Nghiên cứu cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong lá cây xăng máu hạnh nhân (horsfieldia amygdalina

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC NGUYỄN VĂN NAM NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG LÁ CÂY XĂNG MÁU HẠNH NHÂN HORSFIELDIA AMYGDALINA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC

NGUYỄN VĂN NAM

NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG LÁ CÂY

XĂNG MÁU HẠNH NHÂN (HORSFIELDIA AMYGDALINA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THANH HÓA, NĂM 2019

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC

NGUYỄN VĂN NAM

NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TRONG LÁ CÂY

XĂNG MÁU HẠNH NHÂN (HORSFIELDIA AMYGDALINA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 84.40.114

Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ NGUYỄN THÀNH

THANH HÓA, NĂM 2019

(theo Quyết định số 1366/QĐ-ĐHHĐ ngày 29 tháng 8 năm 2019 của

Hiệu trưởng Trường Đại học Hồng Đức)

Học hàm, học vị

Chức danh trong Hội đồng

PGS.TS Ngô Xuân Lương Trường Đại học Hồng Đức Phản biện 1

PGS.TS Vũ Quốc Trung Trường ĐHSP Hà Nội 1 Phản biện 2

Học viên đã chỉnh sửa theo ý kiến Hội đồng

Ngày 22 tháng 9 năm 2019

Xác nhận của Người hướng dẫn

TS Lê Nguyễn Thành

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Người cam đoan

Nguyễn Văn Nam

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được bản luận văn này, ngoài sự nỗ lực, quyết tâm, sự dày công nghiên cứu của bản thân, tôi còn nhận sự giúp đỡ tận tình của nhiều tập thể và các cá nhân

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân

thành tới TS Lê Nguyễn Thành - Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam, người đã kề vai, sát cánh, tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Cùng với đó là xin chân thành cảm ơn sự tài trợ từ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ Quốc gia (NAFOSTED)

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ban Giám hiệu, phòng Sau đại học, phòng Khảo thí, phòng Đào tạo và các thầy cô giáo thuộc khoa Tự nhiên, khoa Ngoại ngữ, khoa Triết học trường Đại học Hồng Đức đã nhiệt tình giúp

đỡ cũng như trực tiếp giảng dạy để tôi có được những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin cảm ơn tập thể lớp cao học Hóa hữu cơ K10 đã cùng tôi đi qua những ngày tháng miệt mài học tập, chia sẻ những buồn vui, sánh bước bên tôi, cổ vũ, động viên để tôi quyết tâm hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn ban Giám hiệu và tổ Hóa học trường THPT Chu Văn

An đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi một số công việc ở trường để tôi tập trung thời gian học tập, nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ủng hộ, động viên tôi trong cuộc sống cũng như trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Do những hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn không tránh được những thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự đóng góp quý báu của các thầy cô để tôi tiếp tục bổ sung, hoàn thiện luận văn này

Thanh Hóa, ngày 15 tháng 8 năm 2019

Tác giả: Nguyễn Văn Nam

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về họ Myristicaceae (Họ Đậu khấu) 4

1.2 Tổng quan về chi Horsfieldia (Xăng máu) 4

1.2.1 Về vị trí phân loại của chi Horsfieldia 4

1.2.2 Về đặc điểm thực vật và phân bố của chi Xăng máu Horsfieldia 5

1.2.3 Về thành phần hóa học của chi Horsfieldia 5

1.2.4 Về hoạt tính sinh học của chi Horsfieldia 10

1.3 Tổng quan về cây Horsfieldia amygdalina 11

1.3.1 Về vị trí phân loại của cây Xăng máu hạnh nhân 11

1.3.2 Về đặc điểm chung của cây Xăng máu hạnh nhân (Horsfieldia amygdalina) 12

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.2 Phương tiện nghiên cứu 14

2.3 Phương pháp nghiên cứu 15

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập 15

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro 17

2.3.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế Acetylcholinesterase 18

Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập 20

3.1.1 Chiết xuất 20

3.1.2 Phân lập các hợp chất từ dịch chiết n-hexan và ethyl acetat 20

3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất phân lập 22

3.1.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được 22

3.2 Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro của các hợp chất phân lập 34

