Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây mã đề (plantago mảo l ) ở huyện triệu sơn tỉnh thanh hóa

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC LÊ THỊ THU HẰNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY MÃ ĐỀ PLANTAGO MAJOR L.. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓATRƯỜNG ĐẠI HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC

LÊ THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH

HỌC CỦA CÂY MÃ ĐỀ (PLANTAGO MAJOR L.) Ở HUYỆN

TRIỆU SƠN TỈNH THANH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

THANH HÓA, NĂM 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO UBND TỈNH THANH HÓA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC HỒNG ĐỨC

LÊ THỊ THU HẰNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH

HỌC CỦA CÂY MÃ ĐỀ (PLANTAGO MAJOR L.) Ở HUYỆN

TRIỆU SƠN TỈNH THANH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Mã số: 8440114

Người hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Việt Hương

THANH HÓA, NĂM 2019

Danh sách Hội đồng chấm luận văn Thạc sĩ khoa học theo Quyết định số

1366/QĐ- ĐHHĐ ngày 29 tháng 8 năm 2019 của Hiệu trưởng Trường Đại học Hồng Đức:

Học hàm, học vị,

Họ và tên

Cơ quan Công tác

Chức danh trong Hội đồng

Xác nhận của Người hướng dẫn

Học viên đã chỉnh sửa theo ý kiến của Hội đồng

Ngày 09 tháng 10 năm 2019

TS Đỗ Thị Việt Hương

* Có thể tham khảo luận văn tại Thư viện trường và Bộ môn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này không trùng lặp với các khóa luận, luận văn, luận án và các công trình nghiên cứu đã công bố

Người cam đoan

Lê Thị Thu Hằng

LỜI CẢM ƠN

Đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây

Mã đề (Plantago major L.) ở huyện Triệu Sơn tỉnh Thanh Hóa được hoàn

thành tại Phòng thí nghiệm Hóa dược và Phòng thí nghiệm các hợp chất thiên nhiên, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến

TS Đỗ Thị Việt Hương, người đã giao cho tôi đề tài này và tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin được chân thành cảm ơn các thầy cô và bạn bè trong Phòng thí nghiệm Hóa dược, cũng như Phòng thí nghiệm các hợp chất thiên nhiên, các thầy cô trong khoa Khoa học tự nhiên- Trường Đại học Hồng Đức đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Và cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, đồng nghiệp, các anh chị em và các bạn lớp thạc sĩ Hóa hữu cơ K10 đã luôn sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học và hoàn thành luận văn này

Thanh Hóa, tháng 8 năm 2019

Tác giả

Lê Thị Thu Hằng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

CHỮ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU v

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về thực vật 3

1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học 6

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 14

2.1 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2 Thực nghiệm 14

2.2.1 Mẫu thực vật 14

2.2.2 Điều chế các cặn chiết 15

2.2.3 Khảo sát định tính thành phần hóa học trong mẫu cây Mã đề bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 17

2.2.4 Phân tích phần chiết ethyl acetate bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) 17

2.2.5 Phân tách phần chiết ethyl acetate bằng sắc ký cột thường (CC) 17 2.2.6 Xác định hoạt tính chống oxy hóa của cặn chiết 18

2.2.7 Khảo sát khả năng ức chế độ hoạt động của enzyme α-glucosidase19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21

3.1 Khảo sát định tính các hợp chất trong phần chiết ethyl acetate (EP) của mẫu cây Mã đề bằng phương pháp sắc kí khí khối phổ (GC-MS) 21

3.2.Phân tích phần chiết ethyl acetat (EP) bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 25

3.3.Phân tách phần chiết ethyl acetate (EP) bằng sắc ký cột thường (CC) 25

3.4.Khảo sát một số chỉ số hóa học và hoạt tính sinh học 33

3.4.1 Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa 33

3.4.2 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Các flavonoid tìm thấy trong loài Mã đề 11

