[Kl-Hup] Tổng Hợp Và Thử Tác Dụng Ức Chế Indoleamin-2,3-Dioxygenase 1 Của Một Số Dẫn Chất Acetamid Mới Mang Khung 6-Amino-1H-Indazol.pdf

Bộ YTÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI• • • • vũ CẢM TÚ TỎNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG ức CHẾ INDOLE AMIN 2,3 DIOXYGENASE 1 CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT ACETAMID MỚI MANG KHUNG 6 AMINO 1H INDAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢ[.]

LỜI CẢM ƠN

Những dòng đầu tiên trong bài khóa luận tốt nghiệp của mình, tôi xin đuợc gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến những nguời đà luôn hỗ trợ, giúp đờ và động viên tôi trong suốt thời gian thục hiện nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành khóa luận của mình một cách tốt nhất

Trước hết, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến hai thầy cô hướng dẫn

tôi thực hiện đề tài này, đó là PGS.TS Trần Phương Thảo - Bộ môn Hóa dược -

Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô không chỉ hướng dẫn tận tình và tạo nhũng điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình nghiên cứu mà còn cho tôi những chỉ dẫn chính xác, kịp thời, những lời khuyên và động viên những lúc tôi gặp khó khăn nhất

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các giảng viên, nghiên cứu viên và các anh chị

kỹ thuật viên đang công tác tại Bộ môn Hóa dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Trường Đại học Tự nhiên Hà Nội đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này

Lời cuối, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè cùng các thành viên khác cũng đang thực hiện nghiên cứu tại Bộ môn Hóa dược, đặc biệt là TS Dương Tiến

Anh, anh Nguyễn Hữu Long, anh Dương Văn Hiếu, em Nguyễn Thị Huế, em Trương Cao Minh, em Lê Thiên Bảo Long đã đồng hành, giúp đỡ, chia sẻ nỗi buồn

vui và khích lệ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Hà Nội, ngày tháng năm

Sinh viên

Vũ Câm Tú

MỤC LỤC

LỜI CAM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VÊ

DANH MỤC CÁC sơ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỐNG QUAN 4

1.1 INDOLEAMIN-2,3-DIOXYGENASE VÀ BỆNH UNG THƯ 2

1.1.1 Khái niệm Indoleamin 2,3 dioxygenase 2

1.1.2 IDO 1 và sự dung nạp miễn dịch 3

1.1.3 Cơ chế của sự ức chế miễn dịch do IDO 1 4

1.2 CẤU TRÚC CỦA IDO1 VÀ CÁC CHẤT ức CHẾ IDO1 7

1.2.1 Cấu trúc của IDO1 7

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế 1DO1 8

1.2.3 Một số chất ức chế IDO1 đã được nghiên cứu 8

1.3 MỘT SỐ PHẢN ỬNG ĐƯỢC THựC HIỆN TRONG ĐỀ TÀI 11

1.3.1 Phản ứng amid hóa 11

1.3.2 Phản ứng khử nhóm nitro thơm 13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ, NỘI DƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 15

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất 15

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 16

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN cứu 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 17

2.3.1 Tổng họp hóa học 17

2.3.2 Thử tác dụng ức chế ID01 18

CHƯƠNG 3: THỤC NGHIỆM, KÉT QUÃ VÀ BÀN LUẬN 41

3.1 HÓA HỌC 21

3.1.1 Tổng họp hóa học 21

3.1.2 Kiềm tra độ tinh khiết 31

3.1.3 Xác định cấu trúc 32

3.2 THỬ TÁC DỤNG ức CHÉ IDO1 35

3.3 BÀN LUẬN 36

3.3.1 Các phản ứng tổng họp hóa học 36

3.3.2 Khắng định cấu trúc 40

3.3.3 Thử tác dụng ức chế IDO1 44

CHƯƠNG 4: KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 47

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẲT

: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

: 1-Methyl tryptophan: Acid acetic

: Aryl hydrocarbon receptor

: A-(benzo[d] [ 1,3]dioxol-5-yl)-2-((5-(p-tolyl)thiazolo[2,3-c] [ 3- yl)thio)acetamid

1,2,4]triazol-: Te bào trình diện kháng nguyên: Dicloromethan được deuteri hóa: Carbonyldiimidazol

: Vạch đôi trong phổ NMR (doublet): Tế bào đuôi gai

: Dicloromethan: Vạch chẻ đôi 2 lần trong phổ NMR (doublet of doublet): VA-Disopropylethylamin

: 4-Dimethylaminopyridin: VA-dimethylformamid: Dimethylsulfoxid được deuteri hóa: Ethyl acetat

: 1 -Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid: Natri ethylendiamintetraacetat

: Họp phần a của Yếu tố khởi phát dịch mã Eukaryotic Initiation Factor 2 (eIF2)

: General control nondipressible 2: Glucokinase 1

: Hydroxybenzotriazol: Indoleamin-2,3-dioxygenase

mTOR : Mechanistic target of rapamycin

NF-kB : Protein kiểm soát phiên mã (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer)

PD-1 : Program cell death 1

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 15

Bảng 2.2 Cách pha các dung dịch thử sinh học 19

Bảng 3.1 Chỉ số hóa lý và hiệu suất tổng hợp các chất Va-d 31

Bảng 3.2 Giá tri Rf và nhiệt độ nóng chảy (t°nc) của các dẫn chất Va-d 32

Bảng 3.3 Giá tri phổ MS của các chất mục tiêu Va-d 33

Bảng 3.4 Dữ liệu phổ IR của các chất Va-d 33

Bảng 3.5 Dữ liệu phổ cộng hưởng từ ‘H-NMR của các dẫn chất Va-d 34

Bảng 3.6 Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của các dẫn chất Va-dError! Bookmarl Bảng 3.7 Kết quả thử ức chế ĨDO1 của Va-d 36

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Con đường kynurenin 2

Hình 1.2 Sự dung nạp miễn dịch của tế bào ung thư 3

Hình 1.3 Ảnh hưởng của sự thiếu hụt trytophan đến sự dung nạp miễn dịch do IDO1 6

Hình 1.4 Co chế gây ra sự dung nạp miễn dịch của IDO1 7

Hình 1.5 Cấu trúc phức hợp IDO1-PI và lối vào kênh nhập xuất cơ chất 7

Hình 1.6 Mô hình cấu trúc các chất ức chế IDO1 8

Hình 1.7 Công thức một số chất ức chế IDO1 mang khung indol 9

Hình 1.8 Công thức một số chất ức chế IDO1 mang khung imidazol 9

Hình 1.9 Công thức một số chất ức chế IDO1 thuộc nhóm V-hydroxyamidin 10

Hình 1.10 Các chất ức chế IDO1 mang khung indazol 10

Hình 1.11 Các chất ức chế IDO1 mang khung 6-aminoindazol 11

Hình 3.1 Phổ TR của chất Va 41

Hình 3.2 Phổ MS của chất Va 42

Hình 3.3 Phổ ’H-NMR của chất Va 43

Hình 3.4 Phổ 13C-NMR của chất Va 44

DANH MỤC CÁC sơ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Quá trình tạo amid nhờ tác nhân acyl hóa 11

