Nghiên cứu thành phần hóa học của tinh dầu và cấu trúc một số hợp chất tách được từ lá cây hoàng lan hoa trắng (canga odorata) ở thanh hóa

Chi Hoàng lan Cananga odorata là một trong những chi quan trọng của họ Na Annonaceae, với khoảng 80 loài, phân bố rộng rãi ở châu Á và Australia, đặc biệt ở Đông Nam Á như Malaysia, Ind

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HOÁ

LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC

THANH HOÁ, NĂM 2021

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này không trùng lặp với các khóa luận, luận văn, luận án và các công trình nghiên cứu đã công bố

Người cam đoan

Lê Thị Như Quỳnh

ii

LỜI CẢM ƠN

Tác giả xin cảm ơn giảng viên hướng dẫn TS Phạm Minh Quân - TS Nguyễn Thị Ngọc Vinh Các Thầy, Cô đã trực tiếp giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo đã giảng dạy và hướng dẫn cho tôi trong suốt khoá học

Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn luôn bên cạnh, ủng hộ tôi trong thời gian qua

Do hạn chế về kiến thức, kinh nghiệm và thời gian nên luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót Vì vậy, tôi rất mong nhận được sự cố vấn của quý thầy cô để luận văn được hoàn chỉnh hơn

Tác giả

Lê Thị Như Quỳnh

iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 2

4 Nhiệm vụ, nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về họ Na (Annonaceae) 3

1.1.1 Đặc điểm thực vật 3

1.1.2 Thành phần hoá học [25] 3

1.1.3 Sử dụng và hoạt tính sinh học 18

1.2 Tổng quan về cây hoàng lan hoa trắng (Canaga Odorata) 19

1.2.1 Đặc điểm thực vật cây hoàng lan hoa trắng (Canaga Odorata) 19

1.2.2 Thành phần hóa học 20

1.2.3 Sử dụng và hoạt tính sinh học 21

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 22

2.1.Đối tượng nghiên cứu và phương pháp lấy mẫu 22

2.2.Các phương pháp hóa học 22

2.2.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học của tinh dầu 22

2.2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất [9] 23

2.2.3 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất [8] 24

2.3 Hóa chất và thiết bị 26

2.3.1 Hoá chất 26

2.3.2 Thiết bị 26

iv

2.4 Nghiên cứu các hợp chất từ cây Hoàng Lan hoa trắng 26

2.4.1 Nguyên liệu thực vật 26

2.4.2 Tách tinh dầu: 27

2.4.3 Phân tích tinh dầu 27

2.4.4 Phân lập các hợp chất 27

2.4.5 Các thông số vật lý của các chất phân lập được 30

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Nghiên cứu tinh dầu 32

3.1.1 Định lượng tinh dầu 32

3.1.2 Phân tích thành phần hoá học tinh dầu của lá cây Hoàng Lan 32

Hợp chất 33

3.2 Phân lập các hợp chất 33

3.2.1 Biện giải để xác định cấu trúc của hợp chất 1 33

3.2.2 Biện giải để xác định cấu trúc của hợp chất 2 38

3.2.3 Biện giải để xác định cấu trúc của hợp chất 3 47

3.2.4 Biện giải để xác định cấu trúc của hợp chất 4 63

KẾT LUẬN 71

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74

v

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Các hợp chất diterpenoit kauran 5Bảng 1.2: Các hợp chất acetogenin 10Bảng 3.1 Thành phần hóa học tinh dầu lá Hoàng Lan 33Bảng 3.2 Số liệu phổ 13

C-NMR của hợp chất 1 34Bảng 3.3: Số liệu phổ 13

C-NMR của hợp chất 2 39Bảng 3.4: Số liệu phổ NMR của hợp chất 3 49Bảng 3.5: Số liệu phổ 13