3.3 Đánh giá tác dụng ức chế Acetylcholinesterase của các hợp chất phân lập

đƣợc 35

3.4 Bàn luận 35

3.4.1 Về thành phần hóa học 35

3.4.2 Về tác dụng sinh học 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC P1

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Số liệu phổ 1

H- và 13C-NMR của hợp chất 1 và TLTK 26 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1

H- và 13C-NMR của hợp chất 2 và TLTK 30 Bảng 3.3: Số liệu phổ 1

H- và 13C-NMR của hợp chất 3 và TLTK 34 Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro trên bốn dòng tế bào ung thư người của ba hợp chất phân lập 35 Bảng 3.5: Kết quả Đánh giá tác dụng ức chế Acetylcholinesterase của ba hợp chất phân lập được 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Các hợp chất phân lập đƣợc từ H iryaghedhi 6

Hình 1.2 Các hợp chất phân lập đƣợc từ H Glabra 6

Hình 1.3 Các hợp chất đƣợc phân lập từ H.superba 7

Hình 1.4 Các hợp chất đƣợc phân lập từ H irya 8

Hình 1.5 Các hợp chất đƣợc phân lập từ H spicata 8

Hình 1.6 Các hợp chất đƣợc phân lập từ H tetratepala 9

Hình 1.7 Các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Horsfieldia macrobotrys 9

Hình 1.8 Các hợp chất phân lập đƣợc từ thân cây và cành 10

Horsfieldia amygdalina 10

Hình 1.9 Một số hình ảnh về cây Xăng máu hạnh nhân (Horsfieldia amygdalina) 11

Hình 3.4 Cấu trúc hợp chất 1 23

Hình 3.5 Phổ khối của hợp chất 1 23

Hình 3.6 Phổ 1H-NMR của hợp chất 1 24

Hình 3.7 Phổ 13C-NMR của hợp chất 1 25

Hình 3.8 Cấu trúc hợp chất 2 27

Hình 3.9 Phổ khối của hợp chất 2 27

Hình 3.10 Phổ 1H-NMR của hợp chất 2 28

Hình 3.11 Phổ 13C-NMR, DEPT của hợp chất 2 29

Hình 3.12 Cấu trúc hợp chất 3 31

Hình 3.13 Phổ khối của hợp chất 3 31

Hình 3.14 Phổ 1H-NMR của hợp chất 3 32

Hình 3.15 Phổ 13C-NMR của hợp chất 3 33

Hình 3.16 Cấu trúc của các hợp phân lập từ lá cây Xăng máu hạnh nhân 36

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn từ lá cây Xăng máu hạnh nhân 20

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cắn chiết n-hexan 21

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cắn chiết ethyl acetat 22

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DPPH Diphenyl picril hydrazilhydrate Diphenyl picril hydrazilhydrat

KB Epidermoid carcinoma of cavity Dòng tế bào ung thư biểu mô

IC50 50% inhibitory concentration Nồng độ ức chế ở 50%

3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazol brom

(HepG2) Human liver cancer cell line Dòng tế bào ung thư gan

RPMI Roswell park memorial institute

Môi trường nuôi cấy do học viện Roswell Park Memorial phát triển

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Thực vật ở Việt Nam có khoảng 12 nghìn loài, trong đó có khoảng

3200 loài cây được sử dụng trong y học dân tộc và 600 loài cây cho tinh dầu Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên rất quý báu của đất nước [3]

Bệnh Alzheimer (AD) là căn bệnh suy giảm trí nhớ, phá hủy các tế bào thần kinh AD trong giai đoạn đầu biểu hiện với sự giảm sút trong nhận thức, mất trí nhớ ngắn hạn Khi bệnh phát triển, bệnh nhân gặp nhiều vấn đề trong đọc, nói và suy nghĩ, ảnh hưởng dài hạn đến trí nhớ Hiện nay, AD là nguyên nhân chủ yếu trong căn bệnh mất trí nhớ của người già, rất phổ biến ở các nước phát triển Theo điều tra dịch tễ học, trên thế giới có khoảng 34 triệu người mắc bệnh AD, trong đó khoảng 7-10% người trên 65 tuổi và 50-60% người trên 85 tuổi Đến năm 2050, số người mắc bệnh có thể tăng đến 114 triệu người [26]

Ung thư là căn bệnh phổ biến, là nỗi lo sức khỏe của các nước phát triển cũng như đang phát triển Theo số liệu năm 2012, trên thế giới có khoảng 14,1 triệu ca mắc mới, 8,2 triệu ca tử vong và 32,6 triệu ca ung thư [29]

