Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy chủng bacillus tb1 kích thích sinh tổng hợp poly g glutamic acid

ĐẶT VẤN ĐỀ Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng các hợp chất tự nhiên trong công nghệ thực phẩm là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất có hoạt tính sinh học được tổng hợp

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian học tập tại Trường Đại Học Lâm nghiệp, được sự chỉ dạy tận tình của Thầy Cô giáo trong Trường đặc biệt là Thầy Cô giáo đang công tác và giảng dạy tại Viện Công Nghệ Sinh học, đã giúp em hiểu biết về Ngành Công Nghệ sinh học nói chung và chuyên ngành Công nghệ vi sinh - hóa sinh nói riêng

Thời gian qua em đã tiến hành thực tập khóa luận với đề tài: “Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus TB1 kích thích sinh tổng hợp poly -glutamic acid” tại phòng thí nghiệm Viện Công Nghệ sinh học trường Đại học Lâm nghiệp Nhờ sự giúp đỡ tận tình của Thầy Cô và các Bạn đề tài đã được hoàn thành

Em xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô đang công tác tại Viện Công nghệ sinh học trường Đại Học Lâm nghiệp đã chỉ dạy cho em những kiến thức

và kinh nghiệm quý báu về chuyên ngành Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh trong suốt thời gian qua Đặc biệt là Ts Nguyễn Như Ngọc đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ

bảo về chuyên môn để em hoàn thành đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các Thầy Cô cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công Nghệ Vi sinh - Hóa sinh đã tạo những điều kiện thuận lợi

và sự giúp đỡ nhiệt tình của bạn bè để em có thể hoàn thành tốt đề tài

Do thời gian nghiên cứu có hạn, vốn kiến thức và kinh nghiệm còn hạn chế nên em không thể tránh khỏi những thiếu sót Kính mong quý Thầy Cô, các bạn đóng góp ý kiến để đề tài của em được tốt hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

LÊ THỊ HẰNG

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Giới thiệu về poly γ-glutamic acid 3

1.2 Phân loại poly γ-glutamic acid 4

1.3 Tính chất poly γ-glutamic acid 6

1.4 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp poly γ-glutamic acid 7

1.4.1 Bacillus subtilis 7

1.4.2 Bacillus lichenformis 8

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp  - PGA 8

1.5.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp γ-PGA 8

1.5.2 Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đến quá trình sinh tổng hợp  - PGA 12

1.6 Ứng dụng của γ-PGA 14

1.6.1 Trong lĩnh vực môi trường 14

1.6.2 Trong lĩnh vực y dược 15

1.6.3 Trong lĩnh vực nông nghiệp 16

1.6.4 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm 16

1.6.5.Trong lĩnh vực mỹ phẩm, chăm sóc da 18

1.7 Tình hình nghiên cứu -PGA trên thế giới và Việt Nam 18

1.7.1.Tình hình nghiên cứu -PGA trên thế giới 18

1.7.2 Tình hình nghiên cứu  - PGA trên Việt Nam 19

CHƯƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 22

2.1 Mục tiêu nghiên cứu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.3 Vật liệu và hóa chất 22

2.3.1 Vật liệu 22

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 22

2.3.3 Hóa chất 22

2.4 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu 23

2.5 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm 24

2.6 Phương pháp nghiên cứu 24

2.6.1 Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp -PGA của chủng Bacillus TB1 24

2.6.2 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp  - PGA 26

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 32

3.1 Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp -PGA của chủng Bacillus TB1 32

3.1.1 Khả năng tạo màng trên môi trường đặc hiệu của chủng Bacillus TB1 32

3.1.2 Khả năng tạo độ nhớt bằng nhớt kế mao quản 32

3.1.3 Kết quả thu nhận γ-PGA 33

3.1.4 Kết quả chạy sắc ký bản mỏng 33

3.2 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và sinh tổng hợp  - PGA 34

3.2.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp  - PGA 34

3.2.2 Nghiên cứu nguồn dinh dưỡng cho quá trình sinh tổng hợp -PGA 36

3.2.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc 37

3.2.4 Ảnh hưởng của pH 39

3.2.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 41

3.2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ 43

3.2.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 44

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 47

4.1 KẾT LUẬN 47

4.2 KIẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Thành phần môi trường dinh dưỡng cho quá trình sinh tổng hợp PGA của vi khuẩn [61] 9Bảng 2.1: Thành phần môi trường LB 23Bảng 2.2: Thành phần môi trường đặc hiệu [61] 23Bảng 2.3: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp  - PGA 27Bảng 2.4: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến khả năng tạo độ nhớt và hàm lượng -PGA thô 27Bảng 2.5: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng tạo độ nhớt và hàm lượng -PGA thô 28Bảng 2.6: Ảnh hưởng cuả pH đến khả năng tạo độ nhớt và hàm lượng -PGA thô 29Bảng 2.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo độ nhớt và hàm lượng -PGA thô 29Bảng 2.8: Ảnh hưởng cuả nguồn cacbon đến khả năng tạo độ nhớt và hàm lượng

γ--PGA thô 30Bảng 2.9: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tạo độ nhớt và hàm lượng -PGA thô 31Bảng 3.1: khả năng tạo độ nhớt bằng nhớt kế mao quản của chủng vi khuẩn 120h 32Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo độ nhớt và hàm lượng  - PGA chủng Bacillus TB1 35Bảng 3.3: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến khả năng tạo độ nhớt chủng TB1 36Bảng 3.4: Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng tạo độ nhớt chủng TB1 38Bảng 3.5: Ảnh hưởng của độ pH đến khả năng tạo độ nhớt chủng TB1 39Bảng 3.6: Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tạo độ nhớt chủng TB1 42Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo độ nhớt chủng TB1 43Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tạo độ nhớt chủng TB1 45

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc của phân tử γ-PGA [40] 3 Hình 3.1: Ảnh chụp màng của vi khuẩn TB1tạo ra trên môi trường đặc hiệu 32 Hình 3.2: Hàm lượng γ-PGA sau khi thu nhận bằng phương pháp Manocha 33 Hình 3.3: Sắc ký bản mỏng sản phẩm thủy phân từ dịch nhớt trong canh trường 34 Hình 3.4: Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng tạo độ nhớt và hàm lượng  - PGA chủng Bacillus TB1 35 Hình 3.5: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới khả năng sinh tổng hợp

-PGA của vi khuẩn TB1 tại thời điểm 96 giờ 37 Hình 3.6: Biểu đồ ảnh hưởng của tốc độ lắc tới khả năng sinh tổng hợp  - PGA của vi khuẩn TB1 tại 96 giờ 38 Hình 3.7: Biểu đồ ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh tổng hợp  - PGA 40 Hình 3.8: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng sinh tổng hợp  - PGA của Bacillus TB1 tại 96 giờ 42 Hình 3.9: Biểu đồ ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng sinh sinh hợp  - PGA của vi khuẩn TB1tại thời điểm 96 giờ 44 Hình 3.10: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn nitơ tới khả năng sinh tổng hợp  - PGA của vi khuẩn TB1 tại 96 giờ 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng các hợp chất tự nhiên trong công nghệ thực phẩm là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất có hoạt tính sinh học được tổng hợp từ quá trình sinh học của vi sinh vật So với các hợp chất được tổng hợp bằng phương pháp hóa học, chúng có những ưu điểm vượt trội như an toàn cho sức khỏe của con người và thân thiện với môi trường Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay, việc sử dụng các hóa chất độc hại, nhiều phụ gia có nguồn gốc hóa học ngày càng phổ biến, làm cho vấn đề đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm càng trở nên báo động hơn bao giờ hết Để góp phần giải quyết vấn đề này, việc nghiên cứu tạo ra các chất phụ gia có nguồn gốc sinh học, phù hợp tiêu chuẩn an toàn, thay thế những hóa chất độc hại đang ngày được quan tâm

