ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thời cổ đại con người đã biết sử dụng các Vi sinh vật VSV để chế biến và bảo quản thực phẩm, nhưng ý tưởng tạo ra những sản phẩm VSV sống hữu ích để bổ sung vào thức ăn hoặ
TỔNG QUAN
Vi khuẩn Lactic (LAB)
1.1.1 Khái quát về nhóm vi khuẩn sinh Lactic
Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn Gram dương, bao gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ưa khí nhưng chịu oxy Chúng sản sinh acid lactic như sản phẩm chính trong quá trình lên men carbohydrat LAB bao gồm nhiều chi, trong đó có những chi tiêu biểu nhất.
Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [3,14]
Các LAB không di động, có catalase âm tính và tỉ lệ GC thấp dưới 50% Chúng ưa ấm và chịu nhiệt, với nhiệt độ sinh trưởng tối ưu khác nhau tùy theo từng loài.
Nhiệt độ từ 28 đến 45 độ C là điều kiện lý tưởng cho LAB, vì chúng có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp Trong quá trình lên men, LAB cần các vitamin, acid amin và peptid ngắn Nguồn carbohydrat có thể bao gồm glucose, fructose, lactose, maltose và sucrose; một số chủng vi khuẩn như Lactobacillus amylophilus và L amylovorus có khả năng sử dụng tinh bột.
LAB xuất hiện phổ biến trong nhiều hệ sinh thái, thường có mặt trong các loại thực phẩm như sản phẩm từ sữa, thịt, rau quả lên men và bột nhào chua Chúng cũng tồn tại trên thực vật và trong hệ tiêu hóa, hô hấp, cũng như sinh dục của con người và động vật.
LAB đã được ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men nhờ vào những lợi ích về dinh dưỡng, cảm quan và tuổi thọ sản phẩm, đặc biệt là với các sản phẩm dễ hỏng như sữa, thịt, cá và một số loại rau quả Trong y dược, nhiều loài LAB được sử dụng làm probiotic để cải thiện sức khỏe, với các tác dụng trị liệu đáng chú ý như ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu và giảm nguy cơ mắc ung thư.
LAB sản sinh nhiều loại chất kháng khuẩn như acid lactic, acid acetic, ethanol, acid béo, H₂O₂, diacetyl, và đặc biệt là chất kháng khuẩn Mặc dù chất kháng khuẩn có mặt ở nhiều loại vi khuẩn khác, nhưng chất kháng khuẩn do LAB tạo ra thu hút sự chú ý của các nhà khoa học nhờ tính an toàn và khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm như Staphylococcus aureus và Listeria monocytogenes.
200 chất kháng khuẩn đã đƣợc mô tả cho đến nay, chất kháng khuẩn từ LAB chiếm tới 90% [16]
Một số vi khuẩn phổ biến trong thực phẩm bao gồm các giống vi khuẩn lactic quan trọng như Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình lên men thực phẩm.
1.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic
1.1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic theo Orla-Jensen
Orla-Jensen đã phân loại vi khuẩn lactic dựa trên các đặc điểm hình thái học như cầu khuẩn hoặc trực khuẩn, kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau và mức độ sử dụng đường Một số giống vi khuẩn lactic quan trọng trong quá trình lên men thực phẩm bao gồm Lactobacillus và Lactococcus.
Hình 1.1 Một số hình ảnh về vi khuẩn lactic [1]
Nhóm vi khuẩn Streptococcus có hình dạng cầu hoặc hình trứng, thường xuất hiện theo cặp hoặc thành chuỗi, và có khả năng lên men đồng hình Hiện nay, đã có hơn 50 loài Streptococcus được xác định, chủ yếu phân bố trong xoang miệng và đường hô hấp Một số loài như Streptococcus mutans là nguyên nhân gây ra bệnh sâu răng và viêm màng tim.
Sp Thermophilus, cùng với Lb delbrueckii subsp bulgaricus, là vi khuẩn chính được sử dụng trong sản xuất yogurt và phô mai, đóng vai trò quan trọng như một tác nhân acid hóa để đông tụ Lactic.
