Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dịch chiết từ cây lá lốt (piper sarmentosum roxb ) ở vùng thọ xuân, tỉnh thanh hóa

Hiện nay, hầu hết các loài trong họ Hồ tiêu Piperaceae đều có khả năng sinh tổng hợp và tích luỹ các hợp chất tự nhiên, đặc biệt là tinh dầu... Nhiệm vụ nghiên cứu Nhiệm vụ nghiên cứu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố và có nguồn gốc rõ ràng và được trích dẫn đầy đủ theo quy định

Thanh Hóa, ngày 01 tháng 7 năm 2020

Tác giả

Phạm Văn Vĩnh

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Đỗ Quang Huy ĐHKH Tự nhiên ĐHQG Hà Nội là người đã trực tiếp hướng dẫn tôi, tạo mọi điều kiện giúp đỡ và cho tôi những lời khuyên qúy báu để tôi có thể hoàn thành đề tài luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy, cô thuộc Bộ môn Hóa học- Trường Đại học Hồng Đức đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm thí nghiệm và hoàn thành đề tài nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi đo phổ các mẫu chất sau thí nghiệm khi thực hiện đề tài nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè tôi - những người đã luôn động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này./

Thanh Hóa, ngày 1 tháng 7 năm 2020

Tác giả

Phạm Văn Vĩnh

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Đối tượng nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Nghiên cứu thực vật họ Hồ tiêu (Piperaceae) 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 Ở Việt Nam 4

1.2 Giá trị sử dụng của các loài trong họ Hồ tiêu (Piperaceae) 5

1.3 Tinh dầu 8

1.3.1 Khái niệm chung về cây tinh dầu 8

1.3.2 Khái niệm về tinh dầu 8

1.4 Nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu họ Hồ tiêu (Piperaceae) 11

1.4.1 Trên thế giới 11

1.4.2 Ở Việt Nam 16

1.5 Cây lá lốt 17

1.5.1 Đặc điểm thực vật 17

1.5.2 Thành phần hoá học 18

1.5.3 Sử dụng 18

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Phương pháp nghiên cứu tinh dầu 21

2.1.1 Thu mẫu và chưng cất tinh dầu 21

2.1.2 Phương pháp định lượng tinh dầu 21

2.1.3 Phương pháp phân tích thành phần hoá học tinh dầu 21

2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất 22

2.2.1 Phương pháp thu hồi dung môi 25

2.2.2 Tách các chất từ các cao thu được 25

2.2.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 26

2.3 Phương pháp xử lí số liệu 27

2.4 Hóa chất và thiết bị 28

2.4.1 Hoá chất 28

2.4.2 Thiết bị 28

2.5 Nghiên cứu các hợp chất từ phần trên mặt đất của cây lá lốt (Piper sarmentosum Roxb.) 28

2.5.1 Phân lập các hợp chất 28

2.5.2 Các dữ kiện vật lý của các chất tách được 30

2.6 Thử hoạt tính kháng khuẩn của các chất tách được 31

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả nghiên cứu tinh dầu 34

3.1.1 Định lượng tinh dầu 34

3.1.2 Phân tích thành phần hoá học tinh dầu của cây lá lốt 34

Phần trên mặt đất của cây lá lốt được thu hái ở Thọ Xuân Thanh Hóa vào tháng 8 năm 2019 Hàm lượng tinh dầu đạt 0,038% so với trọng lượng tươi, tinh dầu có màu trắng, nhẹ hơn nước 34

3.2 Kết quả phân lập các hợp chất từ cây lá lốt 36

3.2.1 Cấu trúc của hợp chất HV1 37

3.2.2 Cấu trúc hợp chất HV2 50

3.2.3 Hợp chất HV3 54

3.3 Thử hoạt tính kháng khuẩn của các chất tách được 62

3.3.1 Phương pháp phân tích 62

3.3.2 Kết quả 63

KẾT LUẬN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Thành phần hóa học tinh dầu từ phần trên mặt đất của Lá lốt ở Thọ Xuân Thanh Hóa 35B¶ng 3.2: Sè liÖu phæ 13C-NMR cña hîp chÊt HV1 40Bảng 3.3 Số liệu phổ 13

C-NMR của hợp chất HV2 51Bảng 3.4 Số liệu phổ 13

C- NMR của hợp chất HV3 54

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Piper sarmentosum Roxb 18

Hình 1.2 Piper sarmentosum Roxb 18

Sơ đồ 2.1: Chiết các phân đoạn của cây lá lốt 29

Sơ đồ 2.2: Tách các hợp chất từ cao etylaxetat của cây lá lốt 30

H×nh 3.1: Phæ UVcña hîp chÊt HV1 37

H×nh 3.2: Phæ khèi l-îng phun mï electron (ESI-MS) positive 38

H×nh 3.3: Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt HV1 38

H×nh 3.4: Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt HV1 (phæ gi·n) 39

H×nh 3.5: Phæ 1H-NMR cña hîp chÊt HV1 (phæ gi·n) 39

H×nh 3.6: Phæ 13C-NMR cña hîp chÊt HV1 41

H×nh 3.7: Phæ 13C-NMR cña hîp chÊt HV1 (phæ gi·n) 41

H×nh 3.8: Phæ 13C-NMR cña hîp chÊt HV1 (phæ gi·n) 42

H×nh 3.9 : Phæ DEPT cña hîp chÊt HV1 42

H×nh 3.10: Phæ DEPT cña hîp chÊt HV1 (phæ gi·n) 43

H×nh 3.11: Phæ HMBC cña hîp chÊt HV1 44

H×nh 3.12: Phæ HMBC cña hîp chÊt HV1 (phæ gi·n) 45

H×nh 3.13: Phæ HMBC cña hîp chÊt HV1 (phæ gi·n) 46

H×nh 3.14 : Phæ HMBC cña hîp chÊt HV1 (phæ gi·n) 47

H×nh 3.15: Phæ HMBC cña hîp chÊt HV1 (phæ gi·n) 48

H×nh 3.16 : Phæ HSQC cña hîp chÊt HV1 49

Hình 3.17: Phổ khối lƣợng va chạm (EI-MS) của hợp chất HV2 52

Hình 3.18: Phổ 1 H-NMR của hợp chất HV2 52

Hình 3.19: Phổ 13 C-NMR của hợp chất HV2 53

Hình 3.20: Phổ DEPT của hợp chất HV2 (phổ giãn) 53

Hình 3.21 Phổ MS của hợp chất HV3 55

Hình 3.22 Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 56

Hình 3.23 Phổ 1H-NMR của hợp chất LT3 (phổ giãn) 56

Hình 3.24 Phổ 1H-NMR của hợp chất HV3 (phổ giãn) 57

Hình 3.25 Phổ 1H-NMR của hợp chất HV3(phổ giãn) 57

Hình 3.26 Phổ 13C-NMR của hợp chất HV3 58

Hình 3.27 Phổ 13C-NMR của hợp chất HV3 58

Hình 3.28 Phổ 13C-NMR của hợp chất HV3 59

Hình 3.29 Phổ DEPT của hợp chất HV3 59

Hình 3.30 Phổ HMBC của hợp chất HV3 60

Hình 3.31 Phổ HSQC của hợp chất HV3 61

Hình 3.32 Phổ COSY của hợp chất HV3 62

có hoạt tính sinh học của nguồn gen thực vật Trong hệ thực vật Việt Nam, nhóm các cây có tinh dầu rất phong phú và đa dạng Đến nay đã thống kê được khoảng 657 loài thuộc 357 chi và 114 họ (chiếm khoảng 6,3% tổng số

loài; 15,8% tổng số chi và 37,8% số họ) Họ Hồ tiêu (Piperaceae) có 4 chi, 50 loài (chi Lepianthes – Lân hoa có 01 loài: Lepianthes umbellatum; chi Peperomia – Càng cua có 06 loài; chi Piper – Hồ tiêu có 42 loài; chi Zippelia

có 01 loài) Tập trung chủ yếu ở vùng nhiệt đới, đặc biệt là vùng Đông Nam

Á và nhiệt đới châu Mỹ Xu hướng hiện nay của các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung nghiên cứu không chỉ về sinh học mà còn các hợp chất hóa học có ở trong họ này để ứng dụng trong y dược học