Poly -glutamic acid (-PGA) là một loại polymer sinh học tự nhiên được tạo ra từ các phân tử axit glutamic Với ưu thế là một polymer có khả năng phân hủy sinh học, không độc với con người và tự nhiên, có thể tạo muối với kim loại và không bị phân cắt bởi protease Do đó, γ-PGA được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, như: Trong lĩnh vực môi trường, γ-PGA có khả năng xử lý một số kim loại nặng, làm vật liệu bao bì có khả năng phân hủy sinh học hay loại bỏ thuốc nhuộm cơ bản ra khỏi nước Trong lĩnh lực y dược, γ-PGA được dùng như các chất mang, keo sinh học… Trong lĩnh lực thực phẩm, γ-PGA được sử dụng như một loại chất phụ gia để

ổn định chất lượng sản phẩm, chất chống kết tinh hay chất ổn định….Ngoài

ra, γ-PGA còn được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như nông nghiệp, làm đẹp và một số ngành công nghiệp khác

γ-PGA có thể được sản xuất bằng cách trùng hợp axit glutamic thông qua con đường hóa học nhưng phổ biến hơn là theo con đường sinh học Hiện nay, quá trình lên men thu nhận γ-PGA thường được thực hiện bởi các chủng vi sinh vật có trong các sản phẩm lên men truyền thống như: Tương bần (Việt Nam), Natto (Nhật Bản), Thua - nao (Thái Lan), Chungkookjang (Hàn Quốc)…

Với nhu cầu sử dụng γ-PGA ngày càng tăng, các nhà khoa học trong nước và thế giới đã và đang tích cực nghiên cứu để chọn lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA với hiệu suất cao từ tự nhiên Tuy nhiên, để thu nhận được lượng γ-PGA lớn đáp ứng với nhu cầu thị trường, việc nghiên cứu tìm ra các điều kiện thích hợp để nuôi cấy các chủng vi sinh vật thu nhận γ-PGA cũng đang là mối quan tâm lớn của các nhà khoa học

Xuất phát từ cơ sở trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khảo sát các điều kiện nuôi cấy chủng Bacillus TB1 kích thích sinh tổng hợp poly -glutamic acid”

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về poly γ-glutamic acid

γ-PGA lần đầu tiên được phát hiện bởi Ivonovics và Bruckner năm

1937 khi họ nghiên cứu về lớp màng bao quanh vi khuẩn Bacillus anthracis [24] Sau đó, một nguồn tự nhiên khác giàu γ-PGA là chất nhầy

của Natto (đậu nành lên men của Nhật Bản), có chứa hỗn hợp γ-PGA và

fructan được sản xuất bởi Bacillus subtilis [40, 17]

Tuy nhiên, cho đến nay γ-PGA được sản xuất chủ yếu bởi vi khuẩn

Gram dương, bao gồm chi Bacillus Nó cũng đã được báo cáo rằng ít nhất một loại vi khuẩn Gram âm (Fusobacterium nucleatum), một số vi khuẩn cổ và

sinh vật nhân chuẩn có khả năng sản xuất γ-PGA [17] γ-PGA cũng đã được tìm thấy trong các tế bào thần kinh của những con chuột ở trạng thái liên kết cộng hóa trị với tubulin [19]

γ-PGA là một polymer tự nhiên, mang điện tích âm có đơn phân là axit L- glutamic hay D- glutamic hoặc chứa cả hai đơn phân trên liên kết với nhau bằng mối liên kết giữa nhóm γ-carboxyl và nhóm α-amino [40]

Hình 1.1: Cấu trúc của phân tử γ-PGA [40]

Khả năng tham gia phản ứng hóa học với nhóm α-NH2 của nhóm COOH và γ-COOH theo thứ tự giảm dần theo mạch Thông thường, α-NH2

α-liên kết với α-COOH tạo nên α-liên kết α-peptid (hình 1.1), tạo ra sản phẩm là α-PGA thông qua các phản ứng hóa học bằng cách trùng hợp nucleophile

của N-carboxyanhylit Sản xuất vi khuẩn α-PGA rất khó và polymer chỉ có

thể được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp [15] Nhưng khi có được một hệ xúc tác thích hợp, nhóm α-NH2 sẽ liên kết với nhóm γ-COOH để tạo nên liên kết γ-peptid, như mô tả trong hình 1.1 Sự hình thành γ- PGA khác với sự hình thành của protein, vì glutamate được polymer hóa bên trong tế bào thông qua các mối liên kết γ-amide, tổng hợp một cách độc lập với ribosome Do đó, các chất ức chế sự dịch mã của protein, chẳng hạn như chloramphenicol không có ảnh hưởng đến việc tổng hợp γ-PGA [6]

Nhờ quá trình polymer hóa, γ-PGA có thể được hình thành từ hơn 10.000 phân tử axit glutamic

Một số nghiên cứu về γ-PGA từ vi khuẩn đã được tiến hành thông qua việc đo độ nhớt, đo phổ phấp thụ hồng ngoại Các nghiên cứu cho thấy phần chất nhầy của natto chiếm 58% là γ-PGA và polysaccharide chiếm 40% và một số hợp chất khác, khi pH khoảng 5 - 8,8 thì phần nhầy này sẽ thay đổi tỷ

lệ giữa γ-PGAvà polysaccharide [38]

Một số nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng cuả nồng độ polymer tới cấu trúc của γ-PGA Nếu nồng độ polymer thấp thì γ-PGA có cấu trúc xoắn, nhưng γ-PGA lại có cấu trúc dạng β khi ở nồng độ polymer cao [5]

Nồng độ của Mn2+ có thể ảnh hưởng đến cấu hình của axit glutamic

trong γ-PGA được tổng hợp bởi Bacillus subtilis Khi môi trường có nồng độ

Mn2+ cao thì trong γ-PGA có đồng phân dạng D-glutamate >80%, môi trường

có nồng độ Mn2+ thấp thì γ-PGA có đồng phân dạng D-glutamate 40% [50]

1.2 Phân loại poly γ-glutamic acid

Có rất nhiều hình thức phân loại γ-PGA nhưng có 2 loại phân loại phổ biến dựa và tính chất, cấu trúc của γ-PGA hay phương thức tồn tại của γ-PGAtrong môi trường nuôi cấy vi sinh vật mà người ta phân thành 2 cách phổ biến như sau:

 Cách 1: Dựa vào cấu trúc -PGA được phân làm 3 dạng

Dạng 1: Axit poly γ-D-glutamic:

Chỉ chứa đơn phân là D-glutamic Loại polymer này hiện nay mới

được chứng minh được tạo ra bởi chủng vi khuẩn B anthracis, một chủng

được tìm thấy trên các vật chủ bị bệnh than [16, 17]

Dạng 2: Axit poly γ- L-glutamic (L-γ-PGA)

Là polymer chỉ chứa các đơn phân là axit L-glutamic loại này được sản

xuất chủ yếu từ các vi khuẩn Natrialba aegyptiacia (một loài ưa mặn),

L-γ-PGA cũng được tìm thấy rất nhiều trong các động vật có xúc tu (sứa biển, san hô) và thành phần chính trong chất dính của Hydra L-γ- PGA kết hợp với các cation như: Ca²+

, Mg2+ và K+ giúp vi khuẩn và các sinh vật khác điều hòa áp suất thẩm thấu bên trong tế bào [29]

Dạng 3: Axit poly γ-D,L- glutamic (DL-γ-PGA):

Là polymer trong phân tử chứa cả axit L-glutamic và axit D-glutamic,

DL-γ-PGA được sản xuất chủ yếu từ Bacillus được chia làm 2 nhóm:

 Nhóm 1: Cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trường nuôi cấy để tổng hợp γ-PGA

 Nhóm 2: Không cần bổ sung axit L-glutamic vào môi trường nuôi cấy để tổng hợp γ-PGA

 Cách 2: Phân loại theo phương thức tồn tại trong canh trường vi sinh vật, có 2 dạng

Dạng 1: -PGA dạng neo giữ

Chủ yếu có trong vi khuẩn B anthracis Dạng neo giữ thường được tìm

thấy dưới dạng nội bào, được tiết ra ngoài dưới dạng các sợi liên kết giữa vi khuẩn và môi trường ngoài khi gặp điều kiện bất lợi Do vậy việc sử dụng γ-PGA từ dạng neo giữ ít được nghiên cứu [22]

Dạng 2: -PGA dạng tự do được tiết trực tiếp vào môi trường nuôi cấy

Dạng này chủ yếu được tìm thấy trong các loài lành tính của chi

Bacillus mà điển hình là B subtilis γ-PGA chủ yếu tạo độ nhầy bao quanh tế

bào vi khuẩn và có vai trò cung cấp chất dinh dưỡng cho chúng trong trường hợp môi trường thiếu dinh dưỡng, trong giai đoạn suy vong của vi khuẩn [47]

1.3 Tính chất của poly γ-glutamic acid

Không giống như các protein, có liên kết α-amin, γ-PGA hiển thị liên kết γ của các thành phần của nó với glutamat vì vậy nó khác với cả protein cả

về cấu trúc lẫn tính chất chính bởi liên kết γ- peptit trong γ-PGA

-PGA là tinh thể màu trắng, không màu, không mùi, không vị có thể bị phân hủy sinh học và không độc với môi trường, động vật cũng như con người -PGA có khả năng hòa tan trong nước và tạo ra được các liên kết bền vững với nước, do vậy khả năng giữ nước được cho là tính chất nổi trội của γ-PGA [55, 56]

γ-PGA có thể kết hợp với một số kim loại nặng để tạo ra dạng muối phức với các ion như: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, NH4 +… có ứng dụng rộng dãi trong việc

xử lý môi trường, nhờ tạo ra dạng muối phức này γ-PGA làm cô lập, bao bọc các kim loại nặng không cho phát tán ra môi trường gây ô nhiễm môi trường

Đối với các dạng D-PGA và L-PGA riêng rẽ, chúng có khả năng tan trong ethanol, nhưng khi chúng là một hỗn hợp đẳng mol thì bị kết tủa trong ethanol [22, 40]

-PGA có kích thước cũng như khối lượng rất đa dạng, phụ thuộc vào dạng liên kết của nó với các chất khác trong môi trường vi sinh vật, khối lượng trung bình γ-PGA từ vài kilo Dalton đến hàng triệu kilo Dalton Thường khối lượng của γ-PGA ở dạng neo giữ nhỏ hơn dạng γ-PGA tự do hay dạng D, L-γ-PGA thường có khối lượng lớn hơn nhiều so với D-γ-PGA [16]

Tùy thuộc vào điều kiện môi trường, γ-PGA có thể thể hiện 5 dạng khác nhau: α-helix, β-sheet, chuyển tiếp xoắn ốc - ngẫu nhiên, cuộn dây ngẫu nhiên và tổng hợp bao quanh [22].Trạng thái hình thể của γ-PGA có thể thay đổi tùy thuộc vào một số yếu tố, chẳng hạn như độ pH, nồng độ polymer và

sức mạnh ion Nó đã được chỉ ra rằng γ-PGA tinh chế từ B licheniformis có

thể tồn tại trong các trạng thái hình thể khác nhau tùy thuộc vào nồng độ của γ-PGA và độ pH của dung dịch Ở nồng độ thấp (0,1% w / v) và độ pH <7,0,

PGA chấp nhận một cấu hình dựa trên α-helices, trong khi cấu trúc dựa trên tấm β chiếm ưu thế ở pH cao hơn [5] Hình dạng tấm β dường như làm lộ các điện tích âm của γ-PGA rất hiệu quả

1.4 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp poly γ-glutamic acid

Các nghiên cứu trước đây cho thấy tất cả các vi khuẩn tạo ra γ-PGA

đều là vi khuẩn gram dương và chủ yếu là vi khuẩn thuộc các loài như: B

thuringensis, B cereus, B pumilus, B amyloliquefaciens, B mojavensis, B atrophaeus, B megaterium, Staphylococcus epidermidis, Natrialba aegyptiaca, Lysinibacillus sphaericus và Fusobacterium nucleatum trong đó

một số chủng vi khuẩn này đã được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp và đời sống [46,]

1.4.1 Bacillus subtilis

Đây là những vi sinh vật được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu

về đường ruột và trong công nghiệp, chúng được phân bố rộng rãi khắp mọi

nơi như đất, cát, nước, bụi, không khí,…chúng thuộc họ bacillaceae B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hình que, ngắn, nhỏ, hai đầu tròn, tế bào đứng riêng

rẽ hoặc chuỗi B subtilis là vi khuẩn gram dương, chúng có thể sinh trưởng

trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, có khả năng hình thành bào tử khi gặp các điều kiện bất lợi về mặt tự nhiên cũng như khi cạn môi trường hay có những biến động mạnh

Một số chủng B subtilis đã được phân lập và nghiên cứu sinh tổng hợp γ-PGA trên thế giới như: B subtilis NX-2, ZJU-7, TAM 4, IFO 3335, RKY3,

chungkookjang, natto… là nhưng vi khuẩn điển hình được phân lập từ các sản phẩm thực phẩm Các chủng này khi ứng dụng để sản xuất γ-PGA trên thực tế cho sản lượng ổn định từ 20g/l đến 50 g/l, an toàn với người và động vật [58]