Bảng 2.1: Hiệu suất các phần chiết mẫu Mã đề 16

Bảng 3.1: Các hợp chất xuất hiện trong phần chiết EP 22

Bảng 3.2: Các phân đoạn chất từ dịch chiết EP cây Mã đề 26

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxi hóa 34

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 : Các bộ phận của cây Mã đề 6

Hình 1.2: Alkaloid có trong Plantago major 8

Hình 1.3: Dẫn xuất caffeic acid trong Plantago major 9

Hình 1.4: Các glycoside iridoid trong loài Mã đề 12

Hình 2.1: Mẫu cây Mã đề tươi 15

Hình 2.2: Quy trình chiết mẫu cây Mã đề 16

Hình 3.1: Sắc đồ chạy GC - MS của phần chiết EP 21

Hình 3.2: Các hợp phần có trong phần chiết ethyl acetate (EP) 24

Hình 3.3: Sắc ký bản mỏng khảo sát sự phân tách của dịch chiết EP với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (9:1, v/v) 25

Hình 3.4: Phổ cộng hưởng từ hạt nhận 1H NMR của Chất 1 27

Hình 3.5: Công thức cấu tạo của Chất 1 (β-Sitosterol) 28

Hình 3.6: Phổ cộng hưởng từ hạt nhận 1H NMR của Chất 2 29

Hình 3.7: Công thức cấu tạo của Chất 2 (β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside) 30 Hình 3.8: Phổ cộng hưởng từ hạt nhận 1H NMR của Chất 3 31

Hình 3.9: Công thức cấu tạo của Chất 3 (axit ursolic) 32

Hình 3.10: Phổ cộng hưởng từ hạt nhận 1H NMR của Chất 4 32

Hình 3.11: Công thức cấu tạo của Chất 4 33

Hình 3.12: Đồ thị thể hiện khả năng ức chế enzyme α-glucosidase theo nồng độ các phần chiết 35

MỞ ĐẦU

1.Lí do chọn đề tài

2.500 chi và 300 họ Nhiều loài đã được sử dụng rộng rãi trong đời sống đặc biệt là chữa bệnh.[1]

(Plantaginaceae) là loài cây mọc hoang và được trồng phổ biến ở nước ta

và nhiều nước trên thế giới Trong đời sống hàng ngày cây Mã đề được dùng như một loại rau và trong y học dân gian cây Mã đề được dung như một loại dược liệu với các bộ phận có công dụngchữa bệnh khác nhau như: lợi tiểu, chữa ho, tác dụng kháng sinh, chữa bệnh lỵ cấp và mãn tính, làm hưng phấn thần kinh… ngoài ra còn mát gan thanh nhiệt cơ thể ít gây độc hại với cơ thể sinh vật Do đó, các vị thuốc từ cây Mã đề đã được quan tâm nghiên cứu rất nhiều và được tiêu chuẩn hóa trong sử dụng, các tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu từ Mã đề có trong Dược Điển quốc gia [2], [3] Dựa vào các kinh nghiệm dân gian để lại cũng như khảo sát tài liệu tham khảo về các nghiên cứu hóa học và sinh học của cây Mã đề được gieo trồng ở Việt Nam thì hiện nay loại cây này chưa được nghiên cứu nhiều, nên tôi muốn góp phần nghiên cứu về hóa thực vật và hoạt tính sinh học

của cây Mã đề Vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học của cây Mã đề (Plantago major L.) ở huyện Triệu Sơn Tỉnh Thanh Hóa” nhằm góp phần tìm ra những hợp chất hóa học có

tác dụng sinh học thú vị từ cây thuốc dân gian này

2 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Xây dựng quy trình chiết chọn lọc để điều chế các dịch chiết từ cây

Mã đề

- Khảo sát định tính thành phần hóa học của cây Mã đề

- Phân lập và tinh chế các hoạt chất có thể có trong cây Mã đề

- Khảo sát hoạt tính sinh học của cây Mã đề

3 Các nội dung nghiên cứu

-Mẫu Mã đề tươi được phơi khô, ngâm và chiết trong dung môi hữu

cơ có độ phân cực tăng dần nhằm thu được các lớp chất mong muốn

-Phân tích định tính các dịch chiết thu được bằng phương pháp sắc kí khí khổi phổ GC-MS

