Ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần chỉnh lý tên chi (bambusa schreb ) cho ba loài tre và đánh giá đa dạng nucleotide cho tám loài tre chưa có tên khoa học (bambusa SP ) ở việt nam

Ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần chỉnh lý tên chi (Bambusa Schreb.) cho ba loài tre và đánh giá đa dạng Nucleotide cho tám loài tre chưa có tên khoa học (Bambusa SP.) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

VŨ THỊ THU HIỀN

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNA GÓP PHẦN

CHỈNH LÝ TÊN CHI (BAMBUSA SCHREB.) CHO BA LOÀI TRE

VÀ ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG NUCLEOTIDE CHO TÁM LOÀI TRE

CHƯA CÓ TÊN KHOA HỌC

(BAMBUSA SP.) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - NĂM 201

TSGS TS Lê Xu

MỞ ĐẦU

Chi tre (Bambusa Schreb.) phân bố rộng rãi khắp mọi nơi ở Việt Nam Đây là

nguồn tài nguyên có giá trị trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp, gia dụng, cảnh quan, thực phẩm,… Lần đầu tiên vào cuối thế kỷ XIX, nhà thực vật học người Pháp Balansa (1890) đã phân loại tre Việt Nam có 5 chi và 7 loài, trong đó có 2 loài mới Nhưng đến cuối thế kỷ XX công trình phân loại tre của Lê Nguyên (1971) và Phạm Hoàng Hộ (1972,

1993, 2000) đã công bố khá đầy đủ với số lượng lên tới 22 chi và 123 loài Nguyễn Khắc Khôi và Nguyễn Thị Đỏ (2005) đã công bố Danh lục các loài tre trúc của Việt Nam có 29 chi và 127 loài Trong hợp tác nghiên cứu giữa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam với các chuyên gia Trung Quốc đã công bố danh sách các loài và chi tre trúc ở Việt Nam có

25 chi và 216 loài [10], trong đó chi tre (Bambusa Schreb.) có 67 loài, thì có tới 37 loài

chưa định loại được tên loài (dạng sp và aff.)… Bên cạnh đó Lê Việt Lâm (2008) cũng

đã phát hiện thêm 4 loài mới, trong đó 2 loài chưa xác định tên Hiện nay, việc phân loại

phương pháp đòi hỏi mẫu vật phải có đầy đủ các đặc điểm phân loại đặc biệt là cơ

, hầu hết không có đặc

điểm về cơ quan sinh sản (hoa, quả) vì chu kỳ ra hoa tới vài chục năm Hơn nữa trong

một số trường hợp, phương pháp phân loại bằng hình thái khó thực hiện hoặc nhầm lẫn

do mẫu mang đặc điểm trung gian hoặc đồng hình Khó khăn này không chỉ ở Việt Nam

mà ngay cả trên thế giới Vì vậy, việc định loại tên loài ở chi tre vẫn còn rất nan giải cần

có sự hỗ trợ của kỹ thuật phân tích DNA

Kỹ thuật phân tích DNA cho kết quả khá chính xác, giúp cho việc phát hiện loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, chủng loại phát sinh và sự tiến hóa của nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật So với phương pháp hình thái thì phương pháp DNA cho độ chính xác cao mà không

lệ thuộc vào các yếu tố môi trường Đối với thực vật, hai nhóm gen nhân và gen lục lạp (cpDNA) thường được sử dụng trong các nghiên cứu về tiến hoá, sinh thái và phát sinh chủng loại ở thực vật [26], [33], [41], [46] So với gen nhân thì các gen lục lạp có mức độ

bảo thủ hơn bởi việc thay thế chỉ một vài nucleotide [34], [36], [39], [44] Nhờ có kỹ thuật này, mà trong ngân hàng Genbank (2012) đã lưu giữ 16542 trình tự nucleotide cho phân loại Họ phụ tre (Bambusoideae), trong đó có 607 trình tự nucleotide cho chi

Bambusa, trong số này rất nhiều loài cũng có ở Việt Nam [24], [25] Đây là cơ sở cho

nghiên cứu này Ở Việt Nam có khá nhiều công trình công bố về hiệu quả của việc giải

mã trình tự một số vùng gen giúp cho việc định loại tên loài ở nhiều đối tượng sinh vật [1], [3], [12], nhưng đối với các loài tre mới chỉ có Nguyễn Minh Tâm (2006) đã sử dụng một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam Mặc dù, kết quả thu nhận chưa nhiều nhưng cũng là cơ sở để ứng dụng phương pháp phân tích DNA góp phần cho nghiên cứu để chỉnh lý tên chi và đánh đa dạng nucleotide cho tám loài tre chưa có

tên khoa học (Bambusa Schreb.) ở Việt Nam

Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Ứng dụng phương

pháp phân tích DNA góp phần chỉnh lý tên chi (Bambusa Schreb.) cho ba loài tre và đánh giá đa dạng nucleotide cho tám loài tre chưa có tên khoa học (Bambusa sp.) ở

Việt Nam”, với các mục tiêu sau:

- Chỉnh lý tên chi cho ba loài tre: Dùng cầu hai [Bambusa (Lingnania) sp.], Dùng phấn [Bambusa (Lingnania) chungii] và Lùng thanh hoá [Bambusa

(Lingnania) longissima] thuộc chi Bambusa hay Lingnania

- Đánh giá mức độ đa dạng nucleotide cho 08 loài tre chưa có tên khoa học

(Bambusa sp.): Bạc mày, Mét ba vì, Mạy cượp, Mạy khô, Tre đông khê, Tre

lục bình, Tre không gai tân an và Tre trãi long an

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1 Giới thiệu tổng quát về chi tre (Bambusa Schreb.)

Chi tre có danh pháp khoa học là Bambusa Schreb thuộc họ Poaceae Tre phân bố

ở vùng nhiệt đới, á nhiệt đới và ôn đới Châu Á là nơi có số loài nhiều nhất với 65 chi và

900 loài, châu Mỹ 20 chi và 45 loài, châu Phi 3 chi và 5 loài, châu Đại Dương 4 chi và 4 loài, châu Âu không có tre Trung Quốc là quốc gia chiếm nhiều chi, loài và cá thể nhất với 39 chi và 500 loài, tiếp đến là Nhật Bản 13 chi và 237 loài, Việt Nam 25 chi và 216 loài, Ấn Độ 23 chi và 125 loài,…[10], [18]

Cuối thế kỉ XIX, tre ở Việt Nam được phân loại có 5 chi và 7 loài, trong đó có 2 loài mới [15] Đến cuối thế kỷ XX tre Việt Nam có tới 22 chi và 123 loài [4], [5], [6] Năm 2005 theo Nguyễn Khắc Khôi và Nguyễn Thị Đỏ cho rằng tre Việt Nam có 29 chi

và 127 loài [8] Năm 2006, trong hợp tác nghiên cứu giữa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam với các chuyên gia Trung Quốc lại công bố danh sách các loài và chi tre trúc ở

Việt Nam có 25 chi và 216 loài [10], trong đó chi tre (Bambusa Schreb.) có 67 loài, thì có

tới 37 loài chưa định loại được tên loài (dạng sp và aff.)

Vị trí phân loại của chi tre (Bambusa Schreb.) theo phân loại hệ thống cổ điển, tre

Chi ( genus): Bambusa schreb

1.1.1 Một số đặc điểm sinh học chính của ba loài cần chỉnh lý tên chi

a) Dùng cầu hai (Bambusa (Lingnania) sp.)

Thân ngầm mọc cụm, thân khí sinh cao 12-13 cm, đường kính 4-5,8 cm, tròn đều màu xanh; thân non phủ phấn trắng ở các đốt phía trên Lóng khá dài, 50-55 cm, vách dày

7 mm Vòng mo nhô cao, phủ lớp lông màu hung dày cao 4 mm, phía dưới có vòng phấn

trắng cao 5 mm Mỗi đốt thân mang nhiều cành to gần như nhau, cỡ 4 mm Bẹ mo hình thang, đáy dưới rộng 21,7 cm, cao 22-27 cm, đáy trên rộng 11,2 cm, rụng sớm Phiến mo cụp về phía sau Tai mo rộng 3,5 cm, cao phía trong 4 mm; mép ngoài thò dài 2 cm, cao 8

mm, có hàng lông tua dài 1 cm Lưỡi mo nhỏ cao ở giữa, cao 1,5 mm, mép có răng cưa thấp 0,5 mm Phiến lá hình ngọn giáo, dài 22-24 cm, rộng 2,4-2,5 cm, đầu nhọn, gốc tròn hay tim lệch Tai một bên to (rộng 4 mm) mang 9 lông dài 1,1 cm; một bên nhỏ rất thấp, mang 7 lông, dài 1 cm Cuống lá dài 2 mm, rộng 2 mm Măng tháng 6-8 [10]

b) Dùng phấn (Bambusa (Lingnania) chungii Mc Clure)