Đối với chủng B subtilis F-02-1 trong môi trường nuôi cấy thích hợp ở

nhiệt độ 300C với thời gian lên men 48 - 72h lượng γ-PGA có thể đạt mức 50g/l [31]

mạc B licheniformis khuẩn lạc nhỏ, màu trắng đục, bề mặt nhăn nheo, tế bào

chuyển động nhờ tiêm mao và loài này kị khí không bắt buộc

B licheniformis 9945a (NCIM 2324) là một chủng nổi bật đã được sử

dụng để sản xuất γ-PGA Chủng này có thể thu được γ-PGA từ 17 - 23g/l ở

370C trong 96 giờ [53]

B licheniformis SAB-26 có thể được phân loại như một nhà sản xuất

γ-PGA độc lập glutamate khi axit L-glutamic được sử dụng làm nguồn nitơ, việc sản xuất γ-PGA đã bị đàn áp Năng suất 33,5g/l thu được khi vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường tối ưu, tăng gấp 3 lần so với khi nuôi trên môi trường cơ bản [44]

Một số chủng được ứng dụng nhiều trên thế giới như B licheniformis S2,

ATCC 9945a, WBL-3, CCRC 12826, với khả năng sinh tổng hợp γ-PGAlên đến 98 g/l [17]

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp  - PGA

1.5.1 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp γ-PGA

Nguồn dinh dưỡng là yếu tố quyết định để vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và tạo ra các sản phẩm mong muốn Khi nuôi cấy trong môi trường khác nhau, các chủng vi sinh vật sẽ tạo ra các hợp chất khác nhau Chính vì vậy, sau nhiều năm nghiên cứu về γ-PGA các nhà khoa học trên thế giới đã đưa ra một môi trường đặc hiệu E hay còn gọi là môi trường cải tiến với đầy đủ các nguồn dinh dưỡng cần thiết cho quá trình sinh trưởng, phát triển để sinh tổng hợp γ-PGA

Bảng 1.1: Thành phần môi trường dinh dưỡng cho quá trình sinh tổng

hợp γ-PGA của vi khuẩn [61]

1.5.1.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Nguồn cacbon thường được sử dụng trong các nghiên cứu về γ-PGA gồm: đường glucose, fructose, maltose, galactose, lactose, sucrose, bột đậu tương, bột mỳ… làm cơ chất trên môi trường rắn theo một số nghiên cứu

trên thế giới, nhiều chủng vi khuẩn B subtilic có thể sử dụng nguồn đậu

tương làm nguồn cacbon chính trong quá trình sinh tổng hợp γ-PGA, bởi trong thành phần bột đậu tương chứa nhiều các axit amin, vitamin, một số muối khoáng cần thiết Thông thường, trong các môi trường sinh tổng hợp γ-PGA các thành phần cacbon thường được sử dụng là glycerol, axit citric, axit L-glutamic Nghiên cứu về các đặc tính và khả năng chuyển hóa của 3 nguồn cacbon là glutamic acid, citric acid và glycerol được cụ thể như sau:

 Glutamic acid

Glutamic acid trong quá trình tổng hợp γ-PGA được tham gia trong chu trình bằng hai cách Cách thứ nhất glutamic được thêm vào trong canh trường

từ ban đầu, cách thứ 2 glutamic được tạo ra từ các nguồn cacbon khác Theo một số nghiên cứu về γ-PGA, vi sinh vật sinh tổng hợp γ-PGA được chia làm hai nhóm [40]:

 Nhóm1: Môi trường đòi hỏi sử dụng axit L-glutamic để kích thích tế

bào phát triển và tổng hợp γ-PGA bao gồm các chủng B subtilis ATCC9945a,

B subtilis IFO3335 và B subtilis F-2-01, [19, 41]

 Nhóm 2: Môi trường không đòi hỏi axit L-glutamic để sản sinh

γ-PGA bao gồm các chủng B subtilis 5E, B subtilis TAM-4 và B licheniformis

A35 Vi khuẩn không phụ thuộc axit L- glutamic thường sử dụng citric acid

và glucose làm nguồn cacbon chính cho việc tạo thành γ-PGA B subtilis A35

có thể sản sinh γ-PGA từ glucose và NH4Cl [5]

 Citric acid

Theo chu trình chuyển hóa γ-PGA việc sử dụng các nguồn carbon từ axit citric là nguồn cacbon chính, bởi nó là mắt xích trung gian quan trong trong chu trình axit tricacboxylic Vì vậy nó xuất hiện trong trao đổi chất của gần như mọi sinh vật Một số nghiên cứu đã chỉ ra một số chủng vi khuẩn sử dụng citric acid trong thành phần của môi trường thì việc hình thành hàm lượng γ-PGA cao Nhưng nếu sử dụng glucose thay citric acid làm nguồn cacbon thì vi khuẩn tổng hợp hàm lượng γ-PGA rất ít hoặc không có [40, 57] Nhưng ngược lại, có một số chủng vi khuẩn có thể sử dụng glucose cho hàm

lượng lại cao hơn so với sử dụng citric acid như B subtilis NX2, B subtilis ZJU7, B subtilis F-23…[33]

Khi nghiên cứu so sánh sử dụng axit citric với một số các axit hữu cơ khác như axit succinic, L-malic, fumaric trong nghiên cứu lên men sinh γ-PGA cho thấy sự hình thành γ-PGA là rất ít, thay vào đó là sự hình thành nhiều hơn của các sản phẩm phụ.Ở nồng độ citric acid cao hơn 30 g/l sẽ gây

ra hiện tượng ức chế, giảm sự sinh trưởng của tế bào vi sinh vật, làm ảnh hưởng đến sự tạo thành γ-PGA [27] Sự chuyển hóa của axit citric trong quá

trình tổng hợp γ-PGA được khảo sát trên đối tượng là vi khuẩn B

licheniformis cho thấy với nồng độ ban đầu là 12g/l, sau 10 giờ lên men thì

nồng độ citric acid giảm mạnh và gần như không còn sau 21giờ lên men Để tăng hàm lượng γ-PGA lên 15%, các nghiên cứu đã tiến hành bổ sung một lượng từ 2-5 g/l axit citric vào thời điểm sau 21giờ lên men [55]

 Glycerol

Glycerol tham gia trong quá trình sinh tổng hợp γ-PGA như một chất

xúc tác cho quá trình polymer hóa L-glutamic hay làm cơ chất để vi sinh vật phát triển Glycerol ảnh hưởng đến hàm lượng γ-PGA ngay ở thời kỳ đầu của quá trình tổng hợp Khi hàm lượng glycerol tăng hàm lượng γ-PGA tăng