Kinh nghiệm dân gian cho thấy có nhiều loài trong họ Hồ tiêu

(Piperaceae) được đồng bào các dân tộc sử dụng các bộ phận khác nhau để làm thuốc, làm rau ăn, Do vậy, nghiên cứu họ Hồ tiêu (Piperaceae) để có

cơ sở khoa học nhằm khai thác và sử dụng bền vững nguồn tài nguyên thực vật đã và đang là mối quan tâm lớn của nhân loại Trong số các nhóm tài nguyên thực vật thì nhóm cây chứa tinh dầu chiếm vị trí rất quan trọng Đây

là nguồn nguyên liệu thiết yếu cho nhiều ngành công nghiệp như mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Hiện nay, hầu hết các loài trong họ Hồ tiêu

(Piperaceae) đều có khả năng sinh tổng hợp và tích luỹ các hợp chất tự nhiên,

đặc biệt là tinh dầu

Cây lá lốt (Piper sarmentosum Roxb.), thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) còn gọi

là tất bát Green clothing (Piper lolot C.DC.), Thuộc họ hồ tiêu (Piperaceae)

Ở Việt Nam, lá lốt mọc tự nhiên khắp mọi nơi, từ vùng đồng bằng đến trung

du, đặc biệt là ở các tỉnh vùng núi thấp Lá lốt là gia vị và cây thuốc, dùng để chữa đau xương, thấp khớp, tê thấp, đổ mồ hôi tay chân Nhằm nghiên cứu

thêm về cây lá lốt để khai thác hết tiềm năng của loài này, tôi chọn đề tài

“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dịch chiết

từ cây lá lốt (Piper sarmentosum Roxb.) ở vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh

Hóa”

2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận văn cây lá lốt (Piper sarmentosum

Roxb.) ở vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa, có triển vọng cung cấp các chất có hoạt tính sinh học phong phú và hấp dẫn

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Nhiệm vụ nghiên cứu của luận văn bao gồm:

- Chưng cất lôi cuốn hơi nước hoặc chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ phần trên mặt đất của cây lá

lốt (Piper sarmentosum Roxb.) ở vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa

- Xác định thành phần hoá học của tinh dầu từ cây lá lốt (Piper sarmentosum Roxb.) ở vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa

- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ cây lá lốt (Piper sarmentosum Roxb.) ở vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa

- Thử hoạt tính sinh học của một số chất phân lập được cây lá lốt (Piper sarmentosum Roxb.) ở vùng Thọ Xuân, tỉnh Thanh Hóa

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Nghiên cứu thực vật họ Hồ tiêu (Piperaceae)

(Piperaceae) thành hai nhóm là Piperneae gồm 15 chi với 304 loài và Peperomeae có 5 chi với 209 loài [23] De Candolle (1869) xác định họ Hồ tiêu (Piperaceae) gồm 2 chi Piper và Peperomia với trên 1.000 Theo Rendle (1956), họ Hồ tiêu (Piperaceae) gồm 2 chi lớn là Piper với trên 700 loài và

Peperomia với trên 600 loài, ngoài ra, còn thêm 7 chi nhỏ khác Tuy nhiên,

theo Lawrence (1957), họ Hồ tiêu (Piperaceae) có 10 - 12 chi với 2 chi lớn là

Piper và Peperomia Tác giả Burger (1977) cũng đưa ra kết luận tương tự

Theo phân loại của Takhtajan (1987), họ Hồ tiêu (Piperaceae) gồm có 7 chi

và trên 2.000 loài.[22]

Nghiên cứu phân loại họ Hồ tiêu (Piperaceae) bắt đầu với việc xuất

bản Các loài thực vật bởi Linnaeus (1753), đã mô tả có 17 loài thuộc chi

Piper Sau này Hooker (1885) mô tả có 45 loài trong Thực vật chí Ấn Độ

Quisumbing E (1930) có 89 loài phân bố ở Philippine Ở Java, Inđônexia có

23 loài Ridley (1967) đưa ra danh sách 73 loài từ vùng Malay Peninsula Long (1984) đưa ra danh lục ở Bhutan có 12 loài Huber (1987) đã công bố có

10 loài từ Ceylon.[20]

Ở các vùng khác nhau có những công trình công bố đại diện cho khu vực như: Năm 1999, Cheng và cộng sự đã công bố ở Trung Quốc có 60 loài, trong đó có 34 loài đặc hữu Gần đây, Chaveerach và cộng sự (2005), đã công

bố ở Thái Lan có 37 loài Năm 2006 nâng tổng số loài được thừa nhận ở Thái Lan lên 40 loài và 2 thứ Trong “Danh lục thực vật ở Lào” có 24 loài

1.1.2 Ở Việt Nam

Nghiên cứu về họ Hồ tiêu (Piperaceae) ở Việt Nam với công trình đầu

tiên đề cập đến họ này là J Loureio (1793), mô tả 3 chi với 13 loài có ở Nam

Bộ Gagnepain (1908) trong “Thực vật chí đại cương Đông Dương”, đã công

bố 13 chi, 118 loài có mặt ở Đông Dương, trong đó ghi nhận ở Việt Nam có 3 chi và 21 loài; Tiếp theo là những công trình nghiên cứu về họ Hồ tiêu

(Piperaceae) ở Việt Nam như trong công trình “Cây cỏ thường thấy Việt

Nam” của Lê Khả Kế và cộng sự (1975) [1] Phạm Hoàng Hộ (1972) trong

“Cây cỏ Miền Nam Việt Nam” đã công bố 4 chi với 18 loài thuộc họ Hồ tiêu

(Piperaceae) ở Miền Nam Việt Nam Năm 1993, trong “Cây cỏ Việt Nam” Phạm Hoàng Hộ đã xác định ở Việt Nam họ Hồ tiêu (Piperaceae) có 5 chi, 48

loài và thứ; năm 1999 có bổ sung, chỉnh sửa đã đưa tổng số các loài trong họ

Hồ tiêu (Piperaceae) ở Việt Nam là 55 loài và thứ thuộc 5 chi Năm 1999, Lê Trần Chấn và cộng sự đã công bố họ Hồ tiêu (Piperaceae) trong cuốn “Một

số đặc điểm cơ bản của hệ thực vật Việt Nam”, đã thống kê ở Việt Nam có 49 loài và 5 chi Trong cuốn “Tên cây rừng Việt Nam” đã thống kê có 13 loài

Nguyễn Kim Đào (2003), họ Hồ tiêu (Piperaceae) phân bố ở Việt Nam có 5 chi gồm: Peperomia, Zippelis, Circaeocarpus, Piper, Lepianthes, trong đó, chi Piper L có 46 loài.[3]

Ngoài những công trình đã được công bố theo dạng danh lục hoặc sách tra cứu còn được công bố theo hướng các loài có giá trị sử dụng làm thuốc, làm gia vị, làm cảnh,… điển hình là các công trình “1900 loài cây có ích ở Việt Nam” của Trần Đình Lý và cộng sự (1993), đã ghi nhận họ Hồ tiêu

(Piperaceae) có 8 loài thuộc 2 chi có giá trị sử dụng Đỗ Tất Lợi (1999) đã

mô tả 16 loài thuộc 3 chi trong họ Hồ tiêu (Piperaceae) được sử dụng làm

thuốc Lê Trần Đức (1997) đã giới thiệu 2 chi với 10 loài trong họ Hồ tiêu

(Piperaceae) được sử dụng làm thuốc Võ Văn Chi (2012) trong “Từ điển cây

thuốc Việt Nam” đã giới thiệu 18 loài và thứ, thuộc 3 chi trong họ Hồ tiêu

(Piperaceae) được sử dụng làm thuốc ở Việt Nam

Ngoài ra, còn có nhiều công trình công bố về tính đa dạng hệ thực vật ở các khu vực trong cả nước như ở các VQG và Khu BTTN, trong đó có các kết

quả nghiên cứu về các taxon họ Hồ tiêu (Piperaceae) như của tác giả Phùng

Ngọc Lan và cộng sự (1996), khi nghiên cứu đa dạng thực vật ở Cúc Phương

đã công bố họ Hồ tiêu (Piperaceae) có 10 loài thuộc 2 chi Năm 1998, khi

nghiên cứu hệ thực vật ở vùng núi cao Sa Pa - Phan Xi Păng, Nguyễn Nghĩa

Thìn và cộng sự, công bố 2 chi, 7 loài thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) Nguyễn

