TỔNG QUAN
Kỹ thuật sắc ký khí - khối phổ
Sắc ký là một phương pháp phân tích mạnh mẽ, được sử dụng rộng rãi để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp phức tạp dựa trên ái lực khác nhau của chúng đối với pha động và pha tĩnh.
Trong sắc ký, pha tĩnh là chất liệu hoặc dung dịch cố định, đóng vai trò giữ các chất lại trong quá trình phân tách.
- Pha động (mobile phase): là phần khí hay dung dịch đi qua pha tĩnh, pha di động có tác dụng kéo các chất đi
Trong sắc ký, hai pha luôn tiếp xúc nhưng không trộn lẫn, ái lực của chất với pha tĩnh quyết định tốc độ di chuyển của nó Các chất có ái lực cao với pha tĩnh di chuyển chậm hơn, trong khi các phân tử lớn và nặng cũng di chuyển chậm và xuất hiện sau các phân tử nhỏ, nhẹ hơn.
1.1.2 Sắc ký khí – khối phổ
Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là một kỹ thuật phân tích mạnh mẽ, kết hợp sắc ký khí (GC) và khối phổ (MS) để định danh và định lượng các thành phần hoạt chất trong mẫu, đặc biệt hiệu quả với các mẫu ở dạng hơi hoặc khí.
Sắc ký khí phân tách các thành phần dựa trên ái lực khác nhau với pha tĩnh, trong đó các phân tử nhỏ hơn xuất hiện trước Khối phổ xác định định tính và định lượng bằng cách ion hóa các phân tử mẹ và lọc các ion đặc trưng Bộ lọc khối lượng cho phép các hạt có khối lượng nhất định đi qua, và cảm biến đếm số lượng để tính toán tín hiệu và đưa ra kết quả khối phổ.
GC/MS được xem là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định hoạt chất nhờ độ nhạy và độ đặc hiệu cao, dựa trên thời gian lưu và các mảnh ion đặc trưng cho cấu trúc phân tử Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong phát hiện thuốc, các sản phẩm chuyển hóa trong nước tiểu và các chất chưa biết GC/MS là một phương pháp có độ nhạy cao, được sử dụng để định tính và định lượng các chất ở thể khí, với ngưỡng phát hiện đạt đến mức picogram.
1.1.2.1 Cấu tạo của hệ thống GC/MS
Hình 1.1 Cấu tạo hệ thống sắc ký khí – khối phổ [19]
1 Nguồn cấp khí 2 Bộ điều khiển khí nén
3 Bơm tiêm mẫu 4 Lò cột
5 Cột 6 Kết nối sắc ký với khối phổ
7 Nguồn ion 8 Bộ phận phân tích khối lượng
9 Đầu dò 10 Hệ thống chân không
11 Bảng điều khiển điện tử
Bộ phận sắc ký khí
2 Bộ điều khiển khí nén
11 Bảng điều khiển điện tử
8 Bộ phân tích ion khối lượng
Cửa tiêm mẫu, trang bị bơm tiêm tự động (3), đưa hỗn hợp chất lỏng vào hệ thống Khí nén (1, 2) dẫn mẫu qua hệ thống sắc ký khí sử dụng khí trơ (heli, hydro) Nhiệt độ cao tại cửa tiêm hóa lỏng mẫu.
Vỏ ngoài: vỏ ngoài của hệ thống GC chính là một lò nung đặc biệt (4) Nhiệt độ của lò này dao động từ 40 o C cho đến 320 o C
Trong hệ thống GC, cột là một ống hình trụ nhỏ tráng polymer đặc biệt, nơi các chất được phân tách dựa trên ái lực khác nhau với pha tĩnh, sau đó chuyển đến bộ phận khối phổ.
Nguồn ion đóng vai trò then chốt trong việc cung cấp ion để ion hóa các sản phẩm sau phân tách.\$$\text{Ion mẹ} \rightarrow \text{Bộ phận phân tích khối lượng}$$Ion mẹ sau đó được chuyển đến bộ phận phân tích khối lượng để xác định và định lượng.
Phân tích khối phổ sử dụng bắn phá để tạo ra các mảnh ion đặc trưng, sau đó chọn lọc và phát hiện chúng bằng đầu dò khối phổ hiệu quả, giúp xác định cấu trúc phân tử của chất phân tích.
Hệ thống chân không: duy trì áp lực chân không trong bộ phận khối phổ
Bảng điều khiển điện tử: sử dụng để điều khiển hệ thống (11)
1.1.2.2 Kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS
Theo nguyên lý kỹ thuật của Honour JW, steroid liên hợp được thủy phân bằng enzym glucuronidase/sulphatase để tách chiết steroid tự do, sau đó tạo dẫn xuất với methoxyamin và TMSI Steroid được tinh sạch trước khi đưa vào hệ thống sắc ký khí-khối phổ, tại đây chúng được làm bay hơi và phân tách Các steroid sau đó được ion hóa và phân tích bằng đầu dò khối phổ để xác định cấu trúc.
Để phân tích steroid niệu, các steroid liên hợp được thủy phân bằng enzym, sau đó steroid tự do được tách chiết và tinh sạch bằng cột Bond Elut C18 Tiếp theo, tạo dẫn xuất steroid để bảo vệ nhóm chức và thực hiện sắc ký khí khối phổ (GC-MS) Trong GC-MS, steroid được ion hóa và phân mảnh, các ion đặc trưng được phát hiện bằng phương pháp SIM, mỗi steroid tương ứng với một đỉnh trên sắc ký đồ với thời gian lưu đặc trưng.
Chuẩn nội được thêm vào mẫu để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình phân tích, mẫu chuẩn được dùng để xây dựng đường chuẩn, giúp tính nồng độ steroid Thời gian lưu và ion đặc hiệu của steroid được xác định dựa trên phân tích steroid tinh khiết Ưu điểm của GC/MS là khả năng phân tách steroid và phân biệt đồng phân nhờ thời gian lưu khác nhau, cùng với độ nhạy và độ đặc hiệu cao nhờ phân tích cấu trúc phân tử.
Kỹ thuật này có nhược điểm về thời gian xét nghiệm kéo dài so với LC/MS-MS do thời gian thủy phân và tạo dẫn xuất lâu Quá trình chuẩn bị mẫu thủ công đòi hỏi người thực hiện có kinh nghiệm, dẫn đến số lượng mẫu nhỏ và khó tự động hóa Do đó, kỹ thuật này khó phổ biến rộng rãi và có thể cho kết quả không tốt ở mẫu trẻ sơ sinh do nồng độ steroid trong nước tiểu thấp.
Để hạn chế sai số trong phản ứng của enzym glucuronidase, cần tối ưu hóa pH của dung dịch đệm và ổn định steroid tự do sau thủy phân bằng vitamin C Bên cạnh đó, cần làm khô hoàn toàn methanol trước khi tạo dẫn xuất để tránh ức chế, đồng thời ổn định thời gian và nhiệt độ tạo dẫn xuất, cũng như lựa chọn ion đặc hiệu cho mỗi steroid niệu Đối với mẫu nước tiểu loãng của trẻ sơ sinh, có thể cô đặc bằng cách tách chiết qua cột trước khi thủy phân.
Thẩm định phương pháp và thiết lập khoảng tham chiếu
Thẩm định phương pháp là việc cung cấp bằng chứng khách quan chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu, cần thiết cho phương pháp chưa được thẩm định hoặc có thay đổi Xác nhận phương pháp là xác nhận lại giá trị đã công bố của nhà sản xuất Các thuật ngữ khác như đánh giá phương pháp, định trị phương pháp thực chất là cách gọi khác của thẩm định/xác nhận phương pháp.