C-NMR của hợp chất 4 64

vi

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Ảnh cây Hoàng lan 19

Sơ đồ 2.1: Chiết các hợp chất trong lá cây Hoàng Lan 27

Hình 2.1 Sắc ký bản mỏng từ dịch chiết n hexan 28

Hình 2.2 Sắc ký cột cao n hexan từ lá và cành nhỏ cây Hoàng lan 29

Hình 3.1: Phổ khối lƣợng va chạm electron (EI-MS) của hợp chất 1 35

Hình 3.2: Phổ 1 H-NMR của hợp chất 1 35

Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 (phổ dãn) 36

Hình 3.4: Phổ 1 H-NMR của hợp chất 1 (phổ dãn) 37

Hình 3.5: Phổ 13 C-NMR của hợp chất 1 37

Hình 3.6: Phổ DEPT của hợp chất 1 (phổ dãn) ……… 38

Hình 3.7: Phổ 1 H-NMR của hợp chất 2 40

Hình 3.8: Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 (phổ dãn) 41

Hình 3.9: Phổ DEPT của hợp chất 4 41

Hình 3.10: Phổ HMBC của hợp chất 2 (phổ dãn) 42

Hình 3.11: Phổ HMBC của hợp chất 2 (phổ dãn) ……… 43

Hình 3.12: Phổ HMBC của hợp chất 2 (phổ dãn) ……… 44

Hình 3.13: Phổ HSQC của hợp chất 2 45

Hình 3.14: Phổ HSQC của hợp chất 2 (phổ dãn) ……… 46

Hình 3.15: Phổ khối lƣợng phun mù electron chất 3 47

Hình 3.16: Phổ 1 H-NMR của hợp chất 3 48

Hình 3.17: Phổ 13 C-NMR của hợp chất 3 48

Hình 3.18: Phổ 1 H-NMR của hợp chất 3 51

Hình 3.19: Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 ………52

Hình 3.20: Phổ 13 C-NMR của hợp chất 3 52

Hình 3.21: Phổ 13 C-NMR của hợp chất 3 53

Hình 3.22: Phổ DEPT của hợp chất 3 53

Hình 3.23: Phổ DEPT của hợp chất 3 54

Hình 3.24: Phổ DEPT của hợp chất 3 54

vii

Hình 3.25 Phổ HMBC của hợp chất 3 ……… 55

Hình 3.26: Phổ HMBC của hợp chất 3 56

Hình 3.27: Phổ HMBC của hợp chất 3 57

Hình 3.28: Phổ HMBC của hợp chất 3 58

Hình 3.29: Phổ HMBC của hợp chất 3 59

Hình 3.30: Phổ HSQC của hợp chất 3 ……… 60

Hình 3.31: Phổ HSQC của hợp chất 3 61

Hình 3.32: Phổ HSQC của hợp chất 3 62

Hình 3.33: Phổ khối lƣợng (EI-MS) của hợp chất 4 63

Hình 3.34 Phổ 1 H-NMRcủa hợp chất 4 63

Hình 3.35 Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 ………66

Hình 3.36 Phổ DEPT của chất 4 67

Hình 3.37 Phổ DEPT của chất 4 67

Hình 3.38 Phổ HMBC của chất 4 68

Hình 3.39 Phổ HMBC của chất 4 69

Hình 3.40 Phổ HMBC của chất 4 70

Hệ thực vật ở nước ta theo các thống kê có trên 10.000 loài [3, 7với 3.200 loài cây được áp dụng rất nhiều trong y học cổ truyền dân tộc và 600 loài cây lấy tinh dầu [5] Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên rất quý báu của đất nước có

tác dụng lớn đối với đời sống và sức khỏe của con người

Họ Na (Annonaceae) là một họ lớn của bộ Mộc lan (Magnoliales) với chi điển hình là Annon Một số loài này được trồng làm cây cảnh, phổ biến nhất là Polythia longifoliapendula (lá bó sát thân) Người ta còn dùng các loài

cây thân gỗ dể làm chất đốt Một số loài có qủa lớn, nhiều thịt ăn được bao

gồm các loài của chi Annona (na, na Nam Mỹ, mãng cầu xiêm) hay chi

Asimina (đu đủ Mỹ) hoặc chi Rollinia [2, 13]

Chi Hoàng lan (Cananga odorata) là một trong những chi quan trọng

của họ Na (Annonaceae), với khoảng 80 loài, phân bố rộng rãi ở châu Á và Australia, đặc biệt ở Đông Nam Á như Malaysia, Indonesia, Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam, các loài trong chi này còn chứa tinh dầu thơm

và được ứng dụng trong điều chế nước hoa hoặc đồ gia vị Vỏ cây, lá và rễ của một số loài được sử dụng trong y học dân gian điều trị nhiễm trùng, bệnh

ho, bệnh gan, bệnh vàng da do gan, bệnh tiêu chảy… Các nghiên cứu dược

lý đã tìm thấy khả năng chống nấm, chống khuẩn và đặc biệt là khả năng sử dụng trong hóa học trị liệu của một số thành phần hóa học của lá và vỏ cây

[4] Chính vì vậy chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học

của tinh dầu và cấu trúc một số hợp chất tách được từ lá cây hoàng lan

hoa trắng (Canaga Odorata) ở Thanh Hóa” từ đề tài này, chúng ta có thể

xác định một số hợp chất tìm ra nguồn nguyên liệu cho ngành hóa dược

2

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tách và xác định cấu trúc và nghiên cứu tinh dầu của cây hoàng lan hoa

trắng ở Thanh Hóa

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận văn là cây hoàng lan hoa trắng ở

Thanh Hóa

4 Nhiệm vụ, nội dung nghiên cứu

Chúng tôi đặt ra các nhiệm vụ trong luận văn này như sau:

- Cất lôi cuốn hơi nước thu tinh dầu

- Sử dụng PP GC-MS xác định thành phần Hóa học của tinh dầu

- Chiết chọn lọc với các (hệ) dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ lá cây hoàng lan hoa trắng

- Sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân đoạn để phân lập các hợp chất

- Sử dụng các phương pháp phổ để xác định cấu trúc các hợp chất thu được

3

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về họ Na (Annonaceae)

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Họ Na (Annonaceae) là một họ lớn, trước đây chúng đã từng được nghiên cứu về những hoạt tính sinh học quan trọng và kết quả nghiên cứu được công bố trên các tạp chí về hóa thực vật Việc nghiên cứu các dược phẩm bắt nguồn từ họ này rất được chú ý vì chúng có thể phục vụ cho nhu cầu

sử dụng thuốc của con người

Họ Na (Annonaceae) còn được gọi là họ Mãng cầu Đây là họ lớn nhất

của bộ Mộc lan (Magnoliales), có khoảng 130 chi và hơn 2.300 loài Những

cây họ Na là loại thực vật có hoa, bao gồm các cây thân gỗ, thân bụi và một

số là dạng dây leo [6] được tìm thấy nhiều nhất ở vùng nhiệt đới [13] Các loài thuộc họ Na (Annonaceae) có lá đơn, mọc so le (mọc cách), có cuống lá

và mép lá nhẵn Lá mọc thành hai hàng dọc theo thân cây Vết sẹo nơi đính lá thường nhìn thấy rõ các mạch dẫn Cành thường ở dạng ziczăc Chúng không

có các lá bẹ Hoa đối xứng xuyên tâm (hoa đều) và thường là lưỡng tính ở phần lớn các loài thì 3 đài hoa nối với nhau ở gốc hoa Hoa có 6 cánh có màu nâu hay vàng, nhiều nhị hoa mọc thành hình xoắn ốc Hoa có nhiều nhụy hoa, mỗi nhụy có bầu nhụy dạng một ngăn chứa một hay nhiều tiểu noãn Có đôi khi hoa mọc trực tiếp trên các cành lớn hoặc thân cây Qủa là nang, bế qủa hay đa qủa [2, 13]

Ở Việt Nam, theo Nguyễn Tiến Bân [1, 2] đã xác định họ Na có 26 chi,

201 loài

1.1.2 Thành phần hoá học [25]

Trong 2 thập kỉ trước đây, 18 loài của họ Na (Chi Annona (8 loài):

Annona cherimola, A glabra, A montana, A muricata, A reticulata, A

4

squamosa, A artemoya (A cherimola x squamosa), A purpurea; chi Artabotrys (2 loài): Artabotrys hexaptalus, A uncinatus; chi Cananga (1

loài): Cananga odorata; chi Fissistigma (2 loài): Fissistigma glaucescens, F

oldhamii; chi Goniothalamus (1 loài): Goniothalamus amuyon; chi Polyalthia

(2 loài): Polyalthia longifolia, P longifolia “Pendula”; chi Rollinia (1 loài):

Rollinia mucosa và chi Uvaria (1 loài): Uvariarufa) đã được nghiên cứu rất kĩ

lưỡng Các nhà khoa học đã xác định cấu tạo hoá học và thử tác dụng sinh học của chúng (về tim mạch, độc tính và các hoạt tính dược lý khác) Một số hợp chất được ứng dụng để sản xuất thuốc chữa bệnh [22]

Mặc dù cây họ Na (Annonaceae) đã được khảo sát lần đầu tiên bởi Stehous năm 1855, nhưng trong 2 thập kỉ trước đây vẫn ít được quan tâm đến; đến năm 1970, họ Na (Annonaceae) bắt đầu nhận được nhiều sự chú ý Trong đó, phần lớn các đề tài nghiên cứu về alkaloit nhưng cây họ Na (Annonaceae) cũng chứa một lượng lớn non - alkaloidal (không phải alkaloit)

có nhiều hoạt tính kháng tế bào ung thư và chữa bệnh tim mạch rất quan trọng Các chất không phải alkaloit của họ Na (Annonaceae) bao gồm kauran, lignan, acetogenin, steroit và các hợp chất thơm

Các hợp chất diterpenoit kauran

Bộ khung cơ bản của các hợp chất diterpenoit kauran gồm 20 cacbon Một số hợp chất được tách ra gồm 19 cacbon và được gọi tên nor-kauran diterpenoit Trong nghiên cứu của Wu và cộng sự [25] đã tách được 36 hợp

chất kauran từ 4 loài khác nhau bao gồm: A cherimola, A glabra, A

squamosa và R mucosa và 7 chất trong số chúng là chất mới phát hiện Cấu

trúc và sự tìm thấy của các hợp chất được nêu ra ở bảng 1.1 [25]

