Nghiên cứu chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen ossweet liên quan tính kháng bạc lá vào giống lúa bắc thơm

Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của các dòng lúa tái sinh T0 làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về vai trò của các vị trí EBE trên OsSWEET13 liên quan tới tính mẫn cảm với

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

TRẦN THỊ THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC CHỈNH SỬA GEN

GIỐNG LÚA BẮC THƠM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2020

Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Huyền

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới GS.TS Phạm Xuân Hội và PGS.TS Đồng Huy Giới đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2020

Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Huyền

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

Trích yếu luận văn ix

Thesis abstract xi

Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

Phần 2 Tổng quan tài liệu 3

2.1 Giới thiệu chung về cây lúa 3

2.1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa 3

2.1.2 Giới thiệu chung về giống lúa Bắc Thơm 7 5

2.1.3 Bệnh hại lúa 5

2.2 Cải biến di truyền lúa thông qua công nghệ chỉnh sửa gen 12

2.2.1 Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen 12

2.2.2 Thành tựu cải biến di truyền bằng công nghệ chỉnh sửa gen ở lúa 14

2.3 Các phương pháp chuyển gen 15

2.3.1 Chuyển gen trực tiếp 15

2.3.2 Chuyển gen gián tiếp 17

2.4 Hệ vector sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen thực vật 18

2.4.1 Vectơ liên hợp (co-integrate vector) 19

2.4.2 Vectơ nhị phân (binary vector) 20

2.4.3 Quá trình chuyển T- DNA vào tế bào thực vật 21

2.4.4 Vector chỉnh sửa gen trong tế bào thực vật 21

2.5 Chuyển gen vào lúa nhờ vi khuẩn Agrobacterium 27

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 29

3.1 Vật liệu nghiên cứu 29

3.2.1 Hóa chất 29

3.2.2 Thiết bị 30

3.3 Phương pháp nghiên cứu 30

3.3.1 Biến nạp vector biểu hiện vào tế bào A tumefaciens 30

3.3.2 Phương pháp chuyển gen vào lúa 31

3.3.3 Phương pháp tách DNA tổng số của lúa 34

3.3.4 Xác định kiểu gen của cây chuyển gen bằng PCR 34

3.3.5 Đánh giá sinh trưởng và phát triển của các dòng lúa chuyển gen 37

Phần 4 Kết quả và thảo luận 38

4.1 Biến nạp vector vào tế bào A tumefaciens 38

4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến nuôi cấy in vitro và chuyển gen 39

4.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ Javen đến hiệu quả khử trùng hạt và khả năng nảy mầm của hạt 39

4.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng hình thành mô sẹo 41

4.2.3 Xác định nồng độ dịch khuẩn A tumefaciens thích hợp để chuyển gen 43

4.3 Tạo dòng lúa chỉnh sửa gen OsSWEET13 của giống lúa Bắc Thơm 7 46

4.3.1 Tạo mô sẹo và lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens vào mô sẹo lúa BT7 46

4.3.2 Hiệu quả chọn lọc mô sẹo 46

4.3.3 Hiệu quả tái sinh mô sẹo 48

4.3.4 Nuôi trồng cây trong điều kiện nhà lưới 50

4.4 Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của các dòng lúa tái sinh T0 51

4.4.1 Xác định sự có mặt của cấu trúc gen chuyển 51

4.4.2 Xác định số lượng bản sao trong cấu trúc gen chuyển 55

4.4.3 Giải trình tự đánh giá hiệu quả chỉnh sửa promoter OsSWEET13 được chỉnh sửa trong các dòng lúa chuyển gen 55

4.4.4 Đánh giá đặc điểm kiểu hình của các dòng lúa tái sinh T0 56

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 55

5.1 Kết luận 57

5.2 Kiến nghị 57

Công trình công bố 58

Tài liệu tham khảo 59

Phụ lục 64

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

các đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên)

T3SS Type III secretion system (hệ thống tiết loại III)

phiên mã)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Phân loại chi Oryza 4

Bảng 2.2 Ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas trên lúa gạo 15

Bảng 2.3 Một số hệ vector CRISPR/Cas9 dùng cho chuyển gen ở thực vật 22

Bảng 3.1 Mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra lúa Bắc Thơm 7 35

Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR 35

Bảng 3.3 Mồi dùng cho phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc A tumefaciens 36

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của nồng độ javen đến hiệu quả khử trùng hạt và khả năng nảy mầm của hạt 40

Bảng 4.2 Tỷ lệ tạo mô sẹo của hạt lúa Bắc Thơm 7 khi xử lý bằng 2,4-D ở các nồng độ khác nhau (%) 41

Bảng 4.3 Tỷ lệ lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens ở các nồng độ dịch vi khuẩn khác nhau (%) 45

Bảng 4.4 Kết quả tạo mô sẹo và lây nhiễm vi khuẩn A tumefaciens 46

Bảng 4.5 Kết quả chọn lọc mô sẹo từ phôi trưởng thành 47

Bảng 4.6 Kết quả tiền tái sinh và tái sinh của phôi trưởng thành 49

Bảng 4.7 Kết quả cây tái sinh gieo trồng trong nhà lưới 50

Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra với cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv và pCas9–Fw/pCas9– Rv 54

Bảng 4.9 Hiệu quả quá trình sàng lọc các cá thể mang gen chuyển 54

Bảng 4.10 Tổng hợp số liệu bản sao trong cây chuyển gen 55

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ phân bố bệnh bạc lá lúa trên thế giới 6

Hình 2.2 Triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa 7

Hình 2.3 Khuẩn lạc và hình dạng của Xanthomonas oryzae pv oryzae 8

Hình 2.4 Cơ chế sửa chữa đứt gãy DNA mạch kép 13

Hình 2.5 Cơ chế hoạt động của hệ thống CRIPRS-Cas9 14

Hình 2.6 Cơ chế cắt DNA của phức hệ protein CRISPR/Cas9 25

Hình 3.1 Chu trình nhiệt PCR 35

Hình 4.1 Ảnh điện di sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc 38

Hình 4.2 Hình ảnh mô sẹo trên môi trường MS khác nhau 42

Hình 4.3 Khả năng tạo mô sẹo của giống lúa Bắc thơm số 7 43

Hình 4.4 Hình ảnh lây nhiễm mô sẹo của giống lúa Bắc thơm số 7 44

Hình 4.5 Mô sẹo ở môi trường chọn lọc SI 47

Hình 4.6 Hình ảnh chọn lọc mô sẹo mang gen đích lần II (A) và lần III (B) 48

Hình 4.7 Mô sẹo ở môi trường tiền tái sinh 48

Hình 4.8 Mô sẹo trên môi trường tiền tái sinh và tái sinh 49

Hình 4.9 Cây non phát triển ở môi trường ra rễ 50

Hình 4.10 Cây non ngâm 1 tuần trong nước 51

Hình 4.11 Ảnh điện di DNA tổng số từ mô lá lúa chuyển gen 52

Hình 4.12 Nhân bản gen actin từ mẫu DNA tổng số cây lúa chuyển gen 52

Hình 4.13 PCR sử dụng cặp mồi cặp mồi Hyg–Fw/Hyg–Rv 53

Hình 4.14 PCR sử dụng cặp mồi pCas9–Fv/pCas9–Rv 53

Hình 4.15 Kết quả giải trình tự promoter OsSWEET13 55

Hình 4.16 Cây được trồng trong nhà lưới 56

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Trần Thị Thanh Huyền

Tên luận văn: “Nghiên cứu chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen OsSWEET liên quan tính

kháng bạc lá vào giống lúa Bắc Thơm”

Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của các dòng lúa tái sinh T0 làm tiền

đề cho các nghiên cứu sâu hơn về vai trò của các vị trí EBE trên OsSWEET13 liên quan tới tính mẫn cảm với vi khuẩn Xoo của giống lúa Bắc Thơm 7, từ đó hướng tới việc tạo

ra giống lúa mới có năng suất và chất lượng cao, đồng thời kháng bệnh bạc lá phổ rộng

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào khả biến;

Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli DH5α bằng kỹ thuật sốc nhiệt (heat shock);

Chuẩn bị tế bào khả biến;

Biến nạp plasmid vào E.coli DH5α;

Tách chiết DNA plasmid từ E.coli;

Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bằng kỹ thuật

sốc nhiệt (heat shock);

Phương pháp chuyển gen vào lúa;

Ảnh hưởng của nồng độ Javen đến hiệu quả khử trùng hạt và khả năng nảy mầm của hạt;

Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo;

Ảnh hưởng của nồng độ dịch khuẩn A tumefaciens đến tỷ lệ lây nhiễm vi khuẩn

A tumefaciens lên mô sẹo lúa Bắc Thơm 7;

Chọn lọc mô sẹo bằng kháng sinh;

Tái sinh cây hoàn chỉnh;

Phương pháp tách DNA tổng số của lúa;

Phương pháp PCR;

PCR kiểm tra sự có mặt cấu trúc biểu hiện gen chuyển;

PCR kiểm tra sự tồn tại Ti-plamid trong vi khuẩn A tumefaciens

Kết quả nghiên cứu và kết luận

Xây dựng được quy trình và chuyển thành công cấu trúc biểu hiện phức hệ

protein-RNA chỉnh sửa promoter OsSWEET13 vào giống lúa Bắc Thơm 7

Kiểm tra số lượng bản sao trong các cây chuyển gen có 34/72 cây mang 1 bản sao

và 38/72 cây mang nhiều hơn 1 bản sao

Trong số các dòng cây chuyển gen sống sót có 21/27 dòng (tương đương 77,78%)

có kiểu hình tương đương cây đối chứng

THESIS ABSTRACT

Master candidate: Tran Thi Thanh Huyen

Thesistitle: "Research on converting the structure of OsSWEET transgenic related to

Bacterial leaf blight disease resistance in Bac Thom rice variety"

To research the genotypic and phenotypic characteristics of regenerated T0 rice

lines as the premise for further studies on the role of EBE positions on OsSWEET13 related

in relation to Xoo susceptibility of Bac Thom 7 rice variety, therefrom towards the creation

of new rice varieties with high yield and quality, and resistance to broad spectrum Bacterial leaf blight disease