Nghĩa Thìn, Mai Văn Phô và cộng sự (2003), khi nghiên cứu hệ thực vật

VQG Bạch Mã ghi nhận họ Hồ tiêu (Piperaceae) có 4 loài thuộc 01 chi Năm

2004, Nguyễn Nghĩa Thìn và Nguyễn Thanh Nhàn đã ghi nhận họ Hồ tiêu

(Piperaceae) ở VQG Pù Mát có 14 loài và thứ thuộc 3 chi Năm 2008, Trần

Minh Hợi và cộng sự đã công bố ở VQG Xuân Sơn có 3 chi với 11 loài thuộc

họ Hồ tiêu (Piperaceae) Đỗ Ngọc Đài và cộng sự (2010), công bố 2 chi, 8 loài thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) có ở Khu BTTN Xuân Liên, Thanh Hóa

Năm 2012, Lê Thị Hương và cộng sự, khi nghiên cứu hệ thực vật Pù Hoạt,

Nghệ An đã công bố 2 chi với 6 loài thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) L V

Averyanov và cộng sự (2012) đã công bố ở VQG Phong Nha - Kẻ Bàng có 2

chi, 9 loài thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) Đậu Bá Thìn và cộng sự (2016), công bố 2 chi 12 loài của họ Hồ tiêu (Piperaceae) ở khu BTTN Pù Luông,

Thanh Hóa Năm 2015, Lê Thị Hương và cộng sự, đã công bố 1 chi và 6 loài

thuộc họ Hồ tiêu (Piperaceae) ở VQG Vũ Quang[19]

1.2 Giá trị sử dụng của các loài trong họ Hồ tiêu (Piperaceae)

Rất nhiều loài trong họ Hồ tiêu (Piperaceae) có chứa tinh dầu nên đã

được trồng để dùng làm gia vị, làm chất kích thích và làm thuốc trong y học

dân gian Nhiều bộ phận của các loài thuộc chi Hồ tiêu (Piper L.) đều có thể

được dùng để làm thuốc Tuy nhiên, giữa các quốc gia khác nhau có sự khác nhau về loài hoặc bộ phận được sử dụng của cùng một loài Công dụng phổ

biến nhất của chi này theo kinh nghiệm dân gian là để chữa các bệnh về đường tiêu hóa (bệnh dạ dày, đầy hơi, tiêu chảy, táo bón), giảm đau (bệnh thấp khớp, đau lưng, đau răng) và kháng khuẩn, chống viêm (viêm phế quản, vết thương phần mềm, viêm đường tiêu hóa)

Hồ tiêu (Piper nigrum) là loài có giá trị kinh tế lớn Quả, hạt Hồ tiêu là

loại gia vị được ưa chuộng ở hầu khắp các khu vực trên thế giới dùng là gia vị chế biến thực phẩm nói chung, cũng như trong các bữa ăn hàng ngày

Chỉ với liều lượng nhỏ hạt Hồ tiêu (Piper nigrum) cũng có tác dụng

gây tiết dịch vị, dịch tụy,… kích thích khả năng tiêu hóa ở người Với liều lượng lớn chúng kích thích niêm mạc dạ dày, gây sung huyết và viêm cục bộ

Một số loài khác như Tiêu thất (Piper cubeba), Tiêu dài (Piper longum), Tiêu dội (Piper refrofractum),… cũng được sử dụng làm gia vị của

từng vùng, từng địa phương

Trong y học dân gian ở một số khu vực, loài Tiêu thất (Piper cubeba)

đã được làm thuốc kích thích, hoạt động tiết dịch nhờn ở niêm mạc của cơ quan tiết niệu, cơ quan hô hấp, chữa ho và kích dục,… Tại đảo Java (Inđônêxia), người ta thường sử dụng Tiêu thất và một số loài khác để làm thuốc kích thích tiêu hóa, tráng dương, lợi tiểu, chữa kiết lỵ do amíp, viêm thấp khớp, trị bệnh lậu và sát trùng

Quả và hạt khô loài Tiêu thất (Piper cubeba) hiện vẫn còn là loại gia vị được ưa chuộng ở nhiều nước châu Âu Quả và hạt của Tiêu dài (Piper longum) lại được sử dụng làm gia vị ở nhiều nước Địa Trung Hải; nhiều địa

phương của Lào, Campuchia, Việt Nam, Ấn Độ,… người ta vẫn thường dùng quả, thân, rễ của loài Tiêu dài làm gia vị hoặc làm thuốc trong y học dân tộc

để chữa ho, viêm phế quản, kích thích tiêu hóa, nhuận tràng và làm thuốc xổ Tại Trung Quốc người ta sử dụng rễ Tiêu dài giã nhỏ làm thuốc trợ giúp cho phụ nữ khi sinh đẻ được dễ dàng

Loài tiêu dội (Piper refrofractum) cũng được sử dụng làm gia vị tương

tự như ở nhiều loài khác Trong y học dân gian, đây là loài được sử dụng khá

phổ biến để chữa trị các bệnh về hệ tiêu hóa, đặc biệt là các bệnh về đường

ruột Cư dân tại nhiều nơi ở Đông Nam Á thường dùng Tiêu dội (Piper refrofractum) ngâm rượu dùng để chữa băng huyết và giúp cho nhau thai ra thuận lợi đối với phụ nữ sau khi sinh Dịch chiết từ lá Tiêu dội (Piper refrofractum) được dùng làm nước súc miệng, làm thuốc chữa đau răng tại nhiều địa phương ở Inđonexia; Người Philippines dùng rễ Tiêu dội (Piper refrofractum) sắc lấy nước hoặc nhai dùng chữa bệnh tải; Tại Malaixia, người

ta dùng rễ Tiêu dội (Piper refrofractum) như một loại thuốc độc

Tinh dầu cất từ Tiêu thất (P cubeba) được dùng làm hương vị trong

chế biến thực phẩm và pha chế nước uống không chứa cồn tại nhiều nước Âu

- Mỹ Tiêu thất được xếp vào mục GRAS 2338 và tinh dầu Tiêu thất vào mục GRAS2339 trong danh mục các sản phẩm tự nhiên an toàn trong chế biến dược phẩm và thực phẩm của Hoa Kỳ

Nhân dân ta trước đây thường có tập quán “ăn trầu” khá phổ biến, đặc

biệt là vùng nông thôn Trầu không (Piper betle L.) cũng được dùng làm

thuốc chữa mẫn ngứa, các vết loét, viêm mạch huyết, chàm mặt ở trẻ em, viêm kết mạc, chữa ho hen,…

Mặc dù đã có khá nhiều loài thuộc chi Hồ tiêu (Piper L.) được sử dụng

làm thuốc theo kinh nghiệm dân gian, tuy nhiên, việc sử dụng chi này để chữa bệnh trong thực tế hiện nay không nhiều Hiện nay, có một số sản phẩm thực phẩm chức năng trong thành phần có dịch chiết từ một vài loài thuộc chi Hồ

tiêu (Piper L.) hoặc chứa hoạt chất piperine Trong đó, những sản phẩm có

chứa piperine phối hợp cùng curcumin là phong phú nhất, một số sản phẩm có chứa đồng thời hai hoạt chất này như: Curcumin 2K, Curcumax, Biocurmin

Sự kết hợp giữa hai thành phần hoạt chất này trong nhiều sản phẩm xuất phát

từ kết quả nghiên cứu của Shoba và cộng sự (1997), theo đó piperine có tác dụng làm tăng sinh khả dụng của curcumin lên 20 lần Cơ chế của tác dụng này là do piperine có khả năng ức chế quá trình liên hợp giữa acid glucuronic

và curcumin nên làm giảm quá trình chuyển hóa và đào thải curcumin

Những chế phẩm khác trong thành phần có chứa dịch chiết từ một số

loài thuộc chi Piper L được sử dụng để chữa bệnh như: Eupolin (chứa cao

đặc lá Trầu không và cao đặc Cỏ lào có tác dụng chữa viêm lợi, viêm chân

răng); Sakantin có chứa dịch chiết từ quả của hai loài Piper nigrum L., Piper longum L và gừng giúp kích thích tiêu hóa; sản phẩm Armorex T (chứa hạt

tiêu, tinh dầu tỏi, tinh dầu mè…, có tác dụng kháng khuẩn, chống oxy hóa, giảm co thắt, chữa tiêu chảy) Đặc biệt, một số sản phẩm chứa dịch chiết từ rễ

loài Piper methysticum G Forst (tên gọi khác là kava) có tác dụng an thần,

giảm lo âu Tuy nhiên, gần đây có một số báo cáo về những tác dụng phụ trên gan khi sử dụng những sản phẩm này, vì thế, cần thận trọng khi sử dụng chúng