Sơ đồ 1.2 Cơ chế tạo acyl clorid từ acid carboxylic bằng SOC12 12

Sơ đồ 1.3 Phản ứng amid hóa one-pot với SOC12 có mặt TEA trong DCM 12

Sơ đồ 1.4 Cơ chế tạo acyl clorid với (COC1)2 có mặt DMF 13

Sơ đồ 1.5 Cơ chế khử hóa nhóm nitro thơm với kim loại trong môi trường acid 13

Sơ đồ 1.6 Cơ chế oxy hóa Sn(II) thành Sn(IV) tạo ion [HSnC14]' 14

Sơ đồ 1.7 Khử hóa các dẫn chất indazol bằng SnCl2 trong alcol 14

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung 22

Sơ đồ 3.2 Quy trình tổng họp chất II 21

So’ đồ 3.3 Quy trình tổng họp chất III 21

Sơ đồ 3.4 Quy trình tổng họp của các chất IVa-d 22

Sơ đồ 3.5 Quy trình tổng họp chất IVa 23

So’ đồ 3.6 Quy trình tổng hop chất IVb 24

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hop chất IVc 25

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng họp chất IVd 26

So’ đồ 3.9 Quy trình tổng họp của các chất Va-d 26

Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp chất Va 26

Sơ đồ 3.11 Quy trình tổng hợp chất Vb 28

So’ đồ 3.12 Quy trình tổng hợp chất Vc 29

Sơ đồ 3.13 Quy trình tổng hợp chất Vd 30

Sơ đồ 3.14 Cơ chế hình thành hai sản phẩm khi alkyl 6-nitro-lH-indazol 37

So’ đồ 3.15 Cơ chế thủy phân ester tạo acid 38

Sơ đồ 3.16 Cơ chế amid hóa tạo các dẫn chất IVa-d 39

ĐẶT VÁN ĐÈ

Bệnh ung thư hiện vẫn đang là một gánh nặng bởi số ca mắc lớn cùng tỉ lệ tử vong cao trên toàn thế giới Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), trong năm 2019, ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng thứ nhất hoặc thứ hai tại 112 trong số 183 quốc gia ở đối tượng dưới 70 tuổi [1] Chính vì vậy, dù vẫn còn nhiều thách thức, việc nghiên cứu các phương pháp điều trị ung thư vẫn đang là một trong những mục tiêu hàng đầu trong việc nghiên cứu và phát triển thuốc

Các tế bào ung thư biểu hiện nhiều kháng nguyên sinh miễn dịch nhưng sự thật là hầu hết chúng đều thoát khỏi hệ thống miễn dịch thông qua nhiều cơ chế [34,53] Những năm gần đây, liệu pháp miễn dịch được áp dụng trong điều trị ung thư bước đầu đã có thành quả nhất định và mở đường cho việc tìm ra các thuốc mới trong điều trị với cơ chế khác biệt hoàn toàn so với các thuốc hóa trị liệu thông thường [9,35,37]

Bên cạnh sự thành công của các thuốc ức chế các “chốt” kiểm soát miễn dịch, ngăn chặn hoạt động ức chế của tế bào T như program death receptor 1 (PD-1) và cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 (CTAL-4) [11,12], các chat phân tử nhỏ hướng ức chế enzym indoleamin-2,3-dioxygenase 1 (IDO1) đang nổi lên ở vị trí tiên phong, có vai trò hỗ trợ mạnh mẽ các liệu pháp khác như hóa trị và xạ trị [18]

Indazol là khung cấu trúc quan trọng với hoạt tính sinh học đa dạng, trong đó tác dụng chống ung thư của một số dẫn chất mang khung indazol đã được thử nghiệm và chứng minh [54] Các nghiên cứu gần đây cũng cho thấy sự kết hợp khung indazol vào cấu trúc các chất ức chế IDO1 cho kết quả hoạt tính ức chế IDO1 và cả hoạt tính kháng tế bào ung thư cao [36,39] Trên cơ sở đó, nhằm mục đích tìm kiếm và phát triển thêm các hợp chất có hoạt tính ức chế IDO1 và góp phần làm phong phú thêm vào ngân hàng các hoạt chất mang khung indazol, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài

“Tổng họp và thử tác dụng ức chế indoleamin-2,3-dioxygenase 1 của một số dẫn chất acetamid mói mang khung 6-amino-lH-indazol” với 2 mục tiêu chính, đó là:

1 Tồng hợp một số dẫn chất acetamid mới mang khung 6-amino-lH-indazol

2 Thử tác dụng ức chế IDO1 của các dẫn chất tổng hợp được

CHƯƠNG 1 TỐNG QUAN

1.1 INDOLEAMIN-2,3-DIOXYGENASE 1 VÀ BỆNH ƯNG THƯ

1.1.1 Khái niệm Indoỉeamỉn 2,3 dioxygenase

Indoleamin-2,3-dioxygenase (IDO) là một nhóm enzym nội bào chứa nhân hem, tham gia vào quá trình giáng hóa tryptophan (Trp) thông qua việc xúc tác cho phản ứng oxy hóa phân tách vòng pyrol của indol, là bước đầu tiên và giới hạn tốc độ của con đường kynurenin để sản xuất N- formyl-kynurenin Trong cơ thể, IDO1 có mặt ở nhiều các tế bào, cơ quan (đặc biệt là ở các cơ quan thuộc hệ bạch huyết ngoại vi) bao gồm: tế bào nội mô, tế bào trình diện kháng nguyên (APC), nguyên bào sợi, đại thực bào, tế bào đuôi gai (DC) và cả ở các tế bào ung thư [14,42] Ở người, enzym này được mã hóa bởi gen IDO nằm trên nhiễm sẳc thể số 8 [20]

Formic acid

N-formylkynurenine

Kynurenine formamidase

L-Kynurenine

Con đường Serotonin

Trên thực tế, ngoài IDO còn có thêm enzym khác cũng tham gia chuyển hóa Trp

là tryptophan-2,3-dioxygenase (TDO) Trong khi TDO được phân bố rộng rãi ở cả sinh vật nhân thực và vi khuẩn, IDO chỉ giới hạn ở động vật có vú và nấm men [55] Tuy nhiên, TDO chỉ chuyền hóa được L-tryptophan và tồn tại chủ yếu trong tế bào gan