Pediococcus là vi khuẩn dạng tứ cầu, vi hiếu khí, phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ 20-30 o C và không phát triển ở 45 o C Chúng ưa acid và có khả năng lên men đồng hình Hiện tại, đã có 7 loài Pediococcus được xác định, thường xuất hiện với số lượng lớn trên lá nho, dưa bắp cải lên men, trái oliu và trong sản xuất bia.
Pediococcus đóng vai trò quan trọng trong thực phẩm với cả tác động tiêu cực và tích cực Chẳng hạn, Pe Damnosus là vi sinh vật chính gây hư hỏng trong sản xuất bia, do sự phát triển của chúng có thể tạo ra diacetyl/acetoin, gây ra vị bơ không mong muốn Ngược lại, Pe Acidilactici và Pe Pentosaceus được sử dụng làm chủng khởi động trong sản xuất xúc xích lên men Ngoài ra, Pediococcus cũng tham gia vào quá trình làm chín phô mai, góp phần tăng cường hương vị cho sản phẩm này.
Lactococcus có dạng hình cầu hoặc hình trứng, thường bắt cặp hoặc thành chuỗi Có 5 loài Lactococcus (Lactococcus lactis, Lc garvieae, Lc plantarum,
Lc piscium và Lc raffinolactis hiện đang được công nhận, nhưng chỉ có Lc lactis subsp lactis và Lc lactis subsp cremoris được sử dụng trong quá trình lên men thực phẩm.
Một số chủng Lc.lactis có khả năng chuyển hóa citrate, tạo ra CO2, diacetyl và các hợp chất trung gian khác, góp phần tạo hương vị cho sản phẩm như bơ và phô mai Gouda Nisin, một peptide kháng khuẩn, được sản sinh bởi các giống này.
Lactococcus, một phụ gia bền acid có sẵn trên thị trường, được sử dụng để kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm bằng cách ức chế hệ vi sinh vật Gram dương.
Probiotic
Probiotic là vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe, khi được đưa vào cơ thể qua đường tiêu hóa với số lượng đủ, chúng mang lại nhiều lợi ích cho cả con người và động vật.
Vài trò đối với hệ tiêu hóa: a) Tác động kháng khuẩn
Khi đƣa probiotic vào hệ tiêu hóa sẽ làm giảm số lƣợng vi khuẩn bởi vì
Vi khuẩn probiotic có khả năng tiết ra các chất kháng khuẩn như acid hữu cơ, hydrogen peroxide và chất diệt khuẩn, giúp ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-) Những hợp chất này không chỉ làm giảm sự sống của các sinh vật gây bệnh mà còn ảnh hưởng đến trao đổi chất và sự sản xuất độc tố của vi khuẩn Cơ chế hoạt động của chúng là giảm pH trong khoang ruột thông qua việc tạo ra các acid béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate, butyrate và acid lactic.
Vi khuẩn trong probiotic có khả năng cạnh tranh với các nguồn bệnh, giúp ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh Đồng thời, chúng cũng tác động tích cực lên mô biểu bì ruột.
Sử dụng probiotic giúp tăng cường sự liên kết giữa các tế bào biểu mô, giảm kích thích bài tiết và các hậu quả viêm do nhiễm khuẩn, đồng thời thúc đẩy sản xuất các phân tử bảo vệ như chất nhầy.
Probiotic đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp các phân tử kháng viêm cho đường ruột, giúp giảm đáp ứng viêm và cải thiện hệ miễn dịch, từ đó giảm dị ứng Chúng cũng hỗ trợ cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tình trạng tiêu chảy và táo bón, đồng thời tác động tích cực đến vi khuẩn đường ruột.
Probiotic có khả năng điều chỉnh thành phần vi khuẩn trong đường ruột, với mức độ sống sót khác nhau tùy thuộc vào từng giống khi đi qua các phần của hệ tiêu hóa Khi tập trung ở khoang ruột, probiotic tạo ra sự cân bằng tạm thời cho hệ sinh thái đường ruột, và sự thay đổi này có thể nhận thấy sau vài ngày tiêu thụ thực phẩm chứa probiotic, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng Nghiên cứu cho thấy, với việc tiêu thụ thường xuyên, vi khuẩn probiotic sẽ định cư tạm thời trong ruột, nhưng khi ngừng tiêu thụ, số lượng vi sinh vật này sẽ giảm xuống, điều này áp dụng cho tất cả các loại probiotic.