Các thuốc từ cây cỏ thiên nhiên đang được sử dụng điều trị ung thư, Alzheimer (AD) và nhiều căn bệnh khác Các nghiên cứu gần đây cho thấy 63% các thuốc với phân tử lượng thấp được phát triển từ năm 1986-2006 là các thuốc có nguồn gốc tự nhiên Taxol, vinblastine, vincristine, dẫn chất camptothecin, etoposide được phát triển từ epipodophyllotoxin là các thuốc điều trị ung thư trên thế giới Một số các hợp chất tự nhiên hứa hẹn khác như flavopiridol, roscovitine, combretastatin A-4, betulinic acid đang được thử nghiệm chống ung thư trên lâm sàng và tiền lâm sàng [25] Các chất ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE) được sử dụng để điều trị các bệnh về cơ thần kinh và là thế hệ thuốc đầu tiên trong điều trị AD Các thuốc phổ biến như tacrin, donepezil và hợp chất tự nhiên rivastigmin được sử dụng để điều

trị suy giảm nhận thức, trí nhớ trong các bệnh nhân AD Một số hợp chất tự nhiên từ các cây như Bạch quả, Thạch tùng răng cưa là thuốc điều trị có nguồn gốc tự nhiên đang được nghiên cứu để điều trị AD [21]

Trong quá trình sàng lọc các loài thực vật có hoạt tính sinh học của thực vật Việt Nam, chúng tôi đã phát hiện một số loài thực vật thuộc họ Đậu khấu (Myristicaceae) có hoạt tính chống ung thư và ức chế enzyme AChE Dịch chiết etyl axetat ở nồng độ 10 µg/mL của cây Xăng máu hạnh nhân

(Horsfieldia amygdalina) có tác dụng ức chế 95-100% sự hoạt động của

enzym AChE Dịch chiết này cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư KB với khả năng ức chế 40% ở nồng độ 1µg/mL

Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nào nghiên cứu về thành

phần hóa học và hoạt tính sinh học của lá cây Horsfieldia amygdalina

Chính vì vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu cấu trúc hóa học và

hoạt tính sinh học của một số hợp chất trong lá cây Xăng máu hạnh nhân

(Horsfieldia amygdalina)”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Phân lập được được 3-4 hợp chất từ các dịch chiết của lá cây Xăng

máu hạnh nhân (Horsfieldia amygdalina) và xác định cấu trúc của các hợp

chất phân lập được

- Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro và ức chế enzyme

acetylcholinesterase của các hợp chất phân lập được

3 Đối tượng nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu là lá cây Xăng máu hạnh nhân (Horsfieldia

amygdalina) thuộc chi Xăng máu (Horsfieldia), được thu hái tại Na Hang,

Tuyên Quang, Việt Nam

4 Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu

- Phân lập các chất: Sử dụng các phương pháp tách chiết, điều chế hiện đại để tách chất như sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng

- Sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt

cấu trúc sản phẩm

- Thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro được tiến hành tại phòng Hóa

sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu) và ung thư vú (MCF-7)

- Đánh giá tác dụng ức chế Acetylcholinesterase được tiến hành tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về họ Myristicaceae (Họ Đậu khấu)

Họ Myristicaceae (Họ Đậu khấu) là một họ thực vật có hoa nằm trong

bộ Magnoliidae Họ này gồm 20 chi và gần 500 loài phân bố ở khắp các vùng

nhiệt đới [18] Trong đó các chi được biết đến nhiều nhất là Myristica,

Horsfieldia, Gymnacranthera và Knema Các loài thuộc họ Myristicaceae

thường sống chủ yếu trong các rừng mưa nhiệt đới

Về đặc điểm thực vật của họ Myristicaceae: Hầu hết những loài thuộc

họ Myristicaceae là cây thân bụi hoặc thân gỗ Vỏ cây có màu nâu hoặc đỏ

Lá mọc đơn lẻ, không xẻ thùy, so le, có mùi thơm, màu xanh đen, gân hình lông chim, không có lá mầm Hoa nhỏ, đơn tính, mọc ở nách thành chùm, lá bắc rụng sớm và phát ra mùi hăng Thùy 3-5, nhị 2-40, bao phấn có 2 ngăn, nhụy hoa không cuống có 1 ngăn, 1 noãn ngược, vòi nhụy ngắn hoặc không

có Quả có lông, vỏ dày nhiều nhựa và chứa một hạt Quả thường lớn, khi chín nứt theo chiều dọc một cách tự nhiên thành 2 mảnh [18]