-Khảo sát các dịch chiết thô trên sắc ký lớp mỏng TLC nhằm tìm ra hệ dung môi tách thích hợp Trên kết quả khảo sát định tính thu được bằng phương pháp TLC, các dịch chiết sẽ được tiến hành tách trên cột sắc ký CC nhằm thu được các hợp chất mong muốn Các hợp chất phân lập được sẽ được khảo sát cấu trúc bằng các phương pháp vật lý hiện đại

-Khảo sát hoạt tính sinh học của các dịch chiết điều chế được

4 Cấu trúc của luận văn

Ngoài phần mở đầu, kết luận, luận văn gồm 3 chương:

Chương 1 Tổng quan

Chương 2 Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm

Chương 3 Kết quả và thảo luận

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về thực vật

Mã đề hay còn gọi là Mã tiền á, Xa tiền có tên khoa học là Plantago

asiatica L là một chi chứa khoảng 200 loài thực vật có kích thước nhỏ,

được gọi chung là mã đề Phần lớn các loài là cây thân thảo, mặc dù có một

số ít loài là dạng cây bụi nhỏ, cao tới 60 cm Lá của chúng không có cuống, nhưng có một phần hẹp gần thân cây, là dạng cuống lá giả Chúng có 3 hay

5 gân lá song song và tỏa ra ở các phần rộng hơn của phiến lá Các lá hoặc

là rộng hoặc là hẹp bản, phụ thuộc vào từng loài Các cụm hoa sinh ra ở các cuống thông thường cao 5–40 cm, và có thể là một nón ngắn hay một cành hoa dài, với nhiều hoa nhỏ, được thụ phấn nhờ gió [1]

Họ Mã đề

Họ Mã đề, danh pháp khoa học: Plantaginaceae Juss., là một họ thực vật có hoa trong bộ Hoa môi (Lamiales) Chi điển hình là Plantago L Họ Plantaginaceae nghĩa rộng (sensu lato) là một họ đa dạng, phổ biến toàn

cầu, nhưng chủ yếu tại các khu vực ôn đới Nó bao gồm chủ yếu là các cây thân thảo, cây bụi và một ít cây thủy sinh có rễ mọc trong đất (chẳng hạn

chi Callitriche) Lá của chúng mọc thành vòng xoắn hoặc mọc đối, các lá

có dạng lá đơn hay lá kép Đặc điểm bất thường của họ này so với bộ Hoa môi nói chung là sự thiếu vắng của các phần phân chia theo chiều dọc trong đầu các sợi lông có tuyến Cấu trúc và hình dạng của hoa rất đa dạng Một

số chi có 4 đài hoa và 4 cánh hoa, những loài khác có từ 5-8 đài/cánh hoa,

chẳng hạn chi Sibthorpia Hoa của phần lớn các chi là đối xứng theo nhiều

mặt phẳng Tràng hoa thông thường có 2 môi Trong một số chi, bộ nhị được hình thành trước tràng hoa Quả là dạng quả nang, thường nứt ra tại

các phần chia giữa các ngăn Trong chi Veronica phần phân chia này theo

chiều dài; trong các loài của chi Antirrhinum thì khi quả nứt nó giải

phóng phấn hoa thông qua các lỗ ở đầu bao phấn; hoặc nó có thể xoay chuyển thông qua đường tuần hoàn ngang xung quanh bao vỏ [2], [3]

Chi Mã đề

Chi Mã đề (danh pháp khoa học: Plantago) là một chi chứa khoảng

200 loài thực vật nhỏ, không dễ thấy, được gọi chung là Mã đề Phần lớn các loài là cây thân thảo, mặc dù có một số ít loài là dạng cây bụi nhỏ, cao tới 60 cm Lá của chúng không có cuống, nhưng có một phần hẹp gần thân cây, là dạng giả-cuống lá Chúng có 3 hay 5 gân lá song song và tỏa ra ở các phần rộng hơn của phiến lá Các lá hoặc là rộng hoặc là hẹp bản, phụ thuộc vào từng loài Các cụm hoa sinh ra ở các cuống thông thường cao 5-