Thân ngầm dạng củ, mọc cụm thưa, thân khí sinh đứng thẳng, ngọn hơi cong, cao 5-10 (18) m, đường kính 3-5 (7) cm Lóng dài 30-45(100) cm, vách dày 3-5 mm, khi non phủ dày phấn sáp màu trắng, nhẵn Vòng thân phẳng Mo thân có bẹ mo hình thang, cao 30-35 cm, đáy dưới rộng 23-26 cm, cao 27-30 cm; đáy trên rộng 5,5-6,5 cm, hai đầu nhô cao; mỏng, cứng; màu vàng nhạt Tai mo hình dải hẹp; mép có lông mi màu nhạt, dài mảnh và có ánh bóng Lưỡi mo cao 1,5 mm Phiến mo hình lưỡi mác hay trứng; đầu nhọn, mép cuộn vào trong; gốc hình tròn thu hẹp; đáy rộng bằng khoảng 1/5 đầu bẹ mo (dài 2,5-3 cm, cao 9-12 cm); màu lục-vàng nhạt Tai mo cao 2-3 mm, dài 2-2,5 cm; mép

có hàng lông thô cứng, cao 1,2 cm; mặt trong có lông mềm dày Sự phân cành bắt đầu từ phía trên cao thân, khoảng đốt thứ 8 trở lên; ít hay nhiều cành, mọc cụm, kích thước gần bằng nhau, nhẵn, có phủ sáp Dùng phấn khác với các loài tre khác, mỗi đốt mang nhiều cành phát triển từ 1 gốc giống như Nứa Phiến lá hình lưỡi mác đến lưỡi mác dài, khi già hình dải, dài 10-16 (20) cm, rộng 1-2 cm, hai bên gốc không đối xứng, đầu nhọn, gốc tròn hay gần tròn, khá dày; mặt trên nháp, phần trên có lông; mặt dưới khi non phủ lông nhỏ, khi già nhẵn; gân cấp 2 có 5-6 đôi Thìa lìa 1 mm Tai thấp, có lông cứng thưa, 5-6 cái, dài 1,5 cm Bẹ lá nhẵn Măng vào mùa thu [10]

c) Lùng thanh hoá (Bambusa (Lingnania) longissima)

Thân ngầm mọc cụm dày, thân khí sinh đứng thẳng hay hơi cong; cao 10-20 m, đường kính 6-10 cm Lóng dài 50-80 (100) cm, đôi khi 140-160 cm, tròn đều; khi non màu xanh lục, có phấn trắng; khi già màu xanh vàng, không phấn trắng; vách dày 6-7

mm Mắt nhỏ, tròn, đường kính 1 cm Vòng đốt không phình to, không có vòng rễ; vòng

mo nhô cao, rộng 4 mm, phía dưới nhiều lông màu tím dài 5 mm Phân cành từ khoảng 1/2 dưới thân trở lên, đốt 10-11; nhiều cành chính gần bằng nhau, góc chia cành 60º

Ở nơi khô hạn lá có kích thước nhỏ hơn (dài 15 cm, rộng 2 cm) [10]

1.1.2 Một số đặc điểm sinh học chính của tám loài tre chƣa có tên khoa học (Bambusa sp.) a) Bạc mày (Bambusa sp.)

Thân ngầm mọc cụm dày, thân khí sinh cao 13-18 m, đường kính 13-15 cm, ngọn hơi cong xuống Lóng hơi uốn khúc, dài 26-35 (40) cm; vách dày 2,80-3,00 cm; khi non

có lông màu nâu, thưa; khi già nhẵn; vòng đốt nổi không phồng, có rễ khí sinh mọc rải rác; giữa đốt có lông dài 1,4-1,5 mm, màu nâu; phía dưới đốt có vòng lông tơ dưới mỗi vòng mo Phân cành từ đốt 8-10, có một vài cành hướng lên; 3 cành dài ở đốt trên dài 4-5

m, gốc cành phồng và có rễ Bẹ mo hình thang, cao 25-32 cm, có đáy dưới rộng 40-42

cm, đáy trên rộng 20-22 cm, cao 35-37 cm; mặt lưng có lông cứng ở 2/3 phía trên; rụng sớm Tai mo nhỏ Thìa lìa cao 4-6 mm, mép có lông tua Phiến mo hình tam giác rộng, đáy rộng 3-4 cm, cao 6-8 cm, bằng 1/2 chiều rộng đáy trên bẹ mo, đầu nhọn; phiến thẳng, tồn tại Phiến lá hình lưỡi mác-thuôn, dài 16-28 cm, rộng 3-4 cm; mặt trên màu xanh; mặt dưới màu xanh nhạt; gân thứ cấp 9-10; gân ngang nhỏ không rõ; mép có răng và lông Bẹ lá màu vàng Tai lá cong hình lưỡi liềm, dài 3-5 mm Thìa lìa cao 1mm Mùa măng tháng 7-9 [10]

b) Mạy cượp (Bambusa sp.)

Thân ngầm mọc cụm dày, 20-30 cây trong một bụi, cây mọc sát nhau Thân khí sinh cao 8-10 m, đường kính 8-10 cm, không được thẳng, hơi uốn cong Lóng dài 34-38 (50) cm, vách dày 2-3 cm; khi non có lông màu hơi bạc; vòng đốt nổi, có vòng tròn Phân cành ngay từ gốc thân; mỗi đốt có 1 cành to và nhiều cành nhỏ, các cành dài rủ xuống

Bẹ mo hình thang, cao 12-25 cm, ở các đoạn thân phía trên có đáy dưới rộng 30-36 cm, cao 14-18 cm; đáy trên hơi lõm, rộng 7-10 cm; mặt ngoài có lông thưa màu nâu đen Tai

mo rộng 3-3,5 cm, cao 2-2,5 cm; mép lượn sóng, có lông cứng dài 6 mm, thưa Thìa lìa cao 6 mm, có lông cứng dài 3 mm, khi rụng còn lại như răng cưa Phiến mo đáy rộng 3-3,3 cm, cao 5-5,6 cm, mặt trong có lông Phiến lá hình mũi giáo, dài 23-30 cm, rộng 4,5-4,8 cm; gốc tù Bẹ lá cao 1 mm, có lông dài 4 mm, thưa, sớm rụng Cuống là dài 2-3 mm

c) Mạy khô (Bambusa sp.)

Thân ngầm mọc cụm thưa, thân khí sinh cao 13-15 m, đường kính 4-5 (7) cm; lóng dài 20-25 cm, tròn đều, vách dày 2-3 cm Phân cành ngay từ gốc: mỗi đốt có 1 cành to và nhiều cành nhỏ, nhiều cành nhỏ mọc dày bao quanh thân cây Bẹ mo hình thuôn đứng hay hình thang cao 25-32 cm, 2 mép mỏng, có gân mịn và dày, đáy dưới hơi lượn sóng, đáy trên nhỏ cao ở giữa và hơi lõm ở ngoài; mặt ngoài có lông màu đen, thưa, sớm rụng Đoạn thân phía trên các bẹ mo có đáy dưới rộng 29-30 cm, cao 20-21 cm, đáy trên rộng 15-17 cm; đoạn thân phía dưới bẹ mo có đáy dưới rộng 22-26 cm, cao 11-14 cm, đáy trên rộng 12-13 cm, tai mo một bên xuôi xuống và nhô ra ngoài; một tai đứng, rộng 3 cm và cao 2 cm, có lông dày dài đến 2 mm, thìa lìa cao 4 mm; có lông mịn và thấp, dài 1 mm Phiến mo ở đoạn thân phía trên có đáy rộng 1,5 cm, cao 4 cm; có lông thưa, ngắn; ở đoạn thân phía dưới có đáy rộng 3 cm, cao 1,2 cm; có lông thưa dày, dài đến 6 mm Phiến lá hình nêm, dài 7,5-8,5 (14) cm, rộng 1,5 (2) cm; gốc bằng, cắt ngang; gân 5-6 đôi Tai lá

có lông thưa, dài 1 mm Bẹ lá không lông Cuống lá dài 1 mm Măng có vào các tháng mùa mưa [10]

d) Mét ba vì (Bambusa sp.)

Thân ngầm mọc cụm, thân khí sinh cao 9-12 m, đường kính 7-8 cm, ngọn cong xuống Lóng dài 30-35 cm, hơi uốn cong; khi non có lông thưa; khi già nhẵn; vách dày 1,5-2,0 cm; vòng đốt cao 6-10 mm, phồng lên với vòng rễ, dưới vòng mo có vòng màu xám, chồi mắt phồng lên Phân cành từ dưới thấp; các đốt phía gốc có 1 cành; các đốt phía trên có 3 đến vài cành, cành giữa to và dài hơn rõ rệt Bẹ mo hình thang, cao 30-35

cm, có đáy dưới dài 40 cm, cao 30 cm, đáy trên dài 18 cm Tai mo rõ, có lông cao 6-8

mm Thìa lìa dài 8-10 mm, mép có răng và lông ở rìa Phiến mo lật ngược ra phía ngoài, tồn tại, hình tam giác-trái xoan hay ngọn giáo, đáy rộng 3-4 cm dài bằng 1/3 đáy trên bẹ

mo, cao 20-22 cm gốc có tơ màu nâu cả 2 mặt Phiến lá hình mũi mác-thuôn, dài 14-20 (28) cm, rộng 2-3 (8) cm mặt trên màu xanh, mặt dưới màu xanh nhạt; gân cấp hai có 7-

8, gân ngang nhỏ không rõ; mép có lông Tai lá cong lưỡi liềm Thìa lìa cao 1 mm Mùa măng tháng 4-9 [10]

e) Tre đông khê (Bambusa sp.)