Nghiên cứu về sự thay đổi nồng độ glycerol trong toàn bộ quá trình lên

men trên B licheniformis cho thấy nồng độ glycerol thay đổi không đáng kể

trong khoảng thời gian 36 giờ quá trình lên men, giảm khoảng 10-15% từ 36 giờ đến 50 giờ [55] Hàm lượng glycerol trong canh trường lên men còn lại 45-50% sau thời gian 96 giờ và giá trị này tùy thuộc vào giá trị pH của canh

trường nuôi cấy

1.5.1.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nguồn nitơ sử dụng trong môi trường nuôi cấy có thể là các hợp chất hữu

cơ (bột đậu tương, bột đậu, cao nấm men, pepton…) hoặc hợp chất vô cơ (urê, NH4NO3, NH4Cl, (NH4)2SO4, các muối amon khác…) Nguồn nitơ là yếu tố quyết định cho sự sinh trưởng của tế bào và là yếu tố xúc tác cho quá trình chuyển hóa thành axit glutamic [27] Sự khác nhau về chủng giống vi sinh vật cũng ảnh hưởng nhiều đến việc sử dụng nguồn nitơ Nhiều nguồn nitơ có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme, một số khác lại kìm hãm hoặc không có ảnh hưởng rõ rệt Nhiều chủng có thể sử dụng một trong hai nguồn nitơ là NH4 + hoặc cao nấm men, hoặc có thể dùng đồng thời hai loại

này như B subtilis ZJU-7 [5]

1.5.1.3 Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng

Trong sinh tổng hợp γ-PGA các nguyên tố vi lượng là Ca2+, Mg2+, Fe3+,

Mn2+,Cu2+,… Các nguyên tố này thường có trong nước hoặc trong các thành

phần hữu cơ khác của môi trường do đó không cần bổ sung hoặc chỉ bổ sung

ở dạng rất ít (bổ sung dưới dạng muối vô cơ với hàm lượng nhỏ hơn 0,5% thành phần của môi trường) Nếu nồng độ của các nguyên tố này tăng sẽ kìm hãm mạnh sự phát triển của vi sinh vật

Nghiên cứu trên chủng B licheniformic 9945a cho thấy khi không có sự

tham gia của MnSO4, tế bào vi khuẩn bị suy thoái sau 50 giờ nuôi Sự có mặt của MnSO4 giúp tế bào đồng hóa glycerol, L-glutamic và citric acid tốt hơn khi không có nó Sự có mặt của MnSO4 tạo ra một lượng γ-PGA (13g/l) cao hơn so với lượng γ-PGA (5g/l) khi không có sự tham gia của MnSO4 [30] Ion Ca2+ tuy không ảnh hưởng nhiều đến quá trình sinh tổng hợp nhưng

nó ảnh hưởng đến tính chất của sản phẩm khi ứng dụng Sự có mặt Ca2+ trong γ-PGA sản phẩm sẽ giúp tăng sự hấp thụ Ca2+

trong cơ thể giúp ứng dụng trong các lĩnh vực dược phẩm, thực phẩm chức năng [10]

1.5.2 Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh đến quá trình sinh tổng hợp  - P G A

1.5.2.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Thông thường vi khuẩn chia làm 3 dải: vi khuẩn ưa lạnh có nhiệt độ dưới 200C, vi khuẩn ưa ấm có nhiệt độ từ 200C đến 450

C, vi khuẩn

ưa nóng có nhiệt độ từ 450

C trở lên Đây cũng là đặc điểm để phân lập, tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp -PGA Đối với các chủng sinh tổng hợp γ-PGA, tùy theo đặc tính của từng loài mà nhiệt độ tối ưu của các chủng

khác nhau Nghiên cứu trên các chủng B licheniformic ATCC 9945 sinh tổng

hợp γ-PGA thích hợp ở nhiệt độ 30oC Trong khi đó nhiệt độ thích hợp cho

các chủng B subtilis IFO3335, B subtilis ZJU-7, B subtilis TAM-4, cho tổng

hợp γ-PGA là nhiệt độ 37oC Còn chủng B subtilis natto, nhiệt độ 40oC là tối

ưu nhất cho tổng hợp γ-PGA [40, 41]

1.5.2.2 pH môi trường

Trong môi trường nuôi cấy, sự sinh trưởng của vi sinh vật bị ảnh hưởng trực tiếp bởi nồng độ H+, nồng độ H+ phù hợp sẽ thúc đẩy sự sinh tổng hợp  - PGA của vi sinh vật Ngược lại, nồng độ H+ không thích hợp sẽ kìm hãm sự sinh tổng hợp -PGA của vi sinh vật Như vậy có thể nói giá trị pH tối ưu cho mỗi canh trường nuôi cấy phụ thuộc vào rất nhiều chủng tham gia quá trình sinh tổng hợp -PGA Trong quá trình lên men, pH luôn thay đổi liên tục, tùy thuộc theo từng chủng vi sinh vật mà có các pH thay đổi khác nhau

Một số nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp PGA nằm trong khoảng 6 – 8 Giá trị pH tối ưu cho mỗi canh trường nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều vào các chủng vi khuẩn tham gia tổng hợp γ-PGA Một

γ-nghiên cứu về chủng vi khuẩn B subtilis IFO3335 cho thấy, pH tối ưu là 7 và

lượng γ-PGA tạo thành là 23 g/l cao gấp 1,44 lần trước khi tối ưu pH [40] Nghiên cứu về chủng B licheniformis NCIM 2324 cho thấy pH = 6,5 là giá trị tối ưu cho sinh tổng hợp γ-PGA [58]

1.5.2.3 Tốc độ lắc

Trong nghiên cứu quy trình lên men ở quy mô phòng thí nghiệm, quá trình lắc (cấp khí và khuấy trộn) có thể không thể hiện chính xác, tương ứng với quy mô khi nhân rộng

Các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA khi nuôi cấy trên quy mô phòng thí nghiệm thường được nghiên cứu ở chế độ nuôi tĩnh, trong khi thực hiện ở quy mô công nghiệp thường được nghiên cứu bổ sung thêm chế độ sục khí hoặc khuấy trộn đển đảm bảo nguồn oxy cho vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và tổng hợp γ- PGA Vì vậy, trước khi lên men trên quy mô lớn cần phải nghiên cứu kỹ đặc tính chu kỳ sinh trưởng và tổng hợp của chủng vi khuẩn để đưa ra những chế độ cấp khí và khuấy trộn phù hợp

Kết quả nghiên cứu của Shih và các cộng sự cho thấy khi tăng lưu lượng sục khí từ 0,5 lít/phút lên 2,0 lít/phút và tốc độ khuấy từ 250 vòng/phút lên

800 vòng/phút trong quá trình nuôi cấy B licheniformis thì lượng γ-PGA thu

được tăng từ 15 g/l lên đến 23 g/l [40]

1.6 Ứng dụng của γ-PGA

-PGA là một chất rất quan trọng đã được khai thác cho một loạt các ứng dụng hữu ích do tính chất độc đáo của nó Nó có khả năng phân huỷ sinh học, ăn được và không độc đối với con người, có thể tạo muối với kim loại và không bị phân cắt bởi protease Chính nhờ những đặc điểm này mà γ-PGA được ứng dụng rộng dãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: môi trường, y

dược, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm và một số ngành công nghiệp khác

