Khóa luận tốt nghiệp tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus có khả năng sinh enzyme β galactosidase phân giải lactose

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ------ LÊ THỊ KHUYÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE P

ĐỐI T ỢNG – NỘI DUNG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Phạm vi nghiên cứu

Thiết bị dùng trong nghiên cứu đƣợc thể hiện trong bảng 3.2

Bảng 3 2 Thiết bị dùng trong nghiên cứu

STT Tên thiết bị STT Tên thiết bị

1 Tủ lạnh 7 Nồi hấp tiệt trùng

2 Máy Vortex 8 Máy đo pH để bàn

3 Máy ly tâm lạnh Rotor 24 chỗ 9 Buồng cấy vô trùng

4 Cân kỹ thuật điện tử 10 Bể siêu âm

5 Cân phân tích điện tử 11 Máy lắc n nhiệt

Dụng cụ cần thiết cho thí nghiệm bao gồm cốc đong, pipet thủy tinh, bình đựng, que cấy, que trang, ống nghiệm, ống fancol (15 ml, 50 ml), đĩa peptri, bình tam giác, bình định mức, ống đong, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh, đèn cồn, màng bọc, micropipet và ống eppendorf.

Bảng 3 3 Danh sách các hóa chất

STT Tên hóa chất STT Tên hóa chất

8 Na 2 HPO 4 12H 2 O 16 Lactose Địa điểm nghiên cứu: Ph ng thí nghiệm Trung tâm, Khoa Công nghệ thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 3 đến tháng 9 năm 2021.

Nội dung nghiên cứu

- Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus

- Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh β-galactosidase từ nguồn phân lập và bộ sưu tập có sẵn

- Xác định hoạt độ enzyme β-galactosidase

- Tinh sạch sơ bộ chế phẩm enzyme β-galactosidase thô

3 4 Phư ng pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho vi khuẩn Bacillus

Mỗi loài vi khuẩn phát triển tối ưu và sinh enzyme hoạt tính cao khi được nuôi cấy trong môi trường phù hợp Nghiên cứu này tập trung vào vi khuẩn Bacillus, được nuôi cấy trong các môi trường NB, NA và LB, LB-agar để xác định môi trường thích hợp cho sự phát triển của chúng.

- Nuôi lắc 20 chủng Bacillus trong bộ sưu tập có sẵn trong môi trường lỏng NB và

LB được sử dụng để đánh giá khả năng tăng sinh số lượng vi khuẩn trong môi trường lỏng Đầu tiên, hút 5ml môi trường vào ống fancol 50ml và hấp khử trùng ở 121 oC, 1 atm trong 21 phút Sau đó, hút 1% dịch vi khuẩn vào ống và nuôi trong tủ lắc ở 37 oC với tốc độ 200 vòng/phút Kết quả được quan sát sau 24 giờ, ống được coi là đạt yêu cầu nếu dung dịch trong ống chuyển từ trạng thái trong sang đục.

Cấy trang vi khuẩn từ ống đạt yêu cầu lên môi trường thạch tương ứng Pha loãng dung dịch nuôi lắc đến nồng độ 10^-6 theo dãy pha loãng bậc 10 Sau đó, hút 100 µl dịch vào đĩa thạch đã được hấp khử trùng, chang đều đến khi khô, và để đĩa thạch vào tủ nuôi.

Tất cả các thao tác đƣợc thực hiện trên ngọn lửa đèn cồn, trong buồng cấy vi sinh

3 4 2 Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh β-galactosidase

3.4.2.1 Phân p Bacillus từ các mẫu sữa tươi và định tính khả năng sinh enzyme β–galactosidase

Nguyên tắc: Các mẫu sữa đƣợc đóng gói trong túi tiệt trùng, sau đó bảo quản ở

Nhiệt độ 4 độ C được sử dụng để phân lập Bacillus trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu Mẫu sữa được pha loãng đến nồng độ 10^-4, 10^-5, và 10^-6 nhằm giảm mật độ vi khuẩn trên mỗi đĩa cấy Đồng thời, phương pháp định tính Bacillus có khả năng sinh enzyme β–galactosidase cũng được áp dụng.