8 9 10

11

12 13 14

Có 9 chất lignan (37-45) của họ Na (Annonaceae) đƣợc Yang và cộng

sự; Wu và cộng sự công bố [25] Các lignan đƣợc tìm thấy ở loài A montana,

A cherimola và R mucosa gồm: (+)-Syringaresinol (37),

(+)-epi-syringaresinol (38), (+)-dia(+)-epi-syringaresinol (39) và liriodendrin (40) thu đƣợc

từ loài A cherimola, (-)-syringaresinol (41) đƣợc tách từ loài A montana và

yangambin (42), magnolin (43), eudesmin (44), membrin (45) đƣợc tách từ

R mucosa Trong số chúng, 38, 39, 40 và 42 là các chất đồng phân lập thể và

6 O

O

H H

OR OMe

OMe

H H

OH OMe

CH3O O H

OMe

OH OMe

OMe O

O

H H

Tồn tại dãy các hợp chất acetogenin (46-102) đã đƣợc phân lập từ 2 chi

của họ Na (Annonaceae) là Annona và Rollinia, trong đó có 24 chất mới.Chủ

yếu các acetogenin bao gồm một hoặc hai vòng tetrahydrofuran, một α,

β-unsaturated-γ-lacton hoặc epoxit trong mạch chính với các nhóm chức nhƣ –

OH, =O, C=C và diol kề nhau trong mạch dài [11]

O (CH2)9

OH

O OH Me

(CH2)4

OH (CH2)5

9

O OH

O OH Me

2 )10

O O

R 1

Me

erythro trans threotrans threo

47 R1=H

O OH

O OH Me

2 )10

O O

Me trans trans

50

48

O OH

O OH Me

2 )8

O O

Me

51

erythro transthreo trans threo

49

O (CH2)9

cis

cis hoÆc trans*

50, *=cis

51, *=trans

10

O OH

O OH

Me Me

R mucosa 74 artemoin D* A artemoya

53

rolliniastatin-2

(bullatacin)

A reticulata 79 annonacin A montana

A artemoya 80 annonacin-10-on A montana

R mucosa 81 annoreticuin* A reticulata

annoreticuin-9-on* A reticulata

55

A reticulata 84 corossolon A muricata

A squamosa 85 isoannonacin A montana

11

12,15-cis-squamostatin-D*

A artemoya 91 muricatetrocin B A muricata

R mucosa 96 muricin E* A muricata

A artemoya 100 rolliacocin* R mucosa

* Chất mới

Các hợp chất styrylpyron

Nhiều hợp chất styrylpyron chỉ tìm thấy trong chi Goniothalamus của

họ Na (Annonaceae) Chúng đƣợc tách ra từ loài G amuyon gồm có:

goniodiol-7-monoacetat (103), goniodiol-8-monoacetat (104), goniotriol (105), goniothalamin (106) Trong số này có chất 103 ,104 là các chất mới

OAc

O H

104

AcO

OH O H

O

105

103 104

12

OH O H

O O

H

O H

106

O H

những hợp chất đƣợc phân lập từ lá của A purpurea

O

O

O H

benzoit (111-130) đƣợc phân lập từ thân cây

loài A cherimola Trong số đó, 130 là loại

hợp chất quinon và các chất khác là dẫn

xuất của benzenoit chứa 1 vòng benzen với

các nhóm chức khác nhau hoặc các mạch

nhánh gồm: p-hydroxybenzaldehyt (111),

axit p-hydroxybenzoic (112), methylparaben

(113), axit 3-chlorobenzoic (114), vanillin

dimethoxyphenyl)- 1,2-propanediol (127),

3,4,5-trimethoxyphenyl-β-D-glucopyranosit (128), thalictosit (129), 2,6-dimethoxy-p-quinon (130)

R 1

R 2

R 3

R 4C

127

CH3O O H

CH3O

CH2OH OH

14

O O

H O H

Loại hợp chất steroit thường được phân lập từ họ Na (Annonaceae) và

các họ khác như: β-sitosterol (131), stigmasterol (132), β-sitosterol-D-glucosit (133), stigmasterol-D-glucosit (134), β-sitostenon (135), stigmasta-4,22-dien- 3-on (136), 6β-hydroxy-β- sitosteron (137), 6β-hydroxystigmasteron (138)

được tách ra từ thân cây A cherimola Trong đó, 131, 132 là các chất thường

được phân lập nhiều nhất và được phân bố trong hầu hết các loài của họ Na

(Annonaceae)

RO

19 1 2

6 7 8 9 10

11 12 13 14 15 16 17

18

20 22 23

21

*

131, R=H; *= liên kết đơn

132, R=H; *= liên kết đôi (trans)

133, R=Glu; *= liên kết đơn

134, R=H; *= liên kết đôi (trans)