Thẩm định phương pháp phân tích là bước quan trọng để đánh giá sai số kỹ thuật trước khi áp dụng hoặc hiệu chỉnh phương pháp Các phương pháp đo lường luôn chịu ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên và hệ thống, cần được thẩm định để đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng Đối với phân tích hóa sinh, các thông số cần thẩm định bao gồm độ đặc hiệu, độ nhạy, khoảng tuyến tính, độ lệch/độ đúng, độ lặp và độ tập trung Sau khi thẩm định, cần thiết lập khoảng tham chiếu, việc lựa chọn thông số thẩm định phụ thuộc vào kỹ thuật, yêu cầu phương pháp và nguồn lực phòng xét nghiệm.
Hướng dẫn của CLSI khuyến cáo sử dụng 3 thông số sau:
Giới hạn trắng (LOB) là kết quả đo lường cao nhất quan sát được từ mẫu trắng, thường được ước tính bằng giá trị trung bình cộng với 1,65 lần độ lệch chuẩn (SD) của mẫu trắng.
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ tối thiểu của chất phân tích mà một phương pháp định lượng có thể phát hiện được trong các điều kiện cụ thể.
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể định lượng được với độ lặp và độ tái lặp chấp nhận được (CV < 20%) Độ lặp, hay còn gọi là độ chụm, thể hiện mức độ gần đúng giữa các kết quả đo độc lập trên cùng một mẫu và trong cùng điều kiện Đánh giá độ lặp giúp ước tính sai số ngẫu nhiên trong quá trình thực hiện phương pháp, và thường là bước đầu tiên trong việc đánh giá một phương pháp mới.
Độ lặp được đánh giá qua độ lặp ngắn hạn (trong một lần chạy) và độ tái lặp (giữa các lần chạy) Để xác định độ lặp, sử dụng mẫu chuẩn, mẫu nội kiểm hoặc mẫu bệnh phẩm, chạy lặp lại tối thiểu 20 lần trong một ngày (độ lặp lại) và trên 20 ngày (độ tái lặp) Tính SD và CV từ kết quả, so sánh CV với tiêu chuẩn cho phép Độ xác thực là mức độ gần đúng giữa kết quả đo và giá trị thật, dù trị số thực lý tưởng khó đạt được.
Thực nghiệm so sánh phương pháp đánh giá độ xác thực bằng cách phân tích mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp mới và phương pháp tham chiếu, sau đó đánh giá sai số hệ thống dựa trên sự khác biệt Các thuật toán thống kê như đồ thị khác biệt, đồ thị so sánh, phân tích hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan được sử dụng để phân tích kết quả Phương trình tương quan y = ax + b (y là kết quả phương pháp cần thẩm định, x là kết quả phương pháp tham chiếu) cho biết sai số tỷ lệ (a, lý tưởng bằng 1) và sai số hằng định (b, lý tưởng bằng 0) giữa hai phương pháp.
Phân tích sự khác biệt giữa phương pháp thẩm định và phương pháp tham chiếu là cần thiết để đánh giá độ xác thực tương đương Nếu khác biệt nhỏ, phương pháp mới có thể thay thế phương pháp tham chiếu Trường hợp khác biệt lớn, cần xác định phương pháp nào xác thực hơn thông qua thực nghiệm đánh giá độ thu hồi và yếu tố nhiễu.
Trong trường hợp phòng xét nghiệm không có phương pháp tham chiếu, thực nghiệm đánh giá độ xác thực có thể được thực hiện thông qua chương trình ngoại kiểm Phương pháp này so sánh kết quả nội bộ của phòng xét nghiệm với kết quả ngoại kiểm được cung cấp Chương trình ngoại kiểm steroid niệu đặc biệt hữu ích để so sánh và đánh giá kết quả giữa các phòng xét nghiệm trên toàn thế giới.
Thực nghiệm xác định độ thu hồi (recovery experiment)
Để đảm bảo độ chính xác, quy trình phân tích sử dụng hai mẫu: một mẫu được thêm chất chuẩn và mẫu còn lại thêm dung dịch pha loãng chất chuẩn với thể tích không quá 10% để tránh ảnh hưởng đến nền mẫu và giới hạn tuyến tính Mỗi mẫu được đo lặp lại ít nhất ba lần, sau đó tính toán độ thu hồi để đánh giá hiệu quả quy trình.
Công thức tính nồng độ thu hồi và % thu hồi như sau:
là tỷ lệ giữa nồng độ thu hồi và nồng độ chuẩn thêm vào, nhân với 100.
Kết quả thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu thường có độ thu hồi khoảng 90% và độ lặp, độ tái lặp dưới 25% Độ nhạy phụ thuộc vào từng xét nghiệm định lượng steroid, với yêu cầu khoảng 10ng steroid để phát hiện đỉnh trên sắc ký đồ, hoặc 200pg steroid khi sử dụng sắc ký khí – khối phổ chọn lọc ion (GC/MS-SIM).
1.2.2 Thiết lập khoảng tham chiếu
Khoảng tham chiếu là khoảng phân bố đặc trưng của giá trị trong quần thể tham chiếu sinh học Việc thiết lập hoặc xác nhận khoảng tham chiếu là rất quan trọng để diễn giải kết quả xét nghiệm cho bệnh nhân, đặc biệt sau khi phương pháp xét nghiệm đã được thẩm định và chấp nhận Khoảng tham chiếu không phải là yếu tố quyết định hiệu năng của phương pháp xét nghiệm.
Hướng dẫn CLSI EP28A-C3 cung cấp quy trình chi tiết để phòng xét nghiệm thiết lập hoặc xác nhận khoảng tham chiếu, điều này rất cần thiết khi triển khai kỹ thuật xét nghiệm mới do sự khác biệt giữa các đối tượng theo giới tính, tuổi, chủng tộc và vùng địa lý Các chuyên gia y tế khuyến cáo mỗi phòng xét nghiệm nên tự thiết lập giá trị tham chiếu riêng, bắt đầu bằng việc lựa chọn quần thể tham chiếu là những người khỏe mạnh ít nguy cơ mắc bệnh, đại diện cho quần thể lớn, dựa trên thông tin và nghiên cứu có trước.
Bước quan trọng là chọn đối tượng tham chiếu trong quần thể nghiên cứu, thường thông qua phỏng vấn để thu thập thông tin cá nhân, thói quen và yếu tố ảnh hưởng đến xét nghiệm Mục đích của phỏng vấn là loại bỏ các cá nhân có nguy cơ cao mắc bệnh, dựa trên các yếu tố như hút thuốc, uống rượu, mang thai, tiền sử gia đình và thuốc đang dùng Có hai phương pháp lấy mẫu chính: trực tiếp từ đối tượng đã sàng lọc và gián tiếp từ các mẫu thu thập cho mục đích khác, ví dụ như từ người hiến máu hoặc khám sức khỏe định kỳ.
Sinh tổng hợp hormon steroid và bệnh rối loạn tổng hợp steroid bẩm sinh 16 1 Tổng hợp hormon steroid
Cholesterol transport into mitochondria is facilitated by the steroid acute response protein (StAR) Within the mitochondria, the enzyme desmolase cleaves cholesterol to produce pregnenolone, a crucial intermediate Pregnenolone then exits the mitochondria and enters the endoplasmic reticulum, where it is converted into all three classes of steroid hormones.
Nhóm 1 gồm các hormon tham gia chuyển hóa muối nước như DOC, corticosterone, 18OH-corticosterone, aldosterone (nền màu xanh lá cây) Nhóm 2 gồm các hormon tham gia chuyển hóa glucose như 11- deoxycortisol, cortisol, cortisone (nền màu cam)
Nhóm 3 gồm các hormon sinh dục nam như testosterone, 5α-DHT (nền màu xanh đậm) Hormon sinh dục nữ như oestrone, oestradiol (nền màu hồng)
Hormon sinh dục có tiền chất tổng hợp màu xanh nhạt, trong khi progesterone và 17-OHP, tiền chất tổng hợp cortisol, có nền màu vàng.