1.6.1 Trong lĩnh vực môi trường

Kể từ cuộc cách mạng công nghiệp, chúng ta đã thải ra môi trường các chất gây ô nhiễm khác nhau như kim loại nặng, chất phóng xạ và hóa chất đe dọa sức khoẻ cộng đồng và làm tăng khả năng thiếu hụt các nguồn cung cấp thông tin do ô nhiễm sâu dẫn đến giảm sản lượng nông nghiệp, nước bị ô nhiễm và các hiệu ứng chẳng hạn như mưa acid Việc xử lý đất, trầm tích và nước bị ô nhiễm gây ra một thách thức to lớn, và sự hiểu biết về sự tương tác của các chất gây ô nhiễm với γ-PGA có thể cung cấp cơ sở để phát triển công

nghệ xử lý mới

-PGAđược sử dụng như một chất tạo chelate trong xử lý nước thải, làm nhựa sinh học có tác dụng liên kết bùn nhằm làm đông tụ, kết lắng bùn thay thế cho muối nhôm sunfat, chitosan, axit polyacrylic…do tính chất là một polymer có nguồn gốc sinh học, có khả năng phân hủy sinh học, không độc với con người và môi trường

Trong quá trình xử lý môi trường có nhiều loại kim loại nặng như: Cr 3+

, Cu 2+, Pb 2+ và Ni 2+,… phóng xạ tự nhiên ảnh hưởng đến sức khỏe con người, γ-PGA còn có tác dụng làm bao bọc và cô lập các yếu tố gây hại thành một nhóm và không cho phát tán ra môi truờng, hoặc làm cho các kim loại nặng này liên kết với nhau thành các cụm, nhóm tạo điều kiện thuận lợi

cho các quá trình xử lý môi trường [5]

-PGA ngoài ra còn được ứng dụng làm vật liệu bao bì có khả năng phân hủy sinh học trong suốt, có độ đàn hồi và độ dai cao, nhằm thay thế cho các bao bì không có khả năng phân hủy sinh học [13, 47]

-PGA (9,9 × 10 5 Da) có thể được sử dụng hiệu quả để loại bỏ thuốc nhuộm cơ bản khỏi dung dịch nước Người ta đã chứng minh rằng 98% thuốc nhuộm hấp phụ trên γ-PGA có thể được phục hồi ở pH = 1 [25]

Với mục đích áp dụng rộng rãi trong xử lý nước thải, nạo vét và các quy trình hạ lưu công nghiệp, các chất kết tụ -PGA đã được phát triển Trong tương lai, các chất kết tụ sinh học như vậy có thể được sử dụng để làm sạch nước uống nhanh chóng bên cạnh việc xử lý ở hạ nguồn trong các ngành công nghiệp lên men và thực phẩm [11]

Hiện nay, các nhà khoa học đang tiếp tục nổ lực nghiên cứu để mở rộng khả năng ứng dụng cũng như các điều kiện thu nhận -PGA đối với các lĩnh vực xử lý nước, kể cả tinh chế nước và xử lý nước thải

1.6.2 Trong lĩnh vực y dược

Trong y học, γ-PGA được sử dụng làm chất mang cho các loại thuốc khác nhau trong quá trình điều trị theo liệu pháp gen, γ-PGA còn được sử dụng trong thành phần của chất cầm máu và chỉ khâu tự tiêu

γ-PGA đã được tìm thấy để tăng hấp thu canxi trong ống nghiệm và trong cơ thể, và giảm sự mất xương ở người γ-PGA làm tăng khả dụng sinh học của canxi bằng cách tăng khả năng hòa tan và hấp thu ruột Sự tăng độ tan canxi là do sự ức chế sản xuất canxi phosphat không tan [40] Việc sử dụng γ-PGA làm tăng sự hấp thu canxi trong ruột ở phụ nữ sau mãn kinh bằng cách ức chế sự hình thành phức hợp canxi không hòa tan với phosphate

Keo sinh học là một sản phẩm được kết hợp giữa gelatin và γ-PGA Khi ở trong trạng thái dung dịch, hỗn hợp giữa gelatin và γ-PGA được liên kết với nhau bởi các liên kết hydrogel và carbodiimide hòa tan Hợp chất này cho thấy rằng có khả năng hấp phụ và giữ được bọt khí tốt hơn so với keo fibrin

truyền thống Dạng hỗn hợp này đã được sử dụng nhiều trong y học với tác dụng làm lành những tổn thương của phổi [39]

Trong dược phẩm γ-PGA được nghiên cứu kết hợp với các hỗn hợp polymer sinh học như γ-PGA với polylactic, γ-PGA với chitosan, γ-PGA với phenylalanin để làm các loại chất dẫn thuốc trong điều trị các căn bệnh ung thư gan, ung thư phổi và ức chế một số loại virus gây bệnh cho người và động vật [40]

γ-PGA với khối lượng phân tử cao gây ra sự miễn dịch kháng thể chống ung thư qua trung gian tế bào ở những con chuột mang các khối u tương ứng độ phức tạp mạch vành nhóm I lớn nhất [28] Nghiên cứu này gợi

ý khả năng sử dụng γ-PGA trong điều trị miễn dịch ung thư

Các glycopolymer dựa trên γ-PGA (được sử dụng để ức chế vi rút cúm) cho thấy độ tan trong nước và tính ổn định nhiệt cao hơn, và độc tính thấp hơn so với glycopolymer không có γ-PGA [38]

1.6.3 Trong lĩnh vực nông nghiệp

-PGA còn được xem như một chất bảo vệ nguồn vi lượng cho cây, vì

nó có khả năng liên kết với các nguyên tố K+, Na+, Mn2+, Mg2+, Fe3+, Ca2+,… các khoáng chất này được cây trồng hấp thụ dần theo nước có chứa γ- PGA Do vậy, γ-PGA có tác dụng kích thích phát triển bộ rễ, nâng cao khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng, giúp cây tăng trưởng nhanh, tán lá phát triển mạnh, quả lớn, tăng sản lượng và chất lượng cho nông sản [47]

Trong sản xuất thức ăn chăn nuôi, γ-PGA được sử dụng như một chất bổ sung làm tăng cường khả năng thấp thụ canxi, photpho của vật nuôi, giúp cho chúng có khung xương chắc khỏe, tăng chất lượng và trọng lượng cho thịt, xương, cho hiệu quả chăn nuôi cao nhất Nhờ có sự hấp thụ khoáng chất này mà sản lượng trứng tăng, làm giảm lượng chất béo không cần thiết của vật nuôi [47]

1.6.4 Trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm

-PGA hiện nay đang được sử dụng thay thế một phần cho CMC (Carbon methyl Cellulose - một chất tạo kết cấu và sự ổn định trong thực

phẩm) trong công nghệ chế biến thực phẩm như ngành mỳ ăn liền, bún, đồ hộp, nước hoa quả…có nguồn gốc sinh học, an toàn đối với con người hơn CMC [21,47]

-PGA với khối lượng phân tử <20 kDa đã được chứng minh có hoạt động chống đông cao hơn các chất chống đông như glucose và chúng không ảnh hưởng đến hương vị của thực phẩm -PGA được sử dụng làm chất phụ gia bổ sung vào các sản phẩm đông lạnh bởi làm tăng khả năng chống kết tinh của sản phẩm, làm giảm nhiệt độ đóng băng của sản phẩm