12 13 14 15

O O

9

19

H

17 20 11

140

O O

H

O H

16

OR H

Phần lớn các hợp chất alkaloit có dạng một alkaloit isoquinolin

+ Isoquinolin đơn giản

Các tác giả đã tìm thấy một vài isoquinolin ở cây họ Na (Annonaceae)

Trong đó chỉ có 3 isoquinolin đơn giản: doryphornin (143), cherianoin (144),

thalifolin (145) được tách từ thân cây loài A cherimola

N O

O

5 6

7 8

4 3 1

147

N O

O H

Na (Annonaceae) Chúng bao gồm: reticulin (146) là một chất thường thấy

của benzyltetrahydroisoquinolin, coclaurin (147) và N-methylcoclaurin (148) được tách từ A squamosa; (+)-Orientalin A (149), annocherin A (150) và annocherin B (151) được tách từ thân cây A cherimola Trong đó 150, 151 là

chất mới

144, R=H

145, R=OCH3

17

NO

4 5

6

7 8

CH3O

NO

H

OH

ORH

Các hợp chất khác

Từ thân cây của F oldhamii các nhà khoa học đã tách đƣợc một furanon

là fissohamion (152) và hai cyclopentanon là stigmahamon I (153) và stigmahamon II (154) chúng đều là chất mới

O O

3 4 5

18

1.1.3 Sử dụng và hoạt tính sinh học

Các loài cây của họ Na (Annonaceae) thường được dùng để làm cây

cảnh, nhất là Polythia longifolia pendula (lá bó sát thân) Các loài cây thân gỗ

còn được dùng làm chất đốt Một số loài có qủa lớn, nhiều thịt ăn được bao

gồm các loài của chi Annona ( na, na Nam Mỹ, mãng cầu xiêm) hay chi

Asimina (đu đủ Mỹ) hoặc chi Rollinia Ngoài ra, một số loài còn chứa tinh

dầu thơm và được ứng dụng phổ biến trong sản xuất nước hoa hay đồ gia vị

như Hoàng lan (Cananga odorata)

Trong kết quả nghiên cứu của Wu Y C và cộng sự [25] đã tìm được hơn 100 hoạt tính sinh học của các chất tách ra từ cây họ Na (Annonaceae) Trong đó có nhiều chất có độc tính, hoạt tính kháng vi trùng, ức chế sự tái tạo

tế bào HIV, chống đông tụ tiểu cầu …

Năm 1999, Viện dược học, Học viện Khoa học y dược và Trường Đại học Bắc Kinh - Trung Quốc [32] đã nghiên cứu và tách được các chất có khả năng chống u bướu từ thực vật họ Na: có khoảng 50 acetogenin, 12 styrylpyron

và 25 polyoxygenat cyclohexen mới được tách ra từ 5 loài Uvaria, 4 loài

Goniothalamus và 1 loài Annona Bước đầu kiểm tra hoạt tính sinh học, phần

lớn các chất mới tách ra có các hoạt tính chống u, bướu quan trọng

Vỏ cây, lá và rễ của một số loài cây họ Na (Annonaceae) được sử dụng trong y học dân gian dùng để điều trị bệnh nhiễm trùng, bệnh ho, bệnh về gan, bệnh tiêu chảy và bệnh ung thư Các nghiên cứu dược lý đã tìm thấy khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, trong số đó đáng chú ý là khả năng sử dụng trong hóa học trị liệu của một số thành phần hóa học của lá và vỏ cây Nghiên cứu bước đầu các cây thuốc chữa ung thư ở Việt Nam thì trong đó có lượng lớn

cây họ Na (Annonaceae) [1, 2, 4]

- Tại Peru, thuộc vùng núi Andes, người ta trị cảm, xổ mũi bằng lá mãng cầu; hạt nghiền nát làm thuốc trừ sâu Trong vùng Amazon vỏ cây và lá được dùng để chữa tiểu đường, làm dịu đau, chống co giật

- Tại Guyana: lá và vỏ cây nấu thành trà giúp trị đau và bổ tim

19

- Tại Batay, thuộc vùng Amazon, trà trị bệnh gan được nấu từ lá; dầu

ép từ lá và quả còn non trộn với dầu oliu làm thuốc thoa bên ngoài trị thấp khớp, đau sưng gân cốt

- Tại Jimaica, Haiti và West Indies: quả hay nước ép từ quả dùng trị nóng sốt, giúp sinh sữa và trị tiêu chảy; vỏ thân cây và lá dùng trị đau nhức, chống co giật, ho, suyển…

- Tại Việt Nam, hạt được sử dụng tương tự như hạt Na, nghiền nát trong nước, lấy nước gội đầu để trị chí rận Một phương thuốc Nam khá phổ biến để trị huyết áp cao là dùng vỏ quả hay lá mãng cầu xiêm sắc chung với rể nhàu và rau cần thành nước uống hàng ngày