Vi khuẩn probiotic đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa hoạt động trao đổi chất của hệ tiêu hóa Chúng có khả năng làm giảm pH trong bộ phận tiêu hóa, từ đó cản trở hoạt động tiết enzyme của sinh vật đường ruột Ngoài ra, probiotic còn giúp tăng cường khả năng dung nạp đường lactose, giảm thiểu tình trạng đầy hơi và khó tiêu khi tiêu thụ thực phẩm chứa nhiều lactose, đồng thời thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn có lợi và giảm thiểu vi khuẩn gây hại.
Probiotic đóng vai trò quan trọng trong việc chống dị ứng, giúp cơ thể chống lại một số loại dị ứng và cung cấp nhiều chất dinh dưỡng thiết yếu như axit folic, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12.
Probiotic không chỉ có lợi cho sức khỏe tiêu hóa mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc chống ung thư Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi khuẩn probiotic có khả năng giảm nguy cơ ung thư ruột kết và bàng quang, đồng thời giúp khử độc tố gây ung thư trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của khối u Ngoài ra, probiotic còn giúp giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh và hạ huyết áp cao, đồng thời hỗ trợ quá trình hồi phục nhanh chóng sau khi mắc bệnh tiêu chảy và sử dụng kháng sinh.
Probiotics đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi gia súc, giúp vật nuôi tận dụng tối đa năng lượng từ thức ăn nhờ vào mối quan hệ cộng sinh với vi khuẩn Việc sử dụng probiotics đã được chứng minh có thể thay thế kháng sinh trong việc ngăn ngừa bệnh tật và thúc đẩy sự phát triển của vật nuôi Cụ thể, trong chăn nuôi gà và gà Tây, probiotics đã giúp tăng cường khả năng kháng nhiễm khuẩn Salmonella và giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy tự phát Các thử nghiệm thương mại cho thấy việc áp dụng probiotics hợp lý không chỉ nâng cao năng suất vật nuôi mà còn giảm chi phí sản xuất tổng thể.
1.2.3 Các tiêu chuẩn chất lượng của chế phẩm Probiotic
Theo B.Kosin và S.K.Rakshit (2006) thì những tiêu chuẩn truyền thống đƣợc dùng để chọn lọc các dòng vi khuẩn Probiotic bao gồm:
- Tính an toàn: Các chủng vi sinh phải đƣợc xếp vào nhóm GRAS
Các chế phẩm vi sinh được công nhận là an toàn (Generally Recognized As Safe - GRAS) thường chứa các vi sinh vật được phép thương mại hóa tại châu Âu Điều này đảm bảo rằng các vi sinh vật này đã được xác nhận là an toàn cho người tiêu dùng.
Nguồn gốc của các chủng vi sinh rất quan trọng, vì chúng cần được phân lập và định danh dòng (strain) Mỗi dòng khác nhau trong cùng một loài có thể mang lại những ảnh hưởng có lợi khác nhau cho động vật sử dụng chúng.
- Kháng với các điều kiện thí nghiệm in vivo và in vitro: Sau khi sử dụng
Probiotic là vi sinh vật có khả năng sống sót trong môi trường khắc nghiệt của đường ruột, nhờ vào cơ chế bảo vệ của vật chủ Chúng có khả năng kháng lại các điều kiện bất lợi như pH, dịch mật và dịch tụy, giúp duy trì sự cân bằng vi sinh trong hệ tiêu hóa.
Khả năng bám dính và khu trú của chế phẩm Probiotic trên biểu mô ruột phụ thuộc vào đặc tính của vi sinh vật trong chế phẩm và các điều kiện môi trường trong ruột, bao gồm khả năng chịu acid, enzym dạ dày và tụy, pH, mật, muối, cũng như sự tương tác với hệ vi sinh của vật chủ.
Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn đáng chú ý nhờ khả năng sản sinh acid lactic, giúp giảm pH môi trường ruột và giảm năng lực oxy hóa khử Chúng cũng sản sinh hydrogen peroxide trong điều kiện hiếu khí và các chất ức chế đặc biệt như chất kháng khuẩn, subtilin và coagulin Những đặc tính này góp phần tạo ra hiệu quả của Probiotic.