ở cơ thể người với vai trò dị hóa tryptophan dư thừa trong chế độ ăn, còn ĨDO lại thường được tìm thấy ở nhiều mô khác nhau và hoạt động trên nhiều cơ chất tryptophan bao gồm D-tryptophan, L-tryptophan, 5-hydroxy-tryptophan, tryptamin, serotonin [31]

IDO cũng có 2 loại là IDO1 và IDO2 Biểu hiện IDO2 cũng được tìm thấy ở DC của người nhưng không phổ biến như IDO1 và hoạt tính chỉ từ 3-5% so với IDO1 [4] Vai trò sinh lý của IDO2 vẫn chưa được làm rõ và cũng rất ít kết quả cho thấy mối liên quan giữa IDO2 và khối u Chính điều này các nghiên cứu tập trung sâu hơn về vai trò

và tầm quan trọng của 1DO1 đến sự hình thành, phát triển khối u, cách các tế bào ung thư có được sự dung nạp miễn dịch cũng như khai phá thêm những khía cạnh chưa được làm sáng tỏ của enzym này

Biêu hiện của IDO được điêu hòa bởi tín hiệu của phức hợp miên dịch trong các

tế bào có nguồn gốc từ dòng tủy (MDSC) khác nhau bao gồm các DC và đại thực bào cũng như tế bào nội mô, trung mô tế bào mô đệm và nguyên bào sợi [38] Có thể kể đến như các các cytokin viêm interferon tuýp II (IFN-ỵ), các lipopolysaccharid (LPS) cũng như yếu tố hoại tử khối u-a (TNFa) Điều này giải thích tại sao biểu hiện IDO tăng lên trong các bệnh viêm nhiễm hoặc đặc biệt trong quá trình hình thành khối u [25] Nghiên cứu chỉ ra rằng, có sự chênh lệch giữa biểu hiện của IDO1 ở các mô ung thư và các mô khỏe mạnh, cụ thể IDO1 được biểu hiện quá mức ớ 50% các khối u Sự biếu hiện này cũng khác nhau giữa các loại ung thư, ví dụ, sự biếu hiện của IDO1 trong ung thư cổ tử cung nhiều hơn rất nhiều so với cổ tử cung bình thường và so với các loại ung thư khác [4J Gần đây, tỉ lệ kynurenin/tryptophan được coi như một dấu hiệu dự đoán tiên lượng và tiến triến của bệnh ung thư [14, 27]

1.1.2 IDO1 và sự dung nạp miên dịch

Sự phát triên bệnh ung thư

Thoát khỏi hệ miễn dịch là một cửa ngõ quan trọng đối với các bệnh lý ác tính Một điều rõ ràng là các tế bào ung thư biểu hiện nhiều kháng nguyên khác với tế bào bình thường nhưng cuối cùng lại có thể lẩn trốn khởi hệ thống miễn dịch, tiếp tục phát

Sự phát sinh ung thư bắt đầu từ việc hình thành các tế bào bị đột biến Hệ miễn dịch trong giai đoạn đầu có khả năng loại bỏ hoàn toàn các tế bào bị đột biến trên và ngăn chặn được nguy cơ gây ung thư [14] Tuy nhiên, sự bất ổn định về di truyền của

tế bào ung thư đã tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển các chiến lược trốn tránh hoặc ức chế miễn dịch, thậm chí có thể giúp chuyển môi trường vi mô khối u từ ức chế sang hồ trợ cho chúng Một trạng thái cân bằng miễn dịch có thể đạt được khi số lượng

tế bào bị tiêu diệt bằng với số lượng tế bào sinh ra Tế bào ung thư vẫn bị kiểm soát nhưng việc lặp lại nhiều hơn nữa các cơ chế trốn tránh và đánh bại các yếu tố khác nhau của hệ thống miễn dịch, cuối cùng giúp tế bào khối u đạt được khả năng thoát khởi miễn dịch hay còn gọi là dung nạp miễn dịch, tiến đến xâm lấn, di căn [16] ĨDO1 được biểu hiện rõ ở giai đoạn này, chủ yếu được sinh ra từ các tế bào ung thư và các tế bào miễn dịch khác (ví dụ như tế bào DC, tế bào MDSC, đại thực bào liên quan đến khối u (TAM)) [42]

Có nhiều cơ chế đã được đưa ra và thấy rằng, sự biểu hiện quá mức IDO1 góp phần tạo ra dung nạp miễn dịch cho các tế bào ung thư

Việc phát hiện ra enzyme IDO1 ban đầu bắt nguồn từ các quan sát được thực hiện vào những năm 1950 ớ những bệnh nhân ung thư, nơi quá trình dị hóa tryptophan được phát hiện tăng cao [5] Ban đầu, IDO1 được cho là có tác dụng chổng ung thư do làm cạn kiệt tryptophan trong các tế bào ung thư và ức chế sự phát triển của chúng [14] Đen năm 1998, một bước đột phá quan trọng xuất hiện khi Munn, Mellor và các đồng nghiệp chứng minh rằng các tế bào nhau thai biểu hiện IDO1 ngăn chặn sự phá hủy bởi tế bào T của mẹ đối với thai nhi trong thời kỳ mang thai [23,29] Từ đó gợi ý rằng IDO 1 có liên quan đến quá trình gọi là ức chế miễn dịch và là một trong số các yếu tố gây ra ung thư

1.1.3 Cơ chế của sự ức chế miễn dịch do IDO1

Cơ chế giải thích cho sự ức chế miễn dịch, IDO1 bằng cách dị hóa acid amin thiết yếu tryptophan tạo ra và tích tụ các sản phẩm kynurenin cùng các sản phẩm phản ứng khác có thể điều chỉnh khả năng miễn dịch, bao gồm ngàn chặn chức năng hoạt động của các tế bào T [30, 11,45], tế bào diệt tự nhiên (NK) [7], và cũng rất quan trọng đối với việc sản xuất và chức năng của tế bào T điều hòa (Treg) [24], biệt hóa các

tế bào DC thành các tế bào hỗ trợ dung nạp miễn dịch và hoạt hóa các tế bào MDSC [14]

- Với tế bào T, IDO1 làm cạn kiệt tryptophan dẫn đến ức chế tăng trưởng các tế bào này, bắt giữ tế bào ở pha GI đồng thời gây ra apoptosis [43] Bên cạnh đó, các tế bào T CD4+ chưa trưởng thành được biệt hóa thành các tế bào Treg [28, 48] Trên thực

máu của bệnh nhân ung thu có tiên lượng xấu [41].