Các gen CYP21A2, CYP11B1, HSD3B2, CYP11B2, CYP17A1 đóng vai trò quan trọng trong việc quy định tổng hợp các enzyme thiết yếu như 21-OH, 11β-OH, 3β-HSD và 17α-OH Các sản phẩm chuyển hóa steroid trong nước tiểu, ví dụ như THE, cung cấp thông tin quan trọng về hoạt động của các enzyme này.
(tetrahydrocortisone), THF (tetrahydrocortisol), 5α-THF, THS (tetrahydro-11- deoxicortisol), THA (tetrahydroaldosterone), THB (tetrahydrocorticosterone), An (androsterone), Et (etiocholanolone), PD (pregnanediol), PTL (pregnanetriolone),
Hình 1.2 Sơ đồ sinh tổng hợp các hormon steroid [11]
1.3.2 Bệnh lý rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh
Các rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh được chia thành hai nhóm chính: nhóm bất thường tổng hợp glucocorticoid, gây tăng sản thượng thận bẩm sinh do giảm khả năng tổng hợp cortisol, và nhóm bất thường tổng hợp hormon chuyển hóa muối-nước và glucocorticoid, dẫn đến mất cân bằng nước – điện giải.
Nhóm 3: bất thường tổng hợp hormon sinh dục: giảm tổng hợp androgen hoặc estrogen gây rối loạn phát triển giới tính
Ngoài ra, có thể gặp các bất thường tại thụ thể của hormon steroid gây ra các triệu chứng giống với rối loạn tổng hợp hormon steroid
1.3.2.1 Rối loạn sinh tổng hợp hormon nhóm glucocorticoid gây tăng sản thượng thận bẩm sinh
Ca lâm sàng đầu tiên mắc TSTTBS được mô tả vào năm 1865, là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường do đột biến gen Sự thiếu hụt enzym trong tổng hợp cortisol hoặc bất thường protein vận chuyển cholesterol gây ra bệnh Nồng độ cortisol thấp kích thích tuyến yên tăng tiết ACTH, dẫn đến tăng sản thượng thận và tăng tiết androgen, gây rối loạn phát triển giới tính ở nữ.
- TSTTBS do thiếu enzym 21-OH
- TSTTBS do thiếu enzym 11β-OH
- TSTTBS do thiếu enzym 3β-HSD type II
- TSTTBS do thiếu enzym 17α-hydroxylase/17,20 lyase
- TSTTBS thể lipid hóa (Lipoid adrenal hyperplasia) do bất thường protein StAR hoặc enzym tách cholesterol khỏi protein vận chuyển P450scc
- Thiếu hụt Cyt P450-oxidoreductase (POR) gây giảm hoạt tính đồng thời một số enzym như 21-OH, 17α-hydroxylase, aromatase
Enzym 21-OH xúc tác phản ứng chuyển 17-OHP thành 11-deoxycortisol tiền chất để tổng hợp cortisol và xúc tác chuyển progesterone thành 11- deoxycorticosterone tiền chất để tổng hợp aldosterone Thiếu hụt enzym 21-OH thường gặp nhất trong số các rối loạn tổng hợp hormon steroid, gồm thể cổ điển mất muối, thể nam hóa đơn thuần và thể không cổ điển [28]:
Bệnh tăng sản tuyến thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) thể cổ điển được chia thành hai dạng chính: thể mất muối, chiếm khoảng 75% số ca bệnh và gây rối loạn nước và điện giải do thừa androgen từ trong bào thai; và thể nam hóa đơn thuần, chiếm 25% số ca, chỉ gây thừa androgen mà không rối loạn nước điện giải Ngoài ra, còn có thể khởi phát muộn (không cổ điển) với các dấu hiệu thừa androgen xuất hiện muộn hơn và không kèm theo rối loạn nước điện giải Tần suất mắc bệnh TSTTBS thể cổ điển do thiếu enzym 21-OH khác nhau giữa các chủng tộc và vùng địa lý, trung bình ở Hoa Kỳ và châu Âu là khoảng 1:15.000 đến 1:16.000 trẻ sơ sinh.
Tần suất mắc Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) cao nhất được ghi nhận ở người Yupik Eskimos tại Alaska (1:282) và người dân đảo Réunion (1:2.141) Thể không cổ điển của bệnh phổ biến hơn thể cổ điển, có thể lên đến 3% ở một số chủng tộc, đặc biệt cao ở người Ashkenazi Jews (1:27) và người gốc Tây Ban Nha (1:53) Mặc dù chi phí sàng lọc TSTTBS khá lớn, việc phát hiện sớm và điều trị kịp thời đã trở thành quy trình thường quy ở nhiều quốc gia từ những năm 1980.
Thiếu enzym 21-OH cổ điển gây tăng androgen, dẫn đến nam hóa ở trẻ nữ từ giai đoạn bào thai, thể hiện qua phì đại âm vật với mức độ phân loại Prader I-V, trong khi cơ quan sinh dục bên trong vẫn phát triển bình thường; trẻ nam thường không có dấu hiệu bất thường ở bộ phận sinh dục.
Rối loạn nước điện giải, đặc biệt là giảm aldosterone ở bệnh nhân TSTTBS thể 21-OH cổ điển, dẫn đến hạ natri và tăng kali máu Các dấu hiệu mất nước mạn tính như giảm cân, da khô, và li bì có thể xuất hiện, thậm chí hôn mê.
Ở bệnh nhân thiếu hụt 21-OH cổ điển, khoảng 25% chỉ biểu hiện rối loạn giới tính mà không kèm theo rối loạn điện giải Trẻ nữ có thể xuất hiện các dấu hiệu nam hóa sớm sau sinh.
Thể không cổ điển (thể khởi phát muộn) đặc trưng bởi các dấu hiệu thừa androgen xuất hiện sau sinh Trường hợp đầu tiên được phát hiện năm 1957 ở một phụ nữ chậm có con, biểu hiện rậm lông và mụn trứng cá Ở nam giới, tình trạng chậm có con có thể do testosterone sản xuất tại tuyến thượng thận gây giảm sinh tinh trùng và tinh hoàn kém phát triển.
Xét nghiệm máu ở bệnh nhân TSTTBS thể mất muối cho thấy nồng độ natri thấp, kali cao, aldosterone thấp nhưng hoạt tính renin tăng cao Nồng độ cortisol có thể thấp hoặc bình thường, nhưng ACTH thường tăng Ở thể thiếu hụt 21-OH cổ điển, nồng độ 17-OHP, DHEA, androstenedione, testosterone tăng cao ở thiếu niên và người trưởng thành Với thể không cổ điển, nồng độ 17-OHP tăng khi làm nghiệm pháp kích thích bằng ACTH.
Xét nghiệm di truyền giúp phát hiện bệnh rối loạn sinh tổng hợp steroid bẩm sinh do thiếu enzym 21-OH, một bệnh di truyền gen lặn gây ra bởi đột biến gen CYP21A1 trên nhiễm sắc thể số 6 Các đột biến nặng có thể gây mất muối và rối loạn điện giải sớm ở trẻ, trong khi các đột biến khác gây nam hóa đơn thuần hoặc thể không cổ điển, tùy thuộc vào mức độ giảm hoạt tính enzym Hiện nay, đã có hơn 140 đột biến trên gen CYP21A2 được phát hiện, trong đó chỉ có một số ít là thường gặp.