Các sản phẩm đông lạnh khi sử dụng γ-PGA sau khi rã đông không bị mất hương vi do γ-PGA kết hợp với dịch nước trong sản phẩm làm giảm nhiệt

độ đóng băng [41]

-PGA có trong thành phần kẹo cao su, một số đồ uống có tác dụng chống hôi miệng, ngăn ngừa sâu răng mà không làm giảm hương vị của sản phẩm Tác dụng này của γ-PGA được so sánh cao hơn tác dụng của nước muối sinh lý từ 30 - 50% [22]

-PGA có tác dụng làm giảm độ đắng trong đồ uống hoa quả tươi, ổn định cấu trúc nhũ hóa giúp sản phẩm không bị phân lớp trong thời gian bảo quản [22, 41]

-PGA đã được chứng minh là làm giảm sự hấp thụ dầu trong quá trình chiên rán chất béo.Vì thế, γ-PGA được thêm vào bánh rán cho thấy lượng dầu

bị hấp thụ gấp 5 lần so với bình thường và làm hương vị tổng thể của sản phẩm tốt hơn so với bánh quy bình thường [41]

Hiện tại, Trong công nghệ sản xuất bánh kẹo xốp -PGA được thêm vào trong nguyên liệu làm kem cùng với một số chất nhũ hóa có khả năng tăng tính ổn định sản phẩm kem xốp, làm tăng cường tính xốp của kem ở 2 mặt bánh mà không ảnh hưởng đến chất lượng bánh [21, 34] Việc bổ sung γ-PGA vào bánh mì nhằm mục đích làm giảm độ cứng của bánh mì, giúp bánh

mì có độ mềm dẻo nhưng không làm ảnh hưởng đến hương vị của bánh

1.6.5 Trong lĩnh vực mỹ phẩm, chăm sóc da

Nghiên cứu thực tế cho thấy rằng, γ-PGA có tính chất hấp thụ nước và

có độ bám dính bề mặt tốt, do đó γ-PGA đã được nghiên cứu, phát triển và sản xuất chất giữ ẩm và chất phân tán có chất lượng cao được sử dụng trong ngành thẩm mỹ và vệ sinh Trong thực tế, người ta đã sử dụng γ-PGA để thay thế cho axit hyaluronic nhằm mục đích tăng cường các yếu tố giữ ẩm tự nhiên như axit urocanic, axit carboxylic pyrrolidone và axit lactic so với axit hyaluronic và collagen hòa tan [11]

γ-PGA cũng cho thấy tăng cường độ đàn hồi của da nhiều hơn collagen

và axit hyaluronic cũng như làm mới và nuôi dưỡng làn da, làm cho nó trở nên mượt mà và hấp dẫn hơn [11, 40]

-PGA đã được sử dụng thành công như một thành phần hoạt chất trong một chất ức chế hyaluronidase (một enzyme làm giảm axit hyaluronic có trong da ) Bằng cách ức chế hoạt động của hyaluronidase, -PGA đã được tiến hành thử nghiệm trên 50 phụ nữ (30-50 tuổi) thì kết quả cho thấy rằng các phụ nữ sử dụng -PGA được duy trì độ đàn hồi của da và giảm phản ứng

dị ứng [46]

Sự kết hợp giữa γ-PGA-vitamin C bằng liên kết giữa nhóm cacboxyl trong γ-PGA và hydroxyl của vitamin C đã giúp phần cải thiện tính bền của vitamin C Nhờ sự liên kết này mà vitamin C được sử dụng hiệu quả hơn trong việc chăm sóc da, bởi hợp chất này giống như một chất ức chế collagenase khi có tác động của tia cực tím [11, 40]

1.7 Tình hình nghiên cứu -PGA trên thế giới và việt nam

1.7.1 Tình hình nghiên cứu -PGA trên thế giới

-PGA đã được phát hiện từ rất lâu từ năm 1937 khi Invanovic và cộng

sự nghiên cứu về lớp màng bao quanh vi khuẩn Bacillus antharasis[24]

Năm 1962, House và các cộng sự phân tách được một hệ enzym tổng hợp PGA cũng từ chủng Bacillus licheniformis 9945A Tuy nhiên, hệ enzym này xúc tác tạo ra một loại γ- PGA chứa 60% là axit L-glutamic [23]

Năm 1973, Troy đã tìm ra một phức hợp các enzym poly-glutamyl

synthetase ở màng nhầy bao quanh vi khuẩn B licheniformis 9945A xúc tác

cho hàng loạt phản ứng trên màng, trong đó axit L- glutamic được hoạt hóa, đồng phân hóa và polymer hóa thành cấu trúc rất giống cấu trúc của D –PGA

Hệ enzym xúc tác cho các phản ứng này đòi hỏi phải sự có mặt của ion Mg2+

và không thể thay thế bằng các ion kim loại khác [53]

Năm 1982, trong một số nghiên cứu đã công bố việc phân lập được một

số enzym ngoại bào từ Bacillus natto tham gia xúc tác cho phản ứng chuyển

hóa amin đặc biệt là cho glutamine Các đơn phân này được chuyển hóa thành đơn phân còn lại, sau đó chúng sẽ liên kết với nhau nhờ các liên kết γ-peptid

và tồn tại ở dạng đồng hình chỉ chứa một loại đơn phân Kết quả là có hàng loạt enzym phải tham gia vào quá trình tổng hợp này [51]

Các nghiên cứu về -PGA được nghiên cứu sâu hơn vào năm 1995 đã được Kanno và cộng sự đưa ra với phương pháp đơn giản để phát hiện, tinh sạch, xác định PGA rất hữu ích trong việc nghiên cứu di truyền và sinh hóa Phương pháp này sử dụng chất Cetyltrimethylammonium bromide là chất tạo đục trong dịch chứa -PGA rồi đo OD ở 400nm có thể xác định được hàm lượng -PGA [7]

Nghiên cứu về sự hình thành màng sinh học từ chủng B.subtilis ATCC

14593 và chỉ ra rằng -PGA là thành phần chính của màng sinh học nhờ Masaaki và các cộng sự được thực hiện năm 2006 [34]

Năm 2009, Inbaraj và cộng sự đã chứng minh γ-PGA cũng liên kết rất chặt chẽ với ion hóa trị hai như thủy ngân (Hg2+), ion chì (Pb2+), chính nhờ khả năng tạo kết phức với các ion hóa trị hai này mà γ-PGA được coi như một chất hấp thụ đầy hứa hẹn để loại bỏ các kim loại nặng trong quá ô ngiễm nguồn nước [25]

1.7.2 Tình hình nghiên cứu  - PGA trên Việt Nam

Ở nước ta một số sản phẩm truyền thống như tương Bần, nước mắn, chao, tôm chua Huế… là các dạng lên men tự nhiên nhờ vi sinh vật để tạo

thành sản phẩm sử dụng từ xa xưa Trong các loại sản phẩm lên men truyền thống này có chứa các chủng vi sinh vật có tiềm năng sản xuất ra γ-PGA

Do kinh tế chưa phát triển, việc ứng dụng công nghệ sinh học vào đời sống không cao như các nước phát triển nên việc nghiên cứu về poly - glutamic acid còn nhiều hạn chế, việc nghiên cứu chỉ dừng lại các sản phẩm liên quan đến  - PGA, việc đi sâu vào nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp poly -glutamic acid hầu như chưa có