Về ứng dụng của các cây thuộc họ Myristicaceae: Từ xa xưa, con người trên khắp thế giới đã biết sử dụng các loài cây thuộc họ Myristicaceae làm thức ăn, hương liệu gia vị và đặc biệt là làm thuốc chữa bệnh Ví dụ như loài

Myristica fragrans (Nhục đậu khấu) là một vị thuốc dùng để kích thích tiêu

hóa, dùng trong các trường hợp kém ăn, sốt rét Loài Knema corticosa,

Horsfieldia amygdalina có hạt được dùng làm thuốc chữa bệnh ghẻ [4]

1.2 Tổng quan về chi Horsfieldia (Xăng máu)

1.2.1 Về vị trí phân loại của chi Horsfieldia

Chi Xăng máu Horsfieldia thuộc họ Đậu khấu (Myristicaceae), bộ Ngọc lan (Magnoliales), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Theo khung phân loại ngành Ngọc Lan, vị trí phân loại của chi Xăng

máu Horsfieldia được thể hiện như sau [1]:

Giới thực vật: Plantae

Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta

Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida

Bộ Ngọc lan: Magnoliales

Họ Đậu khấu: Myristicaceae

Chi Xăng máu: Horsfieldia 1.2.2 Về đặc điểm thực vật và phân bố của chi Xăng máu Horsfieldia

Chi Xăng máu Horsfieldia bao gồm khoảng 100 loài có đặc điểm xanh

quanh năm và được phân bố trên khắp Nam Á, từ Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan đến Philippines và Papua New Guinea [28]

Ở Việt Nam có khoảng 7 loài là

Ở vùng đồng bằng miền Nam nhất là quanh Sài Gòn gặp 1 loài mọc

nhiều ven sông rạch là cây Xăng máu rạch Horsfieldia irya (Gaertn.) Warb

[3]

1.2.3 Về thành phần hóa học của chi Horsfieldia

Chi Xăng máu Horsfieldia là một chi quan trọng thuộc họ Đậu khấu, ở

Việt Nam có 7 loài Một số loài chi Xăng máu được sử dụng để lấy gỗ và rất nhiều loài được dùng trong y học cổ truyền làm thuốc chữa đau bụng, tiêu chảy, viêm họng, lở loét, nổi mụn và nhiễm trùng đường ruột [16], [30] Tuy nhiên, mới chỉ có vài loài được nghiên cứu trên thế giới và hầu hết các nghiên cứu hóa thực vật về chi này chủ yếu được thực hiện trên hạt của một số loài

như: H glabra, và H tetratepala Hạt của các loài này được coi như nguồn

nguyên liệu triển vọng cho công nghiệp sản xuất dầu [31]

+ Nghiên cứu về hạt loài H iryaghedhi

Năm 1972, nhóm nhà khoa học người Nhật Bản đã nghiên cứu thành

phần hóa học của hạt H iryaghedhi và phân lập được một hợp chất lignan

mới là horsfieldin (1) và 3 hợp chất đã biết: dihydrocubebin (2) (hình 1.1),

myristic acid, myristin cũng được tìm thấy từ dịch chiết methanol của hạt loài

cây này [13]

Hình 1.1 Các hợp chất phân lập được từ H iryaghedhi

+ Nghiên cứu về loài H glabra

Từ H glabra, Kijjoa và cộng sự đã phân lập được các hợp chất:

arylalkanones, acyl resorcinol (3) và (4) (hình 1.2) cùng với 3 hợp chất đã

biết: asarinin, myristic acid, myristin [22]

Hình 1.2 Các hợp chất phân lập được từ H Glabra

+ Nghiên cứu về loài H superba

Nhóm nghiên cứu của Bodo đã công bố một hợp chất oxidole mới:

horsfiline (5) và 2 hợp chất khác:

6-methoxy-2-methyl-l,2,3,4-tetrahydro-8-carboline (6) và 5-methoxy-N, N-dimethyltryptamin (7) (hình 1.3) từ cây H

superba [15]