1.3 Tinh dầu

1.3.1 Khái niệm chung về cây tinh dầu

Trước đây chưa có định nghĩa chính xác về cây tinh dầu Khi phát hiện

ra một số hợp chất của tinh dầu có trong cơ thể mọi sinh vật (axit mật của động vật, caroten trong hầu hết thực vật…) Như vậy, không có ranh giới rõ ràng giữa cây tinh dầu và các cây khác Từ quan điểm này Nicolaev (1968) đưa ra định nghĩa: “Cây tinh dầu là những cây khác biệt với các cây khác ở chỗ có thể thu được tinh dầu từ nó”

Sau này, khi nghiên cứu cấu trúc và hoạt động chức năng các cơ quan tiết, người ta đã thấy rõ sự khác biệt về bản chất của cây tinh dầu Từ đó có thể định nghĩa "Cây tinh dầu là những cây có chứa các cấu trúc chuyên biệt làm nhiệm vụ tiết và tích luỹ tinh dầu"

1.3.2 Khái niệm về tinh dầu

Cho đến nay vẫn chưa có một định nghĩa nào thỏa đáng về tinh dầu Theo dược điển Pháp (1965) thì tinh dầu là các sản phẩm nhìn chung có thành phần khá phức tạp, bao gồm các chất dễ bay hơi có chứa trong thực vật,

và có khả năng thay đổi nhiều hay ít trong quá trình chế biến

Tiêu chuẩn Pháp (1987), đưa ra định nghĩa về tinh dầu như sau: Sản

phẩm thu được từ nguyên liệu có nguồn gốc thực vật, bằng cách cất kéo hơi

nước hoặc bằng các phương pháp cơ học đối với vỏ trái cây thuộc chi Citrus

Tinh dầu được tách ra khỏi nước bằng các phương pháp vật lý” Định nghĩa này có hạn chế là loại trừ các sản phẩm thu được bằng cách chiết xuất với dung môi cũng như các sản phẩm thu được nhờ các phương pháp khác

Tinh dầu được hiểu là những hỗn hợp của hợp chất hữu cơ, có cấu tạo phân tử phức tạp và khác nhau về các đặc tính lý học cũng như hóa học Tinh dầu có một số đặc tính sau:

- Tất cả tinh dầu đều là hợp chất lỏng, sánh, có hoạt tính quang học, gây hiện tượng quay cực của ánh sáng

- Đa số tinh dầu có tỷ trọng nhỏ hơn nước (d < 1), một số có tỷ trọng lớn hơn nước (d > 1), không tan hoặc rất ít tan trong nước, nhưng lại tan trong các dung môi hữu cơ

- Có mùi thơm do thành phần tinh dầu có các cấu tử dạng tự do

- Tinh dầu có khả năng bay hơi

Căn cứ vào cấu tạo phân tử hóa học của tinh dầu được sắp xếp vào 4 nhóm chủ yếu sau:

những hợp chất tạo nên hương vị của thực phẩm Ngoài ra các este alphatic thường được sử dụng trong công nghệ thực phẩm

* Các terpen và dẫn xuất của chúng

Đây là nhóm lớn, thường gặp trong các loài thực vật Các terpen được cấu tạo từ isopren (C5H8)n với n = 2 (monoterpen), n = 3 (sesquiterpen)

- Các hydrocacbon terpen góp phần tạo nên một phần của mùi vị tinh dầu, nhưng các dẫn xuất oxy hóa của chúng lại là những hợp chất thơm rất quan trọng

- Các monotecpen (C10H16) có thể mạch thẳng như geraniol, 1 vòng như limonen, 2 vòng hoặc 3 vòng như cyclofenchen và tricyclen Các monoterpen acyclic thường có các liên kết không bền, do chúng có cấu trúc không bão hòa Các monoterpen acyclic ít tham gia thành phần của mùi hoặc sản phẩm mang hương vị ở thực phẩm song chúng lại được sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học để tạo thành các hương liệu có giá trị trong thực phẩm và mỹ phẩm như: -terpinen, limonen, -terpinen,

- Trong số các terpen bicyclic thì -pinen, -pinen là những hợp chất

có giá trị cao trong công nghệ hương liệu

- Sesquiterpen là những hợp chất được hình thành từ 3 đơn vị isopren

và có công thức cấu tạo chung với 15 nguyên tử cacbon Tuy vậy, hiện vẫn còn nhiều hợp chất sesquiterpen chưa thể xác định được về cấu trúc phân tử Nhiều sesquiterpen là bicyclic có 2 vòng C6 hoặc 1 vòng C6 và 1 vòng C5 Các hợp chất sesquitecpen cùng với monotecpen thường gặp trong thành phần của nhiều loài thực vật Trong tinh dầu, các sesquiterpen luôn là những thành phần quan trọng, song chúng lại có nhiệt độ sôi cao (nhiệt độ sôi thường trên

200oC) do đó thường không thu được hoặc chỉ thu được rất ít

Các hợp chất chứa oxy của các monotecpen và các sesquitecpen thường

có giá trị hơn các hydrocarbon tecpen Sự kết hợp của các thành phần chứa oxy thường tạo thành mùi thơm đặc trưng của nhiều loại tinh dầu Các

alcohol, aldehyd, ether, ceton và este là những nhóm chức quan trọng của các thành phần chứa oxy

Các alcohol monotecpen acyclic và những alcohol sesquitecpen thường góp phần tạo nên mùi đặc trưng và thường có thành phần đáng kể trong nhiều loại tinh dầu

Este của các alcohol tecpen và các axit béo thấp, đặc biệt là các acetate

là những chất thơm quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm và hóa

mỹ phẩm Các este của alcohol tecpen cyclic như α-terpinyl acetate, methyl acetate, bornyl acetate và một số alcohol sesquitecpen như guaiyl acetate, cedryl acetate, là những hợp chất thơm có giá trị sử dụng cao trong công nghệ hương liệu

* Các dẫn xuất benzen

Các dẫn xuất của benzen hoặc các benzoid là những hợp chất có chứa 1 vòng benzen đặc trưng và thường được biểu thị như 1 vòng C6 có 3 nối đôi luân phiên với các nối đơn giữa các nguyên tử cacbon Đây là nhóm hợp chất khá đa dạng và được dùng nhiều trong công nghệ thực phẩm và hóa mỹ phẩm dưới dạng tổng hợp hay tự nhiên Các este của các alcohol thơm và các axít aliphatic có mùi thơm đặc trưng nên được sử dụng trong công nghệ thực phẩm

và mỹ phẩm

* Các thành phần khác

Một vài hợp chất chứa nitrogen có những tính chất khá đặc trưng, tuy chỉ với hàm lượng rất nhỏ, thường nhỏ hơn 0,1%, nhưng lại có tác dụng nâng cao hương vị hấp dẫn của nhiều loại tinh dầu ngay cả ở dạng thô