Thân ngầm mọc cụm dày, thân khí sinh cao 10-13 m, đường kính 4,5-6 cm, đứng thẳng hay hình chữ chi (Zic Zắc) ở phía gốc; nhiều lông màu nâu thẫm và phấn trắng; lóng khá dài, dài 85-90 cm; vòng thân nổi; vòng đốt có lông dài màu nâu thẫm cong xuống; vách mỏng, chỉ dày 2-3 mm Phân cành: có một cành to hơn và nhiều cành nhỏ hơn Bẹ mo hình chuông, thuôn, cao 25-35 cm, có đáy dưới rộng 12-32 cm, cao 28-32 cm; dạng lượn sóng, lõm; đáy trên rộng 11-13 cm phồng to và nhô ra ngoài ở hai mép, dạng lượn sóng, 1 mép to và 1 mép nhỏ, mép nhỏ bằng 1/2 mép to Tai mo lệch, rộng 3-6

cm, cao 3-4 mm, 1 tai cao và 1 tai bằng; có lông cao đến 5 mm, cứng, thưa Thìa lìa cao đến 2 mm, có lông thưa dài đến 1 cm Phiến mo hình tam giác, dài 14-15 cm, rộng 5-6 cm; đầu có mũi nhọn dài, đáy hơi lõm; mặt trong phía dưới có lông dày, màu nâu bạc Phiến lá hình dải, thuôn dài, dài 22-24 cm, rộng 2-2,4 (4) cm; gốc nhọn và lệch; gân lá 6-

7 đôi; mặt dưới nhiều lông nhung màu bạc; mặt trên lông thưa hơn Tai lá rộng 2-3 mm, cao 1 mm; có nhiều lông dài đến 3 mm, cứng, thưa Thìa lìa cao đến 1 mm, có lông mịn

Bẹ lá có gân chính nổi rõ và nhiều lông mịn màu nâu Mùa măng tháng 8-9; măng có màu bạc-đỏ, nhiều phấn trắng dày đặc [10]

f) Tre không gai tân an (Bambusa sp.)

Thân ngầm mọc cụm dày đặc, thân khí sinh cao 8-12 m, đường kính 5-5,5 cm, đứng thẳng Lóng dài 28-33 (45) cm, tròn đều; khi non màu xanh thẫm, khi già mẫu xanh xám; vách dày 5-7 mm; vòng đốt nổi Phân cành với mỗi đốt 1 cành to, dài, vươn cao, gốc cành có rễ khí sinh; nhiều cành nhỏ Bẹ mo hình chuông rộng, cao 18-20 cm, có đáy dưới rộng 22-23 (28) cm, cao 15-18 (35) cm, đáy trên rộng 3-3,5 (5) cm; ở đoạn thân phía trên,

bẹ mo có đáy dưới nhỏ hơn (chỉ rộng 16-22 cm), nhưng cao hơn (cao 22-23 cm), đáy trên

cũng lớn hơn (rộng 4-5,5 cm); mặt ngoài có lông màu đen, thưa Tai mo lõm, có lông tua dài Thìa lìa cao đến 3 mm, có lông tua cứng Phiến mo ở đoạn thân phía dưới đáy rộng 1,2-2 cm, cao 4-7 cm; ở đoạn thân phía trên rộng 2,5-3 cm, cao 12-16 cm Phiến lá dài 9-11 (15)

cm, rộng 1,8-2 cm; gốc tròn hay hình nêm, hơi cắt ngang; mép có răng cưa nhỏ; gân 5-6

đôi Tai lá có lông ngắn, màu trắng Thìa lìa ngắn, có lông dài Cuống lá dài 1-2 mm [10]

g) Tre lục bình (Bambusa sp.)

Thân ngầm mọc cụm dày đặc, thân khí sinh cao 5-7 m đường kính 3-4,5 cm Lóng dài 30-32 cm, tròn đều; khi non hình chữ chi (Zic zắc), màu xanh, nhẵn bóng; vách mỏng, dày 3-5 mm; vòng đốt hơi nổi Phân cành với đốt có 1 cành to và 2 hay nhiều cành nhỏ

Bẹ mo hình thang cao, cao 15-20 cm, đoạn thân phía dưới bẹ mo có đáy dưới rộng 15(17) cm, cao 11-12 (23) cm, đáy trên rộng 4-4,5 (7) cm; đoạn thân phía trên bẹ mo có đáy dưới rộng 13-15 cm, cao 22-24 cm, đáy trên rộng 6-6,5 cm Tai mo rộng 2-4 mm, cao 3-10 mm Thìa lìa cao 1-2 mm; lông tua dài, thưa Phiến mo đáy rộng 3-3,5 cm, cao 4,5-8 (15) cm Phiến lá hình nêm hay ngọn giáo dài, dài 8-9 (17) cm, rộng 0,5-1 (2) cm; gốc hơi nhọn; gân lá 5-6 đôi Tai lá thấp, có lông thưa, sớm rụng Cuống lá dài 1 mm [10]

12-h) Tre trãi long an (Bambusa sp.)

Thân ngầm mọc cụm dày đặc, thân khí sinh cao 10-12 m, đường kính 4,5-5 cm, đứng thẳng Lóng dài 35-39 cm; vách dày 1-1,5 cm; vòng đốt nổi; chồi mặt hình tam giác;

ở phía chồi trên mặt lóng có vết lõm chạy dài gần hết lóng Phân cành với 1 cành to và

1-2 cành nhỏ hay rất nhỏ; gốc cành to phù lên và có rễ khí sinh; gần vòng đốt có vòng màu vàng, khi mo rụng có màu nâu bạc Bẹ mo hình thang cao 15-20 cm, có đáy dưới rộng 20-

22 cm, cao 17-18 cm; đáy trên rộng 2,2-3 cm, hơi lõm; mặt ngoài có lông đen mịn và dày

ở 2 bên, ở giữa lông sớm rụng; mặt trong bóng láng Tai mo có lông tua Thìa lìa cao 1

mm, có lông tua dài 5 mm Phiến mo đáy rộng 1,1-1,2 cm, cao 3-3,5 cm; có lông tua cứng, thưa Phiến lá hình nêm, dài 12-13 cm, rộng 1,7-1,8 cm, gốc tù hay hình nêm Tai lá cao 1 mm, có lông thưa dài đến 0,4 cm Bẹ lá nhẵn, cuống lá dài 2 mm [10]

1.2 Một số vướng mắc trong phân loại bằng phương pháp hình thái ở tre

- Các loài tre cần chỉnh lý tên chi: Các loài thuộc chi Bambusa và Lingnania đều

có một số đặc điểm hình thái giống nhau như thân ngầm mọc cụm, thân khí sinh cao

10-18 m, đường kính thân 4-7 cm,… Song giữa hai chi này có vài đặc điểm hình thái khác

nhau, các loài thuộc chi Bambusa mỗi đốt thân chỉ có 3 cành chính, lóng ngắn (40 - 50 cm), vách dày và phiến mo ôm sát thân; còn các loài thuộc chi Lingnania thì mỗi đốt thân

có rất nhiều cành chính, lóng rất dài (60-80 cm), vách mỏng và phiến mo đôi khi ngửa giáp xuống thân hoặc ngửa gần sát xuống thân [7] Năm 1940, McClure đã tách chi

Lingnania ra khỏi chi Bambusa Schreb [29] Sau đó một số nhà thực vật Trung Quốc và thế giới đã không công nhận chi mới này và chỉ xếp thành chi phụ (sub gen Lingnania) của Bambusa [19] Ở Việt Nam, Nguyễn Khắc Khôi và Nguyễn Thị Đỏ (2005), Nguyễn

Hoàng Nghĩa (2006) thì vẫn cho rằng đó là hai chi độc lập

Cho đến nay ba loài Dùng cầu hai, Lùng thanh hóa và Dùng phấn vẫn chưa rõ

thuộc chi Bambusa hay Lingnania, bởi chúng đều có một số đặc điểm hình thái giống với

cả hai chi, mà cơ quan sinh sản lại chưa bắt gặp Vì vậy cần có sự hỗ trợ của phân tích DNA