40 cm, và có thể là một nón ngắn hay một cành hoa dài, với nhiều hoa nhỏ, được thụ phấn nhờ gió

Các loài Mã đề mọc ở nhiều nơi trên thế giới, bao gồm châu Mỹ, châu Á, Australia, New Zealand, châu Phi và châu Âu Nhiều loài trong chi phân bổ rộng khắp thế giới như là một dạng cỏ dại Tại Việt Nam có hai

loài phân bố là Plantago major (Mã đề) và Plantago asiatica (Mã đề á hay

xa tiền)

Mã đề lớn (Plantago major L.)

Tên khoa học: Plantago major L., Plantago asiatia L., thuộc giới

Plantae, Nghành: Magnoliophyta; Lớp Magnolióida; Bộ Lamiales; Họ Plantaginaceae; Chi Plantago L Mã đề lớn (tên của loài cây này xuất phát

từ việc nó hay mọc ở vết chân ngựa kéo xe; mã là ngựa, đề là móng chân); các tên gọi khác như Mã đề Thảo, Nhả Én, Dứt (Thái), Suma (Thổ)

Mã đề lớn là một loại cỏ sống lâu năm, thân ngắn, lá mọc thành cụm

ở gốc, phiến lá hình thìa hay hình trứng, có gân dọc theo sống lá và đồng quy ở ngọn và gốc lá Hoa mọc thành bông, có cán dãi xuất phát từ kẽ lá Hoa đều lưỡng tính, đài 4, xếp chéo hơi đính nhau ở gốc Tràng màu nâu gồm 4 thùy, nhị 4, quả hộp trong chứa nhiều hạt nhỏ màu đen bóng Là loài

cây ưa sáng ẩm, có khả năng chịu hạn nhẹ Chúng thường mọc hoang và được trồng tại nhiều nơi trên nước ta Thời gian thu hoạch lý tưởng tháng 7-8 thu hái lúc cây đang ra hoa, thu vào ngày khô ráo

Mô tả cây: Cỏ cao 24 - 45 cm, thân rất ngắn gần như không có Rễ mọc thành chùm Lá đơn mọc từ gốc, hình thìa, kích thước 10-15 x 5-7 cm, mép phiến lá có răng cưa nhỏ thưa; màu xanh lục đậm ở mặt trên, nhạt ở mặt dưới Gân lá hình cung với 5 gân chính nổi rõ ở mặt dưới Cuống lá hình lòng máng màu xanh lục nhạt, dài 9-12 cm, gốc rộng có màu trắng hoặc tím

Cụm hoa: dạng bông, trục cụm hoa dài 28 – 46 cm, xuất phát từ kẽ

lá Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 4, không cuống Lá bắc hình bầu dục, kích thước 1,5 x 1 mm, ở giữa dày màu xanh, 2 mép mỏng hơn màu trắng, có gân giữa, bề mặt có những nốt sần Lá đài 4, đều, rời, hình bầu dục, kích thước 2 x 1 mm, ở giữa dày màu xanh, 2 mép mỏng hơn màu trắng

Bao phấn hình đầu tên màu vàng, đầu nhọn, dài 1 mm, 2 ô, nứt dọc, hướng trong, đính đáy Hạt phấn hình quả trám màu vàng, rời, có 1- 2 rãnh dọc, kích thước 25 – 37,5 µm Lá noãn 2, vị trí trước sau, bầu trên 2 ô, mỗi

ô 2 noãn, đính noãn trung trụ, giá noãn lồi 1 vòi nhụy hình sợi, dài 3 mm; 1/4 phía dưới màu trắng nhẵn; 3/4 phía trên màu đỏ nâu, có nhiều lông dài

1 đầu nhụy dạng điểm, có rất nhiều lông dài

Quả hộp nhỏ mang đài tồn tại, hình bầu dục, dài 3,5 – 4 mm, màu xanh khi non, màu hơi ngà khi già, mở theo đường nứt ngang Hạt 8 – 12, hình thoi dẹp, dài 1,5 – 2 mm, màu xanh khi non, màu nâu đen bóng khi già