Hiện nay ở Việt Nam tập đoàn Vedan đã sử dụng vi khuẩn B subtilis var natto và axit -glutamic qua cơ chế chuyển hóa sinh hóa để tạo thành sản

phẩm -PGA Tuy nhiên, công nghệ này chỉ được sử dụng trong tập đoàn Vedan và mọi thông tin về chủng giống cũng như quy trình công nghệ được bảo mật Sản phẩm của Vedan sản xuất là sản phẩm dạng nước được sử dụng làm thức ăn cho chăn nuôi và phân bón nông nghiệp [54]

Năm 2004, Nguyễn Quang Huy bước đầu nghiên cứu về γ-PGA trong việc bảo vệ hoạt tính của enzym papain, một enzyme tách chiết từ thực vật và thường được sử dụng trong in vitro γ-PGA có hoạt tính bảo vệ cao nhất ở nồng độ γ-PGA là 1,25%, bảo vệ tới gần 60% hoạt tính ban đầu trong khi mẫu đối chứng hoạt tính giảm tới 90% sau khi chiếu xạ với cường độ 15kGy [3]

Năm 2013, Lê Phước Cường và cộng sự đã nghiên cứu thành công hệ thống tuyển nổi để tách chì trong nước bằng cách sử dụng γ-PGA Sự kết hợp của than hoạt tính và γ-PGA trong quá trình tuyển nổi là một phương pháp mới

có thể loại bỏ chì trong nước với hiệu quả là 90% lượng Pb trong nước [4]

Năm 2013 đề tài nghiên cứu “Phân lập vi khuẩn có năng lực sinh tổng hợp -poly glutamic acid từ đồ uống Boza” của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên được thực hiện nhằm mục đích phân lập được chủng vi khuẩn

có năng lực sinh tổng hợp γ-PGA và ứng dụng các sản phẩm này trong lĩnh vực nông nghiệp

Năm 2015 Nguyễn Chí Dũng, Trần Liên Hà, Đặng Thị Thu với đề tài

”Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhận poly γ-glutamic acid và hướng ứng

dụng trong thực phẩm” đã đưa ra nhiều ứng dụng về trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là lĩnh vực về thực phẩm [5]

Từ thực trạng nghiên cứu về γ-PGA trong sản xuất và ứng dụng tại Việt Nam cho thấy cần có những nghiên cứu rộng hơn về tính chất ưu việt của vi

khuẩn Bacillus cũng như các sản phẩm do vi khuẩn này tạo ra

CHƯƠNG II: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Khảo sát được ảnh hưởng của các yếu tố, thành phần môi trường và

điều kiện nuôi cấy đến sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn Bacillus TB1

2.2 Nội dung nghiên cứu

 Khảo sát ảnh hưởng của một số thành phần môi trường dinh dưỡng: môi trường, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến khả năng tổng hợp γ-PGA của

Chủng Bacillus TB1 được bộ môn Vi sinh - Hóa sinh thuộc Viện Đại

học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp ( đã được phân lập từ nguồn Tương Bần)

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị

 Dụng cụ thí nghiệm: pipet man (20µl- 100µl, 100µl -

1000µl),peptet thủy tinh( 5ml, 10ml), bình định mức(50ml, 100ml, 200ml,

500ml, 1000ml) đĩa peptri, bình tam giác (50ml, 100ml, 250ml), ống

nghiệm,ống đong (10ml, 50ml,100ml, 250ml, 500ml), giá ống nghiệm, que

cấy, que trãi, cối chày sứ, phễu lọc, đũa thủy tinh, đèn cồn, ống eppendof,…

 Thiết bị: Các thiết bị của viện Công Nghệ sinh học của Trường Đại

Học Lâm nghiệp Việt Nam: box cấy vô trùng, nồi hấp khử trùng, cân phân tích, cân kỹ thuật, máy đo mật độ quang, máy ly tâm, máy đo pH, tủ nuôi ổn nhiệt, tủ lạnh, lò vi sóng, bếp điện, máy lắc, nồi khử trùng, tủ sấy,…

2.3.3 Hóa chất

Các hóa chất dùng trong phân lập và tuyển chọn vi khuẩn: pepton, cao nấm men (Ấn Độ), axit L-glutamic, axit citric, glycerol, NH4Cl, NH4NO3

MgSO4.7H2O, K2HPO4, CaCl2.2H2O, FeCl3.6H2O, MnSO4.H2O, NaOH, PGA, CaCO3, NaCl tinh khiết (Trung quốc), bột đậu tương, glucose, lactose,

γ-sucrose, agar …

2.4 Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy, giữ giống, hoạt hóa giống: Môi trường Luria

Broth (đối với môi trường đặc) với thành phần môi trường bao gồm:

Bảng 2.1: Thành phần môi trường LB STT Thành phần môi trường Trọng lượng (g/l)

2.5 Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm

Phòng Vi sinh - Hóa sinh, Viện công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại Học Lâm Nghiệp Việt Nam

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Phương pháp xác định khả năng sinh tổng hợp -PGA của chủng Bacillus TB1

 Hoạt hóa chủng Bacillus TB1

Cách tiến hành: Chủng Bacillus TB1 sau khi được phân lập, tuyển

chọn, tiến hành hoạt hóa giống trong môi trường LB lỏng, nuôi cấy ở nhiệt độ

370C, tốc độ lắc 150v/p trong thời gian 24 giờ để hoạt hóa chủng

 Cấy chuyển chủng Bacillus TB1 trên môi trường đặc hiệu

Xác định khả năng sinh -PGA của chủng Bacillus TB1 sau khi

được hoạt hoạt hóa trên môi trường LB lỏng tiến hành nuôi cấy trên môi trường đặc hiệu sinh -PGA Từ đó, đánh giá khả năng sinh  - PGA dựa trên các tiêu chí sau:

 Khả năng tạo màng trên môi trường đặc hiệu

+ Nguyên tắc: Môi trường đặc hiệu có áp suất thẩm thấu lớn bởi trong

thành phần môi trường có chứa 80g/l glycerol Khi áp suất thẩm thấu lớn tạo

áp lực lên màng tế bào vi khuẩn, sự phát triển của vi khuẩn này bị ức chế, vi khuẩn có khả năng sinh -PGA mạnh Dựa vào khả năng tạo màng nhày trên môi trường đặc hiệu có thể định tính được chủng có khả năng tạo -PGA mạnh [9, 60]

+ Cách tiến hành: Tiến hành nuôi các chủng vi khuẩn TB1trên môi

trường đặc hiệu sinh γ-PGA trong thời gian 120 giờ để kiểm tra khả năng tạo màng của chủng Quan sát, đánh giá khả năng tạo màng trên môi trường đặc hiệu

 Khả năng tạo độ nhớt bằng nhớt kế mao quản

+ Nguyên tắc: độ nhớt của dung dịch càng lớn thì thời gian chảy của

một thể tích xác định dung dịch qua ống mao quản càng dài