- Các loài tre chưa có tên khoa học: Vì chưa bắt gặp được cơ quan sinh sản nên ở chi tre có tới 37 loài chưa có tên khoa học [10] Trong số đó có 8 loài được lựa chọn cho

nghiên cứu này đó là: Bạc mày, Mét ba vì, Mạy cượp, Mạy khô, Tre đông khê, Tre lục bình, Tre không gai tân an và Tre trãi long an Tám loài tre này vẫn chưa có tên khoa học

và đều thuộc chi Bambusa

1.3 Giới thiệu một số phương pháp phân loại học thực vật

- Phương pháp phân loại bằng đặc điểm hình thái (Morphology): Đây là phương

pháp truyền thống được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu phân loại học, tiến hoá và giám định sinh vật Phương pháp chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái của các cơ quan và cơ thể, đặc biệt là cơ quan sinh sản Phương pháp phân loại bằng hình thái đòi hỏi mẫu vật phải có đầy đủ các đặc điểm phân loại Tuy nhiên trong thực tế mẫu vật thu được không phải luôn luôn thỏa mãn yêu cầu trên, trong một số trường hợp, phương pháp phân loại bằng hình thái khó thực hiện hoặc nhầm lẫn do mẫu mang đặc điểm trung gian hoặc đồng hình

- Phương pháp phân loại bằng hoá học (Chemitaxonomy): Phương pháp xây

dựng trên cơ sở nghiên cứu tiến hoá học của các taxon thực vật Tiến hành phân loại hoặc định loại dựa trên một số phương pháp như sắc ký lớp mỏng, sắc ký khí khối phổ và sắc

ký lỏng cao áp Việc định loại hoặc giám định loài dựa vào dấu vân hoá học (chemical

fingerprint), thực chất đấy là tổ hợp các hợp chất điển hình cho mỗi loài và có đặc điểm ít biến động Ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả nhanh, chính xác và có thể cho biết thêm các số liệu về thành phần hoá học Phương pháp không yêu cầu tính nguyên vẹn của mẫu vật Đây là phương pháp đang được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới Ở nước

ta, phương pháp này mới chỉ được bắt đầu nghiên cứu ở một vài cơ sở Tuy nhiên, do thành phần hoá học thường biến động theo tuổi, thời vụ và điều kiện môi trường, nên đòi hỏi người nghiên cứu cần có kiến thức rộng trên một số lĩnh vực

- Phương pháp phân loại bằng giải phẫu vi cấu trúc (Micro structure): Chủ yếu

dựa trên đặc điểm cấu trúc hiển vi của các nhóm thực vật Phương pháp không đòi hỏi kỹ thuật phức tạp nhưng cho kết quả khá chính xác Ưu điểm không cần sử dụng các tiêu bản

đủ tiêu chuẩn Đối với các loài cây gỗ thường sử dụng đặc điểm giải phẫu thân (gỗ) để định loại, trong khi với các loài cây thảo thường sử dụng đặc điểm cấu trúc của biểu bì Hiện phương pháp này được sử dụng khá rộng rãi tại nhiều quốc gia (Mỹ, Đức, Hà Lan, Trung Quốc, ) Một số nước (Mỹ, Trung Quốc, Indonesia, Malaysia, ) sử dụng phương pháp này trong giám định mẫu của các loài cây gỗ khi không có tiêu bản, đặc biệt giám định gỗ các loài quý hiếm trong công tác xuất nhập khẩu Ở Việt Nam, trường Đại học Lâm nghiệp đang thực hiện phương pháp này để giám định một số loài cây gỗ

- Phương pháp định loại bằng nhiễm sắc thể (Chromosome identification): Là

phương pháp định loại các loài sinh vật dựa trên số lượng và đặc điểm cấu trúc của bộ nhiễm sắc thể Với phương pháp này, việc định loại các loài trong chi cho kết quả chính xác cao Hiện nay, trên thế giới đã có một số ngân hàng lưu trữ về bộ nhiễm sắc thể của nhiều loài sinh vật Tuy vậy, trong một số trường hợp việc ứng dụng phương pháp này gặp khó khăn (hiện tượng dãy nhiễm sắc của một loài,…)

- Phương pháp phân loại học phân tử (Molecular taxonomy): là hướng nghiên

cứu được phát triển mạnh trên thế giới trong những năm gần đây Phân loại học phân tử giải quyết 3 vấn đề chính: (1) Nghiên cứu cấu trúc chủng quần (chẳng hạn như sự biến đổi địa lý, tính dị hợp, hệ giao phối và quan hệ cá thể); (2) Nhận biết ranh giới các loài (giám định gen); (3) đánh giá sự phát sinh chủng loại (tiến hóa loài) [22] Phương pháp được xây dựng dựa trên thành phần và cấu trúc của các gen đặc hữu của các taxon sinh vật nên

có hiệu quả cao trong việc định loại và giám định loài Cơ sở của phương pháp này là dựa trên kỹ thuật phân tích DNA còn được gọi là “dấu vân DNA- DNA fingerprint” Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về

vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loài động thực vật và vi sinh vật So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị DNA cho độ chính xác cao mà không lệ thuộc vào bất cứ yếu tố khách quan nào Hiện nay, ở Việt Nam phương pháp đang được sử dụng trong nghiên cứu phân loại, định loại, tiến hóa,… trên nhiều đối tượng sinh vật ở Viện Công nghệ sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam,…

1.4 Hệ gen sử dụng trong nghiên cứu phân loại phân tử ở thực vật

1.4.1 Một số vùng gen thuộc hệ gen lục lạp

Hệ gen lục lạp (cpDNA) là một phân tử DNA vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặp lại, có kích thước từ 120 kb - 220 kb Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hoá các protein cần thiết cho chức năng quang hợp Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và rất bảo thủ [34]

Hình 1.1 Hệ gen lục lạp của cây Arabidopsis thaliana [34]

Hệ gen lục lạp được đánh giá là sự tích lũy các đột biến theo thời gian, nên phản ánh đúng mức độ tiến hóa của loài Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp hơn từ 4-5 lần

so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng ba lần so với DNA ty thể thực vật và

Vùng gen nghiên cứu

Vùng gen nghiên cứu

thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân loại Hiện nay, các vùng gen matK, trnL-trnF, vùng đệm psbA-trnH, rpoC2…hay được sử dụng trong nghiên cứu hệ thống

học phân tử thực vật Tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận

Vùng đệm psbA - trnH: thường được sử dụng cho nghiên cứu phân loại [36], [45]

Vùng này có kích thước xấp xỉ 450bp, xác suất nhân bản thành công rất cao (100% với các loài đã được nghiên cứu) Mức độ khác biệt trình tự nucleotide giữa các loài trung

bình là 1,24% và sự khác biệt bên trong loài rất thấp từ 0 - 0,08% [36] Trình tự psbA - trnH cũng đã được công bố trên ngân hàng gen với nhiều loài khác nhau thuộc thực vật

hạt trần, dương xỉ, rêu và rêu tản (liverwort)

Gen matK: cùng với vùng đệm psbA - trnH đã được đề xuất làm DNA barcode

cho nhóm thực vật có hoa Kết quả sử dụng gen matK cho phân loại đã thu được sự tương

đồng rất cao với phân loại hình thái và cho giá trị bootstrap từ 92 – 100% [31]

Gen trnL: Là gen mã hoá cho tARN vận chuyển Leucine trong lục lạp, có kích

thước từ 452bp đến 528bp với các loài thuộc họ đậu Gen này được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phân loại phân tử [327], [30], [43] Các kết quả thu được trong các nghiên cứu

nguồn gốc phát sinh loài sử dụng gen trnL cho thấy đây là một vùng DNA hữu ích cho

1.4.2 Vùng gen nhân (ITS)

Vùng ITS (internal transcribed spacer) của gen mã hoá cho ribosome nhân gồm các đơn vị gen 18S, 5,8S và 26S (Hình 1.2) Giữa các đơn vị gen có các đoạn ITS-1 và ITS-2, các thành phần này tạo thành một nhóm gen cơ bản Các nhóm gen như vậy lặp lại liên tục trong hàng nghìn bản sao trong hệ gen nhân và chúng được ngăn cách bởi vùng NTS (nontranscribed spacer) (Hình 1.2)

Trong các nghiên cứu phân loại ở mức độ loài, vùng ITS đã được các nhà nghiên cứu kiến nghị làm vùng DNA barcode cho nhiều loài thực vật [14], [16], [17] Ở mức độ loài, vùng ITS có mức độ đa dạng cao (khoảng 13,6% giữa các loài gần gũi), nhưng lại có mức độ biến đổi thấp bên trong loài [17] Với sự hiện diện của trên 70.000 trình tự ITS được công bố trên ngân hàng Genbank năm 2011 đây là nguồn tư liệu có giá trị, mở ra những triển vọng lớn cho nghiên cứu phân loại và giám định