- Với tế bào NK, các nghiên cứu trước đó đà chỉ ra rằng L-kynurenin có khả năng

ức chế tăng trưởng của tế bào NK in vitro thông qua ức chế sản sinh IL-2 [21,41]

- Tế bào MDSC cũng được hoạt hóa Nhiều bằng chứng cho thấy IDO gây tích lũy các tế bào MDSC và từ đó gây ra dung nạp miễn dịch [14, 26,41]

1.1.3.1 Sự thiếu hụt trytophan

Cơ thể động vật không tự tổng hợp được tryptophan mà phụ thuộc toàn bộ vào thực phẩm và 99% lượng tryptophan được chuyển hóa qua IDO và TDO để tạo thành các sản phấm thoái hóa kynurenin [21] Sự biểu hiện quá mức của IDO gây ra cạn kiệt tryptophan

Ban đầu, sự “đói” tryptophan chỉ được biết đến là sự thiếu đi acid amin thiết yếu, ảnh hưởng đến sự trao đổi chất, ngăn chặn sự phát triển, chức năng của DC, tế bào T

và các tế bào khác trong hệ thống miễn dịch Sau này các nghiên cứu cho thấy rằng, khi nồng độ tryptophan nhỏ hơn 1 pM dẫn đến sự tích tụ các tARN tự do trong tế bào, kích hoạt kinase cảm nhận sự thiếu hụt axit amin liên kết trực tiếp với tARN không tích điện (GCN2) [30, 12] Con đường GCN2 làm thay đổi quá trình phosphoryl hóa tiểu đơn vị a của yếu tố khởi đầu dịch mã eIF2 ở ribosom serin 51 (eIF2 a P), ức chế tổng hợp protein ở các tế bào miễn dịch làm ngừng tăng trưởng tế bào [43,40] Sự suy giảm tryptophan gây ra con đường GCN2, điều hòa chuỗi £ CD3 trong tế bào T CD8 + và ức chế sự biệt hóa tế bào Th 17 [30]

EIF2 ««

IDO

GCN2

Trp-tARN không tích điện

DỊ hóa Tryptophan

GDP

Dịch mã rồng hợp protein

LAP-1 LAP-2

IL-6

IL-IO

TGF-B

Các tác động bổ sung của con đường tín hiệu dị hóa tryptophan này còn có sự kích hoạt LIP, một dạng đồng dạng của yếu tố phiên mã điều hòa miễn dịch Bằng cách can thiệp vào điều hòa gen, cảm ứng LIP do kích hoạt con đường GCN2-eIF2a

có thể thúc đẩy chức năng Treg và ức chế miễn dịch, ví dụ bằng cách thay đổi biếu hiện của các cytokine quan trọng nhu IL-6, IL-10 hoặc TGF-p [26].

Sự thiếu hụt amino acid tryptophan cũng ức chế con đường mTOR trong các tế bào T, là con đường chủ đạo điều hòa sự tổng hợp protein, phát triển và sống sót của tế bào, làm kích hoạt quá trình autophagy, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành

và phát triển của tế bào ung thư [4]

1.1.3.2 Sự tích lũy các chất chuyển hóa kynurenin

Các công trình gần đây đã cung cấp bằng chứng xác thực về vai trò quan trọng của các chất chuyển hóa kynurenin đóng vai trò như một chất “độc”, làm ức chế chức năng miễn dịch qua trung gian IDO [51] Bằng chứng in vitro và in vivo trực tiếp cho thấy chất dị hóa tryptophan có thể ngăn chặn kích hoạt và ức chế sự tăng sinh tế bào T

và NK, gây ra quá trình apoptosis của các tế bào T và các tế bào trợ giúp T biệt hóa ở giai đoạn cuối, thúc đẩy quá trình biệt hóa tế bào CD4 thành Treg (thông qua co chế phụ thuộc TGFb), có tác dụng gây độc tế bào trên tế bào CD3 [11, 22]

Các phát hiện cũng cho thấy các chất chuyển hóa kynurenin hoạt động như một phối tử cho thụ thể hydrocacbon aryl (AhR), một yếu tố phiên mã góp phần vào các chương trình tiền viêm và phản ứng xenobiotic có liên quan nhiều đến ung thư và viêm sinh ung thư Tín hiệu từ AhR sẽ khởi động quá trình tổng hợp tạo protein FOXP3 tạo

ra các tế bào FOXP3+ Treg [27, 28, 48] Tuy vậy, trong năm 2010, nghiên cứu của Nguyen và cộng sự lại cho thấy các chất chuyển hóa kynurenin chỉ ức chế quá trình biệt hóa tế bào T chưa trưởng thành thành tế bào FOXP3+ T điều hòa [32] Tóm lại, kynurenin và AhR không hoàn toàn dẫn đến sự biệt hóa tạo các tế bào T điều hòa ở các bệnh nhân ung thư

Tế bào nội mõ

1.2 CẤU TRÚC CỦA IDO1 VÀ CÁC CHẤT ức CHÉ IDO1

1.2.1 Cấu trúc của IDO1

Ke từ khi phát hiện ra vai trò IDO1 trong kháng miễn dịch ở khối u, việc tìm kiếm các chất ức chế đà được theo đuổi ráo riết cả trong giới học thuật và các công ty dược phẩm, được hỗ trợ bởi việc xuất bản cấu trúc tinh thể đầu tiên của IDO1 trong phức họp với 4-phenylimidazol (4PI) năm 2006 do Sugimoto và các cộng sự [44] Đến nay, hơn 50 cấu trúc thử nghiệm của 1DO1 phức họp với các phối tử khác nhau có sẵn trong Ngân hàng Dữ liệu Protein

Tryptophan

Cấu trúc IDO là chuỗi bao gồm 403 acid amin với cấu trúc bậc 3 gấp thành hai vùng riêng biệt: vùng nhỏ là hợp phần N-terminal và vùng lớn là họp phần C-terminal

Vùng lớn bao gồm 13 chuỗi xoắn a và 2 chuỗi xoắn 310, thường được tập trung nghiên cứu do có chứa nhân hem, trung tâm hoạt động của enzym Trong đó, trung tâm hoạt động được tạo thành chủ yếu bởi 4 chuỗi xoắn G, I, Q và s chạy song song với mặt phăng nhân hem và 2 “pocket” kỵ nước làm mở rộng thêm thể tích trung tâm hoạt động: pocket A nằm phía trên vị trí phối trí thứ sáu của nhân hem; pocket B nằm

ở lối vào của kênh dẫn nhập xuất Trp và sản phẩm chuyển hóa Đặc biệt, Arg231, Phe226, Phe227 có vai trò cơ bản cho hoạt động của IDO1