Nghiên cứu về rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh ở Việt Nam 41 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu về rối loạn tổng hợp hormon steroid bẩm sinh (TSTTBS) tại Việt Nam đã có từ những năm 1970, tập trung vào đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm máu và biến chứng suy thượng thận Chẩn đoán TSTTBS ở trẻ em dựa vào dấu hiệu lâm sàng và định lượng 17-OHP trong máu, kết hợp với các chỉ số khác như progesterone, kali, testosterone, 17-ketosteroid và natri Tuy nhiên, chẩn đoán bằng các tiêu chuẩn không đặc hiệu có thể dẫn đến sai sót hoặc bỏ sót bệnh do nồng độ 17-OHP và testosterone không cao Việc theo dõi và điều trị bằng 17-OHP được thực hiện để phát hiện biến chứng suy thượng thận cấp, và trong giai đoạn 2006-2010, có 52 trường hợp suy thượng thận cấp do TSTTBS được điều trị.
Nghiên cứu từ năm 1999 đến nay đã phát hiện nhiều đột biến gen ở bệnh nhân TSTTBS, bao gồm đột biến mất đoạn và đột biến điểm trên gen CYP21 Tuy nhiên, do sử dụng ít cặp mồi và chưa giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2, tỷ lệ phát hiện đột biến chỉ đạt 55,8%, còn lại 44,2% bệnh nhân có triệu chứng TSTTBS chưa xác định được đột biến gen.
Năm 2017, nghiên cứu của Vũ Chí Dũng và cộng sự đã phân tích gen CYP21A2 trên 212 bệnh nhân để chẩn đoán thiếu 21-OH, đồng thời phát hiện các trường hợp TSTTBS do thiếu 11β-OH và thiếu 3β-HSD II.
[13] Một trường hợp TSTTBS do thiếu 21-OH không được chẩn đoán, điều trị sớm và đầy đủ được phát hiện có u vỏ thượng thận [114]
Năm 2012, nghiên cứu của Phạm Thu Nga trên 695 bệnh nhân rối loạn phát triển giới tính cho thấy, phần lớn bệnh nhân nữ (51,7%) mang nhiễm sắc thể 46,XX chủ yếu do TSTTBS (91,9%) Ở nhóm bệnh nhân mang nhiễm sắc thể 46,XY (25%), có 8,1% mắc chứng không nhạy cảm với androgen.
Từ năm 2012 đến nay, các nghiên cứu đã phát hiện ra các đột biến gen CYP11B1, đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán xác định bệnh Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) do thiếu 11β-OH, bao gồm cả những đột biến mới được xác định.
Số lượng bệnh nhân mắc Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) và Rối loạn phát triển giới tính (RLPTGT) ngày càng tăng, với 50-70 ca được điều trị mỗi năm tại Bệnh viện Nhi Trung ương, đòi hỏi kỹ thuật chẩn đoán nhanh và đặc hiệu Kỹ thuật phân tích gen hiện tại mới chỉ chẩn đoán được thiếu 21-OH và 11β-OH, trong khi nhiều bệnh lý RLPTGT ở người mang nhiễm sắc thể 46,XY, như thiếu 5α-reductase type 2 và thiếu 3β-HSD, vẫn chưa được chẩn đoán xác định tại Việt Nam.
II nên phải hợp tác và gửi mẫu phân tích ra nước ngoài như Nhật Bản, Pháp [116],[117]
Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
269 trẻ khỏe mạnh từ 1 ngày tuổi đến 11 tuổi chia làm 4 nhóm tuổi, đảm bảo số mẫu trong mỗi nhóm đạt ≥ 39 [25]:
Nhóm 1: 64 trẻ từ 1 ngày đến 28 ngày tuổi
Nhóm 2: 61 trẻ từ 1 tháng (≥ 29 ngày) đến < 2 tuổi
Nhóm 3: 74 trẻ từ 2 tuổi đến < 8 tuổi
Giới tính: nam và nữ tương đương nhau
Tiêu chuẩn lựa chọn bao gồm trẻ khỏe mạnh từ 1 ngày đến 11 tuổi, trẻ sơ sinh đủ tháng theo tiêu chuẩn WHO (tuổi thai 37-42 tuần, cân nặng khi sinh > 2500g) Trẻ không có dấu hiệu mắc TSTTBS, RLPTGT, tiền sử gia đình không có trẻ mắc bệnh tương tự, và không sử dụng corticoid trong vòng 1 tháng Tất cả trẻ phải được sàng lọc qua phiếu điều tra và gia đình cam kết tự nguyện tham gia nghiên cứu.
Tiêu chuẩn loại trừ bao gồm sự từ chối tham gia nghiên cứu từ gia đình hoặc trẻ, nghi ngờ mắc TSTTBS hoặc rối loạn phát triển giới tính, và tiền sử gia đình có trẻ đã được chẩn đoán mắc các bệnh này Trẻ em đã được điều trị bằng corticoid trong vòng một tháng trước khi lấy mẫu cũng bị loại trừ Mẫu được thu thập từ trẻ sơ sinh tại Khoa Sản Bệnh viện Đa khoa tỉnh Vĩnh Phúc, trẻ dưới 2 tuổi tại trung tâm y tế xã hoặc phường ở Vĩnh Phúc, trẻ 2-5 tuổi tại các trường mẫu giáo ở Vĩnh Phúc, và trẻ 6-≤11 tuổi tại trường Tiểu học Kim Liên (Đống Đa – Hà Nội).
Nghiên cứu chẩn đoán 200 ca bệnh nghi ngờ rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid bẩm sinh (TSTTBS, RLPTGT) tại khoa Nội tiết – Chuyển hóa – Di truyền, Bệnh viện Nhi trung ương và khoa Phẫu thuật Nhi, Bệnh viện Hữu nghị Việt Đức.
Tiêu chuẩn lựa chọn khi có một hoặc nhiều dấu hiệu sau:
Người bệnh TSTTBS: Tiêu chuẩn lâm sàng và xét nghiệm dựa vào tiêu chuẩn của New MI công bố [3]
Triệu chứng lâm sàng của bệnh bao gồm bộ phận sinh dục không rõ ràng, khó phân biệt giới tính do phì đại âm vật và môi lớn nhăn nheo ở trẻ sơ sinh Trẻ nam có thể dậy thì sớm với các dấu hiệu như dương vật to lên nhanh và mọc lông mu Cả trẻ nam và nữ đều có thể bị sạm da, mất nước, chậm tăng cân, nôn và tiêu chảy.
Người bệnh rối loạn phát triển giới tính không do TSTTBS theo phân loại Chicago 2006 [118]:
Người bệnh có thể có bất thường ở bộ phận sinh dục, dấu hiệu nữ hóa ở người có ngoại hình nam, hoặc các dấu hiệu bất thường ở nữ như vô kinh tiên phát Đặc điểm chung là sự xuất hiện đồng thời đặc điểm giới tính nam và nữ trên cùng một cơ thể.
Gia đình và/hoặc người bệnh nghi ngờ mắc TSTTBS và RLPTGT chấp thuận và ký phiếu tình nguyện tham gia nghiên cứu (phụ lục 1)
Các đối tượng nghiên cứu không đồng ý tham gia nghiên cứu
Người bệnh rối loạn sinh tổng hợp hormon steroid mắc phải như Cushing, Addison, hội chứng Conn, khối u tuyến thượng thận.
Trang bị, hoá chất và chất liệu nghiên cứu
- Máy sắc ký khí – khối phổ: GC 7890A –MS 5975 của hãng Agilent Cột sắc ký HP-5MS dài 30m, đường kính trong 0,25 mm, chiều dày film 0,25 àm (Agilent)
Máy hóa sinh tự động Beckman Coulter 2700 được sử dụng để định lượng creatinine niệu Thiết bị này cũng đo nồng độ các chất điện giải trong huyết tương như natri, kali, clo Nguyên lý hoạt động của máy dựa trên việc sử dụng điện cực chọn lọc.