Hình 1.2 Sơ đồ vùng gen ITS

- Gen PIF (P instability factor): PIF - like transposable elements là đoạn DNA có

khả năng di chuyển độc lập ngay trong nội bộ một thể nhiễm sắc hoặc từ thể nhiễm sắc này sang thể nhiễm sắc khác, còn gọi là gen nhảy (transposon) Gen nhảy lần đầu tiên được Barbara McKlintock (1941) phát hiện nghiên cứu ở cây ngô từ những năm 40 của thế kỷ XX, nhưng mãi đến những năm 70 - 80 với sự tiến bộ của kỹ thuật phân tích di truyền người ta mới hiểu rõ được cấu trúc và cơ chế hoạt động của transposon Transposon được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật và con người Chúng rất đa dạng về độ lớn và cơ chế hoạt động, nhưng đều có điểm chung là được xếp xen kẽ vào hệ gen và sử dụng enzym transposaza để di chuyển từ vị trí này sang vị trí khác của phân tử DNA Với khả năng di động di chuyển vị trí, các gen nhảy tạo nên sự tổ hợp lại hệ gen làm cho hệ gen càng đa dạng Hơn nữa gen nhảy còn gia tăng tần số đột biến Các gen nhảy có thể được xếp xen kẽ vào các đoạn exon, các đoạn intron hoặc vào vùng DNA

điều chỉnh của gen và tạo nên các đột biến gen rất đa dạng [2 ], [9]

Các yếu tố di chuyển (transpoable elements – TEs) được chia làm hai nhóm dựa vào cơ chế di chuyển vị trí Nhóm I là các retrotransposons di chuyển thông qua dạng trung gian ARN nhờ enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase) Ngược lại, nhóm II là

DNA transposon di chuyển trực tiếp thông qua DNA và các phản ứng chuyển vị được xúc tác bởi enzym transposase được mã hóa bởi DNA transposon độc lập (autonomous DNA

transposons) [47] PIF là một DNA transposon độc lập, lần đầu tiên được xác định trình

tự qua phân tích 6 đoạn chèn độc lập vào cùng vị trí chính xác trong intron 2 của gen R ở

ngô, PIF sau đó còn được phát hiện ra ở nhiều loài thực vật, nấm và giun tròn, từ đó được phân loại nằm trong liên họ PIF/Harbinger và được đặc trưng trong nhiều sinh vật nhân chuẩn PIF bao gồm 2 khung đọc mở (ORF), khung đọc thứ nhất mã hóa cho một protein

kết hợp với DNA, khung đọc thứ hai mã hóa cho enzym transposase Trình tự amino acid

trong PIF khá bảo thủ trong cả các loài động vật và thực vật, vì vậy gần đây thường được

dùng để thiết lập mối quan hệ tiến hóa giữa các loài

1.5 Một số thành tựu ứng dụng phương pháp phân tích DNA vào phân loại ở tre

Ngoài nước: Từ hàng nghìn năm nay, tre trúc đã đi vào đời sống của hàng triệu

người dân ở Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và các nước Châu Á khác nên rất được quan tâm nghiên cứu Vì thế, cho đến nay trong cơ sở dữ liệu gen [24], [25] đã lưu giữ

16542 trình tự nucleotide cho phân loại Họ phụ tre (Bambusoideae), trong đó có 607 trình

tự nucleotide cho chi Bambusa, trong số này rất nhiều loài cũng có ở Việt Nam Hai nhóm

gen chính thường được sử dụng là gen nhân và hệ gen lục lạp (cpDNA) vào nghiên cứu phân loại, nhận dạng và tiến hóa trên nhiều đối tượng sinh vật Ngay ở tre, cũng có khá nhiều công bố về mối quan hệ chủng loại và nhận dạng loài Chẳng hạn, Sun và cộng sự (2005) đã sử dụng trình tự nucleotide DNA vùng ITS nhân để nghiên cứu 21 loài tre

thuộc các chi Bambusa, Dendrocalamopsis, Dendrocalamus, Guadua, Leleba và Lingnania, từ các kết quả thu nhận đã giải quyết được mối quan hệ di truyền của một số loài thuộc chi Bambusa (B subaequalis, B multiplex, B emeiensis, B chungii, B contracta, B hainanensis, B flexuosa, B sinospinosa, B tuldoides, B surrecta, B intermedia và B valida) [38] Tương tự, Yang và cộng sự (2007) cũng đã xác định trình

tự nucleotide gen GBSSI và trnL cho 53 loài cần chỉnh lý tên chi (Schizostachyum, Cephalostachyum, Dinochloa, Leptocanna, Melocanna, Melocalamus và Pseudostachyum), thông qua kết quả so sánh trình tự nucleotide các tác giả đã đề nghị

chuyển loài C virgatum và loài C pergracile về chi Schizostachyum; Melocanna và Pseudostachyum là những chi độc lập [43] Năm 2009, Wu và cộng sự đã công bố trình tự

hệ gen lục lạp đầy đủ của 2 loài tre là Dendrocalamus latiflorus và Bambusa oldhamii,

với kích thước tương ứng là 139.350 bp và 139.365 bp [25], [42] Yang và cộng sự (2010)

đã sử dụng 01 vùng gen nhân (GBSSI) và ba vùng gen lục lạp (psbA-trnH, rpl32-trnL và rps16 intron) để xác định trình tự nucleotide và lập cây phát sinh chủng loại cho 64 loài

thuộc tông phụ tre Kết quả xác định trình tự bốn vùng gen, các tác giả đã đề nghị chuyển

loài D rongchengensis về chi Bambusa, ngược lại các tác giả lại không đồng ý quan điểm của Staleton và Xia (1996) là chuyển loài D membranaceus về chi Bambusa [37] Hay

Zhou và cộng sự (2010) cũng đã làm rõ mối quan hệ di truyền các loài tre thuộc các chi

Guaduinae, Shibataceae, Arudinarieae, Bambusinae, Melocananinae và Chusqueeae trên

cơ sở xác định trình tự vùng gen PIF Tương tự, Goh và cộng sự (2010) đã xác định trình

tự nucleotide vùng gen nhân GBSSI và bốn vùng gen lục lạp (rps16-trnQ; trnC-rpoB; trnH-psbA; trnD-trnT) để nghiên cứu mối quan hệ di truyền gần gũi giữa các loài tre (climbing bamboos) ở Đông Nam Á với các loài trong chi Bambusa [21]

Trong nước: Các nghiên cứu về đa dạng di truyền phục vụ công tác bảo tồn đa

dạng sinh học và tái tạo nguồn gen đã được thế giới quan tâm và phát triển Theo hướng này, các nhà nghiên cứu trong nước cũng đã từng bước tiếp cận Gần đây, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại và nhận dạng mẫu sinh vật ở Việt Nam cũng đã được nghiên cứu trên nhiều đối tượng sinh vật [1], [3], [12] Tuy nhiên đến nay, đối với các loài tre Việt Nam mới chỉ có Nguyễn Minh Tâm (2006) sử dụng một số chỉ thị isozyme để nhận dạng cho hai loài tre của Việt Nam [13] Mặc dù các kết quả thu nhận chưa nhiều nhưng cũng là cơ sở cho công tác bảo tồn đa dạng di truyền nguồn tài nguyên sinh vật ở Việt Nam

Tuy nhiên, đến nay chưa có một công trình công bố nào đề cập đến việc ứng dụng

kỹ thuật phân tích DNA để hỗ trợ cho phân loại ở phân Họ tre (Bambusoideae) nói chung

và chi tre (Bambusa) nói riêng ở Việt Nam

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu: Bao gồm 11 loài tre như sau:

- Tám loài tre chưa xác định tên khoa học (Bambusa sp.): Bạc mày, Mét ba vì, Mạy

- Ba loài chỉnh lý tên chi: Dùng phấn (Bambusa (Lingnania) chungii), Dùng cầu hai (Bambusa (Lingnania (Bambusa (Lingnania) longissima)

Mỗi loài nghiên cứu chọn 03 mẫu làm đại diện cho mỗi địa điểm thu mẫu Các mẫu

lá và thân do PGS.TS Nguyễn Khắc Khôi, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cung cấp Các mẫu được xác định chính xác về mặt hình thái theo mô tả của Wu và cộng sự (2009); Phạm Hoàng Hộ (1972, 1993, 2000); Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006) Mẫu lá, thân sau khi thu được bảo quản trong sillicagel và giữ ở nhiệt độ phòng cho tới khi sử dụng