Hình 1.3 Các hợp chất được phân lập từ H.superba

Năm 2013, Al-Mekhlafi và cộng sự đã phân lập đƣợc 20 hợp chất,

trong đó có 3 chất mới từ cặn chiết methanol của vỏ cành cây Horsfieldia

superba: (-)-3,4’,7-trihydroxy-3’-methoxyflavan (8),

(-)-5,6-dihydro-6-undecyl-2H-pyran-2-one (9), (-)-5,6-dihydro-6-tridecyl-2H-pyran-2-one (10)

17 hợp chất đã biết bao gồm: 3,4-dihydroxybenzoic acid (11); methyl

2,4-dihydroxy-3,6-dimethylbenzoate (12); (-)-viridiflorol (14) (-)-4’-hydroxy-7-methoxyflavan (15), (-)-4’,7-dihydroxyflavan (16), (+)-3,4’,7-trihydroxyflavan (17), (-)-

2’,3,4-trihydroxy-4’-methoxydihydrochalcone (20), 3’,4’,7-trihydroxyflavone (21),

hexacosanoic acid, hexadecanoic acid (palmitic acid) và β-sitosterol

(hình 1.3) [8]

+ Nghiên cứu về loài H irya

Năm 2002, Gonzalez và cộng sự đã phân lập được hai hợp chất

chromones (23, 24) và hai hợp chất 2-hydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromones

(25, 26) (hình 1.4) từ cây Horsfieldia irya [12]

Hình 1.4 Các hợp chất được phân lập từ H irya

+ Nghiên cứu về loài H spicata

Gần đây, hai hợp chất Myristicyclins A (27) và Myristicyclins B (28)

(hình 1.5) được phân lập từ H spicata [9]

Hình 1.5 Các hợp chất được phân lập từ H spicata

+ Nghiên cứu về loài H tetratepala

Năm 2014, nhóm nghiên cứu người Trung Quốc đă phân lập được 6

hợp chất mới từ thân, lá và cành cây H tetratepala, bao gồm 1 diarylropanoid

(Horsfiequinone A (29)) và 5 dimeric diarylropanoids (horsfiequinones B-F) (30-34) và 1 hợp chất đă biết: combrequinone B (35) (hình 1.6) [20]

29: Horsfiequinone A Horsfiequinone B-F (30-34) and combrequinone B (35)

R 1 R 2 R 3 R 4 R 5 R 6 R 7

30 B -O-CH2-O- OMe -OH -OH -O-CH2-O-

31 C -O-CH2-O- OH OH

O-CH2-O-

33 E -Ome OH OMe -OH -OH -O-CH2-O-

34 G -Ome OH -OH -OH -H -OH Ome

35 F -Ome OH OMe -OH -H -OH Ome

Hình 1.6 Các hợp chất được phân lập từ H tetratepala

+ Nghiên cứu về loài H macrobotrys

Vào năm 2015, một nhóm tác giả đă công bố hai hợp chất

arylalkanones mới: horsfieldone A (36) phenylnonan-1-one (37) (hình 1.7), một flavanone C-glucoside mới: 8-C-b-D- glucopyranosylpinocembrin (38) và một hợp chất đã biết: maingayone D (39)

1-(2,4,6-trihydroxyphenyl)-9-(hình 1.7) từ vỏ cành Horsfieldia macrobotrys Hợp chất Maingayone D (39)

thể hiện khả năng quét gốc tự do (IC50 0.43µM) và ức chế α-glucosidases (IC50 5.65 µM) tốt hơn 4 lần so với Horsfieldone A (36) [23]

Hình 1.7 Các hợp chất phân lập được từ cây Horsfieldia macrobotrys

+ Nghiên cứu về loài H amygdalina

Gần đây nhất, năm 2018, nhóm nghiên cứu của TS Lê Nguyễn Thành

ở Viện Hóa sinh biển đã tiến hành phân lập và xác định cấu trúc của 5 hợp

chất là seasamin (40), sulfuretin (41), protocatechuic acid (42), β-sitosterol

(43) và daucosterol (44) (hình 1.8) từ thân cành cây Xăng máu hạnh nhân

Horsfieldia amygdalina Đây là nghiên cứu đầu tiên về loài Xăng máu hạnh

nhân Horsfieldia amygdalina trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam [17]

Hình 1.8 Các hợp chất phân lập được từ thân cây và cành

Horsfieldia amygdalina

1.2.4 Về hoạt tính sinh học của chi Horsfieldia

Theo các nghiên cứu về thành phần hóa học, dầu của các loài thuộc chi này có khoảng 40 hợp chất, một số hợp chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào

ở mức độ trung bình và hoạt tính chống sốt rét [8], [19]

Các nghiên cứu in vitro về hoạt tính sinh học cho thấy, hợp chất (9) và

(10) (hình 1.3) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trung bình trên 3 dòng tế bào:

ung thƣ tiền liệt tuyến PC-3, ung thƣ ruột kết HCT-116 và ung thƣ vú MCF-7, trong khi dịch chiết cloroform và etyl axetat thể hiện khả năng ức chế AChE với giá trị IC50 lần lƣợt là 72 và 60 µg/mL [8]

Gần đây, hai hợp chất Myristicyclins A và B được phân lập từ H

spicata Hợp chất Myristicyclin A (27) (hình 1.5) thể hiện giá trị IC50 là 35,

43, and 54 mM tương ứng với các giai đoạn khác nhau của kí sinh trùng sốt

rét là thể nhẫn, thể tư dưỡng non và thể phân liệt Như vậy hợp chất (27) thể

hiện hoạt tính chống lại hiệu quả ký sinh trùng ở các giai đoạn khác nhau

Hợp chất Myristicyclin B (28) (hình 1.5) có khả năng gây tán huyết ở

nồng độ 230 mM, ngoài ra nó có hoạt tính chống kí sinh trùng (ở nồng độ 10.0, 6.6, và 7.9 mM tương ứng với giai đoạn của ký sinh trùng thể nhẫn, thể

tư dưỡng non và thể phân phân liệt) [9]

Các hợp chất (29) đến (34) (hình 1.6) được đánh giá hoạt tính gây độc

tế bào trên 5 dòng tế bào gây ung thư ở người (ung thư bạch cầu HL-60, ung thư gan SMMC-7721, ung thư phổi A-549, ung thư vú MCF-7, ung thư biểu

mô ruột kết SW-480), cho thấy tác dụng ức chế chọn lọc đối với dòng tế bào

gây ung thư bạch cầu HL-60 Các hợp chất (30), (32), (33) và (34) (hình 1.6)

thể hiện hoạt tính tốt với giá trị IC50 lần lượt là 4.28±0.87, 3.18±0.67, 4.46±0.73, và 6.61±0.08µM [20]

1.3 Tổng quan về cây Horsfieldia amygdalina

Hình 1.9 Một số hình ảnh về cây Xăng máu hạnh nhân

(Horsfieldia amygdalina)

1.3.1 Về vị trí phân loại của cây Xăng máu hạnh nhân

Cây Xăng máu hạnh nhân có tên khoa học Horsfieldia amygdalina

thuộc họ Đậu khấu (Myristicaceae), bộ Ngọc lan (Magnoliales), lớp Ngọc lan

(Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (magnoliophyta) [1]

Giới thực vật: Plantae

Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta

Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida

Bộ Ngọc lan: Magnoliales

Họ Đậu khấu: Myristicaceae

Chi Xăng máu: Horsfieldia

Loài Xăng máu hạnh nhân: Horsfieldia amygdalina 1.3.2 Về đặc điểm chung của cây Xăng máu hạnh nhân (Horsfieldia amygdalina)

Loài Horsfieldia amygdalina phân bố ở Việt Nam, Mianma… Ở nước

ta, cây mọc rải rác ở hầu khắp các tỉnh từ Quảng Trị tới Lâm Đồng, thành phố

Hồ Chí Minh, trong các rừng kín thường xanh Cây ưa ẩm, thường mọc ở ven khe suối [3]

1.3.3 Về hoạt tính sinh học

Dịch chiết etyl axetat ở nồng độ 10 µg/mL của cây Xăng máu hạnh

nhân (Horsfieldia amygdalina) có tác dụng ức chế 95-100% sự hoạt động của

enzym AChE Dịch chiết này cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư KB với khả năng ức chế 40% ở nồng độ 1µg/mL