MỤC TIÊU – NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Chủng vi khuẩn Lactic được phân lập và tuyển chọn với các đặc tính ưu việt như khả năng chịu nhiệt, chịu pH thấp, kháng khuẩn, sinh enzyme ngoại bào và kháng kháng sinh, nhằm phục vụ cho việc sản xuất các sản phẩm probiotic chất lượng cao.
Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn thông qua xác định khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn
Nghiên cứu đã xác định các đặc điểm sinh hóa và probiotic của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn, bao gồm khả năng chịu nhiệt, chịu pH thấp, kháng khuẩn, sinh enzyme ngoại bào và kháng kháng sinh.
Phương pháp nghiên cứu
Thu thập mẫu từ các nguồn lên men lactic (dƣa cải muối chua, kim chi, sữa chua, nem chua,…) có tại khu vực Xuân Mai- Chương Mỹ- Hà Nội
Vi khuẩn kiểm định: B subtilis (NT1, H12, Ba1), Ecoli, Salmonella,
Shigella có ở phòng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh, Trường Đại học Lâm Nghiệp
2.3.2 Hóa chất và Thiết bị a) Hóa chất:
Pepton; Cao nấm men; axit lactic; MgSO 4 7H 2 O; MnSO 4 H 2 O; Tween 80; Glucose; K2HPO4; CaCO3; CH3COONa; Amoni xitrat; NaOH 0,1N; Hcl 0,1N; thuốc thử;… b) Môi trường
- Môi trường MRS Agar Tween 80 (g/l):
MgSO4.7H2O 0,58g Cao nấm men 5g MnSO 4 H 2 O 0,28g
Nước cất vừa đủ 1 lít; pH= 7,0; khử trùng121 o C /15 phút
- Môi trường MRS lỏng (MRS Broth) (g/l): Có thành phần như trên ngoại trừ thạch và CaCO3 Công thức môi trường MRS Broth (g/L):
Amoni citrat 2g Cao thịt 10g Natri acetat 5g Cao nấm men 5g
Nước cất vừa đủ 1000 ml , pH= 7 -Công thức môi trường Thạch dùng để nuôi cấy vi sinh vậy kiểm định:
Pepton 10g Cao thịt 5g NaCl 10g Thạch 15g Nước cất vừa đủ 1000ml , pH=7 c)Thiết bị:
Bảng 2.1 Danh sách máy móc thiết bị sử dụng
STT Tên máy STT Tên máy
1 Bếp cách thủy 8 Tủ hấp
2 Cân kỹ thuật 9 Tủ cấy
3 Cân Phân tích 10 Tủ lạnh
4 Lò vi sóng 11 Tủ sấy
5 Máy lắc Vortex 12 Tủ cấy vô trùng
6 Kính hiển vi 13 Tủ ấm
7 Máy li tâm d) dụng cụ:
Bình định mức 50, 100, 1000 ml Ống nghiệm
Pipet Pasteur Đầu côn Đèn cồn Pipetman (Pipet Eppendorf) Đĩa petri đường kính 9 cm Que cấy đầu tròn Ống đong Ống Eppendorf 1,5
2.3.3 Các phương pháp nghiên cứu
Thu thập mẫu từ các nguồn thực phẩm lên men lactic như dưa cải muối chua, kim chi, sữa chua Vinamilk và nem chua tại khu vực Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội Các mẫu thực phẩm này cần được lên men trong khoảng thời gian từ 48 đến 72 giờ để đảm bảo chất lượng.
Sử dụng các ống fancol 30 ml đã khử trùng đựng mẫu nước lên men
Các mẫu vi khuẩn kiểm định có sẵn tại phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh của Trường Đại học Lâm Nghiệp, nơi tiến hành hoạt hóa các chủng vi khuẩn kiểm định trong môi trường LB lỏng.
2.3.3.2 Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men
Phân lập vi khuẩn là quá trình tách rời một loại vi khuẩn từ quần thể vi sinh vật và cấy chúng lên môi trường dinh dưỡng chọn lọc Sau khi ủ trong điều kiện thích hợp, vi khuẩn sẽ phân chia nhiều lần, hình thành các khuẩn lạc riêng biệt Một số tế bào được cấy truyền vào ống môi trường để giữ giống và phát triển thành quần thể mới.