Ký hiệu, địa điểm thu thập mẫu và một số đặc điểm hình thái của 11 loài tre nghiên cứu được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Nguồn gốc, ký hiệu mẫu và một số đặc điểm hình thái của 11 loài tre sử dụng

trong nghiên cứu

gần sát xuống thân

K3001/8 VNMN B000201 Đồng Hỷ, Thái Nguyên K3001/9 VNMN B000202 Chiêm Hoá, Tuyên

gần sát xuống thân

K3002/5 VNMN B000206 Chợ Đồn, Bắc Kạn K3002/15 VNMN B000212 Uông Bí, Quảng Ninh

ngửa gần sát xuống thân

K3003/10 VNMN B000221 Thuận Châu, Sơn La K3003/14 VNMN B000222 Ba Bể, Bắc Kạn

Các loài chƣa xác định tên khoa học dạng Bambusa sp.: gồm 8 loài

khúc, bẹ mo hình thang

K3004/2 VNMN B000224 Cầu Hai, Phú Thọ K3004/5 VNMN B000226 Châu Mộng, Phú Thọ

bẹ mo hình thang

K3009/2 VNMN B000262 Khuổi Chám, Kim

Bình, Tuyên Quang K3009/5 VNMN B000265 Bó Củng, Kim

Bình, Tuyên Quang Mạy

25 cm, tròn đều, vách dày 2-3 cm, bẹ mo hình

thuôn đứng hay hình thang

K3010/8 VNMN B000270 Chiềng An, Thanh

An, Điện Biên K3010/9 VNMN B000271 Thuận Châu, Sơn La Tre

mo hình chuông

K3012/5 VNMN B000278 Thái Cường, Thạch

An, Cao Bằng K3012/6 VNMN B000279 Thái Cường, Thạch

An, Cao Bằng Tre

5-bẹ mo hình chuông rộng

K3014/5 VNMN B000286 Mỹ Xuyên, Sóc Trăng K3014/8 VNMN B000288 Bình Thuỷ, Cần Thơ Tre

bẹ mo hình thang

K3015/2 VNMN B000290 Cao Lãnh, Đồng Tháp K3015/4 VNMN B000292 Mỹ Xuyên, Sóc Trăng

* Ghi chú: Mã hiệu mẫu lưu giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam (VNMN)

Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu: Thông tin chính (kí hiệu, trình tự, kích thước

lý thuyết,…) của 05 cặp mồi đặc hiệu (01 cặp mồi nhân bản vùng gen nhân và 04 cặp mồi nhân bản vùng gen lục lạp) sử dụng trong nghiên cứu như trong bảng 2.2 Trình tự của

các cặp mồi được tổng hợp bởi hãng IDT (Integrated DNA Technology, Mỹ)

Bảng 2.2 Kích thước lý thuyết của các cặp mồi dùng trong nghiên cứu

Nhiệt

độ bắt cặp (Tm)

C

Nguồn gốc tổng hợp cặp mồi

1560 50 Thiết kế dựa

vào trình tự nucleotide loài

Bambusa

chungii mã số

HM448934 Genbank (2011)

rpoC2 rpoC2F2/

rpoC2R2

TGTTTGGGGATTTCTATTGA TCTTTTGTTCCTTGATGCTC

600 52 Thiết kế dựa

vào trình tự nucleotide loài

Bambusa oldhamii mã

số FJ970915 Genbank (2011)

Các hóa chất dùng trong nghiên cứu bao gồm: Hóa chất tách chiết và tinh sạch

DNA (CTAB, EDTA, Tris-HCl, Isopropanol, ethanol, ARNase, chloroform, Kit tinh sạch genomic tổng số, Kit phân tích PCR, Kit tinh sạch sản phẩm PCR, đệm TAE, agarose, TE

là của các hãng Fermentas, Biobasis, QIAGEN,

Các thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: Các thiết bị chính sử dụng trong thí nghiệm: Máy PCR System 9700

(Applied Biosystem, Mỹ), máy ly tâm của hãng Hitachi (Nhật Bản), bộ điện di

Nytechnich (Anh), máy chụp ảnh gel (Cleaver, Đức), máy ổn nhiệt (Memmert, Đức) Xác định trình tự trên máy ABI PRISM®

3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems), …

Dụng cụ: Cối, chày sứ, thìa vô trùng, giấy thấm vô trùng, ống eppendorf, đầu côn

các loại,…của các hãng Canada, Mỹ, Trung Quốc và Việt Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

1) Xác định, phân tích và so sánh trình tự nucleotide của 04 vùng gen (01 vùng gen nhân và 03 vùng gen lục lạp) với các trình tự liên quan trên ngân hàng Genbank phục vụ việc chỉnh lý tên chi cho ba loài tre;

2) Đánh giá mức độ đa dạng nucleotide trên cơ sở xác định phân tích trình tự nucleotide 05 vùng gen (01 vùng gen nhân và 04 vùng gen lục lạp) cho 08 loài tre chưa có tên khoa học

2.3 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại Phòng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Tách chiết DNA tổng số từ 11 loài tre thuộc chi Bambusa Schreb

DNA tổng số được tách chiết từ mẫu lá hoặc thân của 11 loài tre nghiên cứu

(1987) [20] Tinh sạch DNA tổng số bằng bộ kít Genomic DNA Purification kit (#KO512, Fermentas) Sản phẩm DNA tổng số được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,9% Nhuộm gel bằng Ethidium bromide và soi

dưới đèn UV Xác định nồng độ DNA bằng máy đo quang phổ hấp phụ

2.4.2 Thiết kế cặp mồi

Để thiết kế được cặp mồi có tính đặc hiệu cao và giảm thiểu khả năng bắt cặp không đặc hiệu Chúng tôi đã khai thác các dữ liệu trong ngân hàng gen Genbank để tìm

ra tất cả các trình tự gen mã hoá cho vùng gen matK và rpoC2 đối với chi Bambusa

Schreb Sau đó sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh, vùng bảo thủ nhất được sử dụng

để thiết kế cặp mồi Cặp mồi matK19F/matKR nhân bản vùng gen matK được thiết kế

dựa vào trình tự nucleotide loài Bambusa chungii mã số HM448934 trên ngân hàng

Genbank Cặp mồi rpoC2F2/rpoC2R2 nhân bản vùng gen rpoC2 được thiết kế dựa vào trình tự nucleotide loài Bambusa oldhamii mã số FJ970915 trên ngân hàng Genbank Quá

trình thiết kế cặp mồi được thực hiện trên phần mềm DNAstar

2.4.3 Phương pháp nhân bản PCR

Nhân bản PCR và đọc trình tự: Mỗi phản ứng PCR có thể tích 25µl với các thành

phần: 13 µl H2O deion; 2,5 µl buffer 10X; 1 µl MgCl2 25mM; 2,5 µl dNTPs 2,5mM; 1,25

µl mồi xuôi (10 pmol); 1,25 µl mồi ngược (10 pmol); 0,5 µl Taq polymerase (5U/µl); 3 µl

DNA Phản ứng được thực hiện trên máy PCR model 9700 (GeneAmp PCR System 9700, Mỹ) Chu trình nhiệt của phản ứng PCR gồm: 94C trong 3 phút; 35 chu kỳ nối tiếp nhau với các bước: 94C trong 50 giây, 50 đến 55C trong 55 giây (nhiệt độ bắt cặp của từng cặp mồi như trong bảng 1), 72C trong 45 giây; kết thúc phản ứng nhân gen ở 72C trong

10 phút, giữ sản phẩm ở 4C

2.4.4 Thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR

Tinh sạch sản phẩm PCR là bước quan trọng để thực hiện phản ứng giải trình tự Quá trình tinh sạch nhằm thu được sản phẩm đoạn gen mong muốn Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,9%, cắt lấy phân đoạn DNA quan tâm trên bàn soi UV và tinh sạch bằng bộ KIT QIAquick Gel Extraction của QIAGEN Kiểm tra sản phẩm thu được trên gel agarose 0,9% Chụp ảnh sản phẩm thôi gel và xác định hàm lượng DNA để gửi đi xác định trình tự

2.4.5 Xác định trình tự nucleotide các đoạn DNA

Trình tự nucleotide được xác định bằng kỹ thuật xác định trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR theo hai chiều (mồi xuôi và mồi ngược) trên máy đọc trình tự ABI PRIMS®

3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học

2.4.6 Phân tích số liệu

Xử lý số liệu: Dữ liệu được xử lý bằng các phần mềm chuyên dụng BioEdit, Mega

4.0, Clustal X 2.1, DNAstar,…vv Trình tự nucleotide của 11 loài nghiên cứu được so

sánh với các trình tự của vùng gen trnL-trnF, psbA-trnH, matK, rpoC2 và PIF đã công bố

trên Genbank

Xây dựng cây phát sinh chủng loại: Có 4 phương pháp tạo cây bao gồm: (1) phương pháp Neighbor – Joining (NJ), (2) phương pháp Minimum Evolution, (3) phương pháp Maximum Parsimony và (4) phương pháp UPGMA, trong đó Neighbor - Joining là phương pháp thường được sử dụng nhất Khoảng cách di truyền giữa các loài cũng được ước lượng thông qua độ dài của cành cây được xây dựng theo phương pháp NJ (Neighbor Joining) [32]

Dữ liệu DNA sau khi thực hiện ghép nối, xắp xếp thẳng hàng (alignment) để lập cây tiến hoá bằng phần mềm MEGA 4.0, sử dụng phương pháp Neighbor - Joining (NJ) với các thông số phân tích như sau:

- Kiểm tra phân tích: kiểm tra bằng giá trị bootstrap với số lần lặp lại (replicate) là

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả tách chiết và làm sạch DNA tổng số từ các mẫu tre