Vùng nhỏ của protein bao phủ phía trên 2 “pocket”, tạo bởi 6 chuỗi xoắn a, 2 chuỗi p và 3 chuỗi xoắn 310 Ngoài ra, chuỗi xoắn K-L và N cũng tương tác với nhân hem và đồng thời kết nối 2 vùng của protein [44] Vùng nhở của IDO1 gần như chỉ có vai trò về cấu trúc chứ không có vai trò về chức năng xúc tác chuyến hóa Trp của IDO1 [19]

1.2.2 Cấu trúc của các chất ức chế IDO1

Dựa trên nghiên cứu docking giữa IDO 1 và các chất ức chế khác nhau, Rõhrig đã đua ra mô hình cấu trúc lý tưởng của các chất ức chế IDOÍ cần có các đặc điểm sau [40, 42]:

- Một nhân thơm với ít nhất 2 vòng đề chiếm vào vị trí “pocket” A

- Một nguyên tử với cặp electron tự do (ví dụ như oxy, nitơ, lưu huỳnh) có thế tạo liên kết phối trí với nguyên tử Fe của nhân hem

- Một vòng thơm chiếm vào vị trí “pocket” B với các nhóm thế có thể tạo tương tác Van de Waals với Phe226 và Arg231

- Các nhóm thế khác trong phân tử tạo liên kết hydro với Cysl29, Serl67, Gly262, Ala264 và 7-propionat của nhân hem

1.2.3 Một số chất ức chế IDO1 đã được nghiên cứu

I.2.3.I Các dẫn chất mang khung indol

Theo các nghiên cứu, cơ chất L-tryptophan ở nồng độ cao cho thấy có khả năng

ức chế hoạt động của ID01 trong khi D-tryptophan gần như không có tác dụng ức chế

Từ đó, các chất ức chế IDO 1 mang khung indol được bắt đầu nghiên cứu và đến nay chất được thử nghiệm nhiều nhất là 1-methyltryptophan (1-MT) Tương tự như trường hợp của tryptophan, dạng L-l-MT có hoạt tính ức chế TD01 mạnh hơn dạng D-l-MT [46] Tuy nhiên, D-1 -methyltryptophan hay còn gọi indoximod, mặc dù không phải là một chất ức chế tối ưu đối với ID01 nhưng có hoạt tính kháng ung thư thông qua các

cơ chế khác

Hợp chất 1 từng được tìm thấy có hoạt tính ức chế ID01 cao nhất trong các dẫn

chất indol với giá trị IC50 = 7,0 pM [56] Gần đây, họp chất 2 mới được phát hiện là

1-methyltryptophan ID01 IC50 = 0,15 pM

1.23.2 Các dẫn chất mang khung imidazol

Sau khi cấu trúc tinh thể của IDO1 và PI được phát hiện và nghiên cứu, PI được coi là một chất ức chế IDO1 yếu với IC50 = 48 pM Từ đó, dựa trên cấu trúc của PI các chất ức chế IDO1 mang khung imidazol được nghiên cứu và đưa ra [46] Dần chất imidazolisoindol (4) hay được gọi là navoximod được phát hiện có hoạt tính ức chế IDO1 với IC50 = 75 Ỉ1M, họp chất 5 dựa trên cấu trúc của navoximod có IC50 là 38 nM [58] Dan chat imidazolthiazol kết hợp với cầu nối carbamid (6) cho giá trị IC50 là 77

1.233 Các dân chât N-hydroxyamidin

Hợp chất 7 là chất đầu tiên được phát hiện trong dãy TV-hydroxyamidin mới với

giá trị IDO1 IC50 là 67 nM [49] Các nghiên cứu tối ưu hóa sau này dẫn đến sự ra đời họp chất 8 còn gọi là epacadostat, hiện vẫn đang là chất ức chế IDOÍ tiến xa nhất trong thử nghiệm lâm sàng với ĨDO1 (IC50 = 73 nM), chọn lọc hơn 1000 lần trên IDO1

so với IDO2 và TDO [50]

1.2.3.4 Các dẫn chất mang khung indazol

Các dẫn chất tổng hợp được mang khung cấu trúc indazol có tác dụng dược lý rất đa dạng và hoạt tính sinh học cao, ví dụ như chống viêm, chống nấm, kháng virus, điều trị ung thư, chống loạn nhịp [54] Đồng thời, indazol là đồng phân sinh học của indol và nhiều nghiên cứu phát triển các họp chất mới hướng ức chế IDO1 mang khung indazol cho kết quả đáng kì vọng [14, 25]

Nghiên cứu của Wang và cộng sự vào năm 2016 về docking và mối liên qua cấu trúc tác dụng của một dãy các dẫn chất tổng họp được cho ra hợp chất 11 có tác dụng

ức chế IDO1 tốt nhất với IC50 = 5,3 pM Từ đó đã đưa ra một số kết luận liên quan đến cấu trúc tác dụng [39]:

- Khung indazol nằm ở “pocket” A tương tác trực tiếp với nhân hem cần thiếtcho hoạt tính

- cầu nối 4-amin giữa khung indazol và vòng benzen cho hoạt tính tốt hon cầu

nối 4-ether do xuất hiện liên kết hydro với nhóm propionat của nhân hem Khi cầu nối này dài thêm một nhóm CH2 dẫn đến giảm hoạt tính

- Vòng benzen nằm ở pocket B tạo ra tương tác 71-71 với Phe226 và nhóm thế para hydroxy tạo tương tác tĩnh điện với Arg231 làm tăng hoạt tính

Một năm sau, Manna và các cộng sự tống họp dày các dẫn chất l-H-indazol mới

có nhóm thế vị trí số 3 mang cầu nối carbohydrazid trong đó hai họp chất 12 và 13 có hoạt tính nổi bật nhất với IDO1 IC50 lần lượt là 720 nM và 770 Ĩ1M [60]

Năm 2020, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Phương Thảo và ThS Ngô Xuân Hoàng (Trường đại học Dược Hà Nội) đã tống họp một dãy các dẫn chất mang khung 6-aminoindazol trong đó có một sổ hợp chất có khả năng ức chế IDO1 và cả kháng tế bào ung thư [13]

1.3 MỘT SÔ PHẢN ỨNG ĐƯỢC THựC HIỆN TRONG ĐỀ TÀI

1.3.1.1 Phản ứng tạo amid vói tác nhân là acid carboxylic

Với tác nhân acyl hóa là acid carboxylic, ở điều kiện thường thì phản ứng sè dễ dịch chuyền theo hướng tạo muối mà không phải amid Để tạo sản phẩm amid mong muốn cần nâng nhiệt độ hỗn hợp phản ứng có thể lên trên 180°C kết hợp với biện pháp loại nước ra khỏi khối phản ứng, nhưng hiệu suất vẫn rất thấp và độ chọn lọc không cao