- Máy miễn dịch tự động Cobas e601 của hãng Roche dùng trong định lượng cortisol, ACTH, testosterone theo nguyên lý phản ứng miễn dịch điện hóa phát quang ECLIA
- Manifold để tách chiết ở pha lỏng của steroid niệu sau thủy phân
- Máy lắc IKA vortex Genius 3
- Máy trộn Roller-Mixer của DAIHAN Scientific
- Máy Multivortex của THOMAS Scientific
- Cân phân tích CPA3235 của SARTORIUS để cân hóa chất cần pha
- Máy đo pH dung dịch ORION 3 STAR pH Benchop để đo pH dung dịch đệm acetat 2M dùng trong thủy phân steroid liên hợp trong nước tiểu
- Tủ sấy Manheim của Đức dùng tạo dẫn xuất steroid ở 80 0 C và 110 0 C
- Thiết bị làm khô sử dụng khí nitơ để loại bỏ methanol trong mẫu sau khi rửa giải loại Dry block heater của Ratek
- Máy ly tâm, tủ lạnh 2-8 o C, -20 o C, pipette, tủ hút hóa chất
- Các trang thiết bị cần thiết trong phòng xét nghiệm: găng tay, khẩu trang
Hệ thống sắc ký khí khối phổ (GC/MS) Agilent, một thiết bị quan trọng tại khoa Hóa sinh – Bệnh viện Nhi Trung ương, đóng vai trò then chốt trong việc thực hiện nghiên cứu này, hỗ trợ phân tích và định lượng các hợp chất hữu cơ một cách chính xác.
2.2.2 Hoá chất và vật tư tiêu hao
Hóa chất định lượng steroid niệu gồm:
- Chất chuẩn steroid niệu (Standard steroid urine) dạng đông khô của SKML (Hà Lan), chứa nồng độ xác định các steroid cần định lượng như An,
Để định lượng steroid niệu một cách chính xác, cần xây dựng đường chuẩn bằng cách sử dụng các chuẩn steroid như Et, DHEA, 11keto An, 11OH An, 11OH Et, PD, PT, A’3, THE, THF, 5a-THF, α-cortolone, β-cortolone, α-cortol, và β-cortol.
- Steroid tinh khiết (pure steroid của Steraloids/Sigma): các steroid tinh khiết
99% được sử dụng để xác định thời gian lưu và mảnh ion đặc hiệu, giúp xác định các steroid niệu trong mẫu thử Các steroid tinh khiết như An, Et, DHEA, 11-OH An, PD, PT, THE, THF, 5α-THF được sử dụng trong quá trình này.
Chuẩn nội Androstanol (5α-ANDROSTAN-3β-OL) của IsoSciences, mã 14283, dạng đông khô, lọ 100mg, được sử dụng để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình xét nghiệm bằng cách thêm một lượng nhất định sau khi pha với methanol.
- Acid acetic bình dung tích 2,5L của Merck loại đậm đặc 100% dùng để pha dung dịch đệm acetat 2M (mã số hóa chất 1.00063.2500)
- HCl (hydrochloric acid fuming 37%) của hãng Merck- sản xuất tại Đức Hóa chất dạng dung dịch, chai 1L, (mã hóa chất 1.00317.1000)
- Methanol dung tích 2,5L của hãng Merck sản xuất tại Đức, (mã hóa chất
10909809 742) Dùng để hoạt hóa cột Bond Elut, rửa giải và pha chuẩn nội, steroid tinh khiết
- Enzym β-Glucuronidase/arylsulphatase của hãng KURA loại dung dịch 10mL hoặc 25mL để thủy phân steroid liên hợp
- Nitrogen có độ tinh khiết rất cao, mã số UN 1066, nồng độ ≥99,999% dùng làm khô sản phẩm steroid sau tách chiết
- Helium có độ tinh khiết cao, mã số UN 1046 dùng để sắc ký khí
- Methoxyamine hydrochloride độ tinh khiết 98%, lọ 5G dạng bột của hãng Sigma Aldrich, (mã 101397955) dùng để tạo dẫn xuất với steroid
- Pyridine dạng dung dịch chai 1L của hãng Sigma Aldrich có độ tinh khiết
≥99,5% (mã hóa chất 33553), sử dụng để pha methoxyamine
- Sodium acetate anhydrous dạng bột, loại 1000G của Merck dùng để pha đệm acetat 2M trong quá trình thủy phân steroid liên hợp
- Sodium -L-ascorbate (vitamin C), (mã hóa chất A4034), lọ 100G dạng bột của hãng Sigma Aldrich có độ tinh sạch ≥98% nhằm ổn định các steroid tự do
- Iso-octan dạng dung dịch 1L của hãng Sigma Aldrich dùng để tách chiết steroid sau khi đã thủy phân và tạo dẫn xuất
- TMSI (n-Trimethylsilylimidazole) dạng dung dịch, lọ 25mL của SUPELCO, sản xuất tại Hoa Kỳ, (mã hóa chất 33068U)
- Nước cất tinh khiết dành cho sắc ký: dung tích 2,5L của hãng Merck sản xuất tại Đức dùng để pha hóa chất, chất chuẩn
Vật tư tiêu hao bao gồm: Lọ thủy tinh 2 mL có nắp, ống nghiệm thủy tinh chịu nhiệt loại 7mL và 10mL của Kimax hoặc Pirex
Cột Bond-Elut C18 dùng để tách chiết, tinh sạch các steroid tự do
Bảng 2.1: Các sản phẩm steroid niệu được định lượng
Steroid niệu Thời gian lưu (phút)
5α-THF 24,1 562 472 α-Cortolone 24,4 449 359 β-Cortol 24,5 343 243 β-Cortolone 24,8 449 359 α-Cortol 25,1 343 243
THS là steroid có trong mẫu steroid tinh khiết được sử dụng để bán định lượng THS trong mẫu thử do mẫu chuẩn không có nồng độ cho THS
- Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên của trẻ khỏe mạnh và người bệnh nghi mắc TSTTBS, RLPTGT Yêu cầu của mẫu nước tiểu:
Không sử dụng chất bảo quản
Thể tích cần thiết > 3mL nước tiểu
Bảo quản: mẫu nước tiểu sau khi lấy được bảo quản tạm thời ở 2 - 8 o C tối đa được 2 tuần Bảo quản ở -20 o C đến khi phân tích (tối đa được 6 tháng)
Thời gian thu thập mẫu: 10/2015-7/2018.
Phương pháp nghiên cứu
- Nghiên cứu mô tả, cắt ngang
2.3.1 Thẩm định kỹ thuật định lượng steroid niệu bằng GC/MS
2.3.1.1 Quy trình định lượng steroid niệu
Quy trình chuẩn bị mẫu được thực hiện thủ công, cải tiến từ kỹ thuật của Honour JW, kéo dài khoảng 28 giờ trước khi phân tích GC/MS.
A Chuẩn bị hoá chất, thuốc thử:
Để pha dung dịch chuẩn steroid niệu từ dạng đông khô, thêm 15 mL nước cất vào lọ chuẩn và ổn định trong 15 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó, trộn đều dung dịch và chia nhỏ vào các eppendorf (2mL mỗi ống) để bảo quản ở -20°C.
Chuẩn bị hỗn hợp steroid tinh khiết:
Cân chính xác khoảng 8 mg steroid tinh khiết và hòa tan trong 100 mL methanol trong tủ hút hóa chất, ghi lại khối lượng Để dung dịch tan hoàn toàn ở 37°C và bảo quản ở -20°C.