Đã tách chiết và làm sạch DNA tổng số của 33 mẫu lá và thân đại diện cho 11 loài tre nghiên cứu Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,9% tại hình 3.1A cho thấy chất lượng DNA tương đối sạch Kết quả đo OD cũng cho thấy chỉ số OD260/OD280 của các mẫu luôn nằm trong khoảng 1,8 đến 2 (dung dịch DNA có độ sạch rất cao) Để phản ứng PCR có độ nhạy cao, đảm bảo kết quả xác định trình tự nucleotide được chính xác chúng tôi đã tiến hành tinh sạch DNA tổng số bằng bộ KIT tinh sạch DNA (DNA Purification Kit) (Hình 3.1B)

Hình 3.1 Kết quả kiểm tra DNA tổng số (A) và DNA tinh sạch (B) đại diện của 11 loài

tre trên gel agarose 0,9% (giếng 1: Bạc mày; 2: Mét ba vì; 3: Mạy cượp; 4: Mạy khô; 5: Tre đông khê; 6: Tre lục bình; 7: Tre không gai tân an; 8: Tre trãi long an; 9: Dùng cầu

hai, 10: Dùng phấn; 11: Lùng thanh hoá)

3.2 Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre nghiên cứu với các vùng gen đích

Tổng số năm cặp mồi đặc hiệu đã được sử dụng và nhân bản thành công năm đoạn

gen đích, trong đó cặp mồi PIF5/PIF3 dùng để nhân bản vùng gen nhân và 04 cặp mồi trnLF/trnLR, matK19F/matKR, psbA3’f/trnH và rpoC2F2/rpoC2R2 nhân bản các vùng

gen lục lạp Để có độ tin cậy cao về kết quả phân tích cho từng nhóm đối tượng loài, trong

nghiên cứu này mỗi loài sử dụng 03 mẫu Bốn vùng gen (01 vùng gen nhân (PIF) và 03 vùng gen lục lạp (trnL-trnF, matK và vùng psbA-trnH) đã được sử dụng để xác định trình

tự cho 03 loài tre cần chỉnh lý tên chi (Dùng phấn (Bambusa (Lingnania) chungii), Dùng

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

cầu hai (Bambusa (Lingnania (Bambusa (Lingnania) longissima)); Đối với 08 loài tre chưa xác định tên khoa học (Bambusa sp.) đó là Bạc

mày, Mét ba vì, Mạy cượp, Mạy khô, Tre đông

Tre trãi long an thì ngoài việc giải mã bốn vùng gen trên chúng tôi còn giải mã thêm 01

vùng gen lục lạp (rpoC2)

3.2.1 Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi PIF5/PIF3

Trình tự đoạn gen đích đã được nhân bản thành công với cặp mồi PIF5/PIF3 cho

tất cả các mẫu nghiên cứu Hình 3.2 là kết quả đại diện của 11 loài tre nghiên cứu (mỗi loài 1 mẫu), sản phẩm PCR chỉ xuất hiện duy nhất 01 băng có kích thước khoảng 450 bp Kết quả này cũng phù hợp với kích thước lý thuyết dự đoán Do vậy, sản phẩm PCR tiếp tục được tinh sạch phục vụ cho việc giải mã trình tự nucleotide

Hình 3.2 Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi PIF5/PIF3 điện

di trên gel agarose 0,9% (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)

3.2.2 Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi psbA3’f/trnH

Vùng psbA – trnH đã được chứng minh là vùng dễ thực hiện phản ứng PCR nhất

đối với rất nhiều loài thực vật [35] Do có một vùng không mã hoá nên kích thước của

vùng psbA - trnH cũng thay đổi khác nhau giữa các loài Vùng này có kích thước biến đổi trong một giới hạn rất lớn, từ 247bp đến 1221bp [27] Cặp mồi psbA3’f/trnH đã được sử

dụng để nhân bản đoạn DNA cho tất cả 11 loài tre nghiên cứu Kết quả cho thấy sản phẩm

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

0.25 kb 0.5 kb

PCR trên gel agarose 0,9 % tại hình 3.3 cho thấy chỉ thu được một phân đoạn DNA có kích thước khoảng 680 bp (đúng như kích thước lý thuyết) Với kết quả

Hình 3.3 Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi psbA3’f/trnH

điện di trên gel agarose 0,9% (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)

3.2.3 Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi matK19F/matKR

Hình 3.4 Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi matK19F/matKR

điện di trên gel agarose 0,9% (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)

Cặp mồi matK19F/matKR (thiết kế dựa trên trình tự đoạn gen đã công bố trên ngân hàng Genbank mã số HM448934) cũng đã nhân bản thành công đoạn gen matK cho tất cả 11 loài tre nghiên cứu (hình 3.4) Gen matK là một gen chức năng do vậy thường

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

0.5 kb 0.75 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M

1 kb 1.5 kb

không có các đột biến thêm bớt nucleotide xảy ra trên gen, nên kích thước giữa các loài

tương đối ổn định Gen matK có kích thước đầy đủ là 2450 bp, tuy nhiên trong nghiên

cứu này cặp mồi được thiết kế chỉ nhân bản đoạn DNA có kích thước 1560 bp và nằm gần đầu 3’ của gen Sản phẩm PCR nhận được ở đây có kích thước đúng như kích thước lý

thuyết dự đoán

3.2.4 Kết quả nhân bản trình tự DNA của 11 loài tre với cặp mồi trnLF/trnFR

Kết quả trong hình 3.5 cho thấy, tất cả 11 loài tre đã nhân bản được 1 phân đoạn DNA đặc hiệu đúng với kích thước dự đoán (~ 1000 bp), đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu xác định trình tự DNA

Hình 3.5 Sản phẩm PCR đại diện của 11 loài tre phân tích với cặp mồi trnLF/trnFR điện

di trên gel agarose 0,9% (M: marker phân tử 1 kb, từ giếng 1 đến 11 đại diện cho 11 loài tre (1mẫu/loài), thứ tự các loài đại diện như trong hình 3.1)

3.2.5 Kết quả nhân bản trình tự DNA 8 tre loài cần xác định tên khoa học với cặp mồi rpoC2F2/rpoC2R2

Để có thêm độ tin cậy trong việc đánh giá mức độ đa dạng nucleotide cho 8 loài

chưa có tên khoa học, chúng tôi đã sử dụng thêm cặp mồi rpoC2F2/rpoC2R2 để nhân bản gen đích chỉ cho 24 mẫu thuộc 08 loài tre chưa xác định tên khoa học (Bambusa

Kết quả phân tích sản phẩm PCR trong hình 3.6 cho thấy, đã

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

1 kb

0.75 kb

nhân được 01 phân đoạn DNA đặc hiệu và đúng với kích thước dự đoán khoảng 600 bp,

đủ tiêu chuẩn cho nghiên cứu xác định trình tự DNA

Hình 3.6 Sản phẩm PCR đại diện của 08 loài tre phân tích với cặp mồi

rpoC2F2/rpoC2R2 điện di trên gel agarose 0,9% ((M: marker phân tử 1 kb, mỗi loài đại

diện 01 mẫu, giếng 1: Bạc mày, 2: Mét ba vì, 3: Mạy cượp, 4: Mạy khô, 5: Tre đông khê, 6: Tre lục bình, 7: Tre không gai tân an, 8: Tre trãi long an)

3.3 Kết quả phân tích phân tử đối với ba loài tre cần chỉnh lý tên chi

3.3.1 Kết quả xác định trình tự bốn vùng gen nghiên cứu

Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được sử dụng làm DNA khuôn cho xác định đọc trình tự Quá trình xác định trình tự được thực hiện trên máy ABI PRISM®

3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Gen, Viện CNSH Phản ứng đọc trình tự được thực hiện theo cả hai chiều xuôi và ngược

Chín mẫu tre của 3 loài cần chỉnh lý tên chi là Dùng cầu hai, Dùng phấn và Lùng thanh hoá (3 mẫu/1 loài) với bốn cặp mồi đặc hiệu đã thu được trình tự nucleotide có độ

dài là 938 nucleotide đối với vùng gen trnL-trnF, 620 nucleotide đối với vùng gen trnH, 1539 nucleotide đối với vùng gen matK và 444 nucleotide đối với vùng gen PIF

psbA-3.3.1.1 Kết quả xác định trình tự vùng gen PIF

Thông qua ảnh điện di đồ với các đỉnh huỳnh quang rõ nét, cường độ mạnh và rõ

ràng (kết quả không chỉ ra ở đây) cho thấy kết quả xác định trình tự vùng gen PIF có độ

1 2 3 4 5 6 7 8 M

0,5kb 0,75kb

tin cậy rất cao Các trình tự thu được của 09 mẫu nghiên cứu được xử lý phân tích bởi phần mềm BioEdit 4.0 (hình 3.7)

K3003/5 (LTH) C AG A A T C T T A C A G G

Hình 3.7 Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen PIF xác định từ 9 mẫu tre nghiên

cứu thuộc 3 loài Dùng cầu hai (DCH), Dùng phấn (DP) và Lùng thanh hoá (LTH) (K3001/2, K3001/8, K3001/9: Dùng cầu hai; K3002/1, K3002/5, K3002/15: Dùng phấn; K3003/5, K3003/10, K3003/14: Lùng thanh hoá)

