Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ nấm rhizoctonia solani gây ra bệnh lở cổ rễ hại một số cây trồng cạn

Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ của nấm đối kháng Trichoderma viride với bệnh lở cổ rễ hại một số cây trồng trong điều kiện chậu vại .... Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trich

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng vi sinh vật đối kháng phòng trừ nấm Rhizoctonia solani gây bệnh lở cổ rễ hại một số cây trồng cạn

- Các giống cây trồng: cải canh, đậu xanh, đậu đen, đậu cove

Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm rất đa dạng và cần thiết, bao gồm tủ lạnh, tủ định ôn, buồng cấy, nồi hấp, kính hiển vi quang học, bếp điện, lò vi sóng, cân điện tử, cân bàn, đĩa petri, bình tam giác, bình định mức, ống đong, dao cắt và đèn cồn Những thiết bị này hỗ trợ hiệu quả cho các thí nghiệm và nghiên cứu khoa học.

-Nguyên liệu: đường glucose, sacarose, agar, khoai tây, nước cất, cồn và một số hóa chất thiết yếu dùng để điều chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật

- Môi trường nuôi cấy nấm: PGA

Nguồn vi sinh vật đối kháng bao gồm nấm Trichoderma viride và vi khuẩn Bacillus subtilis, được cung cấp bởi bộ môn bệnh cây thuộc khoa Nông học của Học viện Nông nghiệp Việt Nam.

* Danh mục các isolate nấm đối kháng Trichoderma viride sử dụng trong thí nghiệm

STT Isolate nấm đối kháng Trichoderma viride Kí hiệu

1 Nấm T viride gốc – Bộ môn Bệnh cây TV-G

2 Nấm T viride 1 – Bộ môn Bệnh cây TV-1

3 Nấm T viride 2 – Bộ môn Bệnh cây TV-2

4 Nấm T viride 3 – Bô môn Bệnh cây TV-3

Hình 3.1 Danh mục các isolate nấm đối kháng Trichoderma viride sử dụng trong thí nghiệm

* Danh mục các isolate vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis sử dụng trong thí nghiệm

STT Isolate vi khuẩn đối kháng Bacillus cubtilis Kí hiệu

1 Vi khuẩn B.subtilis – Bộ môn Bệnh cây BS-G

2 Vi khuẩn B Subtilis phân lập từ đất trồng ớt – Bộ môn Bệnh cây BS-O

3 Vi khuẩn B Subtilis phân lập từ đất trồng cà chua – Bộ môn Bệnh cây

4 Vi khuẩn B.subtilis – Bộ môn Bệnh cây HT-7

Hình 3.2 Danh mục các isolate vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis sử dụng trong thí nghiệm

3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu:

- Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm P111 bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Hà Nội

- Một số vùng trồng cải canh, cải ngọt mồng tơi, đậu cô ve, đậu tương, đậu xanh, đậu đen ở Hà Nội

- Nhà lưới sau nhà B, khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam -

Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ tháng 12 năm 2020 đến tháng 6 năm 2021

- Điều tra diễn biến bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani Kühn) hại một số cây trồng cạn

- Thu thập phân ly nuôi cấy, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của các isolate nấm Rhizoctonia solani

- Nghiên cứu ảnh hưởng của vi sinh vật đối kháng với Isolate nấm trên môi trường PGA

- Nghiên cứu tính gây bệnh của nấm Rhizoctonia solani Kühn trên một số cây trồng cạn trong điều kiện chậu vại

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma viride và vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis đối với các isolate nấm Rhizoctonia solani trong môi trường PGA Kết quả cho thấy Trichoderma viride và Bacillus subtilis có khả năng ức chế sự phát triển của Rhizoctonia solani, mở ra triển vọng ứng dụng trong quản lý bệnh hại cây trồng.

- Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ của nấm đối kháng Trichoderma viride đối với bệnh lở cổ rễ (R solani) trong điều kiện chậu vại

3.5.1 Phương pháp điều tra bệnh lở cổ rễ Điều tra tình hình bệnh lở cổ rễ ở ngoài đồng ruộng theo quy chuẩn QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng Chọn ruộng, chọn loại cây trồng, điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc, cố định điểm điều tra, mỗi điểm điều tra 50 cây, điểm điều tra cách bờ ít nhất 2m, đếm số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%), điều tra định kỳ 7 ngày một lần

3.5.2 Phương pháp phân ly nuôi cấy nấm Rhizoctonia solani

Mẫu bệnh lở cổ rễ cần được rửa sạch dưới vòi nước, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng ba lần và lau khô bằng giấy thấm vô trùng Cắt mô bệnh với kích thước 1-2 x 1-2mm, chú ý cắt phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe, sau đó sát trùng bằng cồn 70 độ trong 15 giây và nhúng vào nước cất vô trùng Tiếp theo, thấm khô bằng giấy thấm vô trùng và dùng que cấy đã khử trùng để cấy mô bệnh vào đĩa môi trường WA, giữ ở nhiệt độ 25 độ C Khi sợi nấm mọc cách mô bệnh khoảng 1cm, dùng que cấy cắt phần đầu sợi nấm và chuyển sang môi trường PGA, tiếp tục cấy chuyển cho đến khi thu được nấm thuần phục vụ cho các thí nghiệm trong phòng và nhà lưới.

3.5.3 Phương pháp điều chế môi trường

Khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng cách rửa sạch với xà phòng, để ráo nước, sau đó lau lại bằng cồn 70% Tiếp theo, đóng gói dụng cụ bằng giấy bạc bọc thực phẩm và đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 160°C để đảm bảo vệ sinh.

* Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)

Thành phần môi trường bao gồm 200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar và 1000ml nước cất Để điều chế, chọn khoai tây không bệnh, gọt vỏ và rửa sạch, sau đó thái lát mỏng và nấu với 1000ml nước trong 15-20 phút Lọc qua vải lọc và bổ sung nước cất đủ 1000ml Tiếp theo, cho từ từ 20g agar và 20g glucose vào, khuấy đều và đun sôi Đổ hỗn hợp vào các bình tam giác thủy tinh và hấp khử trùng ở 121°C (1,5 atm) Để nguội ở 50°C – 60°C trước khi rót vào đĩa petri đã được khử trùng, sau đó bọc kỹ và bảo quản trong tủ lạnh, ghi rõ tên môi trường và ngày nấu.

3.5.4 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển của nấm Rhizoctonia solani

Nghiên cứu hình thái của nấm Rhizoctonia solani Kühn được thực hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trường PGA Qua quá trình này, chúng tôi đã quan sát sự hình thành và phát triển của tản nấm, bao gồm màu sắc, đường kính và khả năng hình thành hạch.

*Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Rhizoctonia solani

- Tiến hành nghiên cứu, đánh giá sự phát triển của các isolate nấm

Rhizoctonia solani Kühn trên 3 môi trường dinh dưỡng: PGA

Mỗi môi trường tiến hành cấy nhắc lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa petri

- Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát đặc điểm hình thái và màu sắc tản nấm Đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3 ngày nuôi cấy

3.5.5 Khảo sát hiệu lực ức chế của nấm vi sinh vật đối kháng với nấm Rhizoctonia solani trên môi trường nhân tạo

* Phương pháp khảo sát hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma viride với nấm Rhizoctonia solani trên môi trường PGA

Thí nghiệm tiến hành trên môi trường PGA, gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 1 đĩa petri (cấy nấm cách mép đĩa 15mm) :

+ Công thức 1(đối chứng): Cấy nấm Rhizoctonia solani Kühn riêng rẽ trên môi trường PGA

+ Công thức 2: Cấy isolate nấm đối kháng Trichoderma viride trước, sau 24h cấy isolate nấm Rhizoctonia solani

+ Công thức 3: Cấy isolate nấm đối kháng T viride và isolate nấm R solani đồng thời

+ Công thức 4: Cấy isolate nấm Rhizoctonia solani trước, sau 24h cấy isolate nấm đối kháng Trichoderma viride

Hình 3.3 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hiệu lực ức chế của các isolates nấm đôi kháng

Trichoderma viride với nấm Rhizoctonia solani

* Phương pháp khảo sát hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng

Bacillus subtilis với nấm Rhizoctonia solani Kühn

Thí nghiệm được thực hiện trong môi trường PGA với 4 công thức, mỗi công thức được lặp lại 3 lần, sử dụng 1 đĩa petri cho mỗi lần Nấm và vi khuẩn được cấy cách mép đĩa 15mm.

