tương đương 9,03.10-8M

(LOQ)B2 = 3.s y 0,113

a  mg/l, tương đương 3,01.10-7M

Tóm tắt các điều kiện tối ưu xác định Vit.B 2

Sau khi khảo sát các điều kiện tối ưu của Vit.B2 chúng tôi đã chọn được các điều kiện tối ưu xác định Vit.B2 bằng phương pháp cực phổ xung vi phân với thiết bị đo VA Computrace 797 như sau:

+ Dung dịch nền để đo sóng cực phổ xung vi phân của Vit.B2 là dung dịch đệm axetat có tổng nồng độ là 0,032M ; pH = 4,5 tương đương tỉ lệ

VCH3COOH : VCH3COONa là 5,3 : 4,7

+ Thời gian đuổi khí trước khi quét thế là 90s

+ Khoảng nồng độ phân tích tối ưu là 0.1mg/l đến 2mg/l tương đương nồn độ từ 2,657.10-7M đến 5,31.10-6

M + Thời gian cân bằng trước khi quét thế: 10s

+ Thời gian khuấy: 3s