Sau khi loại bỏ trình tự của đoạn mồi và các nucleotide so le ở hai đầu, chúng tôi đã thu được trình tự nucleotide có độ dài là 443 nucleotide đối với loài Dùng cầu hai và Dùng phấn; 444 nucleotide đối với loài Lùng thanh hoá Kết quả thống kê ở hình 3.7 đã chỉ ra 14

vị trí (39, 44, 45, 195, 201, 213, 305, 356, 371, 391, 405, 414, 418 và 423) bị đột biến bởi việc chèn vào hay mất đi nucleotide khi so sánh giữa ba loài nghiên cứu Khi so sánh giữa hai loài Dùng cầu hai và Dùng phấn với Lùng thanh hoá thì có sự sai khác tại 12 vị trí nucleotide, đó là các vị trí thứ 39, 44, 45, 195, 201, 213, 305, 356, 391, 405, 414 và 418 thì (TCTGGAGCTATC) được thay bằng (CAGAATCTACAG), tương ứng Trong khi đó, khi

so sánh trình tự nucleotide giữa tre Dùng cầu hai với hai loài Dùng phấn và Lùng thanh hoá thì tại vị trí nucleotide thứ 423 (T) được thay bằng (G) Hay tại vị trí 371 hai loài Dùng cầu hai và Dùng phấn đã không có nucleotide (T)

3.3.1 en psbA - trnH

Trình tự vùng psbA - trnH đã thu được chiều dài 619 nucleotide đối với hai loài

Dùng cầu hai và Dùng phấn, 620 nucleotide đối với loài Lùng thanh hoá

Hình 3.8 Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen psbA-trnH xác định từ 9 mẫu tre

nghiên cứu thuộc 3 loài Dùng cầu hai (DCH), Dùng phấn (DP) và Lùng thanh hoá (LTH) (Ký hiệu mẫu của các loài như trong hình 3.7)

Sự khác nhau giữa các vị trí nucleotide khi so sánh giữa ba loài Dùng cầu hai, Dùng phấn và Lùng thanh hoá trong hình 3.8 đã chỉ ra 5 vị trí (90, 92, 93, 95 và 138) đột biến bởi chèn vào hay mất đi nucleotide Ví dụ, tại vị trí 90, 92, 93 và 95 hai loài Dùng cầu hai

và Lùng thanh hoá có 4 nucleotide (TCCG, tương ứng) được thay bằng (CGGA, tương ứng) so với loài Dùng phấn Hay tại vị trí 138 loài Dùng cầu hai và Dùng phấn đã không

có nucleotide (T)

Trình tự nucleotide của gen matK thu được kích thước là 1527 nucleotide đối với

cả ba loài Dùng cầu hai, Dùng phấn và Lùng thanh hoá (Hình 3.9) Từ các nghiên cứu

thực tiễn cho thấy, gen matK là gen rất bảo thủ nên được sử dụng như một bacording ở

thực vật [23], tuy nhiên trong hình 3.9 đã tìm thấy 2 vị trí sai khác nucleotide (394 và

1328) khi so sánh trình tự giữa hai loài Dùng cầu hai và Dùng phấn với Lùng thanh hoá thì (A và T) được thay bằng (C và C), tương ứng

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen matK xác định từ 9 mẫu tre thuộc

3 loài Dùng cầu hai (DCH), Dùng phấn (DP) và Lùng thanh hoá (LTH) (Ký hiệu mẫu của các loài như trong hình 3.7)

Hình 3.10 Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng gen trnL-trnF xác định từ 9 mẫu

nghiên cứu thuộc 3 loài Dùng cầu hai (DCH), Dùng phấn (DP) và Lùng thanh hoá (LTH) (Ký hiệu mẫu của các loài như trong hình 3.7)

Trình tự gen trnL-trnF thu được đoạn nucleotide có độ dài 936 nucleotide đối với

loài Dùng cầu hai; 938 nucleotide đối với loài Dùng phấn và 937 nucleotide đối với loài

Lùng thanh hoá Đối với vùng gen trnL-trnF đã chỉ ra 2 vị trí đột biến chèn vào hay mất

đi nucleotide ở tại vị trí vị trí 824 và 825 (hình 3.10) Chẳng hạn, tại vị trí 824 hai loài Dùng phấn và Lùng thanh hoá đã xuất hiện thêm nucleotide (C), hay tại vị trí nucleotide

825, loài Dùng cầu hai và Lùng thanh hoá đã không xuất hiện nucleotide (C)

3.3.2 Mức độ tương đồng nucleotide giữa ba mẫu trong cùng một loài cần chỉnh lý tên chi

Bảng 3.1 Mức độ tương đồng nucleotide của ba mẫu trong cùng một loài cần chỉnh lý tên

chi với hai vùng gen PIF và psbA-trnH

Dùng cầu hai (Bambusa (Lingnania) sp

Kết quả so sánh trình tự nucleotide bằng phần mền MEGA 4.0 cho ba loài tre Dùng

cầu hai, Dùng phấn và Lùng thanh hóa (3 mẫu/1 loài) ở bốn vùng gen PIF, psbA-trnH, matK và trnL-trnF cho thấy, cả ba mẫu trong một loài đều giống nhau 100% (Bảng 3.1, 3.2)

Bảng 3.2 Mức độ tương đồng nucleotide của ba mẫu tre trong cùng loài của ba loài tre

cần chỉnh lý tên chi với hai vùng gen matK và trnL-trnF

Để làm sáng tỏ ba loài Dùng cầu hai, Dùng phấn, Lùng thanh hóa thuộc chi

Bambusa hay Lingnania

psbA-trnH, 13 loài đối với vùng gen matK và 03 loài đối với vùng gen PIF) đã công bố

trình tự nucleotide trên ngân hàng Genbank Vì không có sự thay đổi trình tự nucleotide giữa các mẫu trong cùng một loài (3mẫu/1loài) khi phân tích ở cả bốn vùng gen nên khi phân tích mức độ tương đồng nucleotide chúng tôi chỉ sử dụng mỗi loài một mẫu đại diện Kết quả phân tích cho thấy, mức độ tương đồng nucleotide giữa loài Dùng cầu hai với các

loài thuộc chi Bambusa trên Genbank dao động từ 63,6 đến 99,8% đối với vùng gen PIF

(Bảng 3.3); từ 99,2 đến 100% đối với vùng gen psbA-trnH (Bảng 3.4); từ 99,7 đến 99,9% đối với vùng gen matK (Bảng 3.5) và từ 98,4 đến 100% đối với vùng gen trnL-trnF (Bảng 3.6) Mức độ tương đồng nucleotide giữa loài Dùng phấn với các loài thuộc chi Bambusa trên Genbank dao động từ 63,6 đến 99,8% đối với vùng gen PIF (Bảng 3.3); từ 98,7 đến 100% đối với vùng gen psbA-trnH (Bảng 3.4); từ 99,7 đến 99,9% đối với vùng gen matK (Bảng 3.5) và từ 98,9 đến 99,9% trnL-trnF (Bảng 3.6) Mức độ tương đồng nucleotide giữa loài Lùng thanh hoá với các loài thuộc chi Bambusa trên Genbank dao động 63,0 đến 96,9% đối với vùng gen PIF (Bảng 3.3); từ 99,0 đến 100% đối với vùng gen psbA-trnH (Bảng 3.4); từ 99,7 đến 99,9% đối với vùng gen matK (Bảng 3.5) và từ 99,0 đến 99,9% trnL-trnF (Bảng 3.6) Đặc biệt, khi so sánh trình tự nucleotide loài Dùng phấn Bambusa (Lingnania) chungii (kí hiệu K3001/2) với loài Bambusa chungii trên ngân hàng Genbank

đã chỉ ra mức độ tương đồng nucleotide giữa 2 loài là 81,8% đối với vùng gen PIF (mã số DQ861456) (Bảng 3.3), 99,4% đối với vùng gen psbA-trnH (mã số GU063099) (Bảng 3.4), 99,8% đối với vùng gen matK (mã số HM448934) (Bảng 3.5) và 99,7% đối với vùng gen trnL-trnF (mã số HM448964) (Bảng 3.6)

Bảng 3.3 Mức độ tương đồng giữa ba loài nghiên cứu với 3 loài thuộc chi Bambusa đã

công bố trình tự trên Genbank phân tích ở vùng gen PIF

Bảng 3.4 Mức độ tương đồng giữa ba loài nghiên cứu với 22 loài thuộc chi Bambusa đã công bố trình tự trên Genbank

phân tích ở vùng gen psbA-trnH

Bảng 3.5 Mức độ tương đồng giữa ba loài nghiên cứu với 13 loài thuộc chi Bambusa đã công bố trình tự trên Genbank

phân tích ở vùng gen matK