Materials and Methods

The method of transforming plasmids into variable cells;

Transforming plasmid into E coli DH5α cells by heat shock technique;

Prepare the variable cell;

Transform plasmid into E.coli DH5α;

Extraction of plasmid DNA from E.coli;

Transforming plasmid into cells of Agrobacterium tumefaciens bacteria by heat

shock technique;

Method of gene transfer into rice;

Effect of Javen concentration on seed sterilization efficiency and ability germination of the seed;

Effect of 2,4-D concentration on the ability to create callus;

Effect of A tumefaciens bacterium concentration on A tumefaciens infection rate

on Bac Thom 7 rice variety;

Selective callus with antibiotics;

Regenerate complete tree;

Method of extracting total DNA of rice;

PCR checks for the presence of transgenic expression structure;

PCR checks for Ti-plamid existence in A tumefaciens

Main findings and conclusions

The thesis has built process and converted successfully the expression structure

of the OsSWEET13 promoter protein-RNA complex into Bac Thom 7 rice variety

Examine the number of copies in transgenic plants with 34/72 plants carrying 1 copy and 38/72 plants carrying more than 1 copy

Among the transgenic lines that survived, 21/27 lines (equivalent to 77.78%) had phenotypes equivalent to that of the control plants

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra là

nguyên nhân gây thiệt hại trung bình 10 – 20% sản lượng lúa gạo trên toàn thế giới Bệnh cũng gây hại nghiêm trọng đối với sản xuất lúa ở Việt Nam, với thiệt hại hàng năm lên tới hàng chục nghìn hecta trồng lúa, đặc biệt là trên một số giống lúa chủ lực trong sản xuất như Bắc thơm 7, J02, TBR225

Những năm gần đây, Việt Nam đã tham gia vào thị trường lúa gạo quốc tế với sản lượng gạo xuất khẩu hàng năm đứng thứ 2 trong số các nước xuất khẩu gạo nhiều nhất thế giới ĐBSCL và ĐBSH là hai vựa lúa lớn nhất của cả nước, đã góp phần quan trọng trong thành quả chung đó Năng suất và sản lượng lúa của nước ta không ngừng tăng lên, theo Tổng cục thống kê: năm 1990 năng suất lúa đạt 31,8 tạ/ha; năm 1995: 36,9 tạ/ha; năm 2000: 42,4 tạ/ha; năm 2006: 48,9 tạ/ha Sản lượng lúa năm 1990 là 19,2 triệu tấn; năm 1995: 25,0 triệu tấn; năm 2000: 32,5 triệu tấn; năm 2006: 35,8 triệu tấn Sản lượng lúa cả năm 2010 ước tính đạt gần 40 triệu tấn, tăng 1,04 triệu tấn so với năm 2009, chủ yếu do diện tích gieo trồng ước tính đạt 7513,7 nghìn ha, tăng 76,5 nghìn ha so với năm trước và năng suất đạt 53,2 tạ/ha, tăng 0,8 tạ/ha (Tổng cục Thống kê, 2010) Trong năm 2019, Việt Nam xuất khẩu 6,37 triệu tấn gạo, tăng 4,1% so với năm 2018, đồng thời thu

về 2,81 tỷ USD Để có được kết quả trên, có đóng góp không nhỏ của Bắc Thơm

7 - giống lúa chủ lực ở các tỉnh thành ở Bắc Bộ, bởi ưu điểm là năng suất cao, gạo thành phẩm có chất lượng cao cùng mùi thơm nhẹ đặc trưng

Tuy nhiên trong điều kiện khí hậu của Việt Nam nóng ẩm quanh năm, các yếu tố như đất đai, cỏ dại, dịch bệnh và hạn hán diễn biến rất phức tạp Cây lúa dễ mắc các dịch bệnh do nấm và vi khuẩn gây ra như bệnh đạo ôn, khô vằn, đặc biệt

là bạc lá đã làm giảm chất lượng và năng suất của lúa từ 20 – 80% Việc sử dụng các chất độc hóa học trong bảo vệ thực vật đã ảnh hưởng không nhỏ đến sức khỏe của con người và các sinh vật khác

Cơ chế gây bệnh bạc lá của vi khuẩn Xoo đã được chứng minh là có liên

quan mật thiết với các protein TAL (transcription activator–like – tương tự yếu tố

hoạt hóa phiên mã) TAL là nhóm protein tiết loại III đặc trưng của vi khuẩn Xoo

có vai trò thúc đẩy quá trình Xoo gây bệnh cho cây chủ, trong đó có cây lúa Khả

năng kháng bệnh bạc lá của cây lúa có thể được tăng cường bằng cách chỉnh sửa

vị trí bám đặc hiệu của protein TAL trên promoter “gen mẫn cảm” (susceptibility

gene) trong hệ gen tế bào chủ, trong đó có OsSWEET13 – một gen thuộc họ gen

mã hóa protein vận chuyển đường OsSWEET (Streubel & cs., 2013) Một vài nghiên cứu đã tiến hành chỉnh sửa promoter của OsSWEET13 để tạo ra giống lúa

có khả năng kháng với một hoặc thậm chí nhiều chủng vi khuẩn Xoo Các nghiên

cứu này đã cho thấy tiềm năng to lớn của việc ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen,

đặc biệt là hệ thống CRISPR/Cas9 để can thiệp vào “gen mẫn cảm” OsSWEET13

trên các giống lúa chủ lực trong sản xuất nhằm tạo ra giống lúa năng suất cao kháng

vi khuẩn Xoo phổ rộng

Với mục tiêu cải thiện khả năng kháng bệnh bạc lá của giống lúa chủ lực Bắc thơm 7 bằng công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9, đồng thời làm phong phú dữ liệu ngân hàng gen các giống lúa Việt Nam, tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu chuyển cấu trúc chỉnh sửa gen OsSWEET liên quan tính kháng bạc lá vào giống lúa Bắc Thơm”

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Chuyển cấu trúc T-DNA chỉnh sửa promoter OsSWEET13 vào giống lúa

Bắc Thơm 7

Nghiên cứu đặc điểm kiểu gen và kiểu hình của các dòng lúa tái sinh T0 làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về vai trò của các vị trí EBE trên

OsSWEET13 liên quan tới tính mẫn cảm với vi khuẩn Xoo của giống lúa Bắc Thơm

7, từ đó hướng tới việc tạo ra giống lúa mới có năng suất và chất lượng cao, đồng thời kháng bệnh bạc lá phổ rộng

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY LÚA

2.1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa

Cây lúa thuộc họ Graminae (hòa thảo), chi Oryza, loài Oryza sativa L Chi Oryza có 23 loài trong đó có 2 loài lúa trồng là O sativa phổ biến ở Châu Á và O glaberrima phổ biến ở Tây Phi O sativa có 2n = 24 nhiễm sắc thể và được chia

thành 3 loài phụ là Indica, Japonica và Javanica (hay Japonica nhiệt đới) (Phạm Xuân Hội & Trần Duy Quý, 2002; Pascanle & cs., 1999; Shavindra & Amitabh,

2005; Shiping & cs., 1998)

Lúa Indica thường trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, có thân cao,

dễ đổ ngã, nhiều chồi, lá xanh nhạt cong và kháng được nhiều sâu bệnh hạt lúa dài và trung bình, có nhiều tinh bột Năng suất kém hơn lúa Japonica

Lúa Japonica thường được trồng ở những vùng ôn đới hoặc nơi có độ cao trên 1000m (so với mặt nước biển), có thân ngắn, chống đổ, lá xanh đậm, thẳng đứng, ít chồi, hạt lúa thường tròn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì hàm lượng tinh bột ít Lúa Japonica thường có năng suất cao hơn Indica

Lúa Japonica nhiệt đới được trồng phổ biến ở Indonesia, mang đặc điểm của 2 loại lúa Japonica và Indica Hình thức gần giống như lúa Japonica, có lá rộng với nhiều lông và ít chồi, thân cứng, chắc và ít cảm quang, hạt lúa thường có đuôi Danh sách các loài, số lượng nhiễm sắc thể, bộ gen của từng loài được ghi

ở Bảng 2.1 (Vaughan, 1994)

Bảng 2.1 Phân loại chi Oryza

I Nhóm O sativa

III NhómO ridleyi

Nghiên cứu bằng isozyme, người ta có thể phân biệt O sativa làm 6 nhóm

rõ ràng hơn: Nhóm I (Indica), II, III, IV, V, và VI (Japonica)

2.1.2 Giới thiệu chung về giống lúa Bắc Thơm 7

Bắc Thơm 7 (BT7) là giống lúa thuần Trung Quốc do xí nghiệp giống lúa Đông Triều (Quảng Ninh) nhập về năm 1992, canh tác chủ yếu ở các tỉnh thuộc

QĐ/BNN-KHCN ngày 21 tháng 4 năm 1998 Với các tính trạng có giá trị như hạt thóc thon dài, gạo trong, không bạc bụng, tỷ lệ gạo nguyên cao, cơm bóng, dẻo, mềm, đặc biệt là có hương thơm nên trong suốt hơn 20 năm qua với trên 40 vụ sản xuất, BT7 luôn đứng hàng đầu trong nhóm các giống lúa chất lượng và được ưa thích Bắc thơm 7 là giống lúa có thể gieo cấy được trong cả 2 vụ, thời gian sinh trưởng ngắn