1.2 Tổng quan về cây hoàng lan hoa trắng (Canaga Odorata)

1.2.1 Đặc điểm thực vật cây hoàng lan hoa trắng (Canaga Odorata)

Tên khoa học: Cananga odorata, C odorata

Chi Cananga, là loài cây thân gỗ

Họ Na (Annonaceae)

Tên dân gian: hoàng lan hoa trắng hay ngọc lan tây

Hình 1.1 Ảnh cây Hoàng lan

20

Chiều cao trung bình của loài cây này vào khoảng 12 m, sinh trưởng tốt nhất khi được trồng tại nơi có nhiều ánh nắng mặt trời, nó ưa thích các rừng mưa vì ở đó có nhiều loại đất chua Vỏ cây có màu xám trắng và nhánh ngang hay buông xuống, mang lá song đính, không có lông Lá của nó khá dài và trơn, bóng loáng Hoa có màu trắng, quăn như sao biển, và có tinh dầu cho mùi thơm rất mạnh, nở trong khoảng giữa tháng 11 và tháng 12 Mỗi hoa cho

ra một chùm quả, mỗi chùm quả chứa 10 - 12 hạt, giống như hạt na [1] Tại Việt Nam, hoàng lan phân bố ở khắp mọi nơi Tinh dầu thơm của cây được sử dụng trong sản xuất nước hoa và đồ gia vị Vỏ cây, lá và rễ của một số loài được sử dụng trong y học dân gian chữa bệnh nhiễm trùng, bệnh ho, bệnh gan, bệnh vàng da do gan, bệnh tiêu chảy… Qua nghiên cứu đã chỉ ra được khả năng chống nấm, chống khuẩn nhất là khả năng sử dụng trong hóa học trị liệu của một số thành phần hóa học của lá và vỏ cây [2] Mặc dù các cây họ

Na (Annonaceae) có giá trị trong lĩnh vực kinh tế khá lớn, ngoài ra có các hoạt tính sinh học quý được sử dụng rộng rãi trong dân gian, song việc nghiên cứu về thành phần hoá học của nó chưa được tiến hành nhiều ở Việt Nam

1.2.2 Thành phần hóa học

Những nghiên cứu trước đây đã phân lập được những hợp chất có hoạt tính kháng u, có độc tính với các tế bào ung thư ở con người như cetylmelodorinol, tautomelodorinon và melodorinon Buckingham J (2005)

đã xác định dãy các hợp chất acetogenin đã được tách từ 2 chi của họ Na (Annonaceae) là Annona và Rollinia, trong đó có 24 chất mới Phần lớn các

acetogenin gồm một hoặc hai vòng tetrahydrofuran, một α, lacton hoặc epoxit trong mạch chính với các nhóm chức như –OH, =O, C=C

β-unsaturated-γ-và diol kề nhau trong mạch dài [3] Wu β-unsaturated-γ-và cộng sự đã tìm thấy 4 chất

flavonoit và tất cả chúng đều là dẫn xuất của glycosit: rhamnosit , kaempferol-3-O-rhamnosit , isorhamnetin-3-O-rhamnosit , tanarixetin-3-O- rhamnosit thu được từ lá của A purpurea [4]

quercetin-3-O-21

1.2.3 Sử dụng và hoạt tính sinh học

Tinh dầu hoàng lan được dùng trong chữa trị bằng xoa bóp dầu thơm, người ta cho rằng nó có thể điều trị chứng huyết áp cao, điều tiết các chất bã nhờn đối với các vấn đề về da, và cho rằng nó có tác dụng kích thích tình dục Tinh dầu hoàng lan cũng được sử dụng phổ biến trong công nghiệp sản xuất nước hoa theo phong cách phương Đông Mùi của loài này có thể hòa hợp được với hầu hết các loại mùi cây cỏ, hoa quả và gỗ Tại Indonesia, hoa hoàng lan được rải trên giường cưới của các đôi tân hôn

22

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu và phương pháp lấy mẫu

Lá và cành nhỏ được thu hái vào tháng 5/2020 tại Trường ĐH Hồng Đức, mẫu tiêu bản số Q52020 do PGS.TS Đậu Bá Thìn phòng đào tạo

Trường Đại học Hồng Đức giám định tên khoa học là: Cananga odorata, C

odorata thuộc họ Na Annonaceae Các mẫu tiêu bản được lưu tại Khoa Khoa

học Tự nhiên Đại học Hồng Đức Thanh Hóa Mẫu được thu hái ở thời điểm thích hợp Sau khi thu hái về, làm sạch mẫu tươi, để nơi thoáng mát hoặc đem sấy khô ở 400