Hiện nay, khi thực hiện phản ứng amid hóa, người ta thường sử dụng các tác nhân acyl hóa hoạt động hóa học mạnh hơn như các hologenid acid, anhydryd acid, este hoặc các acyl imidazol Các tác nhân này có thể được tạo thành nhờ chuyến acid carboxylic thành các dẵn xuất theo sơ đồ chung:

I.3.I.2 Phản ứng tạo amid vói tác nhân là halogenid acid

Halogenid acid thường là những chất lỏng, dễ bị thủy phân, quá trình acyl hóa tạo ra HX có thể tạo muối với amin làm giảm hiệu suất phản ứng, vì vậy người ta thường phải dùng các base hữu cơ như pyridin, triethylamin, dimethylaminopyridin (DMAP), quinolin, làm chất hấp thụ

Halogenid acid là các tác nhân acyl hóa rất mạnh, trong đó các clorid acid được

sử dụng nhiều nhất Cơ chế tạo clorid acid từ SOC12 được trình bày như sau:

Có thể thấy, quá trình tạo acyl clorid sinh ra một lượng acid hydrocloric, acid này

có thể tạo muối với amin thêm vào dẫn đến giảm hiệu suất hình thành amid Trong trường hợp này một lượng tương ứng các base hữu cơ như DMAP, TEA, pyridin cần được thêm vào để trung hòa lượng HC1 tạo thành

Nhìn chung phản ứng tạo amid bao gồm 2 giai đoạn: i) tạo acyl clorid từ acid carboxylic; ii) acyl clorid phản ứng với amin tạo amid, tuy nhiên ta có thể thực hiện chuyển hóa trên theo tổng họp one-pot theo sơ đồ sau:

SOC1 2 , Et 3 N

R 2

A

Ưù điểm khi sử dụng SOC12 và tổng hợp one-pot tạo amid là phản ứng thực hiện đơn giản, xảy ra ở điều kiện nhiệt độ phòng, thời gian phản ứng ngắn, dễ nâng quy mô Đối với phản ứng tạo amid từ amin bậc 2 hoặc bậc 3, phản ứng xảy ra với hiệu suất cao và không cần tinh chế thêm Từ những ưu điểm trên, khoá luận đã sử dụng phản ứng amid hoá one-pot với tác nhân SOC12

Một phương pháp khác đế tạo acyl clorid đi từ oxalyl clorid (COC12) có mặt xúc tác DMF Cơ chế được trình bày theo sơ đồ 1.4

Tuy nhiên, (COC1)2 là tác nhân đắt tiền hơn nhiều SOC12, DMF cũng xúc tác tạo acyl clorid với SOC12 tương tự như với (COC1)2 nhưng tạo ra sản phấm trung gian có khả năng gây ung thư là dimethylcarbamoyl clorid và khí độc như co nên cơ chế này không được khuyến khích sử dụng cho quy mô lớn [10]

1.3.2.1 Khử hóa bằng hydro phân tử có xúc tác

Đây là phương pháp phổ biến nhất để điều chế các amin trong công nghiệp Phương pháp này tạo amin thơm có độ tinh khiết tương đối cao và có thể tiến hành ở

cả pha hơi lẫn pha long với xúc tác là niken và đồng

1.3.2.2 Khử hóa bằng kim loại trong môi trường acid

Đây là một trong những phương pháp phổ biến nhất để khử hóa các họp chất hữu

cơ nói chung và các hợp chat nitro thơm nói riêng Người ta sử dụng các kim loại như một nguồn cho electron và phối hợp thêm các nguồn cho proton (AcOH, NH4CI, )

Cơ chế của phản ứng này như sau:

Kim loại chủ yếu được sử dụng là sắt (phản ứng Bechamp) Tốc độ phản ứng phụ thuộc lớn vào kích thước bột sắt và tốc độ khuấy trộn Trong qua trình phản ứng cần rất lưu ý đến vấn đề an toàn do phản ứng có sinh hydro có khả năng gây nổ và rò rỉ.

I.3.2.3 Phản ứng khử hóa bằng SnCl2.2H2O

Ngày nay, phản ứng khử nitro benzen thường được tiến hành theo phưong pháp này Xuất phát từ một phản ứng khử cơ bản, khử nitrobenzen thành anilin trong SnCl2

và axit clohydric, cơ chế của phản ứng khử bằng SnCl2 trong EA có mặt HC1 đã được nghiên cứu cho thấy sự hình thành của ion [HSnClJ’ là một nguồn cho ion hydrid, chính ion này tham gia quá trình khử nhóm nitro

[HSnCl4]-Các phản ứng thường được thực hiện trong dung môi EA hoặc dung môi alcol Tuy nhiên, khi sử dụng dung môi là alcol, Abassi và cộng sự đã cho thấy sự khử nhóm nitro của họp chất 4-nitroindazol và 7-nitroindazol ngoài sản phấm khử mong muốn còn xuất hiện sản phẩm thế 7-alkoxy và 4-alkoxy tương ứng

Phản ứng được thực hiện với SnCl2.2H2O trong ethanol hoặc EA, hoặc SnCl2 khan trong các alcol ở 70°C, hồi lưu Ớ những điều kiện trên, các nhóm chức dễ bị khử khác như ceton, ester, nitril, halogen, oxim và alken đều không bị ảnh hưởng Bên cạnh đó, SnCl2 có khả năng khử chọn lọc nhóm nitro thơm ở cả môi trường acid và môi trường trung tính, phản ứng cho hiệu suất tạo arylamin cao [3] Với các ưu điếm

đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng tác nhân khử là SnCl2.2H2O trong môi trường EA để tổng họp các dẫn chất mục tiêu

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cúư

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Nguyên lêu, hóa chất

Các dung môi, hóa chất dùng trong tống họp và tinh chế các chất mục tiêu trong nghiên cứu này chủ yếu có nguồn gốc từ một số hãng nhu Merck (Đức), AKSci (Mỹ),

và Trung Quốc Các hóa chất này đuợc sử dụng trực tiếp mà không cần qua tinh chế thêm và đuợc trình bày trong bảng sau:

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc - Xuất xứ

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

- Dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn một cổ dung tích 50 mL, bình cầu đáy tròn một cố dung tích 25 ml, sinh hàn, bình tam giác 250 mL, cốc thủy tinh, phễu lọc, phễu lọc Buchner, bình chiết, ống đong, pipet pasteur

- Cân kĩ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức)

- Bơm hút chân không DIVAC 1.21 (Mỳ)

- Máy cất quay Buchi R-210 (Thụy Sĩ)

- Sắc ký lóp mỏng (TLC): đuợc thục hiện trên bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck)