Nhóm nghiên cứu của TS Lê Nguyễn Thành ở Viện Hóa sinh biển đã

tiến hành phân lập và xác định cấu trúc của 5 hợp chất là seasamin (40),

sulfuretin (41), protocatechuic acid (42), β-sitosterol (43) và daucosterol (44)

từ thân cành cây Xăng máu hạnh nhân Horsfieldia amygdalina Đây là nghiên cứu đầu tiên về loài Xăng máu hạnh nhân Horsfieldia amygdalina

trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam Trong nghiên cứu này, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất hóa học từ lá loài Xăng máu hạnh

nhân Horsfieldia amygdalina đƣợc tiếp tục nghiên cứu

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu lá cây Xăng máu hạnh nhân (Horsfieldia amygdalina) được thu

hái tại Na Hang, tỉnh Tuyên Quang, Việt Nam vào tháng 07 năm 2015 và đã được TS Nguyễn Quốc Bình thuộc Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam định tên Mẫu tiêu bản ký hiệu VN-1208 hiện đang được lưu giữ tại phòng tiêu bản của Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam

2.2 Phương tiện nghiên cứu

Trang thiết bị

Chiết xuất và phân lập:

- Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn (Merck 60 F254, Đức) Các vết chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng

bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao cho đến khi hiện màu

- Sắc ký cột (CC) được tiến hành với chất hấp phụ pha thường (silica gel, 240-430 mesh, Merck, Đức) hoặc Sephadex LH-20

- Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện Hóa học

- Phổ khối lượng (ESI-MS) được đo trên máy Agilent 1260 mass

spectrometer, Viện Hóa sinh biển

Thử hoạt tính gây độc tế bào:

- Phiến 96 giếng (SPL Life Sciences, Hàn Quốc)

- Ống ly tâm 1.5 ml, 2 ml, máy ly tâm (Universal 320R)

- Đĩa nuôi cấy đã xử lý bề mặt

- Buồng đếm tế bào (Fisher Hoa Kỳ)

- Máy đọc ELISA (ELISA Bio-Rad machine, Mỹ)

toàn cấp II, tủ lạnh sâu -25o

C, -80oC

- Kính hiển vi (Zeizz), máy quang phổ (Genios, Tecan), bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác

Dung môi, hóa chất

Chiết xuất và phân lập:

- Dung môi, hóa chất dùng để chiết xuất và phân lập gồm: n-hexan, ethyl acetat, ethanol, methanol, dichloromethan đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

Thử hoạt tính gây độc tế bào:

- DMEM (Dullbecco’s modified Minimum Essential Medium) (Gibco, Mỹ)

- RPMI 1640 (Roswell park memorial institute) (Gibco, Mỹ)

- FBS (Fetal bovine serum) (Gibco, Mỹ)

- MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid) (DUCHEFA biochemie, Hà Lan)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập

Chiết xuất

+ Chuẩn bị mẫu: Mẫu lá cây Xăng máu hạnh nhân khô được xay nhỏ,

được ngâm với dung môi MeOH

+ Chiết mẫu:

Chiết phân đoạn:

Mẫu được ngâm chiết với MeOH sau đó là chiết với các dung môi hexan, ethyl acetat, cất thu hồi dung môi thu được các cắn tương ứng

n-Phân lập các chất

+ Sử dụng phương pháp sắc ký cột/sắc ký lớp mỏng điều chế Theo dõi

quá trình phân lập bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) Phương pháp sắc ký cột:

- Chuẩn bị cột: Chuẩn bị cột phù hợp với lượng silica gel được dùng Cột được rửa sạch, sấy khô, lắp thẳng đứng trên giá cố định

- Pha tĩnh: Silica gel pha thường (40-63 µm, Merck), tùy theo lượng cắn để sử dụng silica gel phù hợp

- Cân một lượng silica gel cần dùng vào cốc có mỏ, thêm dung môi vào, khuấy đều, đuổi hết bọt khí

- Nhồi cột: Cột sắc ký được lót một lớp bông mỏng ở phía đáy cột để ngăn không cho chất hấp phụ chảy xuống khi mở khóa cột

- Tiến hành nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt Hỗn dịch silica gel được đổ từ từ lên cột, vừa đổ, vừa gõ nhẹ vào thành cột để silica gel được nén đều, mở khóa cột tối đa

- Ổn định cột: Sau khi đưa hết silica gel lên cột, tiếp tục gõ nhẹ, đều và đối xứng xung quanh thân cột tới khi trong cột không còn bọt khí, mặt thoáng phẳng và lớp silica gel lắng xuống đã ổn định Tiếp tục cho dung môi chảy qua cột khoảng 2 giờ, thì khóa cột lại

- Nạp mẫu lên cột: Cắn được hòa tan trong một lượng dung môi tối thiểu đến tan hoàn toàn sau đó trộn đều với một lượng tối thiểu silica gel (0,5-