Khi trưởng thành, cây có kích thước trung bình 90 - 95 cm Cây lúa đẻ nhánh khá, trỗ kéo dài Năng suất thu được ở mức cao, trung bình đạt ngưỡng 40 - 45 tạ/ha Nếu được chăm sóc đúng cách, cung cấp đầy đủ dinh dưỡng năng suất có thể chạm tới ngưỡng 50 tạ/ha Hạt thóc thu được có hình dạng thon nhỏ, màu vàng sẫm Hàm lượng amylose ở mức trung bình 13% nên cơm sẽ dẻo, không bị cứng khi khô lại kết hợp với mùi thơm nhẹ đặc trưng khiến giá gạo Bắc Thơm 7 thường có giá cao hơn 20% tới 40% so với các loại gạo tẻ thương khác (Nguyễn Đức Doanh, 1998) Tuy có nhiều điểm cộng về chất lượng nhưng Bắc Thơm 7 cũng có nhiều hạn chế khi xét sức chống chịu trước dịch bệnh Khả năng chống đổ cũng như chịu rét chỉ ở mức trung bình Bên cạnh đó, BT7 là giống nhiễm nhẹ đến vừa với rầy

cây lúa yếu, dễ đổ khiến năng suất có thể giảm 30-70% (Phan Hữu Tôn & cs., 2016) Chính vì vậy việc nghiên cứu giống lúa Bắc Thơm 7 có khả năng kháng bạc

lá lúa mà vẫn bảo tồn được các đặc tính tốt trở nên cấp thiết hơn bao giờ

2.1.3 Bệnh hại lúa

2.1.3.1 Bệnh bạc lá ở lúa

Bệnh bạc lá (bacterial leaf blight disease) là một trong những bệnh gây hại

nghiêm trọng nhất trên cây lúa, xuất hiện phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới (Hình 2.1) Bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở vùng Fukuoko, Kyushu, Nhật Bản từ năm 1884 Sau đó bệnh được báo cáo đã xuất hiện ở các nước Đông Nam Á từ đầu những năm 1950 như Việt Nam (1945), Ấn Độ (1951),

Trung Quốc (1957) và Philippines (1957)… Cho đến nay bệnh vẫn đang lan rộng

và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa của khu vực này Bệnh bạc lá lúa cũng xuất hiện ở một số nước châu Phi, châu Úc, Bắc Mỹ (Lousiana và Texas), Trung và Nam Mỹ; tuy nhiên tác hại của bệnh chỉ ảnh hưởng chủ yếu đối với kinh

tế nông nghiệp của châu Á (OEPP/EPPO, 2007) Những nghiên cứu về bệnh bạc

lá lúa bắt đầu từ năm 1901 và cho tới năm 1922 nguyên nhân gây bệnh mới được phát hiện là do vi khuẩn Năm 1990, tác nhân gây bệnh bạc lá ở lúa đã được xác

định là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra Bệnh bạc lá còn

có các tên gọi khác như bệnh BLB (bacterial leaf blight), bệnh kresek… (Swings

& cs., 1990)

Hình 2.1 Bản đồ phân bố bệnh bạc lá lúa trên thế giới

Nguồn: CABI/EPPO (2016)

Chú thích: Vị trí phân bố bệnh bạc lá lúa thể hiện bằng chấm màu đỏ

Bệnh bạc lá có thể xảy ra ở mọi giai đoạn sinh trưởng của cây lúa với ba triệu chứng điển hình là bạc lá, vàng lá và héo xanh (kresek) Vi khuẩn gây hại ở thời kỳ

mạ (cây non) gây ra các vệt nước (water–soaked streak) có màu xanh nhạt đến xanh xám ở đầu lá, mép lá với độ dài ngắn khác nhau Các tổn thương này kết hợp lại và trở thành màu trắng vàng với các cạnh lượn sóng Cuối cùng, lá bị héo, toàn bộ lá trở nên trắng bạc hoặc nâu xám (bạc lá) Đặc biệt, cây non sau thời kỳ mạ và trong thời kỳ đẻ nhánh thường biểu hiện triệu chứng “kresek”: lá cây bị héo, cuộn lại do mất nước nghiêm trọng, sau đó chuyển sang màu xám xanh; cuối cùng toàn bộ cây

con sẽ chết héo; những cây sống sót sẽ còi cọc và hơi vàng Ở giai đoạn trổ đòng ra hoa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ và điển hình hơn: vết bệnh từ mép lá, chóp lá lan dần vào trong phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân chính Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh có màu vàng lục, sau cùng khiến lá cây bị cháy khô Thông thường phần mô bệnh trên phiến lá có ranh giới khá rõ ràng và phân biệt với mô khỏe (Hình 2.2A) Trên các cây lúa bị nhiễm bệnh, vết bệnh (triệu chứng) có thể lan tới tận bẹ lá (Adhikari & Basnyat, 1999; Borkar & Yumlembam,

2016; Mew & cs., 1993; OEPP/EPPO, 2007)

Hình 2.2 Triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa

Chú thích: (A) Lá lúa bị nhiễm bệnh với phần mô lá bị khô vàng dọc theo gân lá và mép lá (B) Giọt dịch vi khuẩn rỉ ra trên vết tổn thương mới ở lá lúa bị nhiễm bệnh

Ở các vết tổn thương mới thường xuất hiện các giọt dịch chứa vi khuẩn rỉ ra trông giống như một giọt sương màu vàng đục ở chóp lá hoặc dọc theo rìa lá vào lúc sáng sớm (Hình 2.2B) Ở giai đoạn muộn, các triệu chứng bệnh có thể dễ bị nhầm lẫn với bệnh đốm sọc (bacterial leaf streak – BLS) Bệnh dễ dàng lây lan và phát triển mạnh ở nhiệt độ từ 28°C đến 34°C, ở nhiệt độ này cây rất dễ bị “kresek” (Adhikari & Basnyat, 1999; Borkar & Yumlembam, 2016; OEPP/EPPO, 2007) Vì thế, trong điều kiện khí hậu ấm nóng, các tỉnh phía Bắc thường xuất hiện bệnh từ cuối tháng 3 trở đi

và thường bị thiệt hại nặng trong vụ lúa mùa

Hình 2.3 Khuẩn lạc và hình dạng của Xanthomonas oryzae pv oryzae

Nguồn: Ming & cs (2019)

Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa là vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) (Hình 2.3) Vi khuẩn Xoo chủ yếu xâm nhập vào lúa thông qua các vết

thương cơ giới ở rễ và lá Sau đó sẽ dần dần lây lan vào hệ thống mạch dẫn rồi dẫn đến nhiễm trùng toàn thân cây lúa Ngoài ra vi khuẩn còn có thể xâm nhập qua lỗ thùy khổng ở mép lá, đầu mút lá dễ dàng gây tổn thươnng dọc theo gân lá Vi khuẩn có thể lây lan thông qua nước tưới, mưa và gió Tuy nhiên, thời gian tối đa

mà vi khuẩn có thể sống sót trong nước chỉ là khoảng 15 ngày Mầm bệnh Xoo có

thể tồn tại trong đất trung bình từ 30 tới 60 ngày đồng thời có thể tồn dư trong rơm

rạ, lúa chét, thậm chí hạt giống của các cây nhiễm bệnh Khi gặp điều kiện sinh trưởng thuận lợi, vi khuẩn sẽ được kích hoạt và phát triển Thời tiết ẩm ướt, nhiều

mưa là điều kiện lý tượng để vi khuẩn lây lân trên diện rộng (Wang & cs., 2013)

Đây cũng là một trong các lý do giải thích tại sao Đông Nam Á nói chung cũng như Việt Nam nói riêng luôn bị tàn phá nặng nề bởi bệnh bạc lá lúa

2.1.3.2 Ảnh hưởng của bệnh bạc lá tới sản xuất lúa gạo

Bệnh bạc lá trở thành đại dịch trên cây lúa vào những năm 1960, là thời kỳ các giống cao sản bắt đầu được đưa vào trong sản xuất Thiệt hại sản lượng lên tới 26% trên các giống lúa mẫn cảm với bệnh Bệnh bạc lá lúa gây thiệt hại nhiều nhất đối với sản xuất lúa gạo của các quốc gia châu Á, đặc biệt là các nước khu vực Đông Nam Á Năm 1954, Nhật Bản có diện tích nhiễm bệnh lên tới 90000 –

150000 ha trồng lúa, thiệt hại sản lượng hàng năm ước tính 22000 – 110000 tấn

Ở Ấn Độ, sản lượng lúa gạo sụt giảm do bệnh bạc lá có năm lên tới 60% Tương

tự, Philippine cũng bị sụt giảm sản lượng lúa gạo ước tính 22,5% trong những năm xảy ra bệnh dịch (Borkar & Yumlembam, 2016) Theo thống kê của tổ chức Nông

lương thực Thế giới (FAO), bệnh bạc lá lúa không những làm giảm năng suất mà còn làm giảm đáng kể chất lượng gạo Nguyên nhân là do bệnh làm tăng cường hô hấp, giảm cường độ quang hợp, kéo dài thời gian trổ dẫn đến tỉ lệ hạt lép cao, gạo đem xay dễ bị dập nát

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá được phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ Đến nay bệnh bạc lá đã lan rộng và gây hại ở tất cả các địa phương trồng lúa khắp

cả nước Trong các năm trở lại đây, tình trạng mất trắng xảy ra ngày càng phổ biến, tập trung nhiều ở các tỉnh phía Bắc và vùng đồng bằng sông Cửu Long Theo số liệu thống kê của Cục Bảo vệ Thực vật, diện tích lúa nhiễm bệnh bạc lá ở nước ta năm 2013 là 72343 ha; năm 2016, diện tích nhiễm là 149551 ha (tăng 129% so với năm 2015), nhiễm nặng trên 19045 ha (tăng gần 10 lần so với năm 2015), mất trắng 385 ha (tăng 25 lần so với năm 2015) Năm 2018, tính đến 13/9/2018, diện tích nhiễm bệnh bạc lá là 24542 ha, nhiễm nặng trên 2342 ha Trong đó, diện tích nhiễm tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Nam: 6246 ha (nhiễm nặng trên 637 ha), khu IV: 4883,8 ha (nhiễm nặng trên 1592 ha); ở khu vực Phía Bắc, diện tích nhiễm bệnh là 3412 ha (nhiễm nặng 113 ha)

2.1.3.3 Biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa

Để kiểm soát bệnh bạc lá ở lúa, bước đầu có thể hạn chế tác nhân gây bệnh

và ngăn chặn tác nhân gây bệnh phát triển trên cây chủ thông qua áp dụng một số biện pháp canh tác Các biện pháp canh tác thường được áp dụng là: sử dụng hạt giống sạch bệnh hoặc giống kháng để gieo cấy; xử lý cây con trong quá trình gieo cấy kết hợp xử lý cỏ dại; duy trì chế độ cấp thoát nước tốt trong ruộng; tránh dư thừa nitơ, bón cân đối NPK; xứ lý đất bằng vôi bột hoặc tro bếp… (Borkar & Yumlembam, 2016)