X-gal và cơ chất lactose nhằm giảm thời gian thu Bacillus có hoạt tính

Vùng vi khuẩn có hoạt tính trên đĩa thạch sẽ xuất hiện màu xanh indigo nhờ enzyme thủy phân X-gal, tạo ra kết tủa dichloro-dibromo-indigo màu xanh (Toru Nakayama & Teruo Amachi, 1996).

Để pha loãng mẫu, đầu tiên hút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất đã được hấp tiệt trùng, tạo ra nồng độ pha loãng 10^{-1} Tiếp theo, lặp lại thao tác này bằng cách hút 1ml dịch pha loãng trước đó vào ống nghiệm chứa 9ml nước cất, nhằm đạt được nồng độ pha loãng lần lượt là 10^{-2} và tiếp tục cho các nồng độ thấp hơn.

3,…,10 -n Sử dụng dung dịch ở các nồng độ 10 -4 , 10 -5 , 10 -6

-Hút 60 l X-gal nồng độ 20 mg/ml vào mỗi đĩa, chang đều

Hút 100 ml dịch đã pha loãng ở ba nồng độ khác nhau vào từng đĩa thạch chứa môi trường NA bổ sung 1% lactose (w/v) đã được hấp tiệt trùng ở 121 °C, 1 atm trong 21 phút, với mỗi nồng độ tương ứng cho một đĩa, sau đó chang đều.

-Ủ các đĩa petri trong tủ nuôi 37 o C, quan sát sau 24h, 48h

3.4.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase từ ộ sưu t p có sẵn a, Phương pháp nuôi chủng vi khuẩn

Nguyên tắc: Các chủng vi khuẩn Bacillus được lưu trữ trong tủ -35 o C tại

Ph ng Thí nghiệm Trung tâm được nuôi lỏng trong môi trường NB nhằm tăng khả năng sinh β-galactosidase của chủng

Chuẩn bị các ống fancol 50ml có chứa 5ml môi trường NB đã hấp khử trùng ở

Nghiên cứu được thực hiện ở nhiệt độ 121 độ C và áp suất 1 atm trong 21 phút Sử dụng pipet để hút 50 lít dịch vi khuẩn và cho vào ống fancol Miệng ống được quấn bằng màng bọc thực phẩm, đồng thời đánh dấu tên chủng và thời gian cấy Tất cả các thao tác thí nghiệm được thực hiện trong buồng cấy vi sinh và trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó, các ống fancol được chuyển vào tủ nuôi cấy, duy trì ở 37 độ C và lắc 200 vòng/phút trong 24 giờ Cuối cùng, vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase được xác định bằng phương pháp Test X-Gal.

Theo phương pháp của Toru Nakayama và Teruo Amachi (1996), enzyme β-galactosidase có khả năng thủy phân X-gal, tạo ra sản phẩm kết tủa màu xanh da trời kiểu indigo Do đó, vi khuẩn dương tính với β-galactosidase sẽ hình thành khuẩn lạc màu xanh khi được nuôi cấy trên môi trường đĩa thạch b có chỉ thị X-gal và cơ chất lactose.

Cách 1: Xác định khả năng sinh enzyme β–galactosidase bằng phương pháp cấy chấm điểm trên đĩa thạch

-Môi trường NA b sung 1% đường lactose được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó b sung 60 l X-gal nồng độ 20 mg/ml trên mỗi đĩa, chang đều

Tiến hành cấy chấm điểm chủng vi khuẩn trên mỗi đĩa bằng dịch hoạt hóa Có thể sử dụng que cấy V đã đốt nóng và để nguội, hoặc đầu côn đã hấp khử trùng, sau đó hơ qua ngọn lửa đèn cồn để lấy dịch hoạt hóa.