- Đèn tử ngoại với hai bước sóng 254 nm và 365 nm

- Bình khai triển sắc ký

- Cột sắc ký (ISOLAB, 400x20)

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Smp3 (Mỹ)

Tetramethylsilan (TMS) làm chất chuẩn nội của hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ khối lượng Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ hồng ngoại FTIR Affinity (Nhật Bản) tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CÚU

2.2.1 Tổng họp hóa học

Tổng hợp 4 dẫn chất acetamid mang khung 6-amino-lH-indazol gồm:

+ 2-(6-amino-l//-indazol-l-yl)-7V-(3-clorophenyl) acetamid (Va)

+ 2-(6-amino-l//-indazol-l-yl)-/V-(4-clorophenyl) acetamid (Vb)

+2-(6-amino-l//-indazol-l-yl)JV-(3-florophenyl) acetamid (Vc)

+2-(6-amino-l//-indazol-l-yl)JV-(4-florophenyl) acetamid (Vd)

- Kiềm tra độ tinh khiết của các họp chất tổng hợp được

- Khẳng định cấu trúc của các chất tổng hợp được

2.2.2 Đánh giá dụng ức chế IDO1

Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng họp, tinh chế và khẳng định cấu trúc được thử tác dụng ức chế IDO1 tại nồng độ 1,0 mM so sánh với chất chứng dương là 1DO5L bằng kit thử chuyên dụng của hãng BioVision

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.3.1 Tổng họp hóa học

2.3.1.1 Tổng họp

- Dựa trên những nguyên tắc của các phản ứng hóa học và điều kiện phản ứng đế tổng hợp các dẫn chất có cấu trúc theo như dự kiến Các phản ứng đã sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

+ Phản ứng /V-alky 1 hóa với tác nhân alkyl hóa là 2-cloroethyl acetat có mặt xúc tác K2CO3

+ Phản ứng thủy phân ester trong môi trường kiềm NaOH với dung môi là MeOH

+ Phản ứng acid hóa muối natri của acid hữu cơ bằng dung dịch HC1 5%

+ Phản ứng tạo amid giữa một acid carboxylic và các anilin mang nhóm thế mục tiêu với tác nhân SOC12 trong dung môi DCM có mặt TEA làm xúc tác

+ Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm với tác nhân SnCl2.2H2O

- Các phản ứng được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng

- Hỗn họp sau phản ứng được tinh chế bằng các kĩ thuật phù hợp với từng giai

đoạn, bao gồm các kĩ thuật chiết phân bố lỏng-lỏng và sắc ký cột

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Độ tinh khiết của sản phẩm được kiểm tra ở từng giai đoạn bằng kĩ thuật sắc ký lóp mỏng (thời điểm dừng phản ứng và độ tinh khiết của sản phẩm sau tinh chế) và đo

- sắc kí lớp mỏng:

+ Pha tĩnh: bản mỏng silicagel 60 F254 được hoạt hóa ở 110°C trong 30 phút

+ Pha động: hệ dung môi EA:n-hexan = 1:1

- Nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy MPA (Mỹ)

2.3.1.3 Khăng định cấu trúc các hợp chất tổng họp được

Các chất sau khi được tổng họp, tinh chế và đánh giá là tinh khiết được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phố hiện đại, bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân ^H-NMR và 13C-NMR)

2.3.2 Thử tác dụng ức chế IDO1

Các dẫn chất mục tiêu sau khi được tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trúc được thử hoạt tính ức chế IDO1 tại nồng độ 1 mM so sánh với chất chứng dương là ĨDO5L bằng kit thử của hãng BioVision

2.3.2.I Nguyên tắc thử

Đánh giá tác dụng ức chế IDO 1 của chất thử bằng cách xác định và so sánh với chất chứng dương IDO5L về lượng sản phẩm N-formylkynurenin tạo thành thông qua con đường kynurenin Khác với các phương pháp thử đo quang thông thường dựa trên

độ hấp thụ ƯV, nhóm nghiên cứu sử dụng kit thử hiện đại hơn bằng cách sử dụng một tác nhân tạo huỳnh quang phản ứng chọn lọc với N-formylkynurenin Phản ứng tạo thành một hợp chất phát huỳnh quang khi được kích thích bởi bước sóng khả kiến (Ex/Em = 402/488 nm) Phương pháp này đảm bảo thu được kết quả có tín hiệu mạnh

và ít nhiễu do giảm được sai số của bước sóng ngắn, hạn chế sự hấp thụ của các họp chất khác trong quá trình thử Tất cả các thử nghiệm đều được tiến hành ở nồng độ 1,0 mmol

23.2.2 Chuẩn bị các tác nhân và bảo quản

- Dung dịch đệm: bảo quản ở 4°c, tránh ánh sáng Trước khi sử dụng, để rã đông

ở nhiệt độ phòng

- Dung dịch chống oxy hóa (nồng độ 100 pM): hòa tan chất chống oxy hóa trong

110 pl dung dịch đệm và bảo quản ở -80°C, tránh ánh sáng

- Cơ chất IDO1 (L-Tryptophan): hòa tan phối tử với 110 pl dung dịch đệm để thu được dung dịch có nồng độ 10 mM

- Chất ức chế 1DO1 (IDO5L): hòa tan IDO5L với 55 pl DMSO để thu được dung dịch nồng độ 1 mM

- Dung dịch tác nhân huỳnh quang hóa: bảo quản ở 4°c Điều chỉnh đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.

- IDO1 tái tổ hợp ở người: không mở ra đến khi sử dụng, tái hòa tan với 1,1 ml dung dịch đệm và bảo quản ở -80°C, sử dụng trong vòng 2 tháng

2.3.23 Cách tiến hành và tính kết quả

Với mỗi chất thử, pha loãng vào dung môi phù họp (thường sử dụng DMSO sao cho nồng độ cuối của DMSO < 0,5%), sau đó pha loãng bằng dung dịch đệm để thu được dung dịch nồng độ 10 mM

- Chuẩn bị hổn họp trước khi thử: pha loãng dung dịch chống oxy hóa với dung dịch đệm ở trên theo tỉ lệ 1:50

- Pha các mâu vào các giêng thử theo bảng sau:

Trắng (Dung môi)

900 pl dung dịch đệm Thêm 10 pl dung dịch này vào mỗi giếng để tổng thể tích mỗi giếng đạt 100 pl Để yên các giếng thử ở 37°c ở chỗ tối trong 45 phút

Mỗi giếng được thêm 50 pl chất huỳnh quang hóa, đậy kín rồi đề yên ở 45°C ở chỗ tối trong 3 giờ, sau đó, làm nguội tự nhiên các giếng đến nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 giờ Sau thời gian trên, đo cường độ huỳnh quang của các giếng (Ex/Em =

402/488 nm).