Bên cạnh đó, một số hóa chất cũng được sử dụng để kiểm soát bệnh bạc lá lúa ví dụ như: xử lý cây có biểu hiện bệnh bằng Sasa 20WP, Xanthomix 20WP, Bactocide 12 WP, Kasumin, Staner…; xử lý hạt giống hoặc phun bón lá bằng Streptocycline và Sulfate Đồng hoặc Agrimycin và Oxychloride Đồng để phòng trừ bệnh; xử lý nước bằng bột clo Tuy nhiên việc sử dụng các thuốc hóa học thường gây hại cho sức khỏe người sử dụng và có thể ảnh hưởng đến các loài sinh vật khác trong hệ sinh thái Mặt khác, các chủng vi khuẩn kháng thuốc dễ dàng xuất hiện Chính vì vậy, cho đến nay chưa có phương thức kiểm soát bằng hóa chất nào mang lại hiệu quả cao và lâu dài (Borkar & Yumlembam, 2016)

Kiểm soát sinh học cũng được cho là một giải pháp sinh thái có hiệu quả cho việc ngăn ngừa bệnh bạc lá lúa Một số biện pháp khống chế sinh học kết hợp với các biện pháp kể trên cũng được cho là giải pháp tốt để điều trị bệnh bạc lá lúa (Ji & cs., 2008)

Trong số các chiến lược kiểm soát bệnh bạc lá lúa, chọn tạo giống lúa kháng bệnh được cho là biện pháp chủ đạo và hiệu quả nhất Đồng thời vệc gieo trồng các giống kháng bệnh vừa có hiệu quả kinh tế vừa giảm ảnh hưởng đến môi trường

Do đó, việc chọn tạo ra các giống lúa kháng bệnh bạc lá được nhiều quốc gia chú

trọng nghiên cứu (Mew & cs., 1993; Ogawa & cs., 1991) Tuy nhiên các nhóm

quần thể vi khuẩn kháng lại gen kháng bệnh cũng phát triển khá nhanh, gây khó khăn cho công tác phòng chống dịch bệnh bạc lá lúa

2.1.3.4 Những hướng tiếp cận tạo giống lúa kháng bạc lá lúa

Để phòng ngừa bạc lá lúa, việc sử dụng các chất hóa học để giết chết hoặc

ức chế sự nhân lên của các tác nhân gây bệnh bằng cách ngăn chặn con đường trao đổi chất của vi khuẩn là phương pháp có chi phí thấp cũng như thông dụng nhất Tuy nhiên, phương pháp này cũng để lại những tác hại nặng nề với môi trường cùng nguy cơ lớn tạo ra quần thể vi khuẩn kháng thuốc Để khắc phục những hạn chế trên, công tác nghiên cứu tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá đã và đang được chú trọng nghiên cứu tại Việt Nam với hai hướng tiếp cận chính: (i) xác định các gen/QTL (quantitative trait locus) kháng tồn tại sẵn trong lúa, sử dụng chúng như nguồn vật liệu lai tạo giống kháng; (ii) nghiên cứu bản chất di truyền, đặc tính gây bệnh của các nguồn gây bệnh để xác định hướng lai tạo thích hợp

Đến nay, ít nhất 41 gen kháng (các gen kháng thường đưọc kí hiệu Xa/xa –

alen kháng trội/alen kháng lặn) đã được xác định trên các giống lúa sản xuất và giống lúa hoang dại, trong đó có 09 gen đã được phân lập và nghiên cứu chi tiết

bao gồm Xa1; Xa21; Xa5; xal3; xa25; xa41; Xal0; Xa23 và Xa27 (Romero & Gatica-Arias, 2019) Một số gen kháng vi khuẩn bạc lá lúa như Xa4, xa5, Xa7, xal3, Xa21 đã được dùng để tạo các dòng gần đẳng gen (near-isogenic lines, NIL)

được dùng trong công tác nghiên cứu đặc tính gây bệnh của các chùng vi khuẩn

bạc lá lúa (Sun & cs., 2016) Một trong các khó khăn trong việc nghiên cứu là

nhiều gen kháng bạc lá lúa có phổ kháng hẹp, biểu hiện không đồng nhất ở các khu

vực khác nhau trên thế giới chỉ kháng được một số chủng vi khuẩn Xoo nhất định

ở một vài khu vực phân bố nhất định (Mew & cs., 1992) Đơn cử là gen Xa4, dù

đã được chứng minh hiệu quả tại Philippines, Trung Quốc, Indonesia nhưng lại

mất tính kháng tại Việt Nam và Ấn Độ Những gen duy trì được tính kháng của mình tại các vùng khác nhau trên thế giới nên đã được sử dụng cho lai tạo tại Viêt

Nam: xa5, Xa7, Xa21 (Phan Hữu Tôn, 2016) Bên cạnh đó, việc tạo các dòng đa

gen kháng giúp mở rộng phổ kháng bệnh của lúa, hạn chế lai tạo nhiều gen kháng bệnh đơn lẻ gây phá vỡ sức đề kháng của lúa Một số thành tựu tiêu biểu như tạo

dòng mang 3 gen kháng: IRBB56 (Xa4+xa5+xal3), IRBB57 (Xa4+xa5+Xa2), IRBB59 (xa5+xal3+Xa21), IRBB61 (Xa4+xa5+Xa7),… 4 gen kháng IRBB (Xa4

(Xa4+xa5+Xa7+xa13+Xa21) (Mikami & cs., 2015) Từ nguồn gen là các gen

kháng có sẵn kết hợp với công tác nghiên cứu các đặc tính gây bệnh của quần thể

vi khuẩn tại địa phương giúp hướng lai tạo phù hợp nhất

Một hướng nghiên cứu khác là sử dụng một số dòng đa gen kháng đưa vào công tác chọn tạo giống kết hợp chỉ thị phân tử Dù đã có một số thành tựu nhất

định tại các quốc gia Ấn Độ (Streubel & cs., 2013), Trung Quốc (Rao & cs.,

2014)… nhưng hướng tiếp cận này cũng có nhiều hạn chế như thời gian lai tạo kéo dài, chọn lọc giống mới phải gần với giống bố mẹ cũng như phải bảo tồn các phẩm chất tốt vốn có từ trước Với những yêu cầu đề ra, công việc này đòi hỏi trình độ chuyên môn cao của các nhà nghiên cứu Ngoài ra, quần thể phải có sự phân ly lớn tạo tiền đề cho quá trình chọn tạo giống Đây cũng chính là hướng nghiên cứu chính hiện nay

2.1.3.5 Hướng nghiên cứu dựa trên protein TAL

Hệ thống tiết loại III T3SS (Type III secretion system) đã được chứng minh

là “công cụ” gây bệnh bạc lá lúa chính của vi khuẩn Xoo bới các chủng Xoo bị đột biến bất hoạt T3SS không thể gây bệnh kháng bạc lá lúa cho lúa (Jiang & cs.,

2020) T3SS giải phóng các protein (được gọi là các effector) vào tế bảo vật chủ Các effector này sẽ tương tác ức chế gây suy giảm chức năng với hệ miễn dịch của vật chủ Nhờ đó, góp phần kích thích sự tăng trưởng của vi khuẩn Trong số các

họ T3SS đã được xác định, có một họ được đặc biệt nghiên cứu là protein TAL (transcription activator-like) Protein TAL được vận chuyển vào nhân tế bào chủ, bám đặc hiệu vào vùng khởi động (promoter) để hoạt hóa biểu hiện của gen đích nhằm thu được lợi ích tối đa cho quá trình sinh trưởng của vi khuẩn Yếu tố điều hòa trên promoter của gen đích liên kết đặc hiệu với protein TAL được gọi là EBE

(effector-binding element) (Nino & cs., 2006) Lợi dụng mối quan hệ này, nhiều

loài thực vật tự tạo ra tính kháng tự nhiên thông qua phản ứng quá mẫn (Hypersensitive Responses) gây chết tế bào nếu chúng nhận biết được TAL effector trong tế bào Một số loài lại xuất hiện đột biến ở trình tự EBE khiến TAL effector không thể bám promoter, kết quả vi khuẩn sẽ không nhân lên và tiếp tục phát triển trong mô lá

Một nhóm gen trong họ OsSWEET đã được xác định là nhóm gen nhiễm

quan trọng đối với vi khuẩn Xoo thông qua protein TAL (Streubel & cs., 2013)

Đồng thời, nhóm nghiên cứu này cũng đã xác định một gen kháng mới xa41(t) có

tính kháng phổ rộng với cả vi khuẩn bạc lá lúa châu Á và châu Phi nhờ việc giải

trình tự vùng promoter của gen OsSWEET14 Tiếp nối những nghiên cứu về gen OsSWEET14, kĩ thuật TALEN được sử dụng chỉnh sửa promoter của gen này tạo

ra giống lúa có tính kháng nhóm vi khuẩn Xoo châu Á, nhóm nghiên cứu tại IRD (Pháp) cũng đã tạo thành công giống lúa kháng cả hai nhóm vi khuẩn Xoo Châu Á

và Châu Phi nhờ phương pháp nghiên cứu tương tự (Blanvillain–Baufumé & cs.,

2017) Chính vì vậy, việc gây đột biến thay thế nucleotide bám đặc hiệu trên vùng

biểu hiện khởi động gen của họ gen OsSWEET ở lúa bằng công nghệ chỉnh sửa

gen nói chung và CRIPRS/Cas9 nói riêng để tăng tính kháng bạc lá lúa là hướng nghiên cứu hoàn toàn khả thi