1.4 Nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu họ Hồ tiêu (Piperaceae)

1.4.1 Trên thế giới

Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu và hoạt tính sinh học Điển hình là các công trình như: Từ

loài Piper cubeba phân bố ở Inđônexia được Rein B và cộng sự (2007)

nghiên cứu với sabinen (9,1%), β-elemen (9,4%), epi-cubebol (4,3%) và

cubebol (5,6%) là các thành phần chính của tinh dầu quả Trans-sabinen hydrat (8,2%), β-caryophyllen (5,0%), epi-cubebol (4,2%), γ-cadinen (16,6%)

và cubebol (4,8%) là các thành phần chính của lá

Loài Piper permucmnatutum phân bố ở Braxin đƣợc H S Toquilho và

cộng sự (1999) công bố với các thành phần chính trong tinh dầu là δ-cadinen (12,7%), γ-muurolen (7,4%), α-cadinol (6,9%), β-caryophyllen (6,8%) Từ 7

mẫu trên mặt đất của loài Piper anonifolium ở Braxin đƣợc E H A Andrade

và cộng sự (2005) công bố với các thành phần chính của tinh dầu của các mẫu 5,6,7 là α-pinen (45,5%, 45,7% và 41,1%), β-pinen (17,7%, 17,2% và 17,8%)

và limonen (7,1%, 8,4% và 6,1%); mẫu 1 với α-pinen (53,1%) và β-pinen (22,9%) là các thành phần chính; mẫu 2 và 4 đƣợc đặc trƣng bởi α-pinen (40,9% và 41,8%), β-pinen (18,8% và 18,6%), limonen (7,4% và 8,5%) và δ-2-caren (7,7% và 8,0%); mẫu 3 với α-eudesmol (33,5%), ishwaran (19,1%),germacren D (9,6%), α-pinen (7,3%) và limonen (5,9%) là các thành phần chính trong tinh dầu Nghiên cứu 4 loài thuộc họ Hồ tiêu ở Braxin, với β-elemen (11,6%) và epi-cubebol (13,1%) là các thành phần chính của loài

Piper cernuum; trong lá loài Piper glabratum đƣợc đặc trƣng bởi caryophyllen (14,6%) và longiborneol (12,0%); ở loài Piper hispidum với β-

β-pinen (12,0%), khusimen (12,1%) và δ-cadinen (13,2%) là các thành phần chính β-caryophyllen (11,2%) và germacren D-4-ol (11,1%) là các thành phần

chính của loài Piper madeiranum Khi công bố 6 mẫu tinh dầu trên mặt đất của loài Piper cyrtopodon ở Braxin, E H A Andrade và cộng sự (2006) cho

thấy, mẫu 1 đƣợc đặc trƣng bởi β-caryophyllen (19,2%), bicyclogermacren (13,0%), germacren D (10,0%), spathulenol (8,4%); mẫu 2 gồm bicyclogermacren (23,3%), germacren D (17,9%), spathulenol (6,9%); mẫu 3

là β-caryophyllen (34,6%), bicyclogermacren (21,4%), germacren D (13,6%)

và α-pinen (7,5%); mẫu 4 với elemicin (26,8%), germacren D (14,8%), bicyclogermacren (14,0%) là các thành phần chính; mẫu 5 với β-caryophyllen (18,1%), bicyclogermacren (14,9%), germacren D (13,6%), elemicin (10,1%)

và mẫu 7 là epi-α-bisabolol (26,3%), α-cadinol (9,5%), bicyclogermacren (8,3%) và germacren D (7,5%)

Trong lá của loài Piper peltata đƣợc J A Pino và cộng sự (2004) công

bố trong tinh dầu đặc trƣng bởi caryophyllen oxit (22,9%), spathulenol (9,0%), trans-calamenen (5,4%) và α-copaen (5,2%) Dillapiol (82,2%) là

thành phần chính của loài Piper aduncum Khi nghiên cứu 3 loài trong chi Piper ở Costa Rica, B Vogler và cộng sự (2006), đã công bố ở hoa của loài Piper auritum với thành phần chính của tinh dầu là safrol (93,0%); ở loài Piper marginatum với trans-anethol (46,0%), p-anisaldehyd (22,0%) và anisyl keton (14,0%) β-caryophyllen (28,0%), germacren D (17,0%) và (E,E)-α-

farnesen (15,0%) là các thành phần chính của tinh dầu Từ tinh dầu lá, thân, rễ

và cụm hoa của loài Piper truncatum ở Braxin đƣợc A P F Trindade (2010)

công bố với camphen (10,3%), germacren D (56,0%) là thành phần chính ở

cụm hoa; các thành phần đặc trƣng trong lá là (Z)-3-hexenol (35,3%),

β-caryophyllen (24,2%), germacren D (11,1%) và (E)-nerolidol (10,5%); ở cành

với 6(Z), 8(E)-N-isobutyl-decadienamit (16,2%) là thành phần chính và ở rễ

là 6(Z), 8(E)-N-isobutyl-decadienamit (67,6%) Từ lá của thứ Piper tuberculatum var tuberculatum với các thành phần chính trong tinh dầu là β- caryophyllen (26,3%) và α-cadinol (13,7%) Trong tinh dầu lá của loài Piper vicosanum với thành phần chính là các monotecpen (56,0-62,6%); trong đó

và α-pinen (5,0%) Một số loài thuộc chi Piper phân bố ở Braxin với dillapiol (64,4%) là thành phần chính của loài Piper aduncum; p-mentha-1(7),8-dien

(39,0%), 3,4-methylenedioxypropio phenon (19,0%), và (E)-β-ocimen (9,8%)

là các thành phần chính của loài Piper marginatum Các thành phần chủ yếu của loài Piper marginatum là (E)-isoosmorhizol (32,0%), (E)-anethol (26,4%), isoosmorhizol (11,2%) và (Z)-anethol (6,0%) Methyl eugenol (69,2%) và eugenol (16,2%) là các hợp chất chính của loài Piper divaricatum

Safrol (69,2%), methyl eugenol (8,6%) và β-pinen (6,2%) đƣợc đặc trƣng của

loài Piper callosum Ở loài Piper cernuum với thành phần chính là β-elemen (11,6%) và epi-cubebol (13,1%) β-caryophyllen (14,6%) và longiborneol (12,0%) là các hợp chất chính của loài Piper glabratum β-pinen (12,0%),

khusimen (12,1%) và γ -cadinen (13,2%) là các hợp chất đặc trƣng của loài

Piper hispidum Đối với loài thì β-caryophyllen (11,2%) và germacren D-4-ol (11,1%) là các hợp chất chính Trong lá của loài Piper pellucidađƣợc M H

L Silva và cộng sự (1999) công bố với các thành phần chính của tinh dầu là

dillapiol (39,7%) và trans-caryophyllen (10,7%)

Ở Phillipines lá của loài Piper betle với chavibetol (53,0%), acetate

(16,0%) và caryophyllen (4,0%) là các thành phần chính Cũng lá của loài này phân bố ở Malaysian với chavibetol (69,0%) là các thành phần chính; đối với loài phân bố ở Campuchia thì đƣợc đặc trƣng bởi -pinen (7,0%), sabinen (8,0%), 1,8–cineol (10,0%), methyl chavicol (9,0%) và terpinyl acetate (19,0%) Safrol (28,0%) và myrcen (26,0%) là các thành phần đặc trƣng trong

lá của loài phân bố ở Đài Loan

Khi nghiên cứu tinh dầu của một số loài thuộc chi Piper, M.A

Sumathykutty và cộng sự (1999) cho thấy, elemol (11,5%) là thành phần

chính trong lá của loài Piper nigrum, β-caryophyllene (13,0%) là thành phần chính trong lá của loài Piper attenuatum; trong thân là β-cubeben (10,0%) Cubebol (23,6%) là thành phần chính của lá loài Piper cubeba

Từ phần trên mặt đất của 3 loài thuộc chi Piper phân bố ở Malaysia

đƣợc Salleh W và cộng sự (2014) công bố với spathulenol (11,2%), nerolidol (8,5%) và β-caryophyllen (7,8%) là các thành phần chính của tinh