Chuẩn nội Androstanol: cân khoảng 10 mg chuẩn nội, hoà tan trong 100 mL methanol, thao tác thực hiện trong tủ hút hóa chất, bảo quản ở 4 o C
Để kiểm soát chất lượng (QC) xét nghiệm, chúng tôi tự chuẩn bị vật liệu kiểm tra do thiếu mẫu nội kiểm thương mại, sử dụng mẫu nước tiểu thu thập từ người khỏe mạnh (mẫu trộn bình thường) và người bệnh TSTTBS đã chẩn đoán (mẫu trộn bệnh lý), chia nhỏ và bảo quản ở -20°C.
SKML's External Quality Assessment (EQA) materials are used in the UCLH Urine Steroid Profile External Quality Assessment Scheme, an international program involving 28 laboratories worldwide The program consists of 12 lyophilized samples per cycle, with one sample tested per month.
Để tối ưu hoạt tính enzym thủy phân steroid liên hợp, cần sử dụng đệm acetat 2M (pH 5,0 - 5,2) được pha chế từ dung dịch acetat 2M và acid acetic 2M theo tỉ lệ thích hợp, đồng thời kiểm tra và điều chỉnh pH đến giá trị yêu cầu.
Để tạo dung dịch methoxyamine hydrochloride 3%, cân 100 mg methoxyamine hydrochloride và hòa tan trong 3 mL pyridine, thao tác này cần thực hiện trong tủ hút hóa chất để đảm bảo an toàn.
Ascorbate: pha 10 mg/1mL nước cất sử dụng ngay mỗi lần phân tích
B Các bước chuẩn bị mẫu: thuỷ phân, tách chiết steroid niệu và tạo dẫn xuất
Để chuẩn bị mẫu nội kiểm và ngoại kiểm, cũng như mẫu bệnh phẩm và chất chuẩn, cần sử dụng ống thủy tinh 10mL chứa đệm acetat, thêm chuẩn nội, enzym glucuronidase/sulphatase và ascorbate đã pha chế.
Để thủy phân steroid liên hợp, mẫu được trộn đều và ủ với enzym β-glucuronidase/arylsulfatase qua đêm ở 37°C, sau đó ly tâm ở 4000 rpm trong 5 phút.
Bảng 2.2: Cách thức tiến hành định lượng steroid niệu Ống Loại mẫu Thể tích mẫu
Chuẩn nội Đệm acetat Enzym Ascorbate
2 Steroid tinh khiết 0,2 mL 100 μL 3 mL 100 μL 100 μL
3 Mẫu trộn bình thường 2 mL 100 μL 3 mL 100 μL 100 μL
4 Mẫu trộn bệnh lý 2 mL 100 μL 3 mL 100 μL 100 μL
Để tách chiết steroid tự do, sử dụng cột Blond – Elut C18, hoạt hóa cột bằng methanol, sau đó rửa sạch bằng nước cất tinh khiết Cho bệnh phẩm đã thủy phân lên cột, loại bỏ tạp chất bằng nước cất, và cuối cùng tách steroid tự do bằng methanol.
Làm khô dung dịch methanol chứa steroid bằng thiết bị làm khô sử dụng khí nitơ ở 70 o C
Tạo dẫn xuất với methoxyamin: cho 100 μL methoxyamin/pyridin 3% đã pha, votex và ủ ở 80 o C trong 1,5 giờ
Tạo dẫn xuất silyl: cho 100 μL TMSI votex rồi ủ ở 110 o C trong 3,5 giờ
Tách chiết bằng iso – octan thu được mẫu để phân tích trên GC/MS: cho
400 μL HCl 1M và 600 μL iso-octan, votex 10 phút, để lắng tự nhiên rồi hút dịch nổi vào glass-insert là mẫu để phân tích trên hệ thống GC/MS
C Phân tích steroid bằng hệ thống GC/MS sau chuẩn bị mẫu
- Sử dụng hệ thống GC 7890A –MS 5975 (Agilent), cột sắc ký HP-5MS, bơm bằng bơm tự động Agilent 7693 Chương trình nhiệt độ lò cột từ 180 đến
Phân tích steroid được thực hiện bằng sắc ký khí khối phổ (GC-MS) với quy trình tối ưu hóa: gia nhiệt ở 300°C trong 30 phút, tốc độ dòng khí heli 1 mL/phút, và sử dụng phương pháp SIM để phát hiện các ion đặc hiệu cho từng steroid.
Xây dựng đường chuẩn bằng cách phân tích mẫu chuẩn chứa 16 steroid đã biết, song song với mẫu bệnh phẩm và các mẫu kiểm soát chất lượng Đường chuẩn được thiết lập riêng cho từng chất phân tích, dựa trên nồng độ steroid đã biết trong mẫu chuẩn Phần mềm ChemStation được sử dụng để xác định nồng độ steroid trong các mẫu thử sau khi đường chuẩn đã được thiết lập.
Mẫu steroid tinh khiết được sử dụng để xác định thời gian lưu, làm cơ sở cho việc nhận diện và phân tích steroid trong các mẫu chuẩn và mẫu bệnh, đảm bảo tính chính xác của quá trình kiểm nghiệm (SEO: steroid, thời gian lưu, mẫu chuẩn, mẫu bệnh, kiểm nghiệm).
2.3.1.2 Thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu bằng GC/MS
Thực nghiệm xác định giới hạn định lượng (LoQ) bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn pha loãng 5 lần ở 5 nồng độ khác nhau, nhằm xác định giới hạn nhỏ nhất mà mỗi steroid có thể phát hiện được một cách định lượng Mỗi dung dịch chuẩn pha loãng được đo lặp lại 4 lần để tính toán giá trị LoQ.
SD và CV Giới hạn định lượng là nồng độ chất chuẩn ở mức thấp nhất được phát hiện mà CV ≤ 20% giữa các lần phân tích
Thực nghiệm đánh giá độ lặp (precision):
Độ lặp lại được đánh giá thông qua việc đo lặp lại 20 lần trên cả mẫu nước tiểu trộn bình thường và mẫu trộn bệnh lý trong cùng một lần phân tích, thực hiện trong một ngày duy nhất.
- Độ tái lặp được đánh giá bằng cách phân tích hai mẫu nước tiểu bình thường và bệnh lý > 20 lần trong > 20 mẻ phân tích khác nhau
Kết quả thẩm định phương pháp định lượng steroid niệu
3.1.1 Giới hạn định lượng và độ thu hồi Bảng 3.1: Giới hạn định lượng và độ thu hồi của các steroid niệu
Giới hạn định lượng Độ thu hồi (%)
Giới hạn định lượng (μmol/L) CV (%)
5α-THF 0,11 18,07 106,3 α-Cortolone 0,09 8,32 91,3 β-Cortol 0,11 15,16 91,8 β-Cortolone 0,06 10,9 99,4 α-Cortol 0,27 13,09 90,9
Giới hạn định lượng của phần lớn steroid niệu nằm trong khoảng 0,05 đến 0,16 μmol/L, tuy nhiên α-Cortol và A’3 có giới hạn cao hơn nhưng ít giá trị chẩn đoán Độ thu hồi trung bình của các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu đạt 104,1 ± 9,25%, cho thấy quy trình phân tích có độ tin cậy cao.
3.1.2 Độ lặp và độ tái lặp
Bảng 3.2: Độ lặp lại của các steroid niệu
Mẫu trộn bình thường Mẫu trộn bệnh lý
The repeatability of urinary steroids, measured using a normal mixed sample, exhibits a coefficient of variation (CV) ranging from 1.01% to 7.72%, while a pathological mixed sample shows a CV ranging from 0.78% to 9.72% Specific steroid measurements include 5α-THF (3.03, 0.132, 4.34, 8.02, 0.459, 5.70), α-Cortolone (3.13, 0.051, 1.62, 4.42, 0.090, 2.04), β-Cortol (1.22, 0.053, 2.82, 1.23, 0.041, 3.33), β-Cortolone (2.13, 0.045, 2.11, 3.16, 0.075, 2.36), and α-Cortol (0.49, 0.030, 6.12, 0.80, 0.031, 3.95).