+ Công thức 1 (đối chứng): Cấy nấm Rhizoctonia solani Kühn riêng rẽ trên môi trường PGA

+ Công thức 2: Cấy vi khuẩn đối kháng Bacillus subtili trước, sau 24h cấy nấm Rhizoctonia solani Kühn

+ Công thức 3: Cấy đồng thời isolate nấm Rhizoctonia solani Kühn và isolate vi khuẩn đối kháng Bacillus subtili

+ Công thức 4: Cấy isolate nấm Rhizoctonia solani Kühn trước, sau 24h cấy vi khuẩn đối kháng Bacillus subtili

Hình 3.5 Sơ đồ thí nghiệm khảo sát hiệu lực ức chế của các isolate vi khuẩn đối kháng

3.5.6 Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ của nấm đối kháng Trichoderma viride với bệnh lở cổ rễ hại một số cây trồng trong điều kiện chậu vại

Thí nghiệm được tiến hành với 5 công thức, mỗi công thức nhắc lại 2 lần, mỗi lần 1 chậu, mỗi chậu gieo 30 Các công thức được bố trí như sau:

+ Công thức 1: Ngâm hạt giống vào nước sạch trong 15 phút rồi đem gieo + Công thức 2: Ngâm hạt giống vào dịch nấm Rhizoctonia solani trong 15 phút rồi đem gieo

Ngâm hạt giống vào dịch nấm đối kháng Trichoderma viride trong 15 phút trước khi gieo, sau đó xử lý với nấm Rhizoctonia solani khi cây phát triển được 2 lá mầm.

+ Công thức 4: Ngâm hạt giống vào hỗn hợp dịch nấm Rhizoctonia solani và Trichoderma viride trong 15 phút rồi đem gieo

+ Công thức 5: Ngâm hạt giống vào dịch nấm Rhizoctonia solani trước, trong

15 phút rồi đem gieo, khi cây được 2 lá mầm thì xử lý nấm đối kháng Trichoderma viride

Lượng dùng: mỗi công thức sử dụng 1 đĩa petri nấm Rhizoctonia solani hòa với 40ml nước và 1 đĩa petri nấm đối kháng Trichoderma viride hòa với 40ml

Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát và đo đường kính tản nấm sau 1, 2, 3 ngày cấy Tính hiệu lực ức chế của isolate nấm Trichoderma viride với các isolate nấm

Rhizoctonia solani Kühn theo công thức Abbott

3.6 Phương pháp tính toán và sử lý số liệu

A: Tổng số cây bị bệnh B: Tổng số cây điều tra

 Hiệu lực ức chế (HLƯC) của nấm Trichoderma viride với nấm

HLƯC (%) Trong đó: C: Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng

T: Đường kính tản nấm ở các công thức có xử lý T.viride

 Hiệu lực phòng trừ (HLPT) của nấm đối kháng Trichoderma viride với bệnh lở cổ rễ theo công thức Abbott

HLPT (%) Trong đó: C: Tỷ lệ bệnh ở công thức 2

T: Tỷ lệ bệnh ở công thức thí nghiệm

Nghiên cứu đã phân cấp mức độ hiệu lực ức chế của nấm đối kháng T viride và vi khuẩn đối kháng B subtilis đối với nấm gây bệnh trong môi trường nhân tạo, sử dụng công thức PIRG (Percent Inhibition of Radial Growth) Kết quả cho thấy khả năng ức chế của các tác nhân này có thể được đánh giá một cách chính xác, từ đó cung cấp thông tin hữu ích cho việc kiểm soát nấm bệnh.