(E)-dầu loài Piper abbreviatum Loài Piper erecticaule đƣợc đặc trƣng bởi

β-caryophyllen (5,7%) và spathulenol (5,1%) Borneol (7,5%), β-β-caryophyllen

(6,6%) và α-amorphen (5,6%) là các thành phần chính từ loài Piper lanatum

Ở lá và cụm hoa của loài Piper subtomentosum đƣợc đặc trƣng bởi

α-pinen (27,3% và 21,0%) và δ-cadinen; phần trên mặt đất của loài Piper

septuplinervium đƣợc đặc trƣng bởi camphen và α-, β-pinen Trong lá của loài Piper divaricatum với các thành phần chính của tinh dầu là methy leugenol (75,0%) và eugenol (10,0%) Từ lá và cành loài Piper flaviflorum phân bố ở Trung Quốc với các thành phần đặc trƣng là (E)-nerolidol (16,7%

và 40,5%), β-caryophyllen (26,6% và 14,6%) và elixen (5,3% và 12,3%) Ở lá

của loài Piper nigrum đƣợc Bagheri H và cộng sự (2014) công bố với các

thành phần chính từ tinh dầu là β-caryophyllen (25,4 ± 0,6%), limonen (15,6

± 0,2%), sabinen (13,6 ± 0,2%), 3-caren (9,3 ± 0,1%), β-pinen (7,3 ± 0,1%),

và α-pinen (4,3 ± 0,1%) Loài Piper capense phân bố ở phía Đông Cameroon

với các thành phần chính của tinh dầu là β-pinen (33,2%), sabinen (10,0%) và

α-pinen (8,9%) Từ 3 loài của chi Piper phân bố ở Cu Ba đƣợc xác định là

piperiton (34,0%), camphor (17,1%), camphen (10,9%), 1,8-cineol (8,7%) và

viridiflorol (7,4%) là các thành phần chính của loài Piper aduncum Trong các loài Piper auritum và Piper umbellatum đƣợc đặc trƣng bởi safrol (71,8%và 26,4% Ở lá của loài Piper aduncum phân bố từ Braxin với thành phần chính

trong tinh dầu là các monotecpen (90,4%) và sesquitecpen (7,0%) Thành phần đặc trƣng là 1,8-cineol (53,9% Trong tinh dầu lá, rễ, thân và quả của loài Piper klotzschianum đƣợc đặc trƣng bởi 1-butyl-3,4-methylenedioxybenzen; 2,4,5-trimethoxy-1-propenylbenzen, 1-butyl-3,4-methylenedioxybenzen, 1-butyl-3,4-methylenedioxybenzen, limonen và α-phellandren

Tinh dầu từ lá và cành của loài Piper officinarum đƣợc đặc trƣng bởi

β-caryophyllen (11,2%), α-pinen (9,3%), sabinen (7,6%), β-selinen (5,3%) và

limonen (4,6%) Ở thân là β-caryophyllen (10,9%), α-phellandren (9,3%), linalool (6,9%), limonen (6,7%) và α-pinen (5,0%) Từ tinh dầu lá của loài

Piper cubeba được đặc trưng bởi sabinen (20,0%), eucalyptol (11,9%),

4-terpineol (6,4%), β-pinen (5,8%), camphor (5,6%) và δ-3-caren (5,3% Trong

lá và cành của loài Piper caninum phân bố ở Malaysia được Salleh W M và

cộng sự (2011) công bố với safrol (17,1%) trong lá và 25,5% trong cành Từ

rễ, thân, quả và lá của loài Piper longum được Varughese T và cộng sự

(2016) công bố với các thành phần chính là các monotecpen và các sesquitecpen

Từ loài Piper bavinum phân bố ở Hương Sơn, Hà Tĩnh được D

Lesueur và cộng sự (2009) công bố với các thành phần chính là bicyclogermacren (10,6%), globulol (5,7%), leden (5,1%) và α-pinen (4,4%)

Loài Trầu không (Piper betle) phân bố ở Bạch Mã, Thừa Thiên Huế với thành

phần chính là isoeugenol (72,0%), isoeugenyl acetat (12,2%) Trong rễ được đặc trưng bởi -cadinen (11,7%), -cadinol (26,2%) và T-muurolol (20,7%)

Phần trên mặt đất của loài Piper pierrei ở Phong Điền, Thừa Thiên Huế với

p-methylbenzyl cinnamat (18,1%) và -methylbenzyl cinnamat (28,0%) Từ lá,

thân và rễ loài Piper lolot phân bố ở Việt Nam với các thành phần chính trong

tinh dầu là -caryophyllen (26,1%, 30,9% và 27,6%) tương ứng trong lá, thân

và rễ Đỗ Đình Rãng và cộng sự (2001), công bố từ phần trên mặt đất của loài này ở Hà Nội với -asaron (21,8%), d–nerolidol (8,6%), trans-methyl

isoeugenol (5,5%) Loài Peperomia pellucida ở Thừa Thiên Huế được

Nguyễn Xuân Dũng và cộng sự (2005), công bố với các thành phần chính là

carotol (33,1%) và dill apiol (29,3%) Gần đây, Lưu Đàm Ngọc Anh và cộng

sự (2016), công bố ở lá của loài Piper arboricola với các thành phần chính là

spathulenol (27,5%), α-phellandren (20,3%), germacren D (14,6%), terpinen (6,2%)

γ-1.5 Cây lá lốt

1.5.1 Đặc điểm thực vật

Tên thường gọi : Lá lốt, lá nốt

Tên khoa học : Piper sarmentosum Roxb

+ Đặc điểm hình thái: Cây thân thảo, bò rồi đứng, cao 30-40 cm, có mùi

thơm; thân màu xanh đậm, phồng to ở các mấu, tiết diện tròn, mặt ngoài nhiều rãnh dọc, có lông ngắn và mịn Lá đơn, mọc cách, mép nguyên, hình trứng rộng, cỡ 10-12 x 8-11 cm; có nhiều tuyến trong suốt; chóp nhọn; gốc lệch, hình tim; gân gốc 5; cuống lá dài 2-5 cm Cụm hoa mọc đối diện với lá, màu trắng, dài 10-12 mm, nạc Hoa đơn tính khác gốc Lá bắc tròn, lúc đầu màu trắng sau chuyển hơi nâu Lá noãn 3-4, dính nhau tạo thành bầu trên 1 ô đựng

1 noãn, đính noãn đáy, mặt ngoài nhẵn, dài 1,5 mm, đường kính 1-2 mm; vòi nhụy gần như không có; núm nhụy 3-4, hình trứng rộng, màu trắng

+ Sinh học và sinh thái: Cây thường được trồng hoặc sống ở nơi ẩm ướt và chịu

bóng Mùa hoa tháng 4-6, mùa quả tháng 6-11

Hình 1.1 Piper sarmentosum Roxb. Hình 1.2 Piper sarmentosum Roxb.

+ Phân bố: Cao Bằng, Quảng Ninh (Quảng Yên), Hà Nội, Ninh Binh (Cúc

Phương), Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và được trồng ở nhiều nơi khác; Trung Quốc Cây lá lốt thường xống ở những nơi râm mát, cây ưa bóng râm, ánh sáng trực tiếp từ phía mặt trời có thể khiến lá không phát triển, xoăn lại, khô héo Còn những nơi thoáng mát, nhiều cây cối, lá thường to bản xanh mướt Những loại cây này có thể được trồng hoặc mọc hoang nhiều nhất ở các tỉnh phía bắc là chính.[1]

1.5.2 Thành phần hoá học

Thành phần hoá học của tinh dầu cây lá lốt (Piper sarmentosum Roxb.)

đã được một số tác giả nghiên cứu về cây lá lốt, từ dịch chiết n-hexan của rễ

cây lá lốt (Piper sarmentosum Roxb.) của Việt Nam hợp chất -asaron và 1 hợp chất mới có tên là 3-(4’-metoxyphenyl) propanoyl pyrrol

Từ dịch chiết metanol của cây lá lốt cho thấy hoạt tính ức chế ngưng tụ tiểu cầu, chúng tôi tiến hành phân lập 12 amit alkaloit mới, piperlotin A-L, cùng với 29 hợp chất đã biết từ dịch chiết metanol của cây lá lốt (Piper lolot)

2

Các hợp chất được phân lập được thử hoạt tính ức chế ngưng tụ tiểu cầu ở thỏ, piperlotin A, piperlotin C, piperlotin D, piperlotin E, 3-phenyl-1-(2,4,6-trihydroxyphenyl) propan-1-on, 3-(4-methoxyphenyl)-1-(2,4,6-

trihydroxyphenyl)propan-1-on, 1-transcinnamoyl pyrrolidin, sarmentin, pellitorin, methyl 3-phenylpropionat và (10S)- 10-hydroxypheophorbide

methyl ester cho thấy có khả năng ức chế ngưng tụ tiểu cầu [30]