2.2 CẢI BIẾN DI TRUYỀN LÚA THÔNG QUA CÔNG NGHỆ CHỈNH SỬA GEN

2.2.1 Giới thiệu về công nghệ chỉnh sửa gen

Chỉnh sửa gen là công nghệ cho phép cải biến hệ gen sinh vật một cách có chủ đích, chính xác, và hiệu quả Bản chất phương pháp này là lợi dụng hệ thống chỉnh sửa DNA để tạo ra các thay đổi nhỏ trên trình tự của DNA đích nhờ việc sử dụng các enzyme nuclease tổng hợp nhằm tạo các đột biến đứt gây DNA sợi đôi (double-stranded breaks - DSB) ở những vị trí đã định trước (Romero & Gatica-Arias, 2019) Việc sửa chữa các đột biến này sẽ diễn ra theo 2 hướng khác nhau (Hình 2.4): (i) sửa chữa nối đầu mút không tương đồng (non- homologous end- joining-NHEJ) hoặc (ii) cơ chế sửa chữa tái tổ hợp tương đồng (homologous recombination - HR) NHEJ được xác định là cơ chế sửa chữa DSB phổ biến nhất trong các tế bảo thực vật

Hình 2.4 Cơ chế sửa chữa đứt gãy DNA mạch kép

Nguồn: Hiei & Komari (2008) Zinc-finger nuclease (ZFN) và transcription activator-like effector nuclease (TALEN) là hai loại protein được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu

chỉnh sửa gen trên nhiều đối tượng sinh vật khác nhau (Mikami & cs., 2015) Dù được

sử dụng rộng rãi, tuy nhiên 2 công nghệ này đều có những điểm hạn chế cố hữu như: chi phí bản quyền, độ đặc hiệu enzyme thấp, khả năng gây đột biến với gen ngoài gen mục tiêu cao với công nghệ ZFN; hay là đòi hỏi yêu cầu thiết kế phức tạp với mỗi đoạn DNA đích của TALEN Gần đây, có một công cụ đã giải quyết gần như triệt để các nhược điểm của 2 phương pháp trên với độ hiệu quả cao, chi phí thấp, và đơn giản

đó là công nghệ CRIPRS/Cas9 (Korotkova & cs., 2019)

Hệ thống CRIPRS/Cas9 nhận biết và cắt vật liệu di truyền thông qua ba bước: thu nhận, biểu hiện và can thiệp (Hình 2.5) DNA ngoại lai bị nhận biết thông qua các đoạn trình tự ngắn bảo thủ dài 2-5 nucleotide (trình tự PAM) Tiếp theo, CRISPR sẽ phiên mã một phân tử tiền crRNA Sau đó phân tử này tiếp tục được biến đổi thành crRNA hoàn chỉnh nhờ sự trợ giúp của các protein CAS và phân tử tracrRNA tracrRNA kết hợp với crRNA tạo thành phức hợp crRNA-tracrRNA dẫn đường cho protein Cas9 tới vị tri đặc hiệu trên DNA ngoại lai và thực hiện phản ứng cắt trình tự bổ sung với trình tự spacer đã nhận biết trước đó

(Li & cs., 2002; Samudra 1 & cs., 2016)

Hình 2.5 Cơ chế hoạt động của hệ thống CRIPRS-Cas9

Nguồn: Jinek & cs (2012)

2.2.2 Thành tựu cải biến di truyền bằng công nghệ chỉnh sửa gen ở lúa

Dù mới được ra đời cách đây vài năm, nhưng đã có rất nhiều các nghiên cứu liên quan đến việc ứng dụng công nghệ này Đặc biệt, việc cải biển di truyền lúa bằng CRIPRS/Cas9 đang ngày càng được chú trọng Tính từ 2013 đến tháng 8/2018, có 24 đối tượng cây trồng với hơn 193 gen đã được chỉnh sửa bằng công

nghệ CRISPR/Cas (Razzaq & cs., 2019) Các nghiên cứu chỉnh sửa gen trên lúa

gạo được chú trọng nghiên cứu với 109/193 các gen được chỉnh sửa là trên đối tượng này Đa số các gen được chỉnh sửa ở lúa đều hướng tới mục tiêu giúp cây cải thiện khả năng chống chịu (chống sâu hại, thuốc diệt cỏ, asen…) và tăng cường năng suất, chất lượng (Bảng 2.2)

Từ tháng 8/2013, sau khi công cụ CRISPR/Cas lần đầu tiền được ứng dụng

để chỉnh sửa hệ gen lúa, đã có rất nhiều các nghiên cứu theo hướng tiếp cận tương

tự được hiện với nhiều thành tựu đáng được ghi nhận (Srivastava, 1972) Nhờ việc

tác động lên gen EFR922 để tạo đột biến liên quan đến yếu tố đáp ứng phiên mã

ethylene, Wang & cs (2013) đã tạo được giống lúa tăng cường khả năng kháng vi

khuẩn M.Oryzae – tác nhân trực tiếp gây bệnh đạo ôn lên đến 66% vào năm 2016 (Streubel & cs., 2013) Cũng trong năm này, Duan & cs đã tạo thành công giống lúa chịu mặn thông qua việc gây đột biến lên gen OsRAV2 (Verdier & cs., 2012)

Ngoài ra còn có rất nhiều các nghiên cứu khác về việc cải biến di truyền lúa nhằm tăng cường khả năng kháng bệnh, chống chịu của lúa thông qua công cụ

CRISPR/Cas: gây đột biên gen OsANN3 giúp tăng cường khả năng chịu lạnh, hay

một loại các nghiên cứu tạo giống lúa kháng bạc lá lúa nhờ việc chỉnh sửa các gen

EPSPS, ACC, ALS… (Dong & cs., 2017; Shen & cs., 2017; Sun & cs., 2016)

Bảng 2.2 Ứng dụng công nghệ CRISPR/Cas trên lúa gạo

Cơ chế sửa chữa đột biến

Kháng vi khuẩn

gây bạc lá lúa

Kháng

thuốc diệt cỏ

ALS

nCas9 và dCas9

Nguồn: Romero & Gatica-Arias (2019)

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN

Kỹ thuật chuyển gen đã và đang trở thành nhân tố quan trọng trong chương trình chọn tạo giống cây trồng Có thể chia nguyên lý chuyển gen làm 2 cách: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp

2.3.1 Chuyển gen trực tiếp

2.3.1.1 Chuyển gen bằng xung điện

Sử dụng xung điện với thời gian ngắn trong một điện trường cực mạnh Khi đặt các tế bào trần (protoplast) trong điện trường, sự dẫn điện và tính thấm của màng nguyên sinh bị thay đổI, kéo theo sự mất ổn định tại chỗ và tạm thời của màng dẫn tới sự hình thành lỗ hổng trên màng tế bào Một loạt các lỗ hổng trên màng tế bào được hình thành tuỳ thuộc vào điện trường, làm cho DNA bên ngoài môi trường được truyền qua lỗ hổng vào tế bào

Môt số tế bào thực vật có thể tiếp thụ DNA nhờ xung điện mà không cần xử

lý trước như tế bào ngô, lúa và phôi non lúa mì Zang & cs (1988) đưa ra cây lúa chuyển gen từ tế bào trần sử dụng phương pháp xung điện Sau một năm, Shimamoto

& cs (1989) đưa ra cây lúa chuyển gen hữu thụ đầu tiên ở giống lúa japonica sử dụng phương pháp xung điện (Phạm Xuân Hội & Trần Duy Quý, 2002)

2.3.1.2 Chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection)

Người ta sử dụng kim vi tiêm và kính hiển vi để tiêm một lượng nhỏ DNA vào những tế bào nhất định, có thể là tế bào nguyên vẹn Phương pháp này có ưu điểm là DNA đưa vào tế bào một cách chính xác, thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được Phương pháp này cần có thiết bị có độ chính xác cao, thao tác khéo léo, kỹ thuật và kỹ năng của người thực hiện phải chính xác

2.3.1.3 Chuyển gen bằng vi tiêm qua ống phấn (pollen tube)

Khi hạt phấn rơi trên núm nhụy (quá trình thụ phấn) hạt phấn sẽ nẩy mầm

và hình thành ống phấn Lúc này tiêm gen mong muốn đi theo ống phấn mang giao

tử đực vào thụ tinh với giao tử cái sẽ hình thành hợp tử có mang gen chuyển vào Phương pháp này khá thành công, đặc biệt trên cây lúa và cây bông

2.3.1.4 Chuyển gen bằng súng bắn gen (Microprojectile bombardment biolistics)

Kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen được phát hiện bởi Christou & cs (1991) và kỹ thuật này đươc cải tiến bởi Cao & cs (1992); Li & cs (1993) (Nguyễn Thị Lan Hoa & cs., 2003) Ngay lập tức, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm chuyển gen lúa japonica Gần đây kỹ thuật chuyển gen bằng súng bắn gen cũng đã được áp dụng thành công với các giống lúa indica và nhiều giống japonica (Christou & cs., 1998; Datta & cs., 1999) Cheng & cs (1998) đã có những cải tiến rất có ý nghĩa trong việc chuyển nhiều gen vào lúa Japonica sử dụng súng bắn gen (Phạm Xuân Hội & Trần Duy Quý, 2002)

Đây là kỹ thuât tương đối hiện đại và có hiệu quả Khi sử dụng thiết bị (súng bắn gen) tạo được áp lực sẽ đẩy viên đạn được làm bằng kim loại trơ (vàng, tungsten, wolfram) đã bọc plasmid mang gen đã thiết kế, có kích thước vào khoảng 1μm, với vận tốc 130 m/s, xuyên qua các lớp tế bào biểu bì, đi vào tế bào bên trong và gen sẽ được biểu hiện ở đó khi hợp nhất với bộ gen của tế bào chủ

Hiệu quả chuyển gen vào lúa bằng phương pháp dùng súng bắn gen không những không phụ thuộc vào kiểu gen mà tần suất lại cao Ở một vài trường hợp, tần suất chuyển gen bằng phương pháp này ngang bằng với tần suất chuyển gen với cây hai lá mầm (Phạm Xuân Hội & Trần Duy Quý, 2002)

2.3.2 Chuyển gen gián tiếp

2.3.2.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus

Đối với việc chuyển gen vào thực vật thì virus thực vật cũng được coi như

là một vectơ Virus làm vectơ chuyển gen phải có các tiêu chuẩn sau:

 Bộ gen có cấu trúc DNA;

 Có độ thiệt hại thấp hoặc không hại;