-Đĩa cấy vi sinh vật đƣợc đƣa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37 o C, trong điều kiện tối Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h

Cách 2: Xác định khả năng sinh enzyme β–galactosidase bằng phương pháp đục đĩa thạch

-Môi trường NA b sung 1% đường lactose được hấp vô trùng và làm nguội, đục các lỗ trên đĩa thạch

-Hút 10 l X-gal nồng độ 20 mg/ml và 10 – 30 l dịch hoạt hóa vào mỗi lỗ trên đĩa, để đĩa trong tủ lạnh 30 phút-1h đến khi dịch khô

-Sau đó đĩa đƣợc đƣa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37 o C, trong điều kiện tối Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h

3.4.2.3 Cấy ria các chủng có hoạt tính

Nguyên tắc: Tạo khuẩn lạc thuần và đơn từ chủng ban đầu để đi xác định hoạt tính bằng cách cấy ria chủng

Chuẩn bị các đĩa petri với môi trường NA đã được hấp khử trùng ở 121 °C, 1 atm trong 21 phút Sử dụng que cấy vô trùng để lấy khuẩn lạc được chọn từ mục 3.4.2.2.

Ria các đường trên đĩa petri, thực hiện ba đường ria cho mỗi đĩa Sau mỗi đường ria, cần đốt khử trùng que cấy và để nguội trước khi tiến hành đường ria tiếp theo.

-Lật ngƣợc đĩa, ủ ở tủ nuôi 37 o C trong 24h

3 4 3 Phư ng pháp xác định hoạt độ enzyme β-galactosidase

3.4.3.1 Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy gi ng

Nguyên tắc: Hoạt hóa Bacillus trong môi trường NB nhằm tăng khả năng sinh β-galactosidase của chúng

Tiến hành: Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống được tiến hành theo

Nguyễn Lân Dũng và cs (1978) và đƣợc mô tả nhƣ sau:

Chuẩn bị các ống fancol 50ml có chứa 5ml môi trường NB đã hấp khử trùng ở

Ở nhiệt độ 121 độ C và áp suất 1 atm, quá trình tiệt trùng diễn ra trong 21 phút Sử dụng đầu que cấy nhọn đã tiệt trùng để lấy khuẩn lạc và cho vào ống fancol Miệng ống được quấn bằng màng bọc thực phẩm, đồng thời đánh dấu tên chủng và thời gian cấy Tất cả các thao tác thí nghiệm được thực hiện trong buồng cấy vi sinh và trên ngọn lửa đèn cồn Cuối cùng, các ống fancol được chuyển vào tủ nuôi cấy, duy trì ở 37 độ C và lắc với tốc độ 200 vòng/phút trong vòng 24 giờ.

Lấy giống 1% từ ống nghiệm hoạt hóa vào bình tam giác chứa 50ml môi trường

NB có b sung 1% đường lactose (w/v) đã hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút Nuôi cấy ở 37 o C, lắc 200 v ng/phút trong 24h

3.4.3.2 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme β-galactosidase

Nguyên tắc: Theo Nguyễn Thu Hà và cs (2007), hoạt độ β-galactosidase đƣợc xác định bằng cách cho enzyme này phản ứng với cơ chất t ng hợp ortho-nitrophenyl-

Dưới tác dụng của enzyme β-galactosidase, 22 β-galactopyranoside (oNPG) sẽ được thủy phân thành galactose và o-nitrophenol Sự giải phóng o-nitrophenol làm cho hỗn hợp phản ứng chuyển sang màu vàng, với độ hấp thụ (Abs) đạt cực đại ở bước sóng 420 nm.

Sau 24 giờ kích hoạt chủng, hút 1,5ml dịch vào ống Eppendorf 2ml và ly tâm ở 4ºC với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút Sau khi ly tâm, tách phần dịch trong để xác định hoạt độ ngoại bào theo các bước tiếp theo.

 Bước 1: Xây dựng đường chuẩn oNP

Vdung dịch gốc oNP (2 mM) (ml) 0 1 2 3 4 5

Vdung dịch đệm pH 7.3 (100mM) (ml) 10 9 8 7 6 5

Hút từ mỗi ống nghiệm 0.5ml oNP vào ống eppendorf có chứa sẵn 0.75ml