C Xử lý tiếp mẫu bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm

2.2 Các phương pháp hóa học

2.2.1 Phương pháp xác định thành phần hóa học của tinh dầu

Sắc ký khí (GC): Được thực hiện trên máy Agilent Technologies HP

6890N Plus gắn vào detectơ FID của hãng Agilent Technologies, Mỹ Cột sắc

ký HP-5MS với chiều dài 30 m, đường kính trong (ID) = 0,25 mm, lớp phim

thuật chương trình nhiệt độ-PTV) 250oC Nhiệt độ Detectơ 260oC Chương trình nhiệt độ buồng điều nhiệt: 60o

C (2min), tăng 4oC/min cho đến 220o

C, dừng ở nhiệt độ này trong 10 min

Sắc ký khí-khối phổ (GC/MS): Sắc ký khí-khối phổ (GC/MS) việc

phân tích định tính được thực hiện trên hệ thống thiết bị sắc ký khí và phổ ký liên hợp GC/MS của hãng Agilent Technologies HP 6890N Agilent Technologies HP 6890N ghép nối với Mass Selective Detector Agilent HP

kiện 60oC/2 phút; tăng nhiệt độ 4oC/1 phút cho đến 220oC, sau đó lại tăng

23

nhiệt độ 20o/phút cho đến 260oC; với He làm khí mang Việc xác nhận các cấu

tử được thực hiện bằng cách so sánh các dữ kiện phổ MS của chúng với phổ

chuẩn đã được công bố có trong thư viện Willey/Chemstation

+ Một pha bề rộng gọi là pha cố định

+ Pha kia là một chất lỏng hoặc khí, di chuyển qua pha cố định

Phân loại:

+ Sắc ký lỏng: là phương pháp dùng chất lỏng làm pha động:

+ Sắc ký giấy: pha tĩnh là giấy

+ Sắc ký lớp mỏng (TLC-Thin Layer Chromatography): pha tĩnh là một lớp chất hấp phụ được trải bằng phẳng và đều đặn trên một tấm kính hoặc kim loại

+ Sắc ký cột (CC-Column Chromatography): pha tĩnh là chất rắn được nhồi thành cột

+ Sắc ký lỏng cao áp (HPLC- High Performance Liquid Chromatography) + Sắc ký khí: (GC- Gas Chromatography) là phương pháp dùng chất khí làm pha động

Việc nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất sạch được phân lập từ các loài thực vật được thực hiện nhờ sự phối hợp các dữ kiện thu được từ các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối va chạm electron (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1

DEPT) và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC)

Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR-Impact-410 bằng phương pháp viên nén KBr Phổ khối được đo trên máy MS-Engine-5989-HP theo kiểu va chạm electron (ESI) ở 70 Ev, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD Các phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều được đo trên máy Brucker Avance 500 (500 MHz), sử dụng TMS làm chất chuẩn nội Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) được đo trên máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS

Cơ sở lý thuyết của các phương pháp phổ

+ Phổ UV-vis : để xác định sự có mặt hay vắng mặt các nhóm riêng

biệt trong vùng trên 200 nm ( xác định nhóm chức, phân biệt, giải thích hệ liên hợp và hệ không liên hợp…)

+ Phổ IR: Tần số của vân hấp thụ cho phép kết luận sự có mặt của

nhóm chức trong phân tử

+ Phổ H 1 NMR : Số lượng các hấp thu khác nhau cho biết có bao

nhiêu loại proton trong phân tử

25

• Độ chuyển dịch hóa học của proton trong khoảng 0-14 ppm

• Độ chuyển dịch của proton cho biết proton gắn vào nguyên tử nào ( C,

O, H…)

• Sự tách mũi tín hiệu cho biết có bao nhiêu proton hiện diện kề bên

proton khảo sát

• Hằng số ghép được tính bằng khoảng cách giữa các pic doublet,

triplet và quartet rồi nhân với tần số máy Công thức sau: J (Hz) = (δ1- δ2)

máy

+ Phổ C 13 - NMR : Cung cấp thông tin trực tiếp bộ khung cacbon của

phân tử,số nguyên tử cacbon, nhóm chức trong phân tử

• Độ chuyển dịch của cacbon trong khoảng 1- 220ppm

• Chiều cao của pic tỷ lệ thuận với số nguyên tử cacbon tương đương

+ Phổ DEPT :