Ngoài ra trong Đông y, cây lá lốt còn được sắc lấy nước uống để chữa các bệnh đau bụng, lạnh bụng, đau nhức xương khớp Chúng còn được kết hợp với các loại lá khác như xương sông, rễ bưởi, rễ cây cỏ xước, để tăng hiệu quả chữa bệnh… Lá lốt có thể sử dụng tươi sống hoặc phơi khô Một người không nên ăn quá 100g lá lốt tươi mỗi ngày vì có thể xảy ra những tác dụng phụ không mong muốn khác Dược liệu thiên nhiên tốt cho sức khoẻ

Từ xưa đến nay thì cây lá lốt luôn là nguyên liệu cho một số bài thuốc dân gian Hiệu quả mang lại cao, mà an toàn, không nóng và phù hợp với thể trạng của nhiều người Đến nay những bài thuốc ấy vẫn lưu truyền trong dân gian và mọi người vẫn áp dụng trong cuộc sống hằng ngày Một số bài thuốc chữa các bệnh như sau: Những người lớn tuổi, người già bị đau nhức xương khớp do tuổi cao, hay do đã từng bị tai nạn, bị bệnh về xương khớp, do thay đổi thời tiết cũng khiến họ vô cùng khó chịu Để cải thiện tình hình sức khỏe

ổn định hơn bạn có thể sử dụng bài thuốc cây lá lốt sau để chữa bệnh Sắc một

ít lá lốt tươi cùng hai bát nước, đun nhỏ lửa cho đến khi còn nửa bát thì đổ ra

và uống Nên uống sau khi ăn từ 1 – 2 tiếng và kiên trì sử dụng từ 10 –15 ngày tình trạng bệnh sẽ được cải thiện hơn rất nhiều Cây lá lốt có thể sắc nước uống Ngoài ra nếu nước sắc từ cây lá lốt khó uống bạn có thể cho thêm một số dược liệu khác như rễ cây cỏ xước, rễ cây bưởi, vòi voi vào ấm sắc cùng lá lốt Trước khi sắc, bạn sao vàng hạ thổ những dược liệu trên để tạo hương thơm và đem lại kết quả cao hơn.[2]

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp nghiên cứu tinh dầu

2.1.1 Thu mẫu và chưng cất tinh dầu

Mẫu để chưng cất tinh dầu là các bộ phận riêng biệt của cây (lá, thân,

rễ, cụm hoa, quả) Mỗi mẫu thu từ 0,5-3 kg tươi, ghi số hiệu mẫu (số hiệu này trùng với số hiệu mẫu thực vật để định loại) và ngày tháng được thu Sau khi thu hái, mẫu được cắt nhỏ và chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

có hồi lưu trong thiết bị Clevenger trong thời gian 2-4 giờ ở áp suất thường theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV

2.1.2 Phương pháp định lượng tinh dầu

Tinh dầu của các bộ phận khác nhau được định lượng theo phương pháp I của Dược điển Việt Nam IV (2010)

Hàm lượng tinh dầu được tính theo công thức:

Hoặc theo công thức

X(%) = (khi d > 1)

Trong đó: a là thể tích của tinh dầu tính bằng ml

b là khối lượng của mẫu tính bằng gam

Tinh dầu được làm khô bằng Na2SO4 khan, đựng trong các lọ tiêu chuẩn đậy kín, bảo quản ở 0-5oC trước khi đem phân tích

2.1.3 Phương pháp phân tích thành phần hoá học tinh dầu

Chuẩn bị mẫu phân tích cho sắc ký khí: Hoà tan 1,5 mg tinh dầu đã được làm khô bằng Na2SO4 khan trong 1 ml hexan tinh khiết loại dùng cho

phân tích sắc ký

Sắc ký khí (GC) với đầu dò FID: Được thực hiện trên máy Agilent

Technologies HP 6890N Plus với detectơ FID, cột mao quản HP-5MS chiều dài 30 m, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp phim mỏng 0,25m với khí mang là hydro Nhiệt độ buồng bơm mẫu là 250oC Nhiệt độ Detectơ là

260oC Chương trình nhiệt độ 60oC (2 min), tăng 4oC/phút cho đến 220o

C, dừng ở nhiệt độ này trong 10 phút

Sắc ký khí-khối phổ (GC/MS): Được thực hiện trên hệ thống thiết bị

sắc ký khí khối phổ liên hợp Agilent Technologies HP 6890N/ HP 5973 MSD với cột tách và các điều kiện vận hành sắc ký như nêu ở trên và với Heli làm khí mang

Việc xác định định tính các thành phần của tinh dầu được thực hiện bằng các phương pháp sau:

- Dựa trên giá trị của chỉ số lưu giữ (Retention Index), xác định với một dãy các đồng đẳng n-alkan trong cùng một điều kiện sắc ký

- Dựa trên sắc ký nội chuẩn (co-injection) với các chất chuẩn thương mại (của hãng Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) hoặc với các thành phần tinh dầu

Tinh dầu được phân tích tại Phòng Thí nghiệm Trung tâm, Trường Đại học Vinh

2.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

Cơ sở lý thuyết của phương pháp chiết : Trong cây các hợp chất hữu cơ tồn

tại ở dạng:

- Hoà tan trong nước (dịch tế bào) là các cacbonhydrat phân tử bé

(monosacarit, oligosacarit), một số polysacarit (pectin, gôm), glycosit

(saponin, flavonoit, iridoit), alkaloit

- Hoà tan trong dầu béo và tinh dầu là các hydrocacbon, monoterpenoit, sesquiterpenoit, sterol, carotenoit và các dẫn xuất phenyl propanoit

* Glycosit là những chất phân cực mạnh do phần đường có nhiều nhóm

OH, mach đường càng dài thì độ phân cực cang cao Nếu bị thuỷ phân thị phần dường bị cắt tính phân cực giảm

* Các enzym luôn có mặt ở trong cây và tác động đến quá trình chiết tách

+ Dung môi : Bao gồm dung môi phân cực và không phân cực

- Dung môi không phân cực: ete dầu hoả, benzen, toluen, hexan, heptan

- Dung môi phân cực vừa: etyl axetat, clorofoc, axeton, dietyl clorua

- Dung môi phân cực: nước, metanol, etanol, butanol

- Các chất điện ly như các muối vô cơ đều tan trong dung môi phân cực

- Các chất phân cực: Các hợp chất hữu cơ nói chung không ion hoá nhưng nếu chúng có chứa các nhóm hoặc nguyên tử mang điện âm có thể hình thành liên kết hydro với nuớc thì sẽ dễ tan trong nước

+ Những nhóm có khả năng tạo liên kết hydro như OH, CO, NO, NH2

và các halogen gọi là nhóm phân cực

+ Càng có nhiều nhóm phân cực thì phân tử càng dễ hoà tan Mạch hydrocacbon của phân tử càng dài thì độ hoà tan càng giảm

Chất tan ete và dung môi không phân cực

- Các hợp chất hữu có không chứa nhóm phân cực gọi là các chất

không phân cực

- Nói chúng chất không phân cực đều tan tan trong dung môi không phân cực và ngược lại không tan trong nước và dung môi phân cực khác

- Hầu hết các chất hữu cơ tan trong nước đều không tan trong ete

Khi chiết các hợp chất hữu cơ phải lựa chọn dung môi

- Chọn dung môi (phân cực hay không phân cực)

- Dụng cụ chiết (chiết hồi lưu, soxhlet), chiết siêu âm, vi sóng, lỏng siêu tới hạn

- Phương pháp chiết (chiết nhiệt độ thường, chiết nóng)

Dựa vào tính chất phân cực của dung môi và các nhóm hợp chất, có thể

dự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết:

- Ete dầu hoả hoặc n- hexan: hydrocabon béo hoặc thơm, các thành phần của tinh dầu như monoterpenoit, chất béo, caroten, sterol, clorophyl

- Clorofoc hoặc etyl axetat: sesquiterpenoit, diterpenoit, coumarin, quinon, alkaloit, các aglycon do glycosit thuỷ phân

- Metanol hoặc etanol: glycosit, alkaloit, flavonoit, các hợp chất phenol khác, nhựa, axit hữu cơ, tanin

- Nước: glycosit, tanin, cacbonhydrat, pectin, gôm, protein và muối vô

cơ

Khi chiết lấy cao tổng thì dùng dung môi metanol hoặc etanol

- Khi cần tách lấy phân đoạn cac hợp chất thì dùng dung môi không hoà lẫn với nước và có độ phân cực từ yếu đến mạnh:

Ví dụ: n-hexan etyl axetat n-butanol

Hoà tan cao vào một lượng nước, cho vào bình chiết, chiết lần lượt với n- hexan, etyl axetat và cuối cùng là n-butanol Dịch chiết mỗi phân đoạn cất thu hồi dung môi và phân tích riêng

Phương pháp chiết: - Chiết ở nhiệt độ thường (chiết từ 3 đến 5 lần để thu hết chất từ nguyên liệu [6]

- Chiết nóng:

+ Chiết hồi lưu (chiết 2 lần) + Chiết Soxhlet (chiết liên tục) + Chiết siêu âm

+ Chiết vi sóng + Chiết siêu tới hạn

2.2.1 Phương pháp thu hồi dung môi

- Áp suất thường

- Áp suất giảm

- Cất quay chân không [6]

2.2.2 Tách các chất từ các cao thu được

Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp sắc ký như:

- Sắc ký cột (CC)

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích

- Các phương pháp kết tinh phân đoạn

Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký [8]

Sắc ký là một phương pháp vật lý dùng để tách riêng các thành phần ra khỏi một hỗn hợp bằng cách phân bố chúng ra 2 pha:

+ Một pha bề rộng gọi là pha cố định

+ Pha kia là một chất lỏng hoặc khí, di chuyển qua pha cố định

Phân loại: + Sắc ký lỏng: là phương pháp dùng chất lỏng làm pha động:

+ Sắc ký giấy: pha tĩnh là giấy

+ Sắc ký lớp mỏng (TLC-Thin Layer Chromatography): pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ được trải bằng phẳng và đều đặn trên một tấm kính hoặc kim loại

+ Sắc ký cột (CC-Column Chromatography): pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành cột

+ Sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid

Chromatography)

+ Sắc ký khí: (GC- Gas Chromatography) là phương pháp dùng chất khí làm pha động

+ Sắc ký lớp mỏng :

+ Chất hấp phụ: silicagel

+ Dung môi

2.2.3 Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ: Muốn xác định được cấu trúc của các chất phân lập được cần dựa vào dữ liệu vật lý cung cấp từ các phương pháp phổ hiện đại, phải biết kết hợp phân tích dữ liệu mới cho ta một kết quả chính xác

Các phương pháp vật lý hiện đại thường dùng để xác định cấu trúc các hợp chất gồm: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (EI-

MS, ESI-MS, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H- NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, HMQC, COSY,

NOESY)

+ Phổ UV-vis : để xác định sự có mặt hay vắng mặt các nhóm riêng biệt

trong vùng trên 200 nm ( xác định nhóm chức, phân biệt, giải thích hệ liên hợp và hệ không liên hợp)

+ Phổ IR: Tần số của vân hấp thụ cho phép kết luận sự có mặt của nhóm

chức trong phân tử

+ Phổ H 1 NMR : Số lượng các hấp thu khác nhau cho biết có bao nhiêu loại proton trong phân tử

• Độ chuyển dịch hóa học của proton trong khoảng 0-14 ppm

• Độ chuyển dịch của proton cho biết proton gắn vào nguyên tử nào ( C, O,

H )

• Sự tách mũi tín hiệu cho biết có bao nhiêu proton hiện diện kề bên proton khảo sát

• Hằng số ghép được tính bằng khoảng cách giữa các pic doublet, triplet và

quartet rồi nhân với tần số máy Công thức sau: J (Hz) = (δ1- δ2) máy

+ Phổ C 13 - NMR : Cung cấp thông tin trực tiếp bộ khung cacbon của phân

tử, số nguyên tử cacbon, nhóm chức trong phân tử

• Độ chuyển dịch của cacbon trong khoảng 1- 220ppm

• Chiều cao của pic tỷ lệ thuận với số nguyên tử cacbon tương đương

+ Phổ DEPT :

- Xác định bậc của nguyên tử cacbon có nghĩa là gán các nguyên tử cacbon bậc 1, bậc 2, bậc 3, bậc 4 tương ứng cho các nhóm CH3, CH2, CH hoặc C

- Phổ DEPT-90 cho các pic hướng lên của CH, phổ DEPT-135 cho thấy các pic hướng lên của CH và CH3, đồng thời các pic hướng xuống của CH2

+ Phổ HSQC, COSY, HMBC : Phổ HSQC: Các tương tác trực tiếp 1

H-NMR giúp xác định các nguyên tử H ghép cặp này của một cacbon hay các H ghép cặp này của hai cacbon ở gần nhau

Cấu trúc của hợp chất được xác định chính xác khi ta kết hợp phân tích

dữ liệu từ các phổ khác nhau

+ Phổ MS : Trong lĩnh vực rộng của khối phổ, khối phổ phân giải cao thu hút

sự chú ý vì sự kết hợp của tính chính xác khối lượng cao với độ phân giải siêu cao và khối lượng rất cao Kỹ thuật đa năng này không chỉ áp dụng trong hóa học hữu cơ, vô cơ, cơ học, môi trường, mà còn trong nghiên cứu về công

nghệ sinh học

Xác định trực tiếp công thức phân tử và những vấn đề liên quan tới khung cấu trúc của các hợp chất hữu cơ tổng hợp, hợp chất thiên nhiên, các hợp chất nguồn sinh vật không quá phức tạp dạng đơn chất [5] [4]

2.3 Phương pháp xử lí số liệu

Số liệu được xử lí trên phần mềm Microsoft Office Excel 2010

2.4 Hóa chất và thiết bị

2.4.1 Hoá chất

Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA) Dung môi được sử dụng là: metanol (CH3OH), butanol (C4H9OH), etylaxetat (CH3COOC2H5), hexan, nước cất

Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3

Phổ tử ngoại UV được ghi trên máy Hitachi UV - 3210

Phổ khối lượng phun mù electron ESI-MS được ghi trên máy Trap - 00127 và phổ khối lượng EI-MS được ghi trên máy HP 5989 B-MS với năng lượng bắn phá ở 70 eV

C thu được (5,7kg) sau đó đem cắt nhỏ và ngâm với metanol ở nhiệt độ phòng (20 ngày) Cất thu hồi dung môi được cao metanol (815 g) và được phân bố trong nước

rồi chiết lần lượt với n-hexan, etyl axetat và butanol và cất thu hồi dung môi thu được các cao tương ứng có khối lượng là 123g, 536g, 288g

Sơ đồ 2.1: Chiết các phân đoạn của cây lá lốt

Cao etyl axetat được phân tách trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải Clorofom/etylaxtat 97/3 tăng dần nồng độ % etylaxetat, thu được 16 phân đoạn chính Phân đoạn 1 được rửa giải bằng cột sắc ký nhỏ với dung

môi n hexan/clorofomthu tỷ lệ 30:1 thu được chất HV1 Phân đoạn 5 phân

tách lại bằng sắc ký cột với hệ dung môi cloroform:etylaxetat 15:1 thu được

chất HV2 và phân đoạn 16 tiếp tục sắc ký bằng cột nhỏ với hệ dung môi rửa giải là Clorofom/metanol 30:1 thu được hợp chất HV3 Ba chất HV1, HV2

và HV3, với các khối lượng tương ứng là: Chất HV1 104mg chiếm 0,0012%

so với trọng lượng tươi , chất HV2 123 mg chiếm 0,0015 % so với trọng

lượng tươi và hợp chất HV3 118mg chiếm 0,0014 % so với trọng lượng tươi

Phần trên mặt đất cây lá lốt (5,7 kg)

Cao metanol (815 g)

Cao hexan

(123 g)

Cao butanol (288g)

Cao etyl axetat (536g)

Cất thu hồi dung môi

- Phân bố trong nước

- Chiết lần lượt với hexan, etylaxetat, butanol

Sơ đồ 2.2: Tách các hợp chất từ cao etylaxetat của cây lá lốt

2.5.2 Các dữ kiện vật lý của các chất tách được

+ Hợp chất HV1 (104 mg): Tinh thÓ h×nh kim mµu tr¾ng, ®.n.c 281-283OC

Phæ UV(CH3OH) max nm (log ): 240, 258, 319, 366 nm

Cao etylaxetat (536g)

Chất HV2 123mg (223 mg)