Hình 1.1 : Các bộ phận của cây Mã đề

1.2 Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học

Các cacbohydrat

Trong hạt của Mã đề chứa các monosacarit glucose, fructose, xylose

và rhammose cũng như đisacarit sucrose và trisacarit planteose [4] Planteose là cacbohydrat dữ trữ có trong hạt của Mã đề [45] Dịch chiết nước lạnh của hạt Mã đề chứa 61% xyloza, 13.2% arbiose và 24% galacturonic axit, còn trong dịch chiết nước nóng chứa 78% xyloza, 13,2% arabinose, 3% galactose và galacturonic axit [4] Samuelsen và cộng sự đã công bố trong một báo cáo năm 1999, trong dịch chiết nước của Mã đề ở

500C chứa 39,7% xyloza, 13,1% arabinose, 15,5% axit galacturonic, 17,2% axit glucuronic, 15,5% rhamnose, 2,1% galactoseand, 9,9% glucose [48]

Các trisacarit (0.3 mg/trọng lượng khô) và tetrasacarit stachyose (4.5 mg/ trọng lượng khô) đã được phân lập từ lá của Mã đề Hợp chất stachyose được xem như là chất dự trữ tạm thời ở trong lá của Mã đề [14]

Năm 1966, Gorin và các cộng sự đã phân lập được axit galacturonic, galactose, arabinose, rhamnose cùng một lượng nhỏ glucose và xyloza

Bằng phương pháp sắc ký cột DEAE cellulose, pectic axit polysaccharide, galactoarabinan và a galactan đã được phân lập Những chất này còn được gọi là plantaglucid và được dùng trong điều trị bệnh loét dạ dày ở liều lượng 1.5-3 gram/ngày [16], [17], [18]

Trong một thí nghiệm trên chuột, các hợp chất plantaglucid làm giảm triệu chứng loét dạ dày 20 lần, còn các thử nghiệm trên chó cho thấy

nó làm tăng cường tiết dịch vị dạ dày Các tác dụng chống phù nề cũng được ghi nhận trong các thí nghiệm gây ra bởi formalin và dextran [38]

Theo đánh giá của Wagner, các polysaccharide có trong Plantago

major có khả năng miễn dịch Các polysacchariđe phân lập được từ P major có thể làm tăng thực bào từ 15-50% trong hai mô hình thực bào in

vitro, và tốc độ kích thích cao nhất đạt được ở nồng độ 0.1 mg/ml [56]

Các lipid

Các axit béo chiếm 64.8% trong hạt của Mã đề chủ yếu là các axit béo không bão hòa [5] Axit arachidic là hợp chất duy nhất được phân lập

từ hạt của cây P.major và không được tìm thấy trong bất kì loài Mã đề nào

khác được nghiên cứu Hầu hết các axit béo được tìm thấy ở trong hạt của

Mã đề, còn thân, lá và củ chứa một lượng rất ít các axit béo Một lượng nhỏ (1.5%) 9-hydroxy-cis-11-octadecenoic là đồng phân của ricinoleic axit đã được phân lập từ hạt của Mã đề [6] Chỉ có 0.18% lipid được tìm thấy trong

lá tươi Các axit béo không bão hòa 18:33, 18:26 và axit no bão hòa palmitic axit được tìm thấy nhiều nhất trong lá [20]

Các thành phần chính của nhựa lá là các triterpene acid, oleanolic và ursolic axit, alkan mạch thẳng C27H56 , C33H68 Dịch chiết chloroform của lá chứa khoảng 63% triterpenic axit, 17% hydrocarbon mạch thẳng, 1% các alcohol mạch thẳng và 19% các hợp chất không xác định được [9] Các nghiên cứu lâm sàng trên thỏ đã chỉ ra rằng các hợp chất alcohol bão hòa

có khung cacbon từ C26– C30 trong dịch chiết n-hexan có tác dụng chữa lành các vết thương sâu [31]