 Phổ ký chủ rộng;

 Có khả năng tải;

 Có khả năng di chuyển qua các lỗ tế bào

Có hai loại virus đảm nhận được vai trò làm vectơ chuyển gen là:

* Cauliflower Mosaic Virus (CaMV): virus hại cây họ cải đặc biệt là suplơ DNA ngoại lai được đưa vào tế bào thực vật nhờ sự lây nhiễm lá bởi virus Các CaMV có thể nhân lên trong bào tương một cách độc lập, không gây trở ngại cho

tế bào vật chủ (Đái Duy Ban & Lữ Thị Cẩm Vân, 1994) Song vectơ CaMV có một số hạn chế:

 Phổ ký chủ không rộng (chỉ ở các cây họ cải);

 Lượng DNA ngoại lai gắn vào ít, chỉ khoảng 250 bp

* Genini virus:

 Có phổ ký chủ rộng: cây một lá mầm, hai lá mầm;

 Có nhược điểm lớn là hầu như không truyền được qua hạt Do đó muốn nhân các cây chuyển gen trong trường hợp này phải nhân vô tính

2.3.2.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

được xem là phương pháp có nhiều ưu điểm (nhất là đối với cây hai lá mầm) dựa

vào khả năng chuyển gen tự nhiên của loài vi khuẩn đất Agrobacterium

Chuyển gen ở thực vật là quá trình đưa vật liệu di truyền (DNA) ngoại lai vào trong hệ gen thực vật nhằm tạo ra một tính trạng nhất định mà trước đó thực vật không có Quá trình chuyển gen này được coi là thành công khi gen chuyển kết hợp ổn định với DNA hệ gen tế bào thực vật được chuyển nạp Tế bào này sau đó được tái sinh thành cây hoàn chỉnh với sự biểu hiện của gen chuyển và duy trì ổn định trong các thế hệ sau Vật liệu trong chuyển gen thực vật thường là phôi non,

phôi trưởng thành, mô sẹo (từ các nguồn gốc khác nhau), mô lá hay thân mầm…

Phương pháp chuyển gen vào thực vật có thể là gián tiếp (thông qua vi khuẩn A tumefaciens hoặc A rhizogenes) hay trực tiếp (bằng súng bắn gen, xung điện, PEG

– polyethylene glycol, vi tiêm, dung hợp tế bào trần…) Trong đó, chuyển gen gián

tiếp bằng vi khuẩn A tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất cho

đến nay

Trong tự nhiên, vi khuẩn đất A tumefaciens không tự sản xuất được một số

acid amin như octopin, nopaline Để tồn tại, vi khuẩn này xâm nhiễm vào nhiều loài thực vật (thông qua các vết tổn thương) để chuyển gen của nó vào hệ gen thực vật, nhờ thực vật sản xuất ra một số chất cần thiết cho vi khuẩn sử dụng Quá trình

chuyển gen của A tumefaciens diễn ra nhờ một loại plasmid đặc biệt gây nên tình

trạng khối u tại vị trí xâm nhiễm trên cơ thể thực vật, gọi là Ti–plasmid (tumor–inducing plasmid) Một phần của Ti–plasmid, gọi là T–DNA (transfer–DNA), có chứa các gen cần chuyển được truyền vào tế bào thực vật và chèn vào hệ gen trong nhân nhờ một hệ enzyme đặc trưng của vi khuẩn Nhờ đặc tính này mà Ti–plasmid

của A tumefaciens 24 đã được cải biến để sử dụng làm vector truyền các gen ngoại

lai vào nhiễm sắc thể thực vật Phương pháp này đạt hiệu quả cao đối với nhiều đối tượng thực vật hai lá mầm nhưng có nhược điểm là hiệu suất chuyển gen trên các đối tượng cây một lá mầm hay cây thân gỗ rất thấp (Tsaftaris & cs., 2000) Các cấu trúc DNA biểu hiện CRISPR/Cas9 cũng thường được đưa vào tế bào thực vật

nhờ A tumefaciens do nó có xu hướng chèn chỉ một hoặc một vài bản sao của gen

chuyển, đồng thời thao tác đơn giản và không đòi hỏi các máy móc (như súng bắn gen) đắt tiền (Ma & cs., 2016)

2.4 HỆ VECTOR SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN THỰC VẬT

Cấu trúc của vectơ chuyển gen vào thực vật là đặt các gen mong muốn vào môi trường di truyền và vi khuẩn thích hợp để chuyển gen mong muốn vào cây và hợp nhất với bộ gen của cây chủ Một vectơ chuyển gen cần chứa các thành phần sau:

 Gen khởi động (thường có nguồn gốc từ thực vật hoăc liên quan trực tiếp với thực vật như CaMV);

 Một đoạn gen kết thúc (như NOS-terminater);

 Đoạn chịu trách nhiệm cho quá trình tái bản như EColR1;

 Đoạn nhận biết enzym gới hạn (Multicloning Site);

 Các gen chỉ cho phép chọn lọc tế bào vi khuẩn và các mô tái sinh thực vật

Các vectơ chuyển gen ở vi khuẩn A.tumefaciens được tạo ra nhờ gắn trực

tiếp một gen quan tâm vào giữa hai bờ của T-DNA, là những đoạn cần thiết để định hướng cho quá trình chuyển gen (Uchimiya & cs., 2002)

Một cơ sở quan trọng giúp cho kỹ thuật này phát triển là nhờ cấu trúc 2 bờ phải và trái của Ti-plasmid, là yếu tố cần thiết cho quá trình xâm nhập của T-DNA vào tế bào chủ Điều này có nghĩa rằng nếu thay thế các gen nằm trên T-DNA bằng những gen mong muốn thì chúng cũng có thể chuyển vào tế bào thực vật Hơn nữa, khi những gen tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng trên T-DNA bị loại bỏ, tế bào được biến nạp sẽ không sinh sản quá nhanh và khối u không hình thành Tuy nhiên, những tế bào này có khả năng tái sinh và phát triển bình thường

Bên cạnh đó, dãy vật chất của Agrobacterium có phổ rất rộng, nó có khả năng

xâm nhập vào hầu hết các loại cây hai lá mầm Hơn nữa các gen trên T-DNA được di truyền theo quy luật Mendel và mỗi gen có promoter riêng nên các gen ngoại lai đưa vào có thể kết hợp và được biểu hiện (Nguyễn Đức Doanh, 1998)

Các hệ thống vectơ dựa trên Ti-plasmid đã được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu và phát triển theo cách riêng, hiện nay chúng vẫn đang được cải tiến nhằm mang lại hiệu quả tối ưu Tuy nhiên có thể chia chúng thành hai nhóm chính: Vectơ nhị phân (binary vector) và Vectơ liên hợp (co-integrate vector)

2.4.1 Vectơ liên hợp (co-integrate vector)

Vectơ hợp nhất hay còn được gọi là cis vectơ, được thiết kế dựa trên plasmid nhưng phần lớn vùng T-DNA bị loại bỏ (thường là vùng gen gây ung thư)

Ti-và thay thế Ti-vào đó là một đoạn DNA mới Vectơ này không có khả năng gây tạo khối u do không còn vùng gen quy định sinh tổng hợp auxin và cytokinin nhưng vẫn còn chức năng chuyển gen do còn giữ lại hai bờ cần thiết cho quá trình chuyển

Để đưa DNA ngoại lại vào giữa hai bờ của T-DNA cần sử dụng một vectơ trung gian Vectơ này có khả năng hoat động trong E.coli và có một vùng tương đồng với vùng nằm giữa hai bờ của T-DNA Nó được chuyển từ E.coli sang

Agrobacterium thông qua sự tiếp hợp Trong Agrobacterium các plasmid không

có điểm khởi đầu sao chép phù hợp sẽ bị đào thải Nếu giữa vectơ trung gian và

vectơ liên hợp xảy ra sự tái tổ hợp, chúng sẽ được giữ lại trong Agrobacterium và

bằng cách sử dụng các dấu chuẩn di truyền thích hợp như kháng sinh để xác định

tái tổ hợp (Nguyễn Đức Doanh, 1998)

2.4.2 Vectơ nhị phân (binary vector)

Điểm khác biệt của hai vectơ chuyển gen là hai vùng T-DNA và vùng gen vir tồn tại trên hai vùng plasmid khác nhau, sao chép một cách độc lập với nhau

Ưu điểm của vectơ này là không cần đến tái tổ hợp in vivo nên quá trình biến nạp

có hiệu quả hơn và nhanh hơn

* Hệ thống này gồm hai plasmid (Hirofumi Uchimiya & cs., 2002):

- Một plasmid có khả năng sao chép ở cả E.coli và Agrobacterum vì mang

điểm khởi đầu sao chép có dãy vật chủ phổ rộng Phần mang gen gây khối u đã bị loai bỏ và không chứa các gen vir Sau khi sản xuất trong E.coli, các vectơ này

được chuyển vào Agrobacterium thông qua quá trình tiếp hợp

- Một plasmid khác nằm trong Agrobacterum là Ti-plasmid bị loại bỏ

hoàn toàn vùng T-DNA và hai bờ ranh giới, chỉ giữ lại vùng vir cần thiết đóng vai trò như một plasmid trợ giúp cung cấp các sản phẩm gen vir cho quá trình chuyển gen từ tế bào vi khuẩn sang tế bào thực vật Một vài vectơ nhị phân

không bền vững trong Agrobacterium và để duy trì vi khuẩn phải được nuôi

trong điều kiện chọn lọc

Hệ thống vectơ được phát triển đầu tiên là pGV3850, môt loại vectơ liên hợp pGV3850 là 1 Ti-plasmid nopaline C58, vẫn mang các gen vir và vùng trình

tự hai bờ của T-DNA, nhưng phần lớn các gen nằm trên vùng T-DNA đã bị loại

bỏ và thay vào đó là trình tự của pBR322 Như vậy, các gen ta mong muốn khi bị

tách dòng trong pBR322 và được đưa vào Agrobacterium sẽ có thể hợp nhất với từng vùng T-DNA của pGV3850 (Hirofumi Uchimiya & cs., 2002)