- Xác định bậc của nguyên tử cacbon có nghĩa là gán các nguyên tử

cacbon bậc 1, bậc 2, bậc 3, bậc 4 tương ứng cho các nhóm CH3, CH2, CH

hoặc C

- Phổ DEPT-90 cho các pic hướng lên của CH, phổ DEPT-135 cho thấy

các pic hướng lên của CH và CH3, đồng thời các pic hướng xuống của CH2

+ Phổ HSQC, COSY, HMBC : Phổ HSQC: Các tương tác trực tiếp

H và 13C- NMR qua hai, ba liên kết giúp xác định gián tiếp tương quan

cacbon- cacbon và các tương quan giữa cacbon bậc 4 với proton xung quanh

Phổ COSY : Các nguyên tử H ghép cặp với nhau dựa trên kết quả phổ

1

H-NMR giúp xác định các nguyên tử H ghép cặp này của một cacbon hay

các H ghép cặp này của hai cacbon ở gần nhau

Cấu trúc của hợp chất được xác định chính xác khi ta kết hợp phân tích

dữ liệu từ các phổ khác nhau

26

+ Phổ MS : Trong lĩnh vực rộng của khối phổ, khối phổ phân giải cao

thu hút sự chú ý vì sự kết hợp của tính chính xác khối lượng cao với độ phân giải siêu cao và khối lượng rất cao Kỹ thuật đa năng này không chỉ áp dụng trong hóa học hữu cơ, vô cơ, cơ học, môi trường, mà còn trong nghiên cứu về

Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3

Phổ tử ngoại UV được ghi trên máy Hitachi UV - 3210

Phổ khối lượng phun mù electron ESI-MS được ghi trên máy Trap-00127 và phổ khối lượng EI-MS được ghi trên máy HP 5989 B-MS với

LC-MS-năng lượng bắn phá ở 70 eV

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H-NMR được đo trên máy Bruker

27

Đức - Thanh Hóa vào tháng 5 năm 2020 Tiêu bản của loài này đã được TS

Đậu Bá Thìn định danh và lưu giữ mẫu tại Khoa KHTN Đại Học Hồng Đức

2.4.3 Phân tích tinh dầu

Hoà tan 1,5 mg tinh dầu đã được làm khô bằng natrisunfat khan trong

1ml metanol tinh khiết, loại dùng cho sắc ký hoặc phân tích phổ

2.4.4 Phân lập các hợp chất

Lá của cây hoàng lan hoa trắng (4,6 kg) được phơi khô, nghiền nhỏ, ngâm bằng dung môi metanol (10L) ở nhiệt độ phòng trong vòng 20 ngày, thu được dịch chiết được cất thu hồi dung môi thu được cao metanol (176g) Cao metanol được hòa tan trong nước và chiết phân bố với dung môi n hexan, etylaxetat cất thu hồi dung môi các phân đoạn thu được : cao n hexan (78g) , cao Etylaxetat (56g) và dịch chiết nước

Sơ đồ 2.1: Chiết các hợp chất trong lá cây Hoàng Lan

Lá cây (4,6 kg)

Cao metanol (176g)

Cao hexan

(78g)

Dịch nước (292g)

Cao etyl axetat (56g)

- Ngâm metanol 20 ngày

- Phân bố trong nước

- Chiết lần lượt với hexan, etylaxetat, butanol

28

Hình 2.1 Sắc ký bản mỏng từ dịch chiết n hexan

Cao n hexan 28 đƣợc tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n hexan-clorofom (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) và hệ dung môi n hexan : Etylaxetat (100:0, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1) thu đƣợc 8 phân đoạn chính (kí hiệu từ

N1 đến N8) mỗi hệ dung môi sử dụng 100 ml,

29

Hình 2.2 Sắc ký cột cao n hexan từ lá và cành nhỏ cây Hoàng lan

30

Phân đoạn N1 (5,6 g) đƣợc tiến hành sắc ký cột silica gel (200 gam, 60

x 5 cm) rửa giải bằng hệ dung môi n hexan: clorofom (100:0, 50:1, 50:2, 10:1,

4:1), thu hợp chất sạch (1) (3mg)

Phân đoạn N3 (1,7 g) đƣợc sắc ký cột silica gel (200 gam, 60×3,2 cm)

đƣợc rửa giải bằng hệ dung môi n hexan: Etylaxetat (9:1, 6:1, 4:1, 1:1, mỗi

4,07(3H, s, OCH3), 4,00 (3H, s, OCH3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) 

(ppm): xem bảng 3.4

32

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tinh dầu

3.1.1 Định lượng tinh dầu

Lá cây Hoàng Lan được thu hái tại trường ĐH Hồng Đức Thanh Hóa vào tháng 05 năm 2019 Hàm lượng tinh dầu đạt 0,2% trọng lượng tươi Tinh

dầu có màu vàng nhạt, nhẹ hơn nước, có mùi thơm dễ chịu

a là thể tích của tinh dầu

b là khối lượng của mẫu đã trừ độ ẩm tính bảng gam

3.1.2 Phân tích thành phần hoá học tinh dầu của lá cây Hoàng an

Phân tích tinh dầu bằng phương pháp Sắc ký khí-khối phổ (GC/MS): Đã

xác định được 13 hợp chất chiếm 99,0% tổng lượng tinh dầu Thành phần chính của tinh dầu là linalool (88,5%), linalool oxit (4,1%), caryophyllen oxit (1,3%) và β-selinen (1,0%) Các hợp chất còn lại chiếm từ 0,2-0,9%