Các alkaloid

Plantago major được thử nghiệm dương tính với phản ứng nhận biết

alkaloid Indicain và Plantagonin là hai alkaloid được tìm thấy trong hầu hết các loài Mã đề [46],[49],[53]

Hình 1.2: Alkaloid có trong Plantago major

Dẫn xuất của caffeic acid

Các ethyl và methyl ester của axit caffeic được phân lập từ dịch chiết methanol và dịch chiết nước của Mã đề [30],[40] Plantamajoside là một

dẫn xuất của axit caffeic là thành phần chính trong Plantago major L và

một lượng nhỏ acteoside cũng được tìm thấy trong loài này [37] Theo báo cáo của các nhà khoa học Đan mạch, hợp chất plantamajoside được phát

hiện trong 2 loài Mã đề là P major ssp major và P major ssp

spleiosperma Nhưng hợp chất acteoside chỉ tìm thấy trong cây P major

ssp spleiosperma [33]

Hình 1.3: Dẫn xuất caffeic acid trong Plantago major

Plantamajoside là một hợp chất được chứng minh có hoạt tính sinh học Hợp chất này có khẳng năng chống viêm, chống oxy hóa, ức chế độ hoạt động của axit arachidonic gây bệnh phù tai ở chuột, ức chế hoạt động của 5-lipoxygenase và 15-lipoxygenase Ngoài ra, Platamajoside có khả năng bắt gốc tự do DPPH và kháng khuẩn mạnh [32],[35],[41],[52]

Acteoside cũng thể hiện khả năng bắt gốc tự do DPPH như hợp chất Plantamjoside, đồng thời nó cũng thể hiện tính chống oxy hóa và ức chế peroxid hóa lipid Hợp chất này thể hiện khả năng ức chế 15-lipoxygenase kém hiệu quả hơn so với Platamajoside (IC50 117 vs 96 M) Acteoside ức chế hoạt động của protein kinase C bằng các tương tác với enzyme Hợp chất này cũng thể hiện tính kháng khuẩn, ức chế miễn dịch và có tác dụng giảm đau Aceteoside có tác dụng hạ huyết áp tâm thu, tâm trương và huyết

áp động mạch trung với liều dùng 10mg/kg trên chuột [7], [8],[23],[25],[32],[41],[47],[50],[52],[58],[63]

Flavonoid

Theo nghiên cứu của Kawashty, một lượng lớn các flavonoid được phân lập từ Plantago major của Ai cập là luteolin 7-glucoside, hispidulin 7-glucuronide, luteolin 7-diglucoside, apigenin 7-glucoside  nepetin 7-glucoside, luteolin 6-hydroxy 4’-methoxy 7-galactoside [24] Năm 1999, Skari và các cộng sự đã phân lập được Plataginin và homoplantaginin cùng

với một số flavonoid khác lần đầu tiên được tìm thấy trong loài Plantago

major [51] Nhiều flavonoid có tác dụng chống oxy hóa được tìm thấy

trong các loai P major như baicalein, hispidulin và plantaginin; một số khác có tác dụng quét gốc tự do và ức chế quá trình preoxid hóa lipid [10],[44],[51],[59],[61] Cả baicalein và hispidulin đều có hoạt tính chống viêm Baicalein thể hiện khả năng ức chế hoạt động lên một số tác nhân như: carrageenan gây ra bệnh phù chân ở chuột, 12-lipoxygenase và LPS sản sinh axit nitric trong đại thực bào, trong khi herpidulin được chứng minh là chất ức chế của 5-lipoxygenase [26],[34],[60]

Baicalein có tác dụng bảo vệ gan chống lại các tổn thương do CCl4gây ra trên chuột Scutallarein và baicalein có tác dụng chống dị ứng, ngoài

ra chúng còn được chứng minh có khả năng chống lại virus HIV (IC50 2,5

và 5,6 M, tương ứng) Glucosides plantaginin, luteolin 7-glucoside và homoplantaginin cũng thể hiện khả năng ức chế virus HIV mạnh với IC50lần lượt là 9.8, 40.2 và 43.3 M, trong khi apigenin 7-glucoside lại không thể hiện tác dụng ức chế nào với dòng virus này [27],[29],[36]