Giá trị trung bình của CV ở mẫu trộn bình thường là 4,0 ± 2,2 (%) và mẫu trộn bệnh lý là 4,7 ± 2,7(%) (X ± SD)
Bảng 3.3: Độ tái lặp của các steroid niệu
Mẫu trộn bình thường Mẫu trộn bệnh lý
5α-THF 3,46 0,48 13,81 8,48 1,23 14,53 α-Cortolone 3,36 0,40 11,83 5,19 0,78 15,7 β-Cortol 1,39 0,20 14,53 1,47 0,22 15,26 β-Cortolone 2,37 0,30 12,65 3,56 0,47 13,14 α-Cortol 0,58 0,08 13,37 0,85 0,14 16,95 Độ tái lặp của các steroid niệu có CV 10,16 - 14,53(%) ở mẫu trộn bình thường và 12,51 – 16,95(%) ở mẫu trộn bệnh lý Giá trị trung bình ± SD của
CV ở mẫu bình thường là 12,85 ± 1,24(%) và mẫu bệnh lý là 14,86 ± 1,4 (%) (X ± SD)
3.1.3 Kết quả ngoại kiểm steroid niệu
Chương trình ngoại kiểm steroid niệu bằng GC/MS có sự tham gia của
28 phòng xét nghiệm Một trong số các kết quả chúng tôi nhận được (mẫu số 2 năm 2018) như sau:
Biểu đồ 3.1: Kết quả ngoại kiểm
Phòng xét nghiệm Hóa sinh – Bệnh viện Nhi Trung ương tham gia ngoại kiểm SKML cho 16 steroid niệu, đạt kết quả cao nhất với 3 điểm Giá trị MOM được sử dụng để tính điểm và xếp hạng, phòng xét nghiệm xếp thứ nhất trong số 28 đơn vị tham gia vào tháng 2 năm 2018.
Bảng 3.4 Mối tương quan kết quả phòng xét nghiệm với ngoại kiểm
Steroid niệu Hệ số a Hệ số b
11Keto An 1,106 -0,065 y=1,106x-0,065 0,991 11-OH An 1,042 -0,068 y=1,0x-0,068 0,996 11-OH Et 0,611 0,039 y=0,611x+0,039 0,981
PT 0,997 0,039 y=0,997x+0,039 0,999 A’3 1,149 -0,042 y=1,149x-0,042 0,995 THE 1,250 -0,891 y=1,25x-0,891 0,990 THF 1,113 -0,406 y=1,113x-0,406 0,995 5α-THF 1,148 -0,037 y=1,148x-0,037 0,970 α-Cortolone 1,124 -0,211 y=1,124x-0,211 0,981 β-Cortolone 1,113 - 0,082 y=1,113x-0,082 0,992 α-Cortol 1,00 -0,01 y=1,0x-0,01 0,997 β-Cortol 1,013 -0,006 y=1,013x-0,006 0,994
Kết quả từ 17 mẫu ngoại kiểm cho thấy sự tương quan chặt chẽ giữa steroid niệu và kết quả EQA, với hệ số tương quan từ 0,970 đến 0,999 Phương trình tương quan có dạng y = a.x + b, trong đó y là kết quả phòng xét nghiệm và x là kết quả ngoại kiểm Hệ số góc a xấp xỉ 1,0 và giao điểm b xấp xỉ 0, cho thấy đường thẳng tuyến tính gần như đi qua gốc tọa độ.
Riêng THE và DHEA cao hơn giá trị ngoại kiểm với hệ số a là 1,25 và 11-OH
Kết quả xét nghiệm thấp hơn giá trị ngoại kiểm với hệ số a là 0.611, nhưng phần lớn tương đồng nằm trong khoảng ±2SD so với ngoại kiểm.
Biểu đồ 3.2 Tương quan kết quả An
Hệ số tương quan r = 0,991; hệ số góc a = 0,969; giao cắt trục tung tại điểm có giá trị b = - 0,015
Biểu đồ 3.3 Tương quan kết quả PT
Hệ số tương quan r = 0,999; hệ số a = 0,977; giao cắt trục tung tại b = 0,039
Biểu đồ 3.4 Sự tương đồng kết quả Et
Kết quả Et tương đồng với trung vị của các phòng xét nghiệm ngoại kiểm Sự khác biệt chỉ là 0,005 àmol/L (0,95 confid interval: -0,206 tới 0,217), loại trừ các điểm đỏ.
Biểu đồ 3.5 Sự tương đồng kết quả DHEA
Giá trị DHEA tương đồng với giá trị trung vị ngoại kiểm, loại trừ điểm màu đỏ Sự khác biệt giữa kết quả của chúng tôi và kết quả trung vị từ các phòng xét nghiệm khác là -0,032 (khoảng tin cậy 95%: -0,197 đến 0,133).
Khoảng tham chiếu các steroid niệu ở trẻ em
Bảng 3.5 Phân bố độ tuổi và giới tính nhóm chứng
Không có sự khác biệt về số lượng trẻ nam và nữ trong từng nhóm tuổi cũng như giữa tổng số nam và tổng số nữ (p> 0,05)
3.2.1 Sự phân bố các steroid niệu
Các sản phẩm chuyển hóa steroid niệu không tuân theo phân phối chuẩn Gaussian, do đó thuật toán thống kê sử dụng giá trị trung vị, giá trị thấp nhất và cao nhất để xử lý số liệu Khoảng tham chiếu 95% được xác định bằng cách lấy giá trị tại các điểm cắt phân vị thứ 2,5 và 97,5 cho mỗi kết quả định lượng steroid niệu.
Biểu đồ 3.6 Sự phân bố nồng độ An ở trẻ nam 8 - ≤11 tuổi
Sự phân bố nồng độ An ở trẻ nam trong độ tuổi 8 - ≤11 không theo quy luật chuẩn, phần lớn dữ liệu tập trung ở bên trái biểu đồ
3.2.2 Khoảng tham chiếu nồng độ các steroid niệu
Bảng 3.6 So sánh nồng độ steroid niệu giữa các nhóm tuổi
Giá trị trung vị (min-max)
Có sự khác biệt rõ rệt về nồng độ các sản phẩm steroid niệu theo nhóm tuổi với p ≤ 0,001 (kiểm định Kruskal – Wallis)
Biểu đồ 3.7 Nồng độ Cortolone và Cortol theo tuổi
Biểu đồ 3.8 Nồng độ An, Et, DHEA, 11Keto An theo tuổi
Et: Etiocholanolone 11Keto An: 11keto Androsterone
Nồng độ Steroid niệu theo nhóm tuổi a-Cortolone b-Cortol b-Cortolone a-Cortol
Nồng độ steroid niệu theo tuổi
An Et DHEA 11Keto An
Biểu đồ 3.9 Nồng độ 11OH An, 11OH Et, PD, PT theo tuổi
11OH An: 11OH-Androsterone PD: Pregnanediol
11OH Et: 11OH-Etiocholanolone PT: Pregnanetriol
Biểu đồ 3.10 Nồng độ A’3, THE, THF, 5α-THF theo tuổi
Nồng độ steroid niệu như A'3, DHEA, và 11keto An biến đổi theo độ tuổi, giảm từ sơ sinh đến 2 tuổi, sau đó tăng ở trẻ trên 8 tuổi, trong khi THE, THF, và 5α-THF tăng dần sau 2 tuổi.