Mỗi giếng, kết quả được tính bằng công thức sau:

Trong đó, F là giá cường độ phát huỳnh quang đã trừ nền Fsc và FTC tương ứng

là giá trị của mẫu trắng (dung môi) và mẫu chất thử/mẫu chất chứng dương Từ đó, tính toán % ức chế IDO1 của chất thử và của chất chứng dương (IDO5L)

CHƯƠ NG 3: THựC NGHIỆM, KẾT QUÃ VÀ BÀN LUẬN

3.1 HÓA HỌC

3.1.1 Tổng hựp hóa học

Quá trình tống hợp 4 chất mực tiêu từ Va-d trong khóa luận được trình bày theo

sơ đồ như sau:

Vc: R = 3-F

Vd: R = 4-F

o

R

3.1.1.1 Tổng hợp ethyl 2-(6-nitro-lH-indazol-l-yl) acetat (II)

Hợp chất ethyl 2-(6-nitro-l/7-indazol-l-yl) acetat (II) được tổng hợp thông qua

phản ứng alkyl hóa 6-nitro-l//-indazol với tác nhân là 2-cloroethylacetat được trình bày theo sơ đồ sau:

K2 CO3/aceton, 60°C, 2h

- - ►

CICH2 COOEt, KI, 60°C, 6h

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với hệ pha động EA:/i-hexan tỷ lệ 1:1.

❖ Xử lý phản ứng:

- Sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn, toàn bộ khối phản ứng được đem cô quay dưới áp suất giảm để loại dung môi

- Cắn thu được được đem đi chiết với hỗn họp DCM:H2O (3 lần X 25 ml DCM)

- Thu lấy pha hữu cơ và làm khan bằng Na2SO4 khan

- Cô quay loại dung môi và kết tinh sản phẩm trong dung môi n-hexan

- Lọc thu sản phẩm và sấy khô trong tủ sấy tĩnh ở 60°C, thu được dẫn chất trung gian II

❖ Kết quả:

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng hơi vàng

- Hiệu suất: 86%

- Ry= 0,64 (TLC, silicagel 60 GF254, hệ dung môi EA:«-hexan = 1:1)

3.1.1.2 Tổng hợp chất trung gian III

Họp chất acid 2-(6-nitro-l//-indazol-l-yl) acetic (III) được tổng họp từ họp chất trung gian số II thông qua hai phản ứng: phản ứng thủy phân với kiềm mạnh NaOH được tiến hành trong dung môi MeOH và phản ứng acid hóa bằng dung dịch acid hydrocloric 5% Quá trình tổng họp được trình bày theo sơ đồ sau:

❖ Xử lý phản ứng:

- Khi phản ứng kết thúc, khối phản ứng đem đi cô quay dưới áp suất giảm để loại dung môi

- Làm lạnh bình sau cô quay và nhỏ từ từ dung dịch HC1 5% vào khối cắn, lắc

đều Theo dõi pH bằng giấy chỉ thị đến khi pH khoảng 3-4

- Lọc tủa trên giấy lọc và rửa tủa với nước cất lạnh (3 lần X 5 ml)

- Sấy tủa trong tủ sấy tĩnh ở nhiệt độ 60°C thu được dẫn chất trung gian (III).

❖ Kết quả

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Hiệu suất: 81 %

- R/ = 0,31 (TLC, silicagel 60 F254, hệ dung môi DCM:MeOH = 14:1)

3.1.1.3 Tổng hợp các hợp chất trung gian (IVa-d)

Các dẫn chất trung gian amid (IVa-d) được tổng họp từ dẫn chất III acid 2-(6- nitro-lH-indazol-l-yl) acetic bằng phản ứng amid hóa với các anilin mang nhóm thế mục tiêu trong môi trường dicloromethan có mặt SOC12 và TEA được trình bày theo

so đồ sau:

Họp chất trung gian số IVa được tổng họp bằng phản ứng giữa dẫn chất số III

với tác nhân phản ứng là 3-cloroanilin, SOC12, TEA trong dung môi DCM được trình bày theo sơ đồ sau:

3-cloroanilin, DMC, TEA, SOCI2

- - - — - ►

_ F

❖ Tiên hành phản ứng:

- Cân 110,6 mg (0,5 mmol - 1,0 đương lượng) chất số III vào bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml

- Thêm tiếp 3-cloroanilin (0,6 mmol - 1,2 đương lượng) vào bình phản ứng

- Thêm khoảng 25 ml DCM vào bình phản ứng, lắc đều

- Trong tủ hút, thêm tiếp vào bình cầu 210 pl TEA (1,5 mmol - 3,0 đương lượng) vào bình

- Trong tủ hút, nhỏ từ từ từng giọt 110 pl SOC12 (1,5 mmol - 3,0 đương lượng) vào bình, khuấy trên máy khuấy từ trong 6 giờ

- Theo dõi phản ứng bang TLC với hệ pha động EA:n-hexan =1:1

❖ Xử lý phản ứng:

- Hỗn họp sau phản ứng được đem chiết với dung dịch HC1 5% (3 lần X 15 ml)

đề loại 3-cloroanilin còn dư Thu lấy pha hừu cơ và làm khan bằng Na2SO4 khan

- Cô quay dưới áp suất giảm loại dung môi

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột với hệ dung môi EA:n-hexan

- Cô quay loại dung môi dưới áp suất giảm

- Sấy khô cắn trong tủ sấy chân không ở 40°C thu được chất trung gian IVa

❖ Tiến hành và xử lý phản ứng:

Phản ứng đươc tiến hành và xử lý tương tự dẫn chất IVa, thay thế tác nhân 3-

cloroanilin băng 4-cloroanilin (0,6 mmol - 1,2 đương lượng)

Hợp chất trung gian IVc được tổng hợp bằng phản ứng giữa dẫn chất số III với

tác nhân phản ứng là 3-floroanilin, SOC12, TEA trong dung môi DCM được trình bày theo sơ đồ sau:

❖ Tiến hành và xử lý phản ứng:

Phản ứng đươc tiến hành và xử lý tương tự dẫn chất IVa, thay thế tác nhân 3-

cloroanilin bằng 3-floroanilin (0,60 mmol - 1,2 đương lượng)

Hợp chất trung gian số IVd được tổng hợp bằng phản ứng giữa dẫn chất số III

với tác nhân phản ứng là 4-floroanilin, SOC12, TEA trong dung mồi DCM được trình bày theo sơ đồ sau:

4-floroanilin, DMC, TEA, SOCI 2 - - ► O 2N

Phản ứng đươc tiến hành và xử lý tương tự dẫn chất IVa, thay thế tác nhân 3-

cloroanilin bằng 4-floroanilin (0,5 mmol-1,0 đương lượng)