Bảng 1.1: Các flavonoid tìm thấy trong loài Mã đề

Các glycoside iridoid

Aucubin là glycoside iridoid được tìm thấy nhiều nhất trong Plantago

major, hàm lượng của hợp chất này trong các bộ phận của cây và theo các

mùa có sự khác biệt Hàm lượng aucubin được xác định là cao nhất trong lá

khô thu hoạch vào tháng 6 với hàm lượng công bố là 1.3% [28] Plantago

major có hàm lượng aucubin ít hơn trong Plantago lanceloata Các

glycoside iridoid trong phân tử chứa 8 hoặc 9 liên kết đôi là Majoroside, 10-hydroxymajoroside và 10-acetoxymajoroside đã được phân lập từ thân, cành và lá của Mã đề [21],[54]

Aucubin được chứng minh có tác dụng chống viêm, nó có tác dụng ức

chế TPA (12-O-tetradecanoylphorbol acetate) gây phù nề trên chuột với

hiệu lức tối đa là 1 mg/tai Tác dụng này gần với tác dụng của indomethacin liều dùng 0.5 mg/tai [43] Aucubin gây ra các cơn co thắt trên tử cung chuột Đồng thời, khi tiến hành thí nghiệm gây độc cho tế bào gan trên chuột thì hợp chất này lại có tác dụng bảo vệ gan do α-amanitin gây ra, cơ chế này được cho là do tác dụng kích thích của aucubin đối với

sự ức chế α-amanitin trong quá trình tổng hợp RNA của gan Nó cũng thể hiện khả năng bảo vệ gan do CCl4 gây ra ở chuột và chống lại virut viêm

gan B Aglycon của aucubin là aucubigenin, có hoạt tính kháng khuẩn và nấm mốc [11],[12],[13],[15],[39]

Hình 1.4: Các glycoside iridoid trong loài Mã đề

Các terpenoid

Loliolid là một terpenoid được phân lập từ lá của Mã đề Các triterpenoid axit như oleanolic, axit ursolic, 18β-glycyrrhetinic và hợp chất sitosterol được tách chiết từ nhựa của lá Plantago major Axit ursonic ức chế hoạt động của enzyme cyclooxygenase 2 (IC50 130 M) và cyclooxygenase-1 (IC50 295 M) là hai enzyme xúc tác trong quá trinh sinh

tổng hợp prostaglandin in-vitro, trong khi đồng phân oleanolic acid lại ít

thể hiện tính hoạt động ức chế này 18β-glycyrrhetinic axit được báo cáo không thể hiện hoạt tính ức chế Khả năng chống viêm, giải phóng histamin

từ tế bào Mast, ức chế hoạt động của enzyme elastase cũng được chứng minh Axit ursolic và axit oleanolic cũng có tác dụng bảo vệ gan, ức chế sự phát triển khối u và có tác dụng chống tăng lipid máu

Các vitamin

Plantago major được sử dụng như một loại thực phẩm, đặc biệt là vào

mùa xuân Các vitamin trong Mã đề cũng được nghiên cứu Lá tươi của cây

Mã đề già đã ra hạt chứa 6 mg/100 g β-carotene là tiền chất của vitamin A

và 19 mg axit ascorbic/100 g [62] Khảo sát các vitamin trong cây Mã đề

non, kết quả cho thấy P.major non chứa 25mg axit ascorbic, 31 mg axit dehydroascorbic và 8.5 mg carotenoids / 100 g lá non Do đó, P major có

thể coi là một nguồn cung cấp vitamin C và carotenoid Ngoài ra, axit oxalic, nitrat và axit erucic cũng được phát hiện trong cây Mã đề với hàm lượng thấp (67 ± 36 mg / 100 g, 101 ± 18 mg / 100 g và 3,45%) cho thấy độc tính thấp của cây Cây Mã đề non thu hoạch vào tháng sáu chứa 37 mg/g phylloquinone (vitamin K1) Theo nghiên cứu, nếu thực vật chứa hàm lượng vitamin K cao có thể kháng được thuốc diệt cỏ 2, 4 dichlorophenoxyacetic acid Hàm lượng vitamin K trong P major so với các loài thực vật khác chỉ ở mức độ trung bình nên nó chỉ thể hiện khả năng kháng thuốc diệt cỏ ở mức độ trung bình [19],[42]