Nồng độ Steroid niệu theo tuổi
11OH An 11OH ET PD PT
Nồng độ Steroid niệu theo nhóm tuổi
Tuổi àmol/ mmol àmol/ mmol
Bảng 3.7 Khoảng tham chiếu steroid niệu ở trẻ sơ sinh
Giá trị trung vị (min-max)
(μmol/mmol creatinine) Khoảng tham chiếu
11 Keto-An 0,09(0,01 – 0,71) 0,09(0,01 – 1,25) 0,393 0,01 – 0,58 11OH-An 0,03(0 – 0,22) 0,02(0 – 0,18) 0,706 0 – 0,20 11OH Et 0,02(0 – 0,10) 0,03(0,01 – 0,20) 0,058 0 – 0,14
PT 0,05(0,01–1,03) 0,04(0 – 0,13) 0,156 0 – 0,25 A’3 1,74(0,06 – 123,6) 0,47(0,04 – 12,4) 0,211 0,05 – 18,9 THE 0,77(0,09 – 14,4) 0,92(0,31 – 1,84) 0,310 0,16 – 2,76 THF 0,19(0,01 – 4,11) 0,16(0,01 – 0,90) 0,389 0,01 – 0,87 5α-THF 0,3(0,04 – 15,7) 0,36(0,01 – 4,13) 0,893 0,02 – 4,0 α-Cortolone 0,03(0,01 – 0,33) 0,03(0 – 0,09) 0,357 0 – 0,20 β-Cortol 0,02(0 – 0,43) 0,02(0 – 0,05) 0,404 0 – 0,12 β-Cortolone 0,19(0,01 – 3,54) 0,2(0,03 – 0,42) 0,609 0,02 – 0,68 α-Cortol 0,03(0 – 0,72) 0,02(0 – 0,53) 0,170 0 – 0,53 THS 0,01(0 – 0,20) 0,01(0 – 0,1) 0,552 0 – 0,10
Kiểm định Mann-Whitney được sử dụng cho biến không tuân theo phân phối chuẩn, cho thấy không có sự khác biệt về nồng độ steroid niệu giữa trẻ sơ sinh nam và nữ (p > 0,05) Mẫu nước tiểu của trẻ sơ sinh chủ yếu chứa DHEA, A’3, THE, THF, 5α-THF, β-cortolone, trong khi các steroid niệu khác có nồng độ rất thấp.
Bảng 3.8 Khoảng tham chiếu steroid niệu của trẻ 1 tháng - < 2 tuổi
Giá trị trung vị (min-max) μmol/mmol creatinine Khoảng tham chiếu
11 Keto-An 0,01(0 – 0,71) 0,01(0 – 0,28) 0,473 0 – 0,26 11OH-An 0,02(0 – 0,79) 0,04(0 –1,05) 0,278 0 – 0,70 11OH Et 0,01(0 – 0,71) 0,01(0 – 0,18) 0,493 0 – 0,17
Nam: 0 – 0,36 Nữ: 0,01–0,25 A’3 0,15(0 – 6,89) 0,17(0 – 5,5) 0,942 0 – 5,42 THE 0,93(0,05 – 22,1) 0,97(0,1 – 6,76) 0,634 0,08 – 6,6 THF 0,15(0,02 – 0,91) 0,11(0,02 – 1,46) 0,507 0,02 – 0,9 5α-THF 0,22(0,02 – 1,93) 0,17(0,02 – 3,33) 0,428 0,02 – 2,47 α-Cortolone 0,15(0 – 0,71) 0,15(0 – 3,47) 0,540 0 – 1,15 β-Cortol 0,05(0 – 0,71) 0,03(0 – 0,18) 0,660 0 – 0,19 β-Cortolone 0,28(0,01 – 1,09) 0,22(0,02 – 12,3) 0,729 0,01 – 1,17 α-Cortol 0,04(0 – 0,71) 0,05(0 – 2,05) 0,398 0 – 0,67 THS 0,01(0 – 0,71) 0,01(0 – 0,10) 0,702 0 – 0,10
Kiểm định Mann-Whitney được sử dụng cho các biến không tuân theo phân phối chuẩn, cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ steroid niệu giữa nam và nữ (p > 0,05), ngoại trừ PT ở nữ cao hơn nam (p = 0,024) Phần lớn các chất chuyển hóa steroid niệu ở trẻ từ 1 tháng đến dưới 2 tuổi đều rất thấp.
Bảng 3.9 Khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ 2 - < 8 tuổi
Giá trị trung vị (min-max) μmol/mmol creatinine Khoảng tham chiếu Nam (nC) Nữ (n1) p*
11 Keto-An 0,03(0 – 0,34) 0,02(0 – 1,32) 0,383 0 – 0,29 11OH-An 0,09(0 – 0,78) 0,08(0 – 0,52) 0,900 0 – 0,28 11OH Et 0,02(0 – 0,11) 0,01(0 – 0,43) 0,759 0 – 0,10
PT 0,04(0 – 0,23) 0,05(0,01 – 0,87) 0,159 0 – 0,18 A’3 0,03(0 – 0,42) 0,02(0 – 0,76) 0,755 0 – 0,30 THE 1,88(0,02 – 4,46) 1,75(0,02 – 18,2) 0,943 0,02 – 4,34 THF 0,5(0,01 – 1,31) 0,45(0,03 –5,24) 0,529 0,03 – 1,14 5α-THF 0,77(0,02 – 2,87) 0,64(0,03 – 12,4) 0,352 0,03 – 2,43 α-Cortolone 0,46(0,01 – 2,87) 0,49(0,01 – 16,1) 0,822 0,01 – 2,74 β-Cortol 0,15(0,01 – 0,46) 0,15(0 – 3,9) 0,726 0,01 – 0,33 β-Cortolone 0,3(0 – 0,89) 0,32(0,01 – 8,7) 0,714 0 – 0,82 α-Cortol 0,1(0 – 0,83) 0,09(0 – 4,0) 0,697 0 – 0,6 THS 0,01(0 – 0,10) 0,01(0 – 0,04) 0,136 0 – 0,04
Kiểm định Mann-Whitney được sử dụng cho biến không tuân theo phân phối chuẩn, trong khi đó, ở trẻ 2-8 tuổi, steroid androgen thấp nhưng steroid cortisol lại có xu hướng tăng.
Bảng 3.10 Khoảng tham chiếu steroid niệu cho trẻ 8 - ≤11 tuổi
Giá trị trung vị (min-max) μmol/mmol creatinine Khoảng tham chiếu Nam (n)) Nữ (nA) p*
Kiểm định Mann-Whitney được sử dụng cho biến không tuân theo phân bố chuẩn, cho thấy steroid niệu ở trẻ 8-11 tuổi thường cao hơn so với nhóm tuổi trước Nồng độ An, Et, 11Keto An, 11OH Et, PD, PT ở nữ cao hơn so với nam (p < 0,05).
3.2.3 Khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán
Để so sánh tỷ lệ chẩn đoán giữa các khoảng tuổi, do sự phân bố không tuân theo quy luật chuẩn, giá trị trung vị, giá trị thấp nhất và giá trị cao nhất được sử dụng.
Bảng 3.11 So sánh tỷ lệ chẩn đoán giữa các nhóm tuổi
Giá trị trung vị, (min-max) p*
An/Et Không xác định
Et/An Không xác định
*Kiểm định Kruskal-Wallis giữa 4 nhóm
Có sự khác biệt giữa các nhóm tuổi của các tỷ lệ với p< 0,01
Tỷ lệ An/Et và Et/An không xác định ở trẻ < 2 tuổi do nồng độ An và Et thấp
Bảng 3.12 Khoảng tham chiếu tỷ lệ chẩn đoán cho trẻ sơ sinh
Giá trị trung vị, (min-max) Khoảng tham chiếu
Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ PT/ (THE +THF +5α-THF) ở trẻ sơ sinh nam cao hơn đáng kể so với nữ (p