1 lần lượng cắn), rồi cất quay chân không để thu được bột Sau đó đưa mẫu lên cột sắc ký, tiến hành rửa giải

- Dung môi rửa giải: Sử dụng hỗn hợp dung môi thích hợp, dung môi phân cực cao (ethanol, methanol); dung môi phân cực trung bình (ethyl acetat, dichloromethan); dung môi kém phân cực hoặc không phân cực (n-hexan,)

- Phát hiện và thu nhận kết quả sắc ký

Dịch thu được trong quá trình rửa giải được hứng vào lọ thí nghiệm tương ứng Theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn (Merck 60 F254) Gộp các bình hứng có sắc ký đồ giống nhau, thu hồi dung môi

Phát hiện vết: quan sát dưới đèn UV bước sóng 254 nm, hiện màu bằng thuốc thử Ce2SO4

+ Tiến hành phân lập các phân đoạn nhỏ sử dụng các phương pháp sắc

ký trên silica gel, sephadex, sắc ký bản mỏng điều chế

Kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất phân lập

Sử dụng sắc ký lớp mỏng (sử dụng các hệ dung môi khác nhau)

Nhận dạng các hợp chất tinh khiết phân lập được

Sau khi phân lập được hoạt chất tinh khiết, cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định bằng các phương pháp phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1

từ thực nghiệm với các dữ liệu đã công bố

2.3.2 Phương pháp đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro

Đánh giá tác dụng gây độc tế bào in vitro bằng phương pháp MTT

(3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromid) được mô tả bởi Scudiero [24] Thực hiện tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện hóa học - Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Nguyên lý: Phương pháp MTT là một phương pháp so màu MTT

tham gia phản ứng oxy hoá khử với ty thể của tế bào sống và tạo thành các formazan dạng tinh thể Có thể dùng một số dung môi hữu cơ (isopropanol)

để vừa phá huỷ màng tế bào và vừa hoà tan các tinh thể formazan, sau đó đo

độ hấp thụ quang học của các dung dịch này ở 540nm

Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu các hợp chất tinh khiết được pha thành dung

dịch gốc với nồng độ 100 mM trong DMSO, pha loãng thành các nồng độ khác nhau: 1 µg/ml, 4 µg/ml, 16 µg/ml, 64 µg/ml, 256 µg/ml

Chuẩn bị các dòng tế bào: Dòng tế bào ung thư người sử dụng là LU

(Human lung carcinoma) - tế bào ung thư phổi, MCF-7 (Human breast carcinoma) - tế bào ung thư vú Các dòng tế bào nuôi cấy trong môi trường phù hợp, có bổ sung huyết thanh bò 10% (FBS) và các thành phần cần thiết

khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, 37oC, độ ẩm 98%, vô trùng tuyệt đối) Tùy vào từng đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính

Các bước tiến hành: 200 µl dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3x104

tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường DMEM hoặc RPMI

1640 cho các dòng tế bào LU, MCF-7 Mẫu thử được pha loãng sao cho đạt đến nồng độ cuối cùng 1 µg/ml, 4 µg/ml, 16 µg/ml, 64 µg/ml, 256 µg/ml Ủ

37o, 5% CO2 3 ngày

Đối chứng dương (control +) là 200 µl dung dịch tế bào 3x104

tế bào/ml

Đối chứng âm (control -) gồm 200 µl môi trường nuôi cấy

Ellipticin (Sigma) được dùng làm chất đối chiếu

Sau 3 ngày nuôi cấy, ủ tiếp với MTT 0,2 mg/ml ở 37oC trong 4 giờ, loại bỏ môi trường, thêm 100 µl DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540

nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN Mật độ quang phản ánh số lượng tế bào còn sống sót

Tính kết quả: Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào được tính

dựa trên số liệu đo mật độ quang học OD trên máy quang phổ TECAN theo công thức sau:

Bước tiếp theo pha loãng chất trong đệm PBS 0,1M pH 8 sao cho nồng

sóng 410 nm sử dụng máy Microplate reader BIOTEK - USA

Xác định giá trị IC 50 :

% hoạt độ enzym được tính bằng công thức:

nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3 [10]

(ODgiếng thử - ODgiếng blank )(ODgiếng điều khiển dương - ODgiếng blank)x 100%

(%) =