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ

THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện các mục tiêu nghiên cứu đề ra, chúng tôi đã dựa trên các phương pháp nghiên cứu như sau:

- Xây dựng quy trình chiết chọn lọc để điều chế các dịch chiết từ cây

- Phân lập và tinh chế các hoạt chất có thể có trong cây Mã đề

Mã đề tươi được TS Nguyễn Thị Kim Thanh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội xác định là

loài Plantago major L

Hình 2.1: Mẫu cây Mã đề tươi

Mã đề tươi được rửa sạch và phơi tới khô hoàn toàn trong bóng râm

để loại nước và các enzyme gây ảnh hưởng đến quá trình nghiên cứu

10 kg cây Mã đề khô, bao gồm cả thân và củ thu được sau quá trình phơi khô tự nhiên được nghiền nhỏ thành bột và bảo quản trong các túi nilon

2.2.2 Điều chế các cặn chiết

10 kg nguyên liệu khô được ngâm chiết với methanol, sau 5 ngày tiến hành lọc để thu lấy dịch chiết Thí nghiệm được lặp lại 3 lần Các dịch chiết được gộp lại, đem cất quay ở áp suất thấp để loại bỏ dung môi Sau thí nghiệm thu được 980 gram cặn chiết methanol ở dạng cao đặc (kí hiệu

là MP)

Hòa tan 980 gram cặn chiết MP với 500 ml nước nóng 500C, tiến hành chiết trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần: n-hexane

và ethyl acetate, nhằm thu được các lớp chất hữu cơ mong muốn trong mẫu thực vật Các dịch chiết này được làm khan bằng Na2SO4, cất loại dung môi, thu được các phần chiết tương ứng:n- hexane (HP) và ethyl acetate (EP)

Hiệu suất thu được của các phần chiết n-hexane (HP) và ethyl acetate (EP) so với khối lượng khô ban đầu tương ứng là 2.514% và 4.222%

Bảng 2.1: Hiệu suất các phần chiết mẫu Mã đề

STT Dịch chiết Ký hiệu Khối lượng (g) Hiệu suất chiết (%)

(tính theo khối lượng)

Phần chiết ethyl acetate (EP)

Dịch chiết methanol - nước

2.2.3 Khảo sát định tính thành phần hóa học trong mẫu cây Mã đề

Agilent-Kết quả khảo sát sắc ký khí khối phổ GC - MS của phần chiết ethyl acetate được trình bày trong mục kết quả và thảo luận

2.2.4 Phân tích phần chiết ethyl acetate bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

Triển khai sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn DC Alufolien 60F254 của Merck Qua khảo sát với nhiều hệ dung môi khác nhau và hiện màu với thuốc thử vanilin/H2SO4, nhận thấy với hệ dung môi n-hexane/ethyl acetate (9/1, v/v) cho sự phân giải khá tốt đối với cặn chiết ethyl acetate (EP)

Kết quả khảo sát sắc ký lớp mỏng TLC của phần chiết ethyl acetate được trình bày trong mục kết quả và thảo luận

2.2.5 Phân tách phần chiết ethyl acetate bằng sắc ký cột thường (CC)

Nhồi cột sắc ký: cân 400 gram silica gel cỡ hạt 15-40 m, nhồi vào cột

sắc kí bằng phương pháp nhồi ướt, sau đó nén chặt silica gel trong cột

Chuẩn bị mẫu: 100 gram chiết ethyl acetate (EP) được hòa tan trong

aceton, và được đưa trực tiếp lên cột