Một hệ thống vectơ liên hợp khác là SEV (split-end vector) được thết kế dựa trên pTi B653 cũng hay được sử dụng (Nguyễn Đức Doanh, 1998)

Vectơ nhị phân như pBin 19 có nguồn gốc từ pRK252 có thể sao chép trong

cả E.coli và Agrobacterium Vectơ này mang hai gen kháng kanamicin, một gen

hoạt động trong vi khuẩn, gen kia biểu hiện trong tế bào thực vật Khi DNA ngoại lai được đưa vào vị trí nằm trong đoạn gen lac Z, gen lac Z không tổng hợp được B-galactosidase, nhờ đó phát hiện được dòng tái tổ hợp khi nuôi vi khuẩn trên môi trường có X-Gal và IPTG (Hirofumi Uchimiya & cs., 2002) Ngoài ra còn có

pBSG1, pBSG2, pVSG2 (Broglie & cs., 1991)

2.4.3 Quá trình chuyển T- DNA vào tế bào thực vật

Khi các tế bào thực vật bị thương, chúng sẽ tiết ra các hợp chất phenolic như acetosyringone, α-acetosyringone Các hợp chất phenolic là chất dẫn dụ hoá

học với vi khuẩn, kích thích vi khuẩn kết bám lên bề mặt tế bào thực vật Vi khuẩn

sẽ được gắn vào các vị trí đặc trưng trên bề mặt tế bào, quá trình này còn được sự trợ giúp của các gen vir nằm trên nhiễm sắc thể gọi là gen ChV (chrromosome virulence) (Nguyễn Đức Doanh, 1998)

Quá trình chuyển T-DNA là do các sản phẩm của gen vir quy định Đầu tiên, acetosyringone hoạt hoá gen vir A để tổng hợp nên protein vir A Protein vir A hoạt động như một chất thụ cảm hoá học, truyền tín hiệu cho protein vir G nhờ sự photphoryl hoá Protein vir G điều khiển quá trình dịch mã của các gen vir B, vir C, vir D, vir E pH môi trường có ảnh hưởng mạnh mẽ đến cảm ứng gen vir Sự cảm ứng

đó tối ưu ở pH 5,0 – 5,4 và không xảy ra ở pH ≥ 6,3 (Hirofumi Uchimiya & cs.,

2002) Các phân tử đường cũng tham gia hỗ trợ cho các phức hợp phenolic làm tăng cường biểu hiện của các gen vir (Nguyễn Đức Doanh, 1998)

Tiếp theo đó, T-DNA sợi đơn kể cả hai bờ ranh giới được hình thành nhờ

sự cắt giới hạn của endonuclease vir D2 tại vị trí thứ ba và thứ tư tính từ trái sang

ở bờ phải, đoạn T-DNA luôn được tách ra khỏi Ti-plasmid và chuyển từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Đoạn DNA còn lại trên Ti-plasmid sẽ làm khuôn để tổng hợp

Protein vir D2 còn có thêm chức năng nhận biết nhân của tế bào thực vật

Hệ gen vir B mã hoá cho 11 protein có tác dụng kết hợp với màng tế bào thực vật

và định vị tại đó để hình thành cầu nối vận chuyển phức hợp protein-T-DNA Như vậy, cấu trúc màng tế bào thực vật bị thay đổi trong suốt quá trình phức hợp protein-T-DNA đi qua (Nguyễn Đức Doanh, 1998)

Sau khi đã qua màng tế bào, T-DNA sẽ được chuyển đến nhân và kết hợp với DNA trong nhân của tế bào vật chủ ở những vị trí ngẫu nhiên và được biểu

hiện nhờ sự điều khiển của hệ gen vật chủ (Hirofumi Uchimiya & cs., 2002)

Ngoài ra, người ta còn xác định được rằng các gen nằm trên T-DNA di truyền qua các thế hệ tuân theo quy luật Menden và cho rằng quá trình chuyển T-DNA là sự cải biến của cơ chế tiếp hợp vi khuẩn (Nguyễn Đức Doanh, 1998)

2.4.4 Vector chỉnh sửa gen trong tế bào thực vật

2.4.4.1 Giới thiệu chung về hệ thống CRISPR/Cas9

Các vector CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen trong tế bào thực vật có bản chất

là Ti– plasmid nhân tạo mang đầy đủ các thành phần cơ bản và được thiết kế thêm

cấu trúc biểu hiện gen đích, bao gồm 2 phần: (1) cấu trúc biểu hiện sgRNA và (2) cấu trúc biểu hiện Cas9

Một sgRNA điển hình chứa 98 Nu (bao gồm chuỗi mục tiêu 20 Nu – crRNA) và hoạt động như một hướng dẫn trong phức hợp nuclease Cas9/sgRNA)

Sự biểu hiện của sgRNA ở thực vật, nói chung, thường được điều khiển bởi promoter U3 hoặc U6, và sgRNA được phiên mã bởi RNA polymerase III Do cấu trúc [U3/U6: sgRNA] có kích thước nhỏ (300 – 600 bp), nên có thể sử dụng phương pháp nối adapter vào trình tự đích (target–adaptor ligation) hoặc PCR để tạo ra các cấu trúc biểu hiện sgRNA mang chuỗi crRNA đặc trưng

Bảng 2.3 Một số hệ vector CRISPR/Cas9 dùng cho chuyển gen ở thực vật

sgRNA

Phương pháp chuyển gen/vật liệu

Oryza sativa

benthamiana

Solanum

tuberosum

Nguồn: Ma & cs (2016)

Hệ thống CRISPR/Cas được phát hiện từ cuối những năm 1980, trong cơ chế miễn dịch của vi khuẩn và vi khuẩn cổ Những nghiên cứu sau đó đã tìm thấy

CRISPR/Cas ở hầu hết các loài tảo (90%) và vi khuẩn (48%) (Rousseau & cs.,

2009) Sau khi giải mã được vai trò của hệ thống CRISPR/Cas đối với vi khuẩn và

vi khuẩn cổ, hệ thống này đã được cải biến để sử dụng như một công cụ chỉnh sửa

bộ gen

Các hệ thống CRISPR được xác định cho đến nay được được chia thành ba loại (I, II và III) dựa vào sự có mặt của các protein Cas3, Cas9 (hoặc Csn1) và Cas10 tương ứng Hệ thống CRISPR/Cas loại I được tìm thấy ở cả tảo và vi khuẩn; trong khi đó hệ thống CRISPR/Cas loại II (CRISPR/Cas9) chỉ có vi khuẩn; còn hệ thống loại III chủ yếu có ở tảo và một vài loài vi khuẩn Cả 3 hệ thống CRISPR/Cas đều chứa một locus CRISPR với protein Cas1 và Cas2, nhưng khác nhau ở domain liên kết crRNA (CRISPR RNA) và domain khởi động quá trình cắt Locus CRISPR mang thông tin về các nguồn bệnh (vật liệu di truyền ngoại lai) trong quá khứ; các gen Cas mã hóa các protein làm trung gian cho khả năng miễn dịch dựa trên CRISPR Các locus CRISPR bao gồm các chuỗi đối xứng gương (palindromic) dài khoảng 30 Nu tạo thành các chuỗi các trình tự, gọi là spacer, có nguồn gốc từ vật liệu di truyền ngoại lai Các locus CRISPR với các spacer và gen Cas là những thành phần cần thiết để hệ thống CRISPR/Cas có thể hoạt động làm trung gian miễn dịch chống lại các mầm bệnh Mặc dù gen Cas thường được liên kết với locus CRISPR, nhưng trong một số trường hợp chúng được tìm thấy ở nơi khác trong hệ gen Đích tác động của hệ thống CRISPR/Cas là DNA hoặc RNA của mầm bệnh xâm nhập vào tế bào Nhiều protein Cas có hoạt tính RNase và/hoặc DNase, có vai trò quan trọng trong hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas (Arora & Narula, 2017;

Ma & cs., 2016)

Trình tự mã hóa của gen Cas9 có độ dài 4107 bp Ở sinh vật nhân chuẩn, protein Cas9 đòi hỏi có hợp nhất đơn hoặc kép với tín hiệu định vị hạt nhân (nuclear localization signal – NLS) để có thể hoạt động hiệu quả Để tăng cường biểu hiện gen Cas9 ở thực vật, hầu hết các gen Cas9 được sửa đổi để tối ưu hóa với các mã bộ ba đặc trưng cho thực vật Nhìn chung, các promoter như Ubiquitin hay CaMV35S, có thể đáp ứng yêu cầu điều khiển gen Cas9 cả trong cây một lá mầm và hai lá mầm Trong nhiều trường hợp, promoter Ubiquitin được chứng minh

là tạo ra hiệu quả chỉnh sửa cao hơn so với promoter CaMV35S (Ma & cs., 2016)