3.7 Xử lý số liệu thống kê

Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm IRRISTART 5.0 và Excel 2010 Các giá trị trung bình của các nghiệm thức được so sánh thông qua các phương pháp F, t, LSD, và Dulcan với mức xác suất P = 0.95 (α = 0.05) Các giá trị a, b, c,… được ghi nhận có ký hiệu chữ giống nhau cho thấy chúng có giá trị tương đương theo trắc nghiệm Duncan.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm P111 bộ môn Bệnh cây, khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Hà Nội

- Một số vùng trồng cải canh, cải ngọt mồng tơi, đậu cô ve, đậu tương, đậu xanh, đậu đen ở Hà Nội

- Nhà lưới sau nhà B, khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam -

Thời gian nghiên cứu: Đề tài được tiến hành từ tháng 12 năm 2020 đến tháng 6 năm 2021.

Nội dung nghiên cứu

- Điều tra diễn biến bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani Kühn) hại một số cây trồng cạn

- Thu thập phân ly nuôi cấy, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của các isolate nấm Rhizoctonia solani

- Nghiên cứu ảnh hưởng của vi sinh vật đối kháng với Isolate nấm trên môi trường PGA

- Nghiên cứu tính gây bệnh của nấm Rhizoctonia solani Kühn trên một số cây trồng cạn trong điều kiện chậu vại

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma viride và vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis đối với các isolate nấm Rhizoctonia solani trong môi trường PGA Kết quả cho thấy cả Trichoderma viride và Bacillus subtilis đều có khả năng ức chế sự phát triển của Rhizoctonia solani, mở ra triển vọng ứng dụng trong quản lý bệnh hại cây trồng.

- Nghiên cứu hiệu lực phòng trừ của nấm đối kháng Trichoderma viride đối với bệnh lở cổ rễ (R solani) trong điều kiện chậu vại.

Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp điều tra bệnh lở cổ rễ Điều tra tình hình bệnh lở cổ rễ ở ngoài đồng ruộng theo quy chuẩn QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng Chọn ruộng, chọn loại cây trồng, điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc, cố định điểm điều tra, mỗi điểm điều tra 50 cây, điểm điều tra cách bờ ít nhất 2m, đếm số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%), điều tra định kỳ 7 ngày một lần

3.5.2 Phương pháp phân ly nuôi cấy nấm Rhizoctonia solani

Mẫu bệnh lở cổ rễ cần được rửa sạch dưới vòi nước, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng ba lần và lau khô bằng giấy thấm vô trùng Cắt mô bệnh có kích thước 1-2 x 1-2mm, chú ý cắt phần ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe, sau đó sát trùng bằng cồn 70 độ trong 15 giây và nhúng vào nước cất vô trùng Thấm khô bằng giấy thấm vô trùng, rồi dùng que cấy đã khử trùng để cấy mô bệnh vào đĩa môi trường WA, để ở nhiệt độ 25 độ C Khi sợi nấm mọc cách mô bệnh khoảng 1cm, dùng que cấy cắt phần đầu sợi nấm và chuyển sang môi trường PGA, tiếp tục cấy chuyển cho đến khi thu được nấm thuần phục vụ cho các thí nghiệm trong phòng và nhà lưới.

3.5.3 Phương pháp điều chế môi trường

Khử trùng dụng cụ thủy tinh bằng cách rửa sạch với xà phòng, để ráo nước và lau lại bằng cồn 70% Sau đó, đóng gói dụng cụ bằng giấy bạc bọc thực phẩm và đặt vào tủ sấy ở nhiệt độ 160°C để đảm bảo an toàn vệ sinh.

* Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)

Thành phần môi trường bao gồm 200g khoai tây, 20g glucose, 20g agar và 1000ml nước cất Để điều chế, chọn khoai tây không bệnh, gọt vỏ và rửa sạch, sau đó thái lát mỏng và nấu với 1000ml nước trong 15-20 phút Lọc qua vải lọc và bổ sung nước cất đủ 1000ml Tiếp theo, cho từ từ 20g agar và 20g glucose vào, khuấy đều và đun sôi Đổ hỗn hợp vào các bình tam giác thủy tinh và hấp khử trùng ở 121°C (1,5 atm) Để nguội ở 50°C – 60°C trước khi đổ vào đĩa petri đã được khử trùng, sau khi đổ xong, bọc kỹ và bảo quản trong tủ lạnh, ghi rõ tên môi trường và ngày nấu.