- Đối với mẫu thí nghiệm dạng lỏng thì chỉ cần pha loãng ra các nồng độ
Hòa loãng mẫu với các tỷ lệ 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, sau đó hút 0,05 ml dịch mẫu và nhỏ lên đĩa petri chứa môi trường MRS đặc Sử dụng que để trải đều trên bề mặt thạch cho đến khi khô, sau đó ủ ở 37 độ C trong 24 giờ.
- Đối với mẫu thí nghiệm ở dạng rắn thì cần cân 5g mẫu, cho hòa tan vào nước cất, hút dịch lỏng rồi lại pha loãng như trên
Kiểm tra hình thái khuẩn lạc đặc trưng cho vi khuẩn lactic là bước quan trọng trong quá trình phân lập Những dòng vi khuẩn được chấp nhận có hình dạng khuẩn lạc trắng đục, không màu, bờ láng, lồi, và bìa nguyên hoặc chia thùy Khuẩn lạc này cần nằm trên đường cấy chuyển và không được lẫn với những khuẩn lạc có hình thái và màu sắc khác Sau khi tách dòng, các dòng phân lập sẽ được kiểm tra hình thái và quan sát độ thuần dưới kính hiển vi quang học.
Tiến hành cấy ria để tinh sạch các chủng vi khuẩn bằng các kỹ thuật như kiểu chữ chi, chữ T, và ria 3 góc Quá trình này bao gồm việc vết cấy cạn dần cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ.
2.3.3.3 Khảo sát khả năng sinh acid lactic
Để xác định các chủng vi khuẩn lactic, cần nuôi lắc ổn nhiệt trong môi trường MRS dịch thể Nếu là vi khuẩn lactic, chúng sẽ phát triển mạnh mẽ, tạo ra sinh khối lớn và làm môi trường chuyển sang màu trắng đục Các chủng này cũng có khả năng sinh axit lactic, dẫn đến sự giảm pH của môi trường Lượng axit lactic được xác định bằng NaOH, và khả năng sinh axit lactic của các chủng vi khuẩn lactic được đánh giá qua phương pháp chuẩn độ Therner Độ axit được tính theo công thức: \( oT = V_{NaOH} \times 10 \).
Trong đó: o T là độ Therner, 1 o T tương ứng với 0.009g axit lactic
- Lấy 10 ml dịch nuôi lắc đã li tâm cho vào ống nghiệm
- Bổ sung 20 ml nước cất và 1-2 giọt Phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn
- Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại Ghi lại thể tích NaOH đã dùng để chuẩn độ
2.3.3.4 Phương pháp xác định đặc tính sinh học và hóa sinh của chủng vi khuẩn tuyển chọn
Nhuộm Gram là phương pháp phân loại vi khuẩn thành hai nhóm chính: Gram dương và Gram âm, dựa trên đặc tính hóa lý của thành tế bào Vi khuẩn Gram dương giữ phức hợp tím trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được, dẫn đến sự khác biệt về màu sắc sau khi nhuộm Kết quả là vi khuẩn Gram dương có màu tím, còn vi khuẩn Gram âm có màu hồng do fucshin.
- Nhỏ một giọt nước cất lên lam kinh và dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc hào tan hoàn toàn trong giọt nước
- Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn
- Dùng thuốc nhuộm tím tinh thể nhuộm mẫu trong 1 phút
- Thêm dung dịch Lugol trong 3 phút
- Rửa bằng rƣợu trong 10 giây
- Nhuộm tiếp với fuchsin trong 2 phút
- Rửa qua nước Để khô
Lấy khuẩn lạc cho lên trên miếng lamen sạch, sau đó nhỏ một giọt H2O2
10% lên Nếu thấy xuất hiện bọt trắng thì phản ứng là dương tính còn không xuất hiện bọt trắng thì phản ứng là âm tính
2.3.3.5 Khảo sát khả năng chịu nhiệt
Các chủng vi khuẩn được tuyển chọn đã được nuôi cấy trên môi trường MRS dịch thể trong máy lắc ổn nhiệt với tốc độ 200 vòng/phút và ở các nhiệt độ khác nhau là 35, 37, 40 và 45 độ C Lượng giống sử dụng để nuôi lỏng là 1% cho từng loại vi khuẩn Mật độ của các chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua phương pháp cấy trải, đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thạch và tính số lượng vi sinh vật bằng cfu/ml.