2.4.4.2 Cơ chế hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9

Hệ thống CRISPR/Cas loại II là hệ thống hoạt động hiệu quả nhất và đơn giản nhất, chỉ chứa một nhóm gồm 4 protein (Cas1, Cas2, Cas9 và Cas4/Csn2) Cas9 (trước đây được gọi là Csn1) là một protein kích thước lớn sở hữu hai miền (domains) RuvC nuclease domain và HNH nuclease domain, có thể xử lý phân tử tiền crRNA tạo thành crRNA hoàn chỉnh và xúc tác phản ứng cắt sợi đôi DNA mục tiêu tại vị trí xác định Ngoài ra trong hệ thống này còn có sự có mặt của phân tử tracrRNA (trans– encoded CRISPR RNA) điều hướng cho phản ứng cắt DNA Tất cả các hệ thống CRISPR/Cas đều hoạt động qua ba bước cơ bản: thu nhận (adaptation), biểu hiện (expression) và can thiệp (interference) Quá trình thu nhận gồm 2 bước: (1) nhận biết DNA ngoại lai và (2) kết hợp trình tự DNA ngoại lai (spacer) vào locus CRISPR Thông thường, trình tự phía trước spacer (protospacer) chứa đoạn trình tự PAM – protospacer adjacent motif, là đoạn DNA ngắn bảo thủ dài 2 – 5 Nu, có vai trò là motif nhận biết trong quá trình thu nhận mảnh DNA ngoại lai Spacer sau khi được nhân bản thành 2 bản sao, 1 trong 2 bản sao sẽ được chèn vào phía đầu của chuỗi CRISPR Đột biến xuất hiện ở vị trí trình tự PAM có thể cản trở đáp ứng miễn dịch chống lại mầm bệnh Bước thứ hai trong chuỗi hoạt động của hệ thống CRISPR là biểu hiện: một phân tử tiền crRNA được phiên mã từ locus CRISPR biến đổi thành crRNA hoàn chỉnh nhờ sự trợ giúp của các protein Cas (Cas1, Cas2, Cas9 và Cas 4/Csn2) và phân tử tracrRNA Gần đây, tracrRNA đã được phát hiện có tham gia vào quá trình xử lý tiền crRNA ở Streptococcus pyogenes Phân tử tracrRNA bắt cặp với vùng lặp trên crRNA theo nguyên tắc bổ sung và tham gia vào quá trình biến đổi tiền crRNA thành crRNA hoàn chỉnh Phân tử crRNA hoàn chỉnh tham gia vào phức hệ CRISPR và giúp nhận biết vị trí đích đặc hiệu trên DNA ngoại lai Ở bước can thiệp, phân tử crRNA sẽ dẫn đường cho phức

hệ protein Cas tới vị trí đích đặc hiệu trên chuỗi DNA ngoại lai (Hình 2.6) Phản ứng cắt DNA sợi được xúc tác giúp tế bào chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh (Arora & Narula, 2017; Ma & cs., 2016)

Hình 2.6 Cơ chế cắt DNA của phức hệ protein CRISPR/Cas9

Nguồn: Ma & cs (2016)

Chú thích: DNA đích bị cắt tại vị trí mũi tên; Cas9 nuclease: enzyme Cas9 liên kết CRISPR; PAM: protospacer adjacent motif; crRNA: RNA CRISPR; tracrRNA: transencoded CRISPR RNA; sgRNA: single

guide RNA; RuvC và HNH: hai miền (domains) cắt của enzyme Cas9

Dựa trên hệ thống CRISPR loại II được mô tả trước đây, Douna & Charpentier (2012) đã phát triển một hệ thống hai thành phần đơn giản hóa bằng cách kết hợp tracrRNA và crRNA thành một RNA dẫn đường (single guide RNA – sgRNA) tổng hợp để phối hợp với enzyme Cas9 Nhìn chung, cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas9 về cơ bản là quá trình sgRNA điều tiết endonuclease Cas9 cắt đặc hiệu DNA sợi đôi, từ đó hoạt hóa hệ thống sửa chữa đứt gãy mạch đôi (double–strand break – DSB) của tế bào (Bortesi & Fischer, 2015) Kể từ đó, các nhà nghiên cứu đã có thể dễ dàng lập trình một bộ công cụ chỉnh sửa hệ gen mục tiêu bằng CRISPR/Cas9 Bắt đầu với việc lựa chọn trình tự đích có chuỗi PAM ở đầu 3’; sau khi xác nhận vị trí đích, các oligonucleotide đích (crRNA) được thiết kế để tiếp tục dung hợp với chuỗi tracrRNA để tạo thành sgRNA SgRNA được chèn vào một vector cùng với cấu trúc biểu hiện Cas9 (vector nhị phân) hoặc riêng lẻ dưới

sự điều khiển của các promoter phù hợp cho mỗi cấu trúc Các cấu trúc sau đó

được đưa vào tế bào bằng các phương pháp phù hợp Các hệ thống vector khác nhau được lựa chọn tùy thuộc vào đối tượng, mục đích và yêu cầu của nghiên cứu Hoạt tính phân giải đặc hiệu theo vị trí của phức hệ sgRNA/Cas9 được quyết định bởi đoạn trình tự dài khoảng 20 Nu (crRNA) trên phân tử sgRNA Việc thiết kế đoạn trình tự crRNA dài 20 Nu đơn giản hơn rất nhiều so với thiết kế phức hệ ZFN

và TALEN Do đó, người dùng có thể dễ dàng thay đổi mục tiêu của protein Cas

bằng cách thay đổi trình tự đích crRNA trong sgRNA (Arora & Narula, 2017; Ma

& cs., 2016)

2.4.4.3 Ưu và nhược điểm của hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9

CRISPR không phải là công cụ chỉnh sửa hệ gen đầu tiên, nhưng nó đơn giản nhất, nhanh nhất và rẻ nhất Đó là lý do tại sao kĩ thuật này đã vượt xa các kỹ thuật chỉnh sửa gen trước đó như ZFN và TALEN Cả ZFN và TALEN đều là các công cụ chỉnh sửa dựa trên protein và có thể lập trình được Nhưng đối với mỗi mục tiêu mới, một protein (một cặp nuclease) mới phải được thiết kế Việc này tốn nhiều thời gian, công sức và trong trường hợp ZFN là một quá trình tốn kém Hiệu quả hoạt động (on– target) hay tỷ lệ phần trăm đột biến mong muốn đạt được, là một trong những thông số quan trọng nhất để đánh giá một công cụ chỉnh sửa hệ gen Hiệu quả hoạt động của Cas9 cao hơn nhiều so với TALEN hoặc ZFN Ví dụ, trong các tế bào của con người, các ZFN và TALEN được thiết kế tùy chỉnh chỉ

có thể đạt được hiệu suất từ 1 – 50% Trong khi đó, hệ thống Cas9 đã được báo cáo là có hiệu suất lên tới > 70% ở cá ngựa vằn và thực vật, và dao động từ 2 – 5% trong các tế bào gốc đa năng cảm ứng Ngoài ra, Zhou và các đồng nghiệp đã cải tiến hiệu quả hoạt động của hệ thống CRISPR/Cas9 lên tới 78% trong phôi chuột một tế bào và sử dụng sgRNA kép để gây đột biến đồng thời nhiều vị trí mục tiêu khác nhau (Arora & Narula, 2017; Ma & cs., 2016)

Công nghệ CRISPR/Cas9 đã thay thế vị trí của công nghệ RNAi (RNA interference – can thiệp RNA) trong các nghiên cứu kiểm soát biểu hiện gen thông qua bất hoạt gen hiệu quả và chính xác Công nghệ này đã khắc phục những hạn chế của công nghệ RNAi, chẳng hạn như tính đặc hiệu và hiệu suất hoạt động thấp Hơn nữa, việc dễ dàng tạo ra các sgRNA khiến cho hệ thống CRISPR/Cas9 có thể dễ dàng thay đổi mục tiêu Nhờ đó, CRISPR/Cas9 trở thành một trong những hệ thống

chỉnh sửa gen có nhiều ứng dụng nhất (Ma & cs., 2016)

Những hạn chế chính của công nghệ CRISPR/Cas9 bao gồm tỷ lệ chỉnh sửa không hiệu quả của cả hai cơ chế HR và NHEJ Các thay đổi cũng rất ít xảy ra

đồng thời trên mỗi tế bào Sự xuất hiện của nhiều trình tự tương đồng với trình tự mục tiêu trong hệ gen tế bào chủ cũng là nguyên nhân làm cản trở hiệu quả sử dụng công nghệ này Một trong những nhược điểm chính của CRISPR/Cas9 là độ đặc hiệu của sgRNA SgRNA vẫn dẫn đường tới một trình tự tương đồng với trình

tự mục tiêu cho dù một vài nucleotide của crRNA không khớp với trình tự này Tuy nhiên, nhìn chung CRISPR/Cas9 vẫn được xem là công cụ chỉnh sửa hệ gen hiệu quả nhất và dễ sử dụng nhất ở thời điểm hiện tại (Arora & Narula, 2017; Ma

& cs., 2016)

2.5 CHUYỂN GEN VÀO LÚA NHỜ VI KHUẨN AGROBACTERIUM

Phương pháp chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium

không được xem là có hiệu quả với cây một lá mầm Ban đầu, những cố gắng trong

việc tái sinh mô sẹo lúa chuyển gen thông qua Agrobacterium không thành công

(Raineri & cs., 1990), ngay sau đó vấn để này được khắc phục với những mô sẹo lây

nhiễm với Agrobacterium được sinh ra từ mô rễ (Chan & cs., 1992) và phôi chưa

trưởng thành (Chan & cs., 1993) (Phạm Xuân Hội & Trần Duy Quý, 2002)

Gần đây, bước ngoặt trong nghiên cứu chuyển gen lúa thông qua

Agrobacterium được đánh dấu bởi công trình nghiên cứu của Smith & Hood

(1995); Komari & cs (1996); Hiei & cs (1997) Trong công trình nghiên cứu của Hiei & cs., tác giả đã thiết kế thành công vectơ đặc hiệu có tên gọi: Vectơ Super-binary Đặc điểm của vectơ này là đã được bổ sung gen vir Chính sự thay đổi này làm tăng hiệu quả chuyển gen vào lúa japonica Các mô sẹo từ vỏ phôi và dòng vi

khuẩn Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 là thích hợp nhất cho chuyển gen lúa thông qua Agrobacterium Ngoài ra việc sử dụng acetosyringone và điều kiện

nhân tố quan trọng trong việc nâng cao hiệu suất chuyển gen Các phân tích di truyền và phân tử trên số lượng lớn các cây chuyển gen ở thế hệ thứ 3 đã được chứng minh (Phạm Xuân Hội & Trần Duy Quý, 2002)

Bước ngoặt thứ hai trong nghiên cứu chuyển gen lúa thông qua

Agrobacterium được đánh dấu bởi công trình của Komari & cs (1996) Ở công

trình này, một plasmid đặc hiệu mang hai đoạn T-DNA riêng biệt một gen đánh dấu không chọn lọc (Gus), một mang gen đánh dấu chọn lọc (hpt) đã được tạo ra Các plasmid này đã được sử dụng cho việc tạo ra các thế hệ thực vật chuyển gen mang các gen đánh dấu tự do Hiệu suất chuyển của đoạn T-DNA là 47% chứng

tỏ sự ưu việt của loại vectơ đặc hiệu này Sự gắn và sự phân bố riêng biệt của các