2.3.3.6 Khảo sát khả năng chịu PH thấp Đánh giá khả năng sinh trưởng trong môi trường có độ pH khác nhau .Tương tự như trên, các chủng vi khuẩn cũng được nuôi cấy trên môi trường dịch thể trong đệm acetat có pH khác nhau (2,0; 3,0; 4,0 và 5,0), trên máy lắc ổn nhiệt (200 vòng/ phút tại 37 o C cho vi khuẩn Lactic) Mật độ các chủng vi khuẩn được đánh giá thông qua phương pháp cấy trải đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thạch và tính số lƣợng VSV tính bằng cfu/ml
Đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU/ml hoặc CFU/g) là phương pháp dùng để xác định số lượng tế bào vi khuẩn hoặc nấm sống trong một mẫu cụ thể Đây là tiêu chuẩn quan trọng để đo lường sự hiện diện của vi sinh vật trong các mẫu chất lỏng.
N (mật độ tế bào CFU/ml hoặc CFU/g) =
N 0 : Số lƣợng khuẩn lạc trung bình trong các đĩa d: hệ số pha loãng
V: Thể tích đã dùng (ml)
2.3.3.7 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
Trong quá trình nhân sinh khôi vi khuẩn, tế bào vi khuẩn tiết ra enzyme và chất kháng khuẩn vào môi trường Khi thu lấy dịch nuôi này và thử nghiệm trên môi trường thạch có vi khuẩn kiểm định, nếu có chất kháng khuẩn, nó sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn kiểm định xung quanh lỗ thạch Kết quả là tạo ra vòng trong suốt quanh lỗ thạch, được gọi là vòng kháng khuẩn.
- Lên men các chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính amylase đã đƣợc tuyển chọn trong môi trường MRS dịch thể, lắc 200 vòng/phút trong 48 giờ ở nhiệt độ
- Ly tâm dịch nuôi 8000 vòng/phút, loại sinh khối, thu dịch thô
- Nhỏ 0,5 ml dịch thô vào các lỗ thạch trên đĩa đã cấy sẵn vi khuẩn kiểm định, nuôi ở 37 o C, 24 giờ
Khả năng ức chế vi khuẩn được xác định thông qua đường kính vòng vô khuẩn xung quanh lỗ thạch, được tính bằng công thức D - d, trong đó D là đường kính vòng vô khuẩn (mm) và d là đường kính lỗ thạch (mm).
- Mỗi thí nghiệm lặp lại ít nhất 3 lần để có kết quả tin cậy
2.3.3.8 Xác định hoạt tính một số enzyme bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch
Vi khuẩn lactic trong quá trình sống sẽ trao đổi chất với môi trường nuôi cấy và tiết ra enzyme ngoại bào Dựa vào đặc điểm này, có thể chọn các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh enzyme dựa trên sự xuất hiện của vòng phân giải cơ chất tương ứng Sự bắt màu của thước nhuộm với cơ chất còn lại sau khi thử hoạt tính giúp nhận biết khả năng sinh enzyme ngoại bào của vi khuẩn, với cơ chất bị phân hủy tạo thành vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc Độ lớn của môi trường trong suốt phản ánh hoạt động của enzyme.
Cách đánh giá khả năng tạo enzyme:
Dùng thước đo đường kính vòng phân giải tại mặt sau đĩa petri
D-d ≥ 25mm: hoạt tính enzyme rất mạnh
D-d ≥ 20mm: hoạt tính enzyme mạnh
D-d ≥ 10mm: hoạt tính enzyme trung bình
D-d ≤ 10mm: hoạt tính enzyme yếu
Trong đó: D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính khuẩn lạc hoặc là đường kính của khoan khối thạch
Lên men các chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS lỏng ở nhiệt độ 37 độ C với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong khoảng thời gian 24-48 giờ Sau đó, tiến hành ly tâm dịch nuôi ở tốc độ 7000 vòng/phút để loại bỏ sinh